Summary

In vitro Caratterizzazione degli Chaperoni degli istoni mediante saggi analitici, pull-down e chaperoning

Published: December 29, 2021
doi:

Summary

Questo protocollo descrive una batteria di metodi che include la cromatografia analitica di esclusione dimensionale per studiare l’oligomerizzazione e la stabilità dell’istone chaperone, il saggio pull-down per svelare le interazioni chaperone-istone degli istoni, l’AUC per analizzare la stechiometria dei complessi proteici e il saggio di chaperoning degli istoni per caratterizzare funzionalmente un presunto chaperone istonico in vitro.

Abstract

Le proteine istoniche si associano al DNA per formare la cromatina eucariotica. L’unità di base della cromatina è un nucleosoma, costituito da un ottamero istonico costituito da due copie degli istoni H2A, H2B, H3 e H4, avvolti dal DNA. L’ottamero è composto da due copie di un dimero H2A/H2B e una singola copia di un tetramero H3/H4. Gli istoni del nucleo altamente carichi sono soggetti a interazioni non specifiche con diverse proteine nel citoplasma cellulare e nel nucleo. Gli chaperoni istonici formano una classe diversificata di proteine che trasportano gli istoni dal citoplasma al nucleo e aiutano la loro deposizione sul DNA, assistendo così il processo di assemblaggio del nucleosoma. Alcuni chaperoni istonici sono specifici per H2A / H2B o H3 / H4, e alcuni funzionano come chaperoni per entrambi. Questo protocollo descrive come le tecniche di laboratorio in vitro come i saggi pull-down, la cromatografia analitica ad esclusione dimensionale, l’ultra-centrifugazione analitica e il test di chaperoning degli istoni potrebbero essere utilizzate in tandem per confermare se una data proteina è funzionale come chaperone istonico.

Introduction

I nucleosomi composti da DNA e proteine istoniche formano l’unità strutturale della cromatina e regolano diversi eventi cellulari critici. I nucleosomi vengono riposizionati e rimodellati dinamicamente per rendere il DNA accessibile a vari processi come la replicazione, la trascrizione e la traduzione 1,2. Gli istoni altamente basici tendono ad interagire con le proteine acide nell’ambiente cellulare o subiscono aggregazione, portando così a vari difetti cellulari 3,4,5. Un gruppo di proteine dedicate chiamate chaperoni degli istoni aiuta il trasporto degli istoni dal citoplasma al nucleo e previene eventi aberranti di aggregazione istone-DNA 6,7. Fondamentalmente, la maggior parte degli chaperoni degli istoni immagazzinano e trasferiscono gli istoni sul DNA a forza ionica fisiologica, favorendo così la formazione dei nucleosomi 8,9. Alcuni chaperoni istonici hanno una netta preferenza per gli oligomeri istonici H2A/H2B o H3/H410.

Gli chaperoni istonici sono caratterizzati in base alla loro capacità di assemblare nucleosomi dipendenti o indipendenti dalla sintesi del DNA11. Ad esempio, il fattore di assemblaggio della cromatina-1 (CAF-1) è dipendente mentre il regolatore degli istoni A (HIRA) è indipendente dalla sintesi del DNA12,13. Allo stesso modo, la famiglia nucleoplasmina degli chaperoni istonici è coinvolta nella decondensazione della cromatina spermatica e nell’assemblaggio dei nucleosomi14. I membri della famiglia delle proteine di assemblaggio dei nucleosomi (NAP) facilitano la formazione di strutture simili ai nucleosomi in vitro e sono coinvolti nello spostamento degli istoni tra citoplasma e nucleo15. Le nucleoplasmine e le proteine della famiglia NAP sono entrambe chaperoni funzionali degli istoni ma non condividono alcuna caratteristica strutturale. Essenzialmente, nessuna singola caratteristica strutturale consente la classificazione di una proteina come chaperone istonico16. L’uso di saggi funzionali e biofisici insieme a studi strutturali funzionano meglio nella caratterizzazione degli accompagnatori degli istoni.

Questo lavoro descrive metodi biochimici e biofisici per caratterizzare una proteina come un chaperone istonico che aiuta l’assemblaggio del nucleosoma. In primo luogo, è stata effettuata una cromatografia analitica di esclusione dimensionale per analizzare lo stato oligomerico e la stabilità degli chaperoni istonici. Successivamente, è stato eseguito un test pull-down per determinare le forze motrici e la natura competitiva delle interazioni istone chaperone-istone. Tuttavia, i parametri idrodinamici di queste interazioni non hanno potuto essere calcolati con precisione utilizzando la cromatografia analitica di esclusione dimensionale a causa della forma della proteina e dei suoi complessi che influenzano la loro migrazione attraverso la colonna. Pertanto, è stata utilizzata l’ultracentrifugazione analitica, che fornisce proprietà macromolecolari in soluzione che includono il peso molecolare accurato, la stechiometria di interazione e la forma delle molecole biologiche. Studi precedenti hanno ampiamente utilizzato il test di chaperoning degli istoni in vitro per caratterizzare funzionalmente gli chaperoni istonici come yScS116 17, DmACF18, ScRTT106p19, HsNPM120. Il saggio di chaperoning degli istoni è stato utilizzato anche per caratterizzare funzionalmente le proteine come chaperoni istoniche.

