Summary

체외 분석, 풀다운 및 샤프롱 분석을 사용한 히스톤 샤페론의 특성 분석

Published: December 29, 2021
doi:

Summary

이 프로토콜은 히스톤 샤페론 올리고머화 및 안정성을 연구하기 위한 분석 크기 배제 크로마토그래피, 히스톤 샤페론-히스톤 상호작용을 밝히기 위한 풀다운 분석, 단백질 복합체의 화학량론을 분석하기 위한 AUC, 추정 히스톤 샤페론을 시험 관 내에서 기능적으로 특성화하기 위한 히스톤 샤페로닝 분석을 포함하는 일련의 방법을 설명합니다.

Abstract

히스톤 단백질은 DNA와 결합하여 진핵 염색질을 형성합니다. 염색질의 기본 단위는 DNA로 둘러싸인 핵심 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4의 두 사본으로 구성된 히스톤 옥타머로 구성된 뉴 클레오 솜입니다. 옥타머는 H2A/H2B 이량체의 두 사본과 H3/H4 사량체의 단일 사본으로 구성됩니다. 고도로 충전 된 코어 히스톤은 세포질 및 핵의 여러 단백질과 비특이적 상호 작용을하는 경향이 있습니다. 히스톤 샤페론은 다양한 종류의 단백질을 형성하여 히스톤을 세포질에서 핵으로 셔틀하고 DNA로의 침착을 도와 뉴 클레오 솜 조립 과정을 돕습니다. 일부 히스톤 샤페론은 H2A/H2B 또는 H3/H4에 특이적이며 일부는 둘 다에 대한 샤페론으로 기능합니다. 이 프로토콜은 풀다운 분석, 분석 크기 배제 크로마토그래피, 분석 초원심분리 및 히스톤 샤프롱 분석과 같은 시험관 내 실험실 기술을 함께 사용하여 주어진 단백질이 히스톤 샤페론으로 기능하는지 여부를 확인하는 방법을 설명합니다.

Introduction

DNA와 히스톤 단백질로 구성된 뉴 클레오 솜은 염색질의 구조 단위를 형성하고 몇 가지 중요한 세포 사건을 조절합니다. 뉴클레오솜은 복제, 전사 및 번역 1,2와 같은 다양한 프로세스에 DNA에 접근할 수 있도록 동적으로 재배치되고 리모델링됩니다. 매우 염기성인 히스톤은 세포 환경에서 산성 단백질과 상호 작용하거나 응집되는 경향이 있어 다양한세포 결함을 유발합니다3,4,5. 히스톤 샤페론이라고 하는 전용 단백질 그룹은 세포질에서 핵으로의 히스톤 수송을 돕고 비정상적인 히스톤-DNA응집 사건을 방지합니다6,7. 근본적으로, 대부분의 히스톤 샤페론은 생리적 이온 강도로 히스톤을 저장하고 DNA에 전달하여 뉴 클레오 솜 8,9의 형성을 돕습니다. 일부 히스톤 샤페론은 히스톤 올리고머 H2A/H2B 또는 H3/H410에 대해 확실한 선호도를 갖는다.

히스톤 샤페론은 DNA 합성11에 의존적이거나 독립적 인 뉴 클레오 솜을 조립하는 능력에 따라 특징 지어집니다. 예를 들어, 염색질 조립 인자 -1 (CAF-1)은 의존적 인 반면 히스톤 조절자 A (HIRA)는 DNA 합성12,13과 독립적입니다. 유사하게, 히스톤 샤페론의 뉴 클레오 플라스 민 패밀리는 정자 염색질 축합 및 뉴 클레오 솜 어셈블리14에 관여합니다. 뉴 클레오 솜 어셈블리 단백질 (NAP) 패밀리 구성원은 시험관 내에서 뉴 클레오 솜 유사 구조의 형성을 촉진하고 세포질과 핵15 사이의 히스톤 왕복에 관여합니다. 뉴클레오플라스민과 NAP 계열 단백질은 모두 기능성 히스톤 샤페론이지만 구조적 특징을 공유하지 않습니다. 본질적으로, 단백질을 히스톤 샤페론(16)으로 분류할 수 있는 단일 구조적 특징은 없다. 구조 연구와 함께 기능적 및 생물 물리학 적 분석의 사용은 히스톤 샤페론을 특성화하는 데 가장 효과적입니다.

이 연구는 단백질을 뉴 클레오 솜 조립을 돕는 히스톤 샤페론으로 특성화하는 생화학 적 및 생물 물리학 적 방법을 설명합니다. 먼저, 히스톤 샤페론의 올리고머 상태 및 안정성을 분석하기 위해 분석 크기 배제 크로마토 그래피를 수행하였다. 다음으로, 히스톤 샤페론-히스톤 상호작용의 원동력과 경쟁적 특성을 결정하기 위해 풀다운 분석을 수행하였다. 그러나 이러한 상호 작용의 유체역학적 파라미터는 단백질의 모양과 컬럼을 통한 이동에 영향을 미치는 복합체 때문에 분석 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 정확하게 계산할 수 없었습니다. 따라서 정확한 분자량, 상호 작용의 화학량론 및 생물학적 분자의 모양을 포함하는 용액 내 거대분자 특성을 제공하는 분석적 초원심분리가 사용되었습니다. 과거 연구는 yScS11617, DmACF 18, ScRTT106p19, HsNPM120과 같은 히스톤 샤페론을 기능적으로 특성화하기 위해 시험관 내 히스톤 샤페론 분석을 광범위하게 사용했습니다. 히스톤 샤페론 분석은 또한 단백질을 히스톤 샤페론으로 기능적으로 특성화하기 위해 사용되었습니다.

