Denne protokol beskriver et batteri af metoder, der inkluderer analytisk størrelsesekskluderingskromatografi til at studere histon chaperone oligomerisering og stabilitet, pull-down assay for at opklare histon chaperon-histon-interaktioner, AUC til at analysere støkiometrien af proteinkomplekserne og histon chaperoning assay for funktionelt at karakterisere en formodet histon chaperone in vitro.
Histonproteiner associeres med DNA for at danne det eukaryote kromatin. Den grundlæggende enhed af kromatin er et nukleosom, der består af en histonoktamer bestående af to kopier af kernehistonerne H2A, H2B, H3 og H4, viklet rundt af DNA’et. Octamere består af to kopier af en H2A/H2B dimer og en enkelt kopi af en H3/H4 tetramer. De højt ladede kernehistoner er tilbøjelige til ikke-specifikke interaktioner med flere proteiner i den cellulære cytoplasma og kernen. Histone chaperoner danner en forskelligartet klasse af proteiner, der transporterer histoner fra cytoplasmaet ind i kernen og hjælper deres aflejring på DNA’et og dermed hjælper nukleosomsamlingsprocessen. Nogle histon chaperoner er specifikke for enten H2A / H2B eller H3 / H4, og nogle fungerer som chaperoner for begge. Denne protokol beskriver, hvordan in vitro-laboratorieteknikker såsom pull-down-assays, analytisk størrelsesekskluderingskromatografi, analytisk ultracentrifugering og histon chaperoning-assay kan bruges sammen for at bekræfte, om et givet protein er funktionelt som en histon chaperon.
Nukleosomer sammensat af DNA- og histonproteiner danner den strukturelle enhed af kromatin og regulerer flere kritiske cellulære hændelser. Nukleosomer omplaceres dynamisk og ombygges for at gøre DNA tilgængeligt for forskellige processer såsom replikation, transkription og oversættelse 1,2. Histoner, der er meget basiske, har enten tendens til at interagere med sure proteiner i det cellulære miljø eller gennemgå aggregering, hvilket fører til forskellige cellulære defekter 3,4,5. En gruppe dedikerede proteiner kaldet histon chaperoner hjælper transporten af histoner fra cytoplasmaet til kernen og forhindrer afvigende histon-DNA-aggregeringshændelser 6,7. Grundlæggende opbevarer og overfører de fleste histonkaperoner histoner til DNA ved fysiologisk ionstyrke og derved hjælper dannelsen af nukleosomer 8,9. Nogle histon chaperoner har en klar præference for histon oligomerer H2A / H2B eller H3 / H410.
Histone chaperoner er karakteriseret baseret på deres evne til at samle nukleosomer afhængige eller uafhængige af DNA-syntese11. For eksempel er kromatinsamlingsfaktor-1 (CAF-1) afhængig, mens histonregulator A (HIRA) er uafhængig af DNA-syntese12,13. Tilsvarende er nukleoplasminfamilien af histon chaperoner involveret i sædkromatindekondensation og nukleosomsamling14. Nukleosomsamlingsproteinet (NAP) familiemedlemmer letter dannelsen af nukleosomlignende strukturer in vitro og er involveret i shuttling af histoner mellem cytoplasma og kerne15. Nukleoplasminer og NAP-familieproteiner er begge funktionelle histonchaperoner, men deler ingen strukturelle træk. I det væsentlige tillader ingen enkelt strukturel funktion klassificering af et protein som en histon chaperone16. Brugen af funktionelle og biofysiske assays sammen med strukturelle undersøgelser fungerer bedst til at karakterisere histon chaperoner.
Dette arbejde beskriver biokemiske og biofysiske metoder til at karakterisere et protein som en histon chaperon, der hjælper nukleosom samling. For det første blev analytisk størrelsesekskluderingskromatografi udført for at analysere den oligomere status og stabilitet af histonchaperoner. Dernæst blev der udført et pull-down-assay for at bestemme drivkræfterne og den konkurrencemæssige karakter af histon chaperone-histon-interaktioner. Imidlertid kunne de hydrodynamiske parametre for disse interaktioner ikke beregnes nøjagtigt ved hjælp af analytisk størrelsesekskluderingskromatografi på grund af proteinets form og dets komplekser, der påvirker deres migration gennem søjlen. Derfor blev analytisk ultracentrifugering anvendt, hvilket giver makromolekylære egenskaber i opløsning, der inkluderer nøjagtig molekylvægt, interaktionens støkiometri og formen af de biologiske molekyler. Tidligere undersøgelser har i vid udstrækning brugt in vitro histon chaperoning assay til funktionelt at karakterisere histon chaperoner såsom yScS11617, DmACF18, ScRTT106p19, HsNPM120. Histone chaperoning assay blev også brugt til funktionelt at karakterisere proteinerne som histon chaperoner.
