Summary
Adgang til decentraliseret, billig og højkapacitetsdiagnostik, der kan implementeres i samfundet til decentraliseret test, er afgørende for at bekæmpe globale sundhedskriser. Dette manuskript beskriver, hvordan man opbygger papirbaseret diagnostik til virale RNA-sekvenser, der kan detekteres med en bærbar optisk læser.
Abstract
Adgang til molekylær diagnostik med lav byrde, der kan anvendes i samfundet til testning, bliver stadig vigtigere og har meningsfulde bredere konsekvenser for samfundets trivsel og økonomisk stabilitet. I de senere år er der opstået flere nye isotermiske diagnostiske modaliteter for at imødekomme behovet for hurtig, billig molekylær diagnostik. Vi har bidraget til denne indsats gennem udvikling og patientvalidering af tåholdskontaktbaseret diagnostik, herunder diagnostik for myggebårne Zika- og chikungunya-vira, som gav ydeevne, der kan sammenlignes med guldstandard reverse transkription-kvantitativ polymerasekædereaktion (RT-qPCR) baserede assays. Disse diagnoser er billige at udvikle og fremstille, og de har potentialet til at levere diagnostisk kapacitet til miljøer med lav ressource. Her giver protokollen alle de trin, der er nødvendige for udviklingen af et switch-baseret assay til påvisning af Zika-virus. Artiklen tager læserne gennem den trinvise diagnostiske udviklingsproces. For det første tjener genomiske sekvenser af Zika-virus som input til beregningsdesign af kandidatkontakter ved hjælp af open source-software. Dernæst vises samlingen af sensorerne til empirisk screening med syntetiske RNA-sekvenser og optimering af diagnostisk følsomhed. Når valideringen er færdig, udføres valideringen med patientprøver parallelt med RT-qPCR og en specialbygget optisk læser, PLUM. Dette arbejde giver en teknisk køreplan for forskere til udvikling af billige toehold switch-baserede sensorer til applikationer inden for menneskers sundhed, landbrug og miljøovervågning.
Introduction
RT-qPCR er forblevet guldstandardteknologien til klinisk diagnostik på grund af dens fremragende følsomhed og specificitet. Selvom metoden er meget robust, afhænger den af dyrt, specialiseret udstyr og reagenser, der kræver temperaturstyret distribution og opbevaring. Dette udgør betydelige hindringer for tilgængeligheden af kvalitetsdiagnostik globalt, især i tider med sygdomsudbrud og i regioner, hvor adgangen til veludstyrede laboratorier er begrænset 1,2. Dette blev observeret under udbruddet af zikavirus i Brasilien i 2015/2016. Med kun fem centraliserede laboratorier til rådighed til at levere RT-qPCR-test resulterede betydelige flaskehalse, hvilket begrænsede adgangen til diagnostik. Dette var især udfordrende for personer i bynære omgivelser, som blev hårdere ramt af udbruddet 3,4. I et forsøg på at forbedre adgangen til diagnostik viser protokollen en platform, der er udviklet med potentiale til at levere decentraliseret, billig og høj kapacitetsdiagnostik i indstillinger med lav ressource. Som en del af dette blev der etableret en diagnostisk opdagelsesrørledning, der koblede isotermisk amplifikation og syntetiske RNA-switchbaserede sensorer med papirbaserede cellefrie ekspressionssystemer 5,6.
Cellefri proteinsyntese (CFPS) systemer, især E. coli-baserede cellefrie systemer, er en attraktiv platform for en bred vifte af biosensing applikationer fra miljøovervågning 7,8 til patogendiagnostik 5,6,9,10,11,12 . CFPS-systemer omfatter de komponenter, der er nødvendige for transkription og oversættelse, og har betydelige fordele i forhold til helcellebiosensorer. Specifikt er sensing ikke begrænset af en cellevæg, og generelt er de modulære i design, biosikre, billige og kan frysetørres til bærbar brug. Evnen til at frysetørre genkredsløbsbaserede reaktioner på substrater som papir eller tekstiler muliggør transport, langtidsopbevaring ved stuetemperatur5 og endda inkorporering i bærbar teknologi13.
Tidligere arbejde har vist, at E. coli-cellefrie systemer kan bruges til at detektere adskillige analytter, for eksempel giftige metaller såsom kviksølv, antibiotika såsom tetracyclin7,14, hormonforstyrrende kemikalier15,16, biomarkører såsom hippursyre 17, patogenassocierede quorum sensing molekyler 9,18 og ulovlige stoffer såsom kokain 17 og gammahydroxybutyrat (GHB)19 . Til sekvensspecifik påvisning af nukleinsyrer har strategier for det meste været afhængige af brugen af switchbaserede biosensorer koblet til isotermiske forstærkningsteknikker. Toehold-switche er syntetiske riboregulatorer (også kaldet simpelthen 'switches' i resten af teksten), der indeholder en hårnålestruktur, der blokerer downstream-oversættelse ved at binde det ribosomale bindingssted (RBS) og startkodonen. Ved interaktion med deres måludløser-RNA lettes hårnålestrukturen, og efterfølgende oversættelse af en reporter åben læseramme aktiveres20.
Isotermisk forstærkning kan også anvendes som molekylær diagnostik21; disse metoder er imidlertid tilbøjelige til uspecifik forstærkning, hvilket kan reducere testens specificitet og dermed nøjagtighed til under RT-qPCR 22. I det arbejde, der er rapporteret her, blev isotermisk forstærkning opstrøms for de switchbaserede sensorer brugt til at tilvejebringe kombineret signalforstærkning, der muliggør klinisk relevant påvisning af nukleinsyrer (femtomolar til attomolær ). Denne parring af de to metoder giver også to sekvensspecifikke kontrolpunkter, der i kombination giver et højt niveau af specificitet. Ved hjælp af denne tilgang har tidligere arbejde vist påvisning af vira som Zika6, Ebola5, Norovirus10 samt patogene bakterier som C. difficile23 og antibiotikaresistent Tyfus12. Senest er cellefrie tåholdsafbrydere blevet demonstreret til SARS-CoV-2-detektion i bestræbelserne på at give tilgængelig diagnostik til COVID-19-pandemien11,12,13.
