במבחנה אפיון מלווי היסטון באמצעות מבחני אנליטיקה, משיכה וליווי
Summary
פרוטוקול זה מתאר סוללה של שיטות הכוללות כרומטוגרפיה אנליטית של אי-הכללת גודל כדי לחקור אוליגומריזציה ויציבות של מלווה היסטון, בדיקת משיכה למטה כדי לפענח אינטראקציות של מלווה היסטון-היסטון, AUC כדי לנתח את הסטויכיומטריה של קומפלקסי החלבונים, ומבחן מלווה היסטון כדי לאפיין באופן פונקציונלי מלווה היסטון במבחנה.
Abstract
חלבוני היסטון נקשרים לדנ”א ויוצרים את הכרומטין האאוקריוטי. היחידה הבסיסית של הכרומטין היא נוקלאוזום, המורכב מאוקטמר היסטון המורכב משני עותקים של ליבת ההיסטונים H2A, H2B, H3 ו-H4, העטופים על ידי הדנ”א. האוקטמר מורכב משני עותקים של דימר H2A/H2B ועותק יחיד של טטרמר H3/H4. היסטונים הליבה הטעונים מאוד נוטים לאינטראקציות לא ספציפיות עם מספר חלבונים בציטופלסמה התאית ובגרעין. מלווים של היסטון יוצרים קבוצה מגוונת של חלבונים שמעבירים היסטונים מהציטופלסמה אל תוך הגרעין ומסייעים לתצהיר שלהם על הדנ”א, ובכך מסייעים לתהליך הרכבת הנוקלאוזום. חלק ממלווים היסטון הם ספציפיים עבור H2A / H2B או H3 / H4, וחלקם מתפקדים כמלווים עבור שניהם. פרוטוקול זה מתאר כיצד טכניקות מעבדה במבחנה כגון מבחני משיכה כלפי מטה, כרומטוגרפיה אנליטית של אי הכללת גודל, אולטרה-צנטריפוגה אנליטית ובדיקת מלווה היסטון יכולות לשמש במקביל כדי לאשר אם חלבון נתון מתפקד כמלווה היסטון.
Introduction
נוקלאוזומים המורכבים מחלבוני דנ”א והיסטון יוצרים את היחידה המבנית של הכרומטין ומווסתים מספר אירועים תאיים קריטיים. נוקלאוזומים ממוקמים מחדש באופן דינמי ומעוצבים מחדש כדי להנגיש את הדנ”א לתהליכים שונים כגון שכפול, שעתוק ותרגום 1,2. אבנים שהן בסיסיות מאוד נוטות לתקשר עם חלבונים חומציים בסביבה התאית או לעבור צבירה, ובכך מובילות לפגמים תאיים שונים 3,4,5. קבוצה של חלבונים ייעודיים הנקראים מלווים היסטון מסייעים בהעברת היסטונים מהציטופלסמה אל הגרעין ומונעיםאירועי צבירה של היסטון-DNA 6,7. ביסודו של דבר, רוב המלווים של היסטון מאחסנים ומעבירים היסטונים לדנ”א בעוצמה יונית פיזיולוגית, ובכך מסייעים להיווצרות נוקלאוזומים 8,9. לחלק מהמלווים של היסטון יש העדפה ברורה לאוליגומרים של היסטון H2A/H2B או H3/H410.
מלווים של היסטון מאופיינים על סמך יכולתם להרכיב נוקלאוזומים התלויים או בלתי תלויים בסינתזת DNA11. לדוגמה, גורם הרכבת הכרומטין-1 (CAF-1) תלוי בעוד מווסת היסטון A (HIRA) אינו תלוי בסינתזת DNA12,13. באופן דומה, משפחת הנוקלאופלסמין של מלווים היסטון מעורבת בפירוק כרומטין זרע ובהרכבת נוקלאוזום14. בני משפחת חלבון הרכבת הנוקלאוזומים (NAP) מאפשרים היווצרות מבנים דמויי נוקלאוזומים במבחנה ומעורבים בהסתרת היסטונים בין ציטופלסמה לגרעין15. נוקלאופלסמינים וחלבונים ממשפחת NAP הם שניהם מלווים פונקציונליים של היסטון, אך אינם חולקים תכונות מבניות כלשהן. למעשה, אין תכונה מבנית אחת המאפשרת סיווג של חלבון כמלווה היסטון16. השימוש במבחנים פונקציונליים וביופיזיים יחד עם מחקרים מבניים פועלים בצורה הטובה ביותר באפיון מלווים של היסטון.