Protocol

1. Cromatografia analitica di esclusione dimensionale per chiarire lo stato oligomerico e la stabilità degli chaperoni istonici Analisi dello stato oligomerico degli chaperoni istoniciEquilibrare una colonna analitica di cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) da 24 mL con un volume (CV) di 1,2 colonne, cioè 28,8 mL di tampone SEC degassato [20 mM di Tris-HCl (pH 7,5), 300 di mM NaCl e 1 mM di β-mercaptoetanolo (β-ME)] a 4 °C (vedere Tabella dei materiali).<…

Representative Results

Il dominio nucleoplasmina N-terminale ricombinante della proteina FKBP53 da Arabidopsis thaliana è stato sottoposto a SEC analitico. Il volume di picco dell’eluizione è stato tracciato rispetto alla curva standard per identificare il suo stato oligomerico. I risultati analitici del SEC hanno rivelato che il dominio esiste come pentamero in soluzione, con una massa molecolare approssimativa di 58 kDa (Figura 1A,B). Inoltre, il dominio della nucleoplasmina è stato …

Discussion

Questo lavoro dimostra e convalida una serie completa di protocolli per la caratterizzazione biochimica e biofisica di un presunto chaperone istonico. Qui, le proteine della famiglia NAP espresse e purificate in modo ricombinante, AtNRP1 e AtNRP2, e il dominio nucleoplasmina N-terminale di AtFKBP53 sono stati utilizzati per dimostrare i protocolli. Lo stesso insieme di esperimenti potrebbe benissimo essere usato per delineare gli attributi funzionali di chaperoni istonici precedentemente non caratterizzati da qualsiasi o…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Le sovvenzioni extramurali a Dileep Vasudevan dal Science and Engineering Research Board, Government of India [CRG/2018/000695/PS] e dal Department of Biotechnology, Ministry of Science and Technology, Government of India [BT/INF/22/SP33046/2019], nonché il supporto intramurale dell’Institute of Life Sciences, Bhubaneswar sono ampiamente riconosciuti. Ringraziamo la signora Sudeshna Sen e la signora Annapurna Sahoo per il loro aiuto nella preparazione degli istoni. Sono state riconosciute anche le discussioni con i nostri colleghi Dr. Chinmayee Mohapatra, Mr. Manas Kumar Jagdev e Dr. Shaikh Nausad Hossain.

Materials

Acetic acid (glacial) Sigma A6283
Acrylamide MP Biomedicals 814326
Agarose MP Biomedicals 193983
AKTA Pure 25M FPLC Cytiva 29018226 Instrument for protein purification
Ammonium persulfate (APS) Sigma A3678
An-60Ti rotor Beckman Coulter 361964 Rotor for analytical ultracentrifugation
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7030
Chloroform Sigma C2432
Coomassie brilliant blue R 250 Sigma 1.15444
Dialysis tubing (7 kDa cut-off) Thermo Fisher 68700 For dialysing protein samples
Dithiothreitol (DTT) MP Biomedicals 100597
DNA Loading Dye New England Biolabs B7025S
EDTA disodium salt MP Biomedicals 194822
Electronic balance Shimadzu ATX224R
Ethanol Sigma E7023
Ethidium bromide (EtBr) Sigma E8751
Gel Doc System Bio-Rad 12009077 For imaging gels after staining
Horizontal gel electrophoresis apparatus Bio-Rad 1704405 Instrument for agarose gel electrophoresis
Hydrochloric acid (HCl) Sigma 320331
Imidazole MP Biomedicals 102033
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma M8266
Micropipettes Eppendorf Z683779 For pipetting of micro-volumes
Mini-PROTEAN electrophoresis system Bio-Rad 1658000 Instrument for SDS-PAGE
N,N-methylene-bis-acrylamide MP Biomedicals 800172
Nano drop Thermo Fisher ND-2000 For measurement of protein and DNA concentrations
Ni-NTA agarose Invitrogen R901-15 Resin beads for pull-down assay
Optima AUC analytical ultracentrifuge Beckman Coulter B86437 Instrument for analytical ultracentrifugation
pH Meter Mettler Toledo MT30130863
Phenol Sigma P4557
Plasmid isolation kit Qiagen 27104
Proteinase K Sigma-Aldrich 1.07393
pUC19 Thermo Fisher SD0061 Plasmid for supercoiling assay
Refrigerated high-speed centrifuge Thermo Fisher 75002402
SDS-PAGE protein marker Bio-Rad 1610317
SEDFIT Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis
SEDNTERP Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein
SigmaPrep Spin Columns Sigma SC1000 For pull-down assay
Sodium acetate Sigma S2889
Sodium chloride (NaCl) Merck S9888
Sodium dodecyl sulfate (SDS) MP Biomedicals 102918
Superdex 200 Increase 10/300 GL Cytiva 28990944 Column for analytical size-exclusion chromatography
Superdex 75 Increase 10/300 GL Cytiva 29148721 Column for analytical size-exclusion chromatography
TEMED Sigma 1.10732
Topoisomerase I Inspiralis WGT102 Enzyme used in plasmid supercoiling assay
Tris base Merck T1503
Tween-20 Sigma P1379
Urea MP Biomedicals 191450
Water bath Nüve NB 5 For heat treatment of protein samples
β-mercaptoethanol (β-ME) Sigma M6250

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Bobde, R. C., Saharan, K., Baral, S., Gandhi, S., Samal, A., Sundaram, R., Kumar, A., Singh, A. K., Datta, A., Vasudevan, D. In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays. J. Vis. Exp. (178), e63218, doi:10.3791/63218 (2021).

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