Følgende protokol skitserer udviklingen og valideringen af cellefri, papirbaseret syntetisk tåholdskontaktassay til påvisning af Zika-virus, fra in silico biosensordesign gennem monterings- og optimeringstrin til feltvalidering med patientprøver. Protokollen begynder med in silico-design af RNA-tåholdskontaktbaserede sensorer og isotermiske amplifikationsprimere, der er specifikke for Zika-viralt RNA. Selvom der findes adskillige isotermiske amplifikationsmetoder, blev der her demonstreret anvendelse af nukleinsyresekvensbaseret amplifikation (NASBA) for at øge koncentrationen af viralt RNA-mål, der var til stede i reaktionen, hvilket muliggjorde klinisk signifikant følsomhed. Praktisk set har isotermiske forstærkningsmetoder fordelen ved at fungere ved en konstant temperatur, hvilket eliminerer behovet for specialudstyr, såsom termiske cyklister, som generelt er begrænset til centraliserede steder.
Dernæst beskrives processen med at samle de syntetiske tåholdskontaktsensorer med reporterkodningssekvenser gennem overlapningsforlængelse PCR og screening af de syntetiske tåholdskontaktsensorer for optimal ydeevne i cellefrie systemer ved hjælp af syntetisk RNA. Til dette sæt Zika-virussensorer har vi valgt lacZ-genet , der koder for β-galactosidase-enzymet, som er i stand til at spalte et kolorimetrisk substrat, chlorphenolrød-β-D-galactopyranosid (CPRG), for at producere en gul til lilla farveændring, der kan detekteres af øjet eller med en pladelæser. Når de mest effektive syntetiske switche er identificeret, beskrives processen til screening af primere for nukleinsyresekvensbaseret isotermisk amplifikation af den tilsvarende målsekvens ved hjælp af syntetisk RNA for at finde sæt, der giver den bedste følsomhed.
Endelig valideres diagnoseplatformens ydeevne på stedet i Latinamerika (figur 1). For at bestemme den kliniske diagnostiske nøjagtighed udføres det papirbaserede cellefrie assay ved hjælp af Zika-virusprøver fra patienter; parallelt udføres et guldstandard RT-qPCR-assay til sammenligning. For at overvåge kolorimetriske cellefrie assays muliggør vi kvantificering på stedet af resultater i regioner, hvor termiske cyklister ikke er tilgængelige. Den håndsamlede pladelæser kaldet Portable, Low-Cost, User-friendly, Multimodal (PLUM; i det følgende benævnt bærbar pladelæser) introduceres også her24. Oprindeligt udviklet som en ledsagende enhed til cellefri syntetisk tåholdskontaktdiagnostik, tilbyder den bærbare pladelæser en tilgængelig måde at inkubere og læse resultater på en måde med høj kapacitet, hvilket giver integreret, computervisionsbaseret softwareanalyse til brugerne.
Figur 1: Arbejdsgang for test af patientprøver ved hjælp af papirbaserede cellefrie tåholdskontaktreaktioner. Klik her for at se en større version af denne figur.
Protocol
Alle procedurer, der involverer menneskelige deltagere, skal udføres i overensstemmelse med etiske standarder og relevante retningslinjer, herunder de etiske principper for medicinsk forskning, der involverer mennesker, der er fastlagt i Verdenslægesammenslutningens Helsingforserklæring. Denne undersøgelse blev godkendt af human research ethics committee under licensprotokolnummer CAAE: 80247417.4.0000.5190. Informeret samtykke fra alle patienter, der indgik i denne undersøgelse, blev frafaldet af Fiocruz-PE Institutional Review Board (IRB) for diagnostiske prøver.
BEMÆRK: PLUM-enheden vil i det følgende blive omtalt som en 'bærbar pladelæser'.
1. Beregningsdesign af nukleinsyresekvensbaserede amplifikationsprimere
- Scan Zika-genomet for at identificere et sæt kandidatregioner til forstærkning, der er ca. 200 nukleotider (nt) til 300 nt i længden ved at sætte den genomiske sekvens i NCBI / Nucleotide BLAST25,26. Sammenlign genomet med reference-RNA-sekvenser (refseq_rna), og søg efter steder, der forbliver stærkt bevarede og ikke har homologi med det humane genom (andre BLAST-parametre forbliver uændrede). Vælg mindst to steder for at designe den syntetiske tåholdskontakt.
- Brug udvælgelseskriterierne for Deiman et al.27 til at generere par af fremadgående og omvendt nukleinsyresekvensbaserede amplifikationsprimere for hver kandidatforstærkningsregion. Kort sagt, følg disse kriterier for design af primere: (1) GC-indhold mellem 40% -60%; 2) 20-24 nt med en smeltetemperatur på over 41 °C 3) ingen kørsler af fire eller flere identiske nukleotider (4) det endelige 3' nukleotid er en A-base; (5) lav primer sekundær struktur og dimer dannelse sandsynlighed. Skærm 8-10 primerpar for hver målregion (anbefales).
- Præfikssekvensen indeholdende T7-promotorsekvensen AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG (T7-promotorsekvens understreget) tilsættes 5' enden af de forreste primere for at muliggøre transkription af ampliconerne under anvendelse af T7 RNA-polymerase (RNAP). Bestil primerne som DNA-oligoer fra et DNA-syntesefirma.
2. Beregningsdesign af tåholdskontakter
- Installer NUPACK28 version 3.2 (nukleinsyre design suite) baseret på instruktionerne på hjemmesiden29. Brug et UNIX-operativsystem og MATLAB (numerisk computerplatform) som programmeringssprog (anbefales).
- Identificer målsekvenserne (f.eks. viralt genom), der er specifikke for patogenet af interesse for tåholdskontaktdesignet som i trin 1.1. Vælg Zika-målsekvenserne fra de nukleinsyresekvensbaserede ampliconer, der genereres i trin 1.2.
BEMÆRK: I praksis kan enten de nukleinsyresekvensbaserede amplifikationsprimere eller de syntetiske tåholdskontakter designes og testes først afhængigt af brugernes behov. Hvis der allerede er fastlagt særlige målregioner af interesse (f.eks. fra eksisterende publikationer eller diagnostiske protokoller), kan toehold switch design og screening forekomme først, efterfulgt af design og screening for nukleinsyresekvensbaserede amplifikationsprimere. Hvis der ikke er nogen etablerede målregioner, skal du først screene nukleinsyresekvensbaserede amplifikationsprimere mod det fulde genom for at indsnævre de valgte mål, mens du vælger primerforstærkningseffektivitet. Hvis flere sekvenser for patogenet er tilgængelige, er det bedst at designe nukleinsyresekvensbaserede amplifikationsprimere, der fokuserer på stærkt bevarede regioner (snarere end at screene hele genomet). - Download og installer den nødvendige MATLAB-software på computeren.