עבודה זו מתארת שיטות ביוכימיות וביופיזיות לאפיון חלבון כמלווה היסטון המסייע להרכבת נוקלאוזומים. ראשית, כרומטוגרפיה אנליטית של אי הכללת גודל בוצעה כדי לנתח את המצב האוליגומרי והיציבות של מלווים היסטון. לאחר מכן, בוצעה בדיקה נשלפת כדי לקבוע את הכוחות המניעים ואת האופי התחרותי של אינטראקציות histone chaperone-histone. עם זאת, לא ניתן היה לחשב במדויק את הפרמטרים ההידרודינמיים של אינטראקציות אלה באמצעות כרומטוגרפיה אנליטית של אי הכללת גודל בגלל צורת החלבון והקומפלקסים שלו המשפיעים על נדידתם דרך העמודה. לכן, נעשה שימוש באולטרה-צנטריפוגציה אנליטית, המספקת תכונות מקרומולקולריות בתמיסה הכוללות משקל מולקולרי מדויק, סטויכיומטריה של אינטראקציה וצורת המולקולות הביולוגיות. מחקרים קודמים עשו שימוש נרחב במבחן מלווה היסטון במבחנה כדי לאפיין באופן פונקציונלי מלווים היסטון כגון yScS11617, DmACF 18, ScRTT106p19, HsNPM120. מבחן הליווי של היסטון שימש גם לאפיון פונקציונלי של החלבונים כמלווים היסטון.
Protocol
Representative Results
Discussion
עבודה זו מדגימה ומאמתת מערך מקיף של פרוטוקולים לאפיון ביוכימי וביופיזי של מלווה היסטון פוטטיבי. כאן, חלבוני משפחת NAP המבוטאים באופן רקומביננטי ומטוהרים, AtNRP1 ו- AtNRP2, ותחום הנוקלאופלסמין N-terminal של AtFKBP53 שימשו להדגמת הפרוטוקולים. אותה קבוצה של ניסויים יכולה בהחלט לשמש כדי להגדיר את התכונות הפו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המענקים החוץ-אקדמיים לדיליפ וסודוואן ממועצת המחקר למדע והנדסה, ממשלת הודו [CRG/2018/000695/PS] והמחלקה לביוטכנולוגיה, משרד המדע והטכנולוגיה, ממשלת הודו [BT/INF/22/SP33046/2019], כמו גם התמיכה התוך-מורלית מהמכון למדעי החיים, בובנשוואר מוכרים מאוד. אנו מודים לגב’ סודשנה סן וגב’ אנאפורנה סאהו על עזרתן בהכנת היסטון. גם הדיונים עם עמיתינו ד”ר צ’ינמאיי מוהפטרה, מר מנאס קומאר ג’אגדב וד”ר שייח’ נוסאד חוסיין זוכים להכרה.
Materials
| Acetic acid (glacial) | Sigma | A6283 | |
| Acrylamide | MP Biomedicals | 814326 | |
| Agarose | MP Biomedicals | 193983 | |
| AKTA Pure 25M FPLC | Cytiva | 29018226 | Instrument for protein purification |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma | A3678 | |
| An-60Ti rotor | Beckman Coulter | 361964 | Rotor for analytical ultracentrifugation |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Coomassie brilliant blue R 250 | Sigma | 1.15444 | |
| Dialysis tubing (7 kDa cut-off) | Thermo Fisher | 68700 | For dialysing protein samples |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals | 100597 | |
| DNA Loading Dye | New England Biolabs | B7025S | |
| EDTA disodium salt | MP Biomedicals | 194822 | |
| Electronic balance | Shimadzu | ATX224R | |
| Ethanol | Sigma | E7023 | |
| Ethidium bromide (EtBr) | Sigma | E8751 | |
| Gel Doc System | Bio-Rad | 12009077 | For imaging gels after staining |
| Horizontal gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 1704405 | Instrument for agarose gel electrophoresis |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma | 320331 | |
| Imidazole | MP Biomedicals | 102033 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M8266 | |
| Micropipettes | Eppendorf | Z683779 | For pipetting of micro-volumes |
| Mini-PROTEAN electrophoresis system | Bio-Rad | 1658000 | Instrument for SDS-PAGE |
| N,N-methylene-bis-acrylamide | MP Biomedicals | 800172 | |
| Nano drop | Thermo Fisher | ND-2000 | For measurement of protein and DNA concentrations |
| Ni-NTA agarose | Invitrogen | R901-15 | Resin beads for pull-down assay |
| Optima AUC analytical ultracentrifuge | Beckman Coulter | B86437 | Instrument for analytical ultracentrifugation |
| pH Meter | Mettler Toledo | MT30130863 | |
| Phenol | Sigma | P4557 | |
| Plasmid isolation kit | Qiagen | 27104 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | 1.07393 | |
| pUC19 | Thermo Fisher | SD0061 | Plasmid for supercoiling assay |
| Refrigerated high-speed centrifuge | Thermo Fisher | 75002402 | |