Protocol

1. 히스톤 샤페론의 올리고머 상태 및 안정성을 설명하기 위한 분석 크기 배제 크로마토그래피 히스톤 샤페론의 올리고머 상태 분석4°C에서 24mL 분석 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 컬럼을 1.2컬럼 부피(CV), 즉 28.8mL의 탈기된 SEC 완충액[20mM의 트리스-HCl(pH 7.5), 300mM NaCl 및 1mM의 β-메르캅토에탄올(β-ME)]과 평형화합니다( 재료 표 참조).참고: 컬럼 유형, 완충액 …

Representative Results

애기장대 탈리아나로부터의 단백질 FKBP53의 재조합 N-말단 뉴클레오플라스민 도메인을 SEC에 분석하였다. 용리 피크 부피는 표준 곡선에 대해 플롯팅되어 올리고머 상태를 식별했습니다. 분석 SEC 결과는 도메인이 용액에서 펜타머로 존재하며 대략 분자량이 58kDa임을 보여주었습니다(그림 1A,B). 또한, 뉴클레오플라스민 도메인은 분석 SEC와 함께 열적 및 화?…

Discussion

이 작업은 추정되는 히스톤 샤페론의 생화학적 및 생물물리학적 특성화를 위한 포괄적인 프로토콜 세트를 보여주고 검증합니다. 본원에서, 재조합 발현 및 정제된 NAP 패밀리 단백질, AtNRP1 및 AtNRP2, 및 AtFKBP53의 N-말단 뉴클레오플라스민 도메인을 사용하여 프로토콜을 입증하였다. 동일한 실험 세트가 이전에 특성화되지 않은 히스톤 샤페론의 기능적 특성을 모든 유기체에서 설명하는 데 매우 잘 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

인도 정부 과학 및 공학 연구 위원회[CRG/2018/000695/PS]와 인도 정부 과학기술부 생명공학부[BT/INF/22/SP33046/2019]의 Dileep Vasudevan에 대한 교외 보조금과 부바네스와르 생명 과학 연구소의 교내 지원은 크게 인정받고 있습니다. 히스톤 준비에 도움을 주신 Sudeshna Sen 씨와 Annapurna Sahoo 씨에게 감사드립니다. 동료 Chinmayee Mohapatra 박사, Manas Kumar Jagdev 및 Shaikh Nausad Hossain 박사와의 토론도 인정됩니다.

Materials

Acetic acid (glacial) Sigma A6283
Acrylamide MP Biomedicals 814326
Agarose MP Biomedicals 193983
AKTA Pure 25M FPLC Cytiva 29018226 Instrument for protein purification
Ammonium persulfate (APS) Sigma A3678
An-60Ti rotor Beckman Coulter 361964 Rotor for analytical ultracentrifugation
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7030
Chloroform Sigma C2432
Coomassie brilliant blue R 250 Sigma 1.15444
Dialysis tubing (7 kDa cut-off) Thermo Fisher 68700 For dialysing protein samples
Dithiothreitol (DTT) MP Biomedicals 100597
DNA Loading Dye New England Biolabs B7025S
EDTA disodium salt MP Biomedicals 194822
Electronic balance Shimadzu ATX224R
Ethanol Sigma E7023
Ethidium bromide (EtBr) Sigma E8751
Gel Doc System Bio-Rad 12009077 For imaging gels after staining
Horizontal gel electrophoresis apparatus Bio-Rad 1704405 Instrument for agarose gel electrophoresis
Hydrochloric acid (HCl) Sigma 320331
Imidazole MP Biomedicals 102033
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma M8266
Micropipettes Eppendorf Z683779 For pipetting of micro-volumes
Mini-PROTEAN electrophoresis system Bio-Rad 1658000 Instrument for SDS-PAGE
N,N-methylene-bis-acrylamide MP Biomedicals 800172
Nano drop Thermo Fisher ND-2000 For measurement of protein and DNA concentrations
Ni-NTA agarose Invitrogen R901-15 Resin beads for pull-down assay
Optima AUC analytical ultracentrifuge Beckman Coulter B86437 Instrument for analytical ultracentrifugation
pH Meter Mettler Toledo MT30130863
Phenol Sigma P4557
Plasmid isolation kit Qiagen 27104
Proteinase K Sigma-Aldrich 1.07393
pUC19 Thermo Fisher SD0061 Plasmid for supercoiling assay
Refrigerated high-speed centrifuge Thermo Fisher 75002402
SDS-PAGE protein marker Bio-Rad 1610317
SEDFIT Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis
SEDNTERP Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein
SigmaPrep Spin Columns Sigma SC1000 For pull-down assay
Sodium acetate Sigma S2889
Sodium chloride (NaCl) Merck S9888
Sodium dodecyl sulfate (SDS) MP Biomedicals 102918
Superdex 200 Increase 10/300 GL Cytiva 28990944 Column for analytical size-exclusion chromatography
Superdex 75 Increase 10/300 GL Cytiva 29148721 Column for analytical size-exclusion chromatography
TEMED Sigma 1.10732
Topoisomerase I Inspiralis WGT102 Enzyme used in plasmid supercoiling assay
Tris base Merck T1503
Tween-20 Sigma P1379
Urea MP Biomedicals 191450
Water bath Nüve NB 5 For heat treatment of protein samples
β-mercaptoethanol (β-ME) Sigma M6250

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Bobde, R. C., Saharan, K., Baral, S., Gandhi, S., Samal, A., Sundaram, R., Kumar, A., Singh, A. K., Datta, A., Vasudevan, D. In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays. J. Vis. Exp. (178), e63218, doi:10.3791/63218 (2021).

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