- Konfigurer miljøvariablerne, så nukleinsyredesignsuitefunktionerne kan kaldes i softwaren. For at gøre dette skal du åbne softwaren og derefter åbne (eller oprette) en startup.m-fil i standardarbejdsmappen. Kopier derefter følgende kodelinjer til startup.m-filen, og til sidst skal du tilføje mappen, der indeholder nukleinsyredesignpakkens binære filer til PATH:
NUPACKINSTALL = '/Brugere/[user_name]/.../nupack3.2.2';
setenv(»NUPACKINSTALL«,NUPACKINSTALL);
setenv('PATH',[getenv('PATH'),sprintf(':%s/build/bin',NUPACKINSTALL)]); - Åbn den numeriske computerplatformssoftware, og naviger til designsoftwaremappen. Kør de designalgoritmer, der er tilgængelige på https://github.com/AlexGreenLab/TSGEN.
- Indtast målsekvenserne i design_input_file.csv placeret i inputundermappen. Inputtene omfatter Navn, Ydre sekvens, Indre sekvens, Temperatur, Outputnavn og Outputsekvens som defineret i tabel 1. Hvis der endnu ikke er fastlagt nogen grundingssteder for målet, skal du holde indre og ydre sekvenser de samme. Kun de første 29 nt af reporteren vil blive overvejet under designprocessen. Når du er færdig, skal du gemme og lukke det opdaterede regneark.
BEMÆRK: Outputsekvensen er sekvensen af det reporterprotein, der er planlagt til at blive brugt til analysen (f.eks. lacZ). Angivelse af de indre og ydre sekvenser sikrer, at algoritmen ikke genererer syntetiske tåholdskontakter, der overlapper nogen af primerne. Det sikrer også, at analysen genkender tre unikke steder i Zika-genomet for at forbedre dets specificitet. - Vælg de parametre, der skal bruges til designfunktionen: toehold_switch_design_run(num_designs,input_file, indstillinger). Udfyld parameterværdierne som:
- num_designs - antallet af topdesign for hvert måloutput fra softwaren. Standarden er 6 og kan ændres efter behov (mindst seks designs for hvert mål anbefales).
- input_file - denne parameter angiver navnet på den fil, der indeholder inputsekvensoplysningerne. Standardværdien er 'design_input_file.csv' og kan ændres efter behov.
- Vælg mellem følgende muligheder - (1) SeriesA og SeriesB: den eller de versioner af toehold-switchen, som koden genererer. Indstil SeriesB til 1 og SeriesA til 0 for at generere serie B toehold switch, som er det format, der anvendes i Zika-virusdiagnostik6; (2) Parallel: indstillet til 1 for at udnytte flere kerner til at beregne designene; ellers indstillet til 0; (3) Antisense: indstillet til 1 for at generere toehold-switche, der hybridiserer antisense-sekvensen (dvs. det omvendte supplement) af målinputtet; Ellers skal du indstille til 0.
- Kør designfunktionen ved hjælp af de valgte parametre: toehold_switch_design_run(num_designs,input_file,options). Algoritmen begynder derefter at generere toehold-switch-designene til de relevante mål.
- Når designet er afsluttet, skal du finde designsekvenserne for den øverste tåholdskontakt og de tilsvarende målsekvenser i mappen final_designs i form af regneark i .csv format. Toehold switch DNA-sekvenserne genereret af algoritmen vil indeholde T7-promotorsekvensen i 5'-enden og den konserverede 21 nt linker-sekvens AACCTGGCGGCAGCGCAAAAG i 3'-enden.
- Screen de resulterende top toehold switch design sekvenser mod andre almindelige vira ved at sætte dem på NCBI-BLAST og kontrollere for sekvens homologi. Accepter sekvenser med 40% homologi eller mindre.
- Bestil tåholdskontaktens hårnålesekvenser som DNA-oligoer, og saml dem senere med reportergenet til fuldt funktionelle kontakter. Bestil de nødvendige PCR-primere til efterfølgende sensormontering afhængigt af det valgte reporterprotein.
| Parameter | Definition |
| Navn | De ønskede navne på output toehold switch sekvenser. |
| Ydre sekvens | Fuld NASBA-udskrift produceret fra forstærkning. |
| Indre sekvens | Den ydre sekvens eksklusive primerbindingsstederne. Det matcher den ydre sekvens, men udelukker de dele af transkripterne, der binder til de fremadgående og omvendte primere. |
| Temperatur | Den temperatur, som algoritmerne bruger til at beregne RNA-strukturerne. |
| Output navn | Navnet på outputgenet (f.eks. lacZ, gfp). |
| Output sekvens | Sekvensen af outputgenet. |
Tabel 1: Definitionen af hver parameter, der anvendes i toehold switchdesign-softwaren.
3. Konstruktion af tåholdsafbrydere ved hjælp af PCR
BEMÆRK: Disse trin beskriver konstruktionen af LacZ tåholdsafbrydere ved hjælp af overlappende udvidelse PCR. Her bruges DNA-oligoen som en fremadgående primer, og T7-terminatoren bruges som en omvendt primer. Vi bruger pCOLADuet-LacZ-plasmidet som skabelon for lacZ-genet (addgene: 75006). Alle andre DNA-skabeloner, der indeholder den tilsvarende sekvens, kan bruges som skabeloner, forudsat at T7-terminatoren er inkluderet i den endelige konstruktion.
- Når syntetiske DNA-oligoer er modtaget fra den kommercielle leverandør, skal du forberede opløsninger af det syntetiske DNA og omvendt amplifikationsprimer i en koncentration på 10 μM i nukleasefrit vand. Saml reaktioner i PCR-rør på is i henhold til tabel 2.
BEMÆRK: PCR-volumener kan skaleres efter behov. Brug en minimal mængde (0,1-1 ng) pCOLADuet-LacZ DNA-skabelon for at undgå behovet for et yderligere plasmidfjernelsestrin eller baggrunds LacZ-signal. For højere DNA-skabelonmængder skal du følge PCR med en DpnI-restriktionsenzymfordøjelse for at fjerne den resterende plasmidskabelon. - Reaktionerne anbringes i en termisk cyklist i overensstemmelse med de cykelforhold, der er anført i tabel 3. Analyser PCR-produkterne på en agarosegel (figur 2; se supplerende protokol og30).