Dette arbejde demonstrerer og validerer et omfattende sæt protokoller til biokemisk og biofysisk karakterisering af en formodet histon chaperone. Heri blev rekombinant udtrykte og oprensede NAP-familieproteiner, AtNRP1 og AtNRP2, og det N-terminale nukleoplasmindomæne af AtFKBP53 brugt til at demonstrere protokollerne. Det samme sæt eksperimenter kunne meget vel bruges til at afgrænse de funktionelle egenskaber ved tidligere ukarakteriserede histonchaperoner fra enhver organisme.
Den førs…
The authors have nothing to disclose.
De ekstramurale tilskud til Dileep Vasudevan fra Science and Engineering Research Board, Indiens regering [CRG/2018/000695/PS] og Institut for Bioteknologi, Ministeriet for Videnskab og Teknologi, Indiens regering [BT/INF/22/SP33046/2019] samt den intramurale støtte fra Institute of Life Sciences, Bhubaneswar anerkendes i høj grad. Vi takker fru Sudeshna Sen og fru Annapurna Sahoo for deres hjælp med histonpræparation. Diskussionerne med vores kolleger Dr. Chinmayee Mohapatra, Mr. Manas Kumar Jagdev og Dr. Shaikh Nausad Hossain anerkendes også.
Acetic acid (glacial) | Sigma | A6283 | |
Acrylamide | MP Biomedicals | 814326 | |
Agarose | MP Biomedicals | 193983 | |
AKTA Pure 25M FPLC | Cytiva | 29018226 | Instrument for protein purification |
Ammonium persulfate (APS) | Sigma | A3678 | |
An-60Ti rotor | Beckman Coulter | 361964 | Rotor for analytical ultracentrifugation |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
Chloroform | Sigma | C2432 | |
Coomassie brilliant blue R 250 | Sigma | 1.15444 | |
Dialysis tubing (7 kDa cut-off) | Thermo Fisher | 68700 | For dialysing protein samples |
Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals | 100597 | |
DNA Loading Dye | New England Biolabs | B7025S | |
EDTA disodium salt | MP Biomedicals | 194822 | |
Electronic balance | Shimadzu | ATX224R | |
Ethanol | Sigma | E7023 | |
Ethidium bromide (EtBr) | Sigma | E8751 | |
Gel Doc System | Bio-Rad | 12009077 | For imaging gels after staining |
Horizontal gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 1704405 | Instrument for agarose gel electrophoresis |
Hydrochloric acid (HCl) | Sigma | 320331 | |
Imidazole | MP Biomedicals | 102033 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M8266 | |
Micropipettes | Eppendorf | Z683779 | For pipetting of micro-volumes |
Mini-PROTEAN electrophoresis system | Bio-Rad | 1658000 | Instrument for SDS-PAGE |
N,N-methylene-bis-acrylamide | MP Biomedicals | 800172 | |
Nano drop | Thermo Fisher | ND-2000 | For measurement of protein and DNA concentrations |
Ni-NTA agarose | Invitrogen | R901-15 | Resin beads for pull-down assay |
Optima AUC analytical ultracentrifuge | Beckman Coulter | B86437 | Instrument for analytical ultracentrifugation |
pH Meter | Mettler Toledo | MT30130863 | |
Phenol | Sigma | P4557 | |
Plasmid isolation kit | Qiagen | 27104 | |
Proteinase K | Sigma-Aldrich | 1.07393 | |
pUC19 | Thermo Fisher | SD0061 | Plasmid for supercoiling assay |
Refrigerated high-speed centrifuge | Thermo Fisher | 75002402 | |
SDS-PAGE protein marker | Bio-Rad | 1610317 | |
SEDFIT | Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis | ||
SEDNTERP | Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein | ||
SigmaPrep Spin Columns | Sigma | SC1000 | For pull-down assay |
Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
Sodium chloride (NaCl) | Merck | S9888 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | MP Biomedicals | 102918 | |
Superdex 200 Increase 10/300 GL | Cytiva | 28990944 | Column for analytical size-exclusion chromatography |
Superdex 75 Increase 10/300 GL | Cytiva | 29148721 | Column for analytical size-exclusion chromatography |
TEMED | Sigma | 1.10732 | |
Topoisomerase I | Inspiralis | WGT102 | Enzyme used in plasmid supercoiling assay |
Tris base | Merck | T1503 | |
Tween-20 | Sigma | P1379 | |
Urea | MP Biomedicals | 191450 | |
Water bath | Nüve | NB 5 | For heat treatment of protein samples |
β-mercaptoethanol (β-ME) | Sigma | M6250 |