| SDS-PAGE protein marker | Bio-Rad | 1610317 | |
| SEDFIT | Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis | ||
| SEDNTERP | Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein | ||
| SigmaPrep Spin Columns | Sigma | SC1000 | For pull-down assay |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | S9888 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | MP Biomedicals | 102918 | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | Cytiva | 28990944 | Column for analytical size-exclusion chromatography |
| Superdex 75 Increase 10/300 GL | Cytiva | 29148721 | Column for analytical size-exclusion chromatography |
| TEMED | Sigma | 1.10732 | |
| Topoisomerase I | Inspiralis | WGT102 | Enzyme used in plasmid supercoiling assay |
| Tris base | Merck | T1503 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Urea | MP Biomedicals | 191450 | |
| Water bath | Nüve | NB 5 | For heat treatment of protein samples |
| β-mercaptoethanol (β-ME) | Sigma | M6250 |
References
- Hübner, M. R., Eckersley-Maslin, M. A., Spector, D. L. Chromatin organization and transcriptional regulation. Current Opinion in Genetics and Development. 23 (2), 89-95 (2013).
- Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
- Kim, U. J., Han, M., Kayne, P., Grunstein, M. Effects of histone H4 depletion on the cell cycle and transcription of Saccharomyces cerevisiae. EMBO Journal. 7 (7), 2211-2219 (1988).
- Prado, F., Aguilera, A. Partial depletion of histone H4 increases homologous recombination-mediated genetic instability. Molecular and Cellular Biology. 25 (4), 1526-1536 (2005).
- Meeks-Wagner, D., Hartwell, L. H. Normal stoichiometry of histone dimer sets is necessary for high fidelity of mitotic chromosome transmission. Cell. 44 (1), 43-52 (1986).
- Groth, A., et al. Human Asf1 regulates the flow of S phase histones during replicational stress. Molecular Cell. 17 (2), 301-311 (2005).
- Laskey, R. A., Honda, B. M., Mills, A. D., Finch, J. T. Nucleosomes are assembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA. Nature. 275 (5679), 416-420 (1978).
- Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. A. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
- Akey, C. W., Luger, K. Histone chaperones and nucleosome assembly. Current Opinion in Structural Biology. 13 (1), 6-14 (2003).
- De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: An escort network regulating histone traffic. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
- Eitoku, M., Sato, L., Senda, T., Horikoshi, M. Histone chaperones: 30 years from isolation to elucidation of the mechanisms of nucleosome assembly and disassembly. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (3), 414-444 (2008).
- Quivy, J. P., Grandi, P., Almouzni, G. Dimerization of the largest subunit of chromatin assembly factor 1: importance in vitro and during Xenopus early development. EMBO Journal. 20 (8), 2015-2027 (2001).
- Ray-Gallet, D., et al. HIRA is critical for a nucleosome assembly pathway independent of DNA synthesis. Molecular Cell. 9 (5), 1091-1100 (2002).
- Frehlick, L. J., Eirín-López, J. M., Ausió, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Bioessays. 29 (1), 49-59 (2007).
- Ito, T., Bulger, M., Kobayashi, R., Kadonaga, J. T. Drosophila NAP-1 is a core histone chaperone that functions in ATP-facilitated assembly of regularly spaced nucleosomal arrays. Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 3112-3124 (1996).
- Elsässer, S. J., D’Arcy, S. Towards a mechanism for histone chaperones. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (3-4), 211-221 (2013).
- Rodríguez-Campos, A., Koop, R., Faraudo, S., Beato, M. Transcriptionally competent chromatin assembled with exogenous histones in a yeast whole cell extract. Nucleic Acids Research. 32 (13), 111 (2004).