- Rens PCR-produkterne ved hjælp af et spin-kolonnebaseret PCR-rensningssæt og eluer DNA'et i 15-30 μL nukleasefrit vand i henhold til producentens anvisninger. Dna'et kvantificeres ved hjælp af et spektrofotometer.
| Komponent | Lydstyrke | Koncentration |
| 5X Q5 reaktionsbuffer | 10 μL | 1x |
| 10 mM dNTP'er | 1 μL | 200 μM |
| 10 mM fremadgående primer (syntetisk switch DNA FW) | 2,5 μL | 0,5 μM |
| 10 mM omvendt primer (T7 terminator RV) | 2,5 μL | 0,5 μM |
| Skabelon-DNA (pCOLADuet-LacZ) | variabel | <1 ng |
| Q5 DNA-polymerase med høj kvalitet | 0,5 μL | 0,02 U/μL |
| Nukleasefrit vand | til 50 μL | - |
Tabel 2: De PCR-komponenter, der anvendes til at konstruere tåholdsafbrydere.
| Skridt | Temperatur | Tidspunkt | |
| Indledende denaturering | 98 °C | 30 s | |
| 35 cyklusser | Denaturering | 98 °C | 10 sek. |
| Udglødning | 60 °C | 20 sek. | |
| Forlængelse | 72 °C | 1.45 minutter | |
| Endelig forlængelse | 72 °C | 5 minutter | |
| Holde | 4 °C | - | |
Tabel 3: Cykelforhold, der anvendes under konstruktion af tåholdskontakter ved PCR.
4. Forberedelse af syntetisk RNA-mål (Trigger)
- Ved hjælp af en molekylærbiologisk designsoftware skal du ændre de syntetiske trigger-RNA-skabeloner (valgt i trin 1.1) til at omfatte en opstrøms T7-promotorsekvens, hvilket sikrer, at den fulde skabelon forbliver kort (<200 bp). Design fremadgående og omvendte primere for at forstærke udløsersekvensprimeren (for oligosekvenser se supplerende protokol).
- Bestil sekvenserne som DNA-oligoer. Når det er modtaget, rekonstitueres det syntetiske trigger-DNA og amplifikationsprimere til 10 μM i nukleasefrit vand. De tilsvarende PCR'er samles i tyndvæggede rør på is i henhold til tabel 2 , og brug 0,5 μL af udløser-DNA-ultrameren (endelig koncentration på 0,1 μM) som skabelon-DNA.
- Placer reaktionerne i en termisk cyklist, og brug de cykelforhold, der er anført i tabel 3. Brug en forlængelsestid på 15 s. Vurder kvaliteten og rens udløsende PCR-produkter som beskrevet i trin 3.3 og supplerende protokol.
BEMÆRK: For at fremskynde processen kan kolonnerensede trigger-PCR-produkter også bruges direkte til indledende toehold-switch-screening.
5. In vitro transkription af udvalgte triggersekvenser
- Reaktionskomponenter samles på is i henhold til tabel 4.
- Inkubere in vitro-transkriptionsreaktioner (IVT) ved 37 °C i 4 timer efterfulgt af DNase I-behandling for at fjerne skabelon-DNA'et. Til DNase I-trinnet tilsættes 70 μL nukleasefrit vand, 10 μL 10x DNase I Buffer og 2 μL DNase I (RNase-fri) og inkuberes ved 37 °C i 15 min. Hvis du ikke fortsætter til trin 5.4 med det samme, skal du inaktivere DNase I med tilsætning af 50 mM EDTA og varmeinaktivering ved 65 °C i 10 min.
- Valgfrit trin: Udfør denaturering af polyacrylamid gelelektroforese (f.eks. urinstof-PAGE) analyse på IVT-produkterne for at vurdere RNA-kvaliteten som beskrevet i den supplerende protokol.
- Rens de udløsende IVT-produkter ved hjælp af et kolonnebaseret RNA-oprydningssæt i henhold til producentens anvisninger, og kvantificer derefter RNA-koncentrationen og renheden ved hjælp af spektrofotometri. Se supplerende protokol for instruktioner om, hvordan man bestemmer molariteten og kopinummeret / μL af RNA'et.
| Komponent | Lydstyrke | Koncentration |
| 10X reaktionsbuffer | 1,5 μL | 0,75x |
| 25 mM NTP-blanding | 6 μL | 7,5 mio. |
| Skabelonudløser-DNA | X μL | 1 μg |
| T7 RNA-polymeraseblanding | 1,5 μL | - |
| Nukleasefrit vand | X μL | Til 20 μL |
Tabel 4: In vitro transkription (IVT) af udvalgte triggersekvenser.
6. Indledende screening af kontakterne
BEMÆRK: Dette afsnit beskriver de trin, der er forbundet med opsætning af cellefrie, papirbaserede tåholdskontaktreaktioner, og hvordan man screener for højtydende tåholdskontakter. Det BSA-blokerede filterpapir, der anvendes i trin 6.10, skal udarbejdes på forhånd som beskrevet i tillægsprotokollen.
- Forbered en CPRG-stamopløsning ved at opløse 25 mg pulveret i 1 ml nukleasefrit vand. Opløsningen opbevares altid på is, og opbevares ved -20 °C til langvarig brug.
- Bestem antallet af reaktioner, der skal konfigureres. For hver tåholdskontakt, der vurderes, skal du inkludere en ingen skabelonkontrol (ingen switch og ingen mål-RNA - ellers kendt som cellefri alene-kontrol) for at tage højde for ethvert baggrundssignal, der måtte opstå fra mastermixet. Medtag kun en switch-kontrol for at vurdere for baggrundskontaktens lækage eller OFF-hastighed i fravær af mål-RNA.
- Der samles en cellefri reaktionsmasterblanding af opløsning A, opløsning B, RNase-hæmmer og CPRG på is i overensstemmelse med standardprotokollen i tabel 5.
BEMÆRK: De trin, der er beskrevet her, er for en masterblanding, der vil være tilstrækkelig til et tredobbelt sæt af 1,8 μL reaktioner med tilsat 10% volumen for at tage højde for pipetteringsfejl. Master mix-lydstyrken skal justeres efter behov afhængigt af antallet af skærmede tåholdskontakter. - For hver tredobbelt cellefri reaktion skal du dispensere masterblandingen i et PCR-rør og holde alle rørene på is. For røret, der er afsat som cellefri alene-kontrol, tilsættes nukleasefrit vand til et slutvolumen på 5,84 μL, blandes ved at pipettere op og ned og centrifugeres kort. For resten af rørene tilsættes PCR-renset tåholdskontakt-DNA til en endelig koncentration på 33 nM.
- For rør, der er afsat som switch alene-kontroller, tilsættes nukleasefrit vand til et slutvolumen på 5,84 μL. For rør, der er afsat til at teste tåholdskontakten og mål-RNA-kombinationen, tilsættes in vitro-transskriberet mål-RNA til en endelig koncentration på 1 μM. Derefter tilsættes nukleasefrit vand til et slutvolumen på 5,84 μL. Bland alle reaktioner grundigt ved at pipettere op og ned, og centrifuge kort.
- Tilsæt 30 μL nukleasefrit vand til brøndene omkring reaktionsbrøndene på en 384-brønds sort, klarbundet plade. Dette minimerer fordampning i løbet af eksperimentet og forbedrer reproducerbarheden.
BEMÆRK: Hvis du bruger den bærbare pladelæserenhed, skal du placere en PCR-folie over pladen og bruge en præcisionskniv til at skære brøndene beregnet til din reaktion samt hver af de fire hjørnebrønde ud. PCR-folien forhindrer den bærbare pladelæserkamera overeksponering fra tomme brønde. - Ved hjælp af en 2 mm biopsistans og pincet skæres BSA-blokerede filterpapirskiver og placeres i reaktionsbrøndene enten ved at skubbe stansen ud eller ved hjælp af pincet (se Supplerende protokol til fremstilling af BSA-blokeret filterpapir). Dispenser tre gange 1,8 μL volumener fra hvert reaktionsrør på filterpapirskiverne i 384-brøndspladen, og hold alle prøverne såvel som 384-brøndspladen på is til enhver tid.
BEMÆRK: Hvis du bruger den bærbare pladelæserenhed, skal du tilføje 1,8 μL CPRG (0,6 mg / ml) til hvert af de fire hjørner af 384-brøndpladen. Den gule farve fra CPRG giver mønstergenkendelse til den bærbare pladelæser til justering af den digitale multiwell-pladeskabelon i billedanalyse. Dæk pladens brønde med PCR-film for at forhindre fordampning. - Placer pladen i en pladelæser, læs OD570 ved 37 °C hvert minut i 130 min.
| Komponent | Lydstyrke | Endelig koncentration pr. reaktion |
| Løsning A | 2,38 μL | 40% |
| Løsning B | 1,78 μL | 30% |
| RNase hæmmer | 0,03 μL | 0,5% v/v |
| HLRG (25 mg/ml) | 0,14 μL | 0,6 mg/ml |
| Toehold Switch | X μL | 33 nM |
| Mål RNA | X μL | 1 μM |
| Nukleasefrit vand | til 5,94 μL | - |
| Samlet volumen: | 5,94 μL | |
Tabel 5: PURExpress cellefri transkription-translation reaktionskomponenter.
7. Identifikation af højtydende tåholdskontakter
BEMÆRK: Dette afsnit beskriver, hvordan du analyserer data fra trin 6 for at vælge de bedst ydende tåholdskontakter, du kan gå videre med.
- Begynd dataanalyse ved først at normalisere til baggrunden OD570 absorbans. For at gøre dette skal du trække OD 570-målingerne af reaktioner, der ikke har nogen switch eller mål-RNA (dvs. cellefrie alenebrønde) fra de andre OD570-målinger.
- Udjævn de normaliserede data ved hjælp af et trepunkts glidende gennemsnit, og juster minimumsværdien for hver brønd til nul. Se figur 3 for et eksempel på normaliserede tidsforløbsdata indsamlet for tåholdskontakterne 27B, 33B og 47B.
- Ved hjælp af disse behandlede data beregnes foldændringen (eller ON / OFF-forholdet) ved at bestemme forskellen i farveændringshastigheden (dvs. ændring i OD570 over tid) mellem tåholdskontakten og mål- og switchbrøndene alene (se supplerende protokol til beregning af forholdet; Figur 4).
- Vælg kontakter med den højeste ON/OFF foldeændring for yderligere karakterisering. Udelad de dårligt ydende tåholdskontakter, der viser den laveste foldændring.
8. Nukleinsyresekvensbaseret amplifikationsprimerscreening og følsomhed
BEMÆRK: I de følgende trin udføres først en skærm for funktionelle isotermiske amplifikationsprimere, og derefter vurderes deres følsomhed ved at bestemme antallet af mål-RNA-kopier pr. μL syntetisk RNA, som en given tåholdskontakt pålideligt kan detektere, når den kombineres med isotermisk amplifikation. Efter isotermisk amplifikation udføres cellefrie reaktioner for at identificere vellykkede nukleinsyresekvensbaserede amplifikationsprimersæt. Det kan dog være mere omkostningseffektivt at køre polyacrylamid eller agarosegeler på nukleinsyresekvensbaserede amplifikationsreaktioner for først at indsnævre puljen af kandidatprimersæt. I så fald kan nukleinsyresekvensbaserede amplifikationsprimersæt, der genererer et bånd på gelen ved den passende ampliconstørrelse, shortlistes til efterfølgende cellefri screening.
- Lav en 25 μM lageropløsning af alle fremadgående og omvendte primersæt i nukleasefrit vand (se supplerende protokol). Bestem antallet af nukleinsyresekvensbaserede amplifikationsreaktioner og efterfølgende cellefrie reaktioner, der skal oprettes. Dette afhænger af antallet af tåholdskontakter og respektive primersæt.
BEMÆRK: Når du screener primerne, er det vigtigt altid at inkludere en ingen skabelonkontrol for hvert primersæt for at tage højde for eventuelle baggrundsartefakter, der kan opstå på grund af primerassocieret uspecifik forstærkning. - Indstil en 5 μL reaktion som følger (skaler dette efter behov). Tø alle reagenser op på is. Der samles en reaktionsmasterblanding af reaktionsbufferen, nukleotidblandingen og RNase-hæmmeren i henhold til tabel 6. Bland grundigt ved at pipettere op og ned, indtil det hvide bundfald er opløst, og dispenser derefter alikvoter i PCR-rør.
- Hvis masterblandingen er til screening af nukleinsyresekvensbaserede amplifikationsprimere, skal primerne først udelukkes fra masterblandingen (dispenser 2,55 μL mastermix). Ellers kan primerne medtages i masterblandingen, hvis der udføres primerfølsomhedsanalyse (i hvilket tilfælde dispensere 2,75 μL aliquots). Tilsæt enzymblandingen efter denaturerings- og ækvilibreringstrinnene.
- Hvis screening nukleinsyre sekvens-baserede amplifikation primere, tilsættes fremad og omvendt primere til de relevante rør. På en termisk cyklist skal inkubationsprotokollen opstilles som beskrevet i tabel 7.
- Tilsæt 1 μL enten nukleasefrit vand eller 1 μL måludløser-RNA ved 2 pM eller ca. 106 kopier / μL, og sørg for at mærke rørene i overensstemmelse hermed. Bland ved blid pipettering og drej kort rørene ned.