- Levenstein, M. E., Kadonaga, J. T. Biochemical analysis of chromatin containing recombinant Drosophila core histones. Journal of Biological Chemistry. 277 (10), 8749-8754 (2002).
- Huang, S., et al. Rtt106p is a histone chaperone involved in heterochromatin-mediated silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13410-13415 (2005).
- Swaminathan, V., Kishore, A. H., Febitha, K. K., Kundu, T. K. Human histone chaperone nucleophosmin enhances acetylation-dependent chromatin transcription. Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7534-7545 (2005).
- Singh, A. K., Datta, A., Jobichen, C., Luan, S., Vasudevan, D. AtFKBP53: A chimeric histone chaperone with functional nucleoplasmin and PPIase domains. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1531-1550 (2020).
- Scofield, B. T. K. H. . Protein Electrophoresis. , (2012).
- Andrew, S. M., Titus, J. A., Zumstein, L. Dialysis and concentration of protein solutions. Current Protocols in Toxicology, Appendix 3. , 1-5 (2002).
- Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell. Journal of Visualized Experiments. (33), e1530 (2009).
- Padavannil, A., Brautigam, C. A., Chook, Y. M. Molecular size analysis of recombinant importin-histone complexes using analytical ultracentrifugation. Bio-protocol. 10 (10), 3625 (2019).
- Zhao, H., Brautigam, C. A., Ghirlando, R., Schuck, P. Overview of current methods in sedimentation velocity and sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Current Protocols in Protein Science. , (2013).
- Schuck, P. Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modelling. Biophysical Journal. 78 (3), 1606-1619 (2000).
- Kumar, A., Kumar Singh, A., Chandrakant Bob de, R., Vasudevan, D. Structural characterization of Arabidopsis thaliana NAP1-related protein 2 (AtNRP2) and comparison with its homolog AtNRP1. Molecules. 24 (12), 2258 (2019).
- Liu, W. H., Roemer, S. C., Port, A. M., Churchill, M. E. A. CAF-1-induced oligomerization of histones H3/H4 and mutually exclusive interactions with Asf1 guide H3/H4 transitions among histone chaperones and DNA. Nucleic Acids Research. 45 (16), 9809 (2017).
- Bowman, A., et al. The histone chaperones Vps75 and Nap1 form ring-like, tetrameric structures in solution. Nucleic Acids Research. 42 (9), 6038-6051 (2014).
- Newman, E. R., et al. Large multimeric assemblies of nucleosome assembly protein and histones revealed by small-angle X-ray scattering and electron microscopy. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26657-26665 (2012).
- Edlich-Muth, C., et al. The pentameric nucleoplasmin fold is present in Drosophila FKBP39 and a large number of chromatin-related proteins. Journal of Molecular Biology. 427 (10), 1949-1963 (2015).
- Franco, A., et al. Structural insights into the ability of nucleoplasmin to assemble and chaperone histone octamers for DNA deposition. Scientific Reports. 9 (1), 9487 (2019).
- Xiao, H., Jackson, V., Lei, M. The FK506-binding protein, Fpr4, is an acidic histone chaperone. FEBS Letters. 580 (18), 4357-4364 (2006).
- Graziano, G. Role of hydrophobic effect in the salt-induced dimerization of bovine beta-lactoglobulin at pH 3. Biopolymers. 91 (12), 1182-1188 (2009).
- Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
- Donham, D. C., Scorgie, J. K., Churchill, M. E. The activity of the histone chaperone yeast Asf1 in the assembly and disassembly of histone H3/H4-DNA complexes. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5449-5458 (2011).
- Avvakumov, N., Nourani, A., Côté, J. Histone chaperones: Modulators of chromatin marks. Molecular Cell. 41 (5), 502-514 (2011).
- Ransom, M., Dennehey, B. K., Tyler, J. K. Chaperoning histones during DNA replication and repair. Cell. 140 (2), 183-195 (2010).
- Chu, X., et al. Importance of electrostatic interactions in the association of intrinsically disordered histone chaperone Chz1 and histone H2A.Z-H2B. PLoS Computational Biology. 8 (7), 1002608 (2012).
- Heidarsson, P. O., et al. Disordered proteins enable histone chaperoning on the nucleosome. bioRxiv. , (2020).