BEMÆRK: Til screening af primersæt skal du bruge en koncentration af måludløser-RNA, der er høj nok til ikke at påvirke den nedre detektionsgrænse for den isotermiske amplifikationsmetode, men alligevel ikke høj nok til at give aktivering af tåholdskontakten, hvis der ikke skulle forekomme forstærkning. - Flyt rørene til den termiske cyklist og start inkubationen. Efter 12 minutter fjernes rørene og tilsættes 1,25 μL enzymblanding til hvert rør. Bland ved at pipettere op og ned og centrifugerer kortvarigt rørene.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan rørene opbevares ved stuetemperatur; enzymblandingen skal dog opbevares på is, indtil den tilsættes til rørene. - Rør returneres til den termiske cyklist, og spring over 41 °C hold-trinnet for at starte reaktionsinkubationen på 1 time.
BEMÆRK: Efter inkubation kan reaktionerne lægges på is til samme dags forarbejdning eller fryses ved -20 °C til senere behandling. - Følg trin 6.2-6.7 og tabel 8 for at samle papirbaserede cellefrie tåholdskontaktreaktioner for at vurdere primerens ydeevne. Analysere data som beskrevet i trin 7.1-7.2 og figur 3.
BEMÆRK: Ud over de tidligere nævnte kontroller er det vigtigt også at inkludere den negative kontrol for at tage højde for ethvert baggrundssignal, der måtte opstå som følge af reaktionen. Derudover er det vigtigt også at inkludere en kontrol med kontakten og 2 pM (endelig koncentration) af mål-RNA som en ikke-NASBA-amplifikationskontrol. - Identificer kandidatprimerpar for at komme videre med følsomhedsanalyse. Primerpar vælges ud fra, om aktivering af tåholdskontakt sker efter tilsætning af den inkuberede reaktion. Gentag om nødvendigt primerskærmen med flere primerkombinationer.
- Hold RNA-prøver på is til enhver tid, lav følgende serielle fortyndingssæt af mål-RNA'er i nukleasefrit vand: 104, 103, 10 2, 101 og 100 RNA-kopier / μL. Gentag nukleinsyresekvensbaseret amplifikation og cellefrie reaktioner med de valgte primersæt (trin 8.2-8.7), test af den serielle fortyndingsserie for at identificere de primersæt, der giver den bedste følsomhed. Se figur 5 for et eksempel på resultater til bestemmelse af primersættets følsomhed.
BEMÆRK: Ideelt set bør den valgte tåholdskontakt og primerparret detektere så få som 1-100 mål-RNA-kopier pr. μL af RNA'et (stamopløsningskoncentration). - Gentag det nukleinsyresekvensbaserede amplifikationsfølsomhedseksperiment i biologisk triplicat. Dette trin tjener til at bekræfte reproducerbarheden af resultaterne, inden de flyttes til eksperimenter med patientprøver.
- Valgfri: For at have en pålidelig kilde til switch-DNA'et til langvarig brug og til transport skal du klone den eller de valgte switchsekvenser til et plasmid ved hjælp af en konventionel kloningsmetode. Tilsvarende kan måludløser-RNA-sekvensen også klones til et valgfrit plasmid til opbevaring.
| Komponent | Volumen pr. reaktion | Endelig koncentration |
| NASBA reaktionsbuffer | 1,67 μL | 1x |
| NASBA nukleotid blanding | 0,833 μL | 1x |
| 25 μM fremadgående primer | 0,1 μL | 0,5 μM |
| 25 μM omvendt primer | 0,1 μL | 0,5 μM |
| RNasehæmmer (40 U/μL) | 0,05 μL | 0,4 U/μL |
| Mål RNA | 1 μL | |
| NASBA enzym blanding | 1,25 μL | 1x |
| Samlet volumen | 5 μL |
Tabel 6: NASBA-reaktionskomponenter.
| Skridt | Temperatur | Tidspunkt |
| Denaturering | 65 °C | 2 minutter |
| Ligevægt | 41 °C | 10 minutter |
| Holde | 41 °C | ∞ |
| Inkubation | 41 °C | 1 time |
| Holde | 4 °C | - |
Tabel 7: Reaktionsbetingelser for NASBA.
| Komponent | Lydstyrke | Endelig koncentration pr. reaktion |
| Løsning A | 2,38 μL | 40% |
| Løsning B | 1,78 μL | 30% |
| RNase hæmmer | 0,03 μL | 0,5% v/v |
| HLRG (25 mg/ml) | 0,14 μL | 0,6 mg/ml |
| Toehold Switch | X μL | 33 nM |
| Mål-RNA (hvis relevant) | X μL | 1 μM |
| NASBA (hvis relevant) | 0,85 μL | 1:7 |
| Nukleasefrit vand | til 5,94 μL | - |
| Samlet volumen: | 5,94 μL | |
Tabel 8: Papirbaserede cellefrie reaktionskomponenter.
9. Indsamling af patientprøver og viral RNA-ekstraktion
BEMÆRK: Dette afsnit beskriver protokollen til indsamling af patientprøver og ekstraktion af RNA ved hjælp af et RNA-oprensningssæt. Protokollen nedenfor bruges til at opnå serum fra perifert blod. Prøverne, der blev brugt i denne undersøgelse, blev indsamlet fra patienter, der præsenterede feber, eksantem, artralgi eller andre relaterede symptomer på arbovirusinfektion i Pernambuco-staten, Brasilien.
- Indsaml perifere blodprøver fra mistænkte arbovirusinficerede patienter. Udfør venipunktur (fuldblodsrør) ved hjælp af en standard aseptisk teknik. Mærk prøverørene med en anonym kode og datoen for prøveindsamlingen.
- Centrifugeblod for at adskille serumet ved 2.300 x g i 10 min. Ved hjælp af en pipette fremstilles alikvoter af serum (200 μL), der vil blive brugt til RNA-ekstraktion i 1,5 ml rør.
BEMÆRK: Hvis det ikke er muligt at udføre RNA-ekstraktionen kort efter prøveindsamling, skal serumprøver opbevares ved -80 °C inden downstream-applikationer. - Pipette 560 μL forberedt buffer AVL (viral lysisbuffer) indeholdende bærer-RNA'et i et 1,5 ml rør. Der tilsættes 140 μL serum til Buffer AVL/carrier RNA-blandingen i røret. Bland ved pulshvirvel i 15 s.
- Inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur, og centrifugeres derefter kortvarigt prøven for at samle indholdet i bunden af røret. Der tilsættes 560 μL ethanol (96 %-100 %) til prøven og blandes ved pulshvirvel i 15 s. Efter blanding centrifugeres prøven for at samle indholdet i bunden af røret.
- Der tilsættes forsigtigt 630 μL af opløsningen fra trin 9.4 til centrifugeringssøjlen uden at fugte fælgen. Efter dette trin lukkes hætten, og centrifugeres ved 6.000 x g i 1 min. Centrifugeringssøjlen anbringes i et rent 2 ml opsamlingsrør, og det brugte opsamlingsrør, der indeholder filtratet, kasseres.
- Åbn forsigtigt centrifugeringskolonnen, og gentag trin 9.5. Åbn forsigtigt spin-kolonnen og tilsæt 500 μL buffer AW1 (vaskebuffer 1). Luk hætten, og centrifuger ved 6.000 x g i 1 min. Centrifugeringssøjlen anbringes i et rent 2 ml opsamlingsrør, og det brugte opsamlingsrør, der indeholder filtratet, kasseres.
- Åbn forsigtigt spin-kolonnen og tilsæt 500 μL buffer AW2 (vaskebuffer 2). Luk hætten og centrifuge ved 20.000 x g i 3 min. Centrifugeringssøjlen anbringes i et rent 2 ml opsamlingsrør, og det brugte opsamlingsrør, der indeholder filtratet, kasseres.
- For at undgå forurening med resterende buffer AW2, som kan forårsage problemer i nedstrøms enzymatiske reaktioner, skal du placere spinkolonnen i et rent 2 ml opsamlingsrør og kassere det brugte opsamlingsrør med filtratet. Centrifuge ved 20.000 x g i 1 min.
- Centrifugeringssøjlen anbringes i et rent 1,5 ml rør, og det brugte opsamlingsrør kasseres med filtratet. Åbn forsigtigt centrifugeringskolonnen, og tilsæt 60 μL buffer AVE (elutionsbuffer) ækvilibreret til stuetemperatur. Efter dette trin skal du lukke hætten og inkubere ved stuetemperatur i 1 min.
- Centrifuge ved 6.000 x g i 1 min. Det eluerede RNA kan derefter bruges som input til NASBA- og RT-qPCR'erne parallelt.
- Følg trin 8.3 til 8.11 for at udføre nukleinsyresekvensbaseret amplifikation og papirbaserede cellefrie reaktioner ved hjælp af 1 μL ekstraheret patient-RNA, hvilket sikrer, at negative og positive kontrolreaktioner inkluderes. Efter reaktionerne klargøres 384-brøndsreaktionspladen, og analysen køres i den bærbare pladelæseranordning ved 37 °C (se nærmere oplysninger i tillægsprotokollen).
BEMÆRK: To RNA-koncentrationer på 104 og 102 PFU / ml, ekstraheret fra dyrket Zika-virus, anvendes som positive kontroller for alle eksperimenter under den kliniske validering. Ud over de tidligere nævnte kontroller er det vigtigt også at medtage udløseren (10 ng/μL) som en positiv kontrol. - Ved afslutningen af hvert eksperiment kan rådata (.csv fil) fra den prtable pladelæser uploades til en sikker database online. Derudover genererer den bærbare pladelæser en rapport, der angiver, om prøverne er positive eller negative for zikavirus (figur 6); se afsnittet om repræsentative resultater for eksempler på alle de grafer, der er opnået under inkubationen (figur 7).
BEMÆRK: Brugere kan også overføre filer fra den bærbare pladelæser til deres egen computer via USB.
10. Bærbar pladelæser enhed
- Den bærbare pladelæser (figur 8) kan bruges som et alternativ til en konventionel pladelæser24. For protokollen og repræsentative resultater, se Tillægsprotokol.
11. RT-qPCR til påvisning af zikavirus
BEMÆRK: Dette afsnit skitserer trinene til at udføre RT-qPCR til påvisning af zikavirus fra patientprøver (se supplerende protokol).
- For at undgå forurening samles RT-qPCR-komponenterne i et område isoleret fra forstærkningsprocessen (f.eks. Ren hætte). Placer RT-qPCR-bufferen, enzymerne og primeren/sonderne på is eller en koldblok. Herefter tilføjes reaktionerne på en 384-brøndplade på is i henhold til tabel 9.
BEMÆRK: Negativ (ekstraktionskontrol og ikke-skabelonkontrol [NTC]) og positiv kontrol (104 PFU / ml) anbefales til alle eksperimenter. - Efter tilsætning af reagenserne til et 1,5 ml mikrocentrifugerør blandes reaktionen ved pipettering op og ned (ikke hvirvel) og dispenseres 6,5 μL i hver brønd. Tilsæt 3,5 μL af hver RNA-skabelon i tre eksemplarer.
- Placer en PCR-film over toppen af pladen. Centrifuge 384-brøndpladen ved 600 x g i 2 min.
- Pladen anbringes i en RT-qPCR-maskine under anvendelse af følgende cykelforhold, der er beskrevet i tabel 10. For at analysere resultaterne skal du bruge RT-qPCR-maskindesign- og analysesoftwaren og overveje den automatiske tærskel og basislinje (se detaljer i den supplerende protokol).
| Komponent | Lydstyrke | Koncentration |
| 2X QuantiNova Probe RT-PCR Master Mix | 5 μL | 1 X |
| 100 μM fremadgående primer | 0,08 μL | 0,8 μM |
| 100 μM omvendt primer | 0,08 μL | 0,8 μM |
| 25 μM sonde | 0,04 μL | 0,1 μM |
| QuantiNova ROX Reference Farvestof | 0,05 μL | 1 X |
| QuantiNova Probe RT Mix | 0,1 μL | 1 X |
| Skabelon RNA | 3,5 μL | - |
| Nukleasefrit vand | til 10 μL | - |
Tabel 9: RT-qPCR-komponenter til forstærkning af Zika-virus-RNA baseret på Centers for Disease Control and Prevention-CDC USA-protokol til påvisning af Zika-virus fra patientprøver31.
| Skridt | Temperatur | Tidspunkt | |
| Omvendt transkription | 45 °C | 15 minutter | |
| PCR indledende aktiveringstrin | 95 °C | 5 minutter | |
| 45 cyklusser | Denaturering | 95 °C | 5 s |
| Kombineret udglødning/tilbygning | 60 °C | 45 sek. | |
Tabel 10: Cykelforhold for RT-qPCR.
Representative Results
Efter beregningsdesignrørledningen blev konstruktionen af tre tåholdsafbrydere udført af PCR. PCR-produkterne blev analyseret ved hjælp af agarosegelelektroforese (figur 2). Tilstedeværelsen af et klart bånd omkring 3.000 bp, omtrent på størrelse med lacZ-genet koblet til en tåholdskontakt, indikerer typisk en vellykket reaktion. Alternativt indikerer en bane uden et bånd, flere bånd eller et bånd af den forkerte størrelse en mislykket PCR. I tilfælde af en mislykket PCR skal reaktionsbetingelserne og / eller primersekvenserne optimeres.
De samlede tåholdskontakter blev screenet for at vurdere hver sensor i forhold til dens respektive in vitro-transskriberede trigger-RNA (figur 3). Mens alle tre sensorer viste en øget OD 570-absorbans, havde switch27B (figur 3A) den hurtigste hastighed. Switche 33B og i mindre grad 47B viste en øget OD570-absorbans i fravær af måludløser-RNA, hvilket indikerer, at disse switche har en vis baggrundsaktivitet eller lækage (figur 3B, C) - et træk, der ikke ønskes i en kandidatsensor, da det kan reducere specificiteten. For tydeligere at identificere sensoren med det højeste ON/OFF-signalforhold blev foldændringen af OD570-absorbansen beregnet (se supplerende oplysninger afsnit 5) og plottet (figur 4). Fra denne analyse er det klart, at switch 27B er den sensor, der har den bedste ydeevne med et ON / OFF-forhold på omkring 60.
Følsomheden af den mest effektive tåholdskontakt (27B) blev derefter evalueret ved at bestemme den laveste RNA-koncentration, der kræves for at aktivere tåholdskontakten, når den kombineres med en NASBA-reaktion. Grafen illustrerer, at de mest effektive Zika-sensorer kan detektere RNA i koncentrationer så lave som 1,24 molekyler pr. μL (svarende til ~ 2 aM; Figur 5).
Efter at switch 27B blev identificeret og valideret, blev sensormaterialerne distribueret til teammedlemmerne i Recife i Pernambuco-staten Brasilien. I Brasilien blev den kliniske diagnostiske nøjagtighed af zikavirusdiagnostisk platform vurderet ved hjælp af zikaviruspatientprøver parallelt med RT-qPCR til sammenligning. For at validere den papirbaserede Zika-diagnostiske platform blev den bærbare pladelæser brugt, som er i stand til at inkubere og læse det kolorimetriske output fra papirbaserede sensorer. Farveændringen fra gul til lilla bruges til at identificere en positiv prøve, mens en negativ prøve forbliver gul (figur 6). En yderligere mulighed for at visualisere de resultater, der genereres af den bærbare pladelæser (figur 8), er at plotte det kolorimetriske respons for hver papirbaseret reaktion over tid. Prøver blev testet i tre eksemplarer, og prøver, der overskred tærsklen (rød linje sat til 1), blev betragtet som positive, mens prøver under tærsklen blev betragtet som negative (figur 6 og figur 7).
Endelig, for at evaluere og sammenligne den kliniske ydeevne af Zika tåhold-switchsensoren med den nuværende guldstandardmetode til diagnosticering af Zika-virusinfektion, blev alle patientprøver testet parallelt med RT-qPCR. Amplifikationsplottet af to repræsentative patientprøver blev testet i tre eksemplarer til påvisning af Zika-virus ved RT-qPCR (figur 9). Prøverne betragtes som positive, når cyklustærskelværdien (Ct) er ≤38; den røde linje angiver en positiv prøve, og den blå linje angiver en negativ prøve for zikavirus.
Figur 2: Agarosegelelektroforese til vurdering af kvaliteten af PCR-produkter. PCR-produkter analyseres på en 1% agarosegel i 1X TAE, der køres ved 80 V i 90 min. Et enkelt klart bånd indikerer typisk en vellykket reaktion. Bane 1: 1 kb DNA stige; Baner 2-4: 27B switch DNA, 33B trigger DNA og 47B trigger DNA, henholdsvis. Tallene i venstre side repræsenterer båndstørrelse i bp. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Prototyper af tre tåholdskontakter til papirbaserede Zika-sensorer. Ydeevnen af tre papirbaserede RNA-tåholdskontaktsensorer blev målt til 37 °C i over 130 min. Hver graf indeholder to spor, den ene repræsenterer kun switch-kontrolelementet, mens den anden repræsenterer switchen og udløseren. De tre grafer repræsenterer data indsamlet ved hjælp af tåholdskontaktsensorer 27B (A), 33B (B) og 47B (C). Fejllinjer repræsenterer standardfejlen for middelværdien (SEM) fra tre replikater. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Sensorer med topeffekt identificeres ved at beregne foldændringen i absorbans ved 570 nm. Foldændring (eller maksimalt ON/OFF-forhold) beregnes ved at måle absorbansforholdet (OD570) ved 130 min mellem switchens eneste kontrol og switch plus trigger CFPS-analysen. Fejllinjer repræsenterer SEM fra tre replikater. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Følsomhedsvurdering af den mest effektive switch. In vitro transskriberet Zika RNA titreres til NASBA-reaktioner. Efter en 1 time inkubation blev reaktionerne tilsat cellefrie PURExpress-reaktioner på papirskiver i forholdet 1:7. Foldskiftet efter 130 min ved 37 °C afbildes. Dette tal er gengivet fra24. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Bærbar pladelæseroptagelsesside fyldt med optagne billeddata. Denne figur viser et eksempelbillede af det endelige billede, der er taget af den bærbare pladelæser under en dataindsamling. Det oprindelige dato-/tidsstempel er synligt øverst i billedet. Gul farve indikerer kontrol eller negative reaktioner, og den lilla farve indikerer en positiv reaktion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Dataanalysetilstand. Til venstre vælger brugerne de datasæt, de gerne vil plotte; Graferne vises derefter til højre med unikke farver for hvert eksempel eller kontrolsæt. Den stiplede røde linje tjener som en tærskel til bestemmelse af positive og negative prøver. Prøver testet i tre eksemplarer, der overstiger tærsklen, betragtes som positive, mens prøver under tærsklen anses for negative. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelse (SD) fra tre replikater. Ctrl 1 til Ctrl 5 angiver kontroller. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8. PLUM, en bærbar pladelæser. Denne bærbare pladelæser fungerer som et lab-in-a-box og fungerer som en temperaturstyret pladelæser til at inkubere og overvåge kolorimetriske reaktioner. Denne bærbare enhed kan levere kvantitative og højtydende målinger af de papirbaserede Zika-sensorer på stedet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: RT-qPCR-plot af amplifikation af to patientprøver testet i tre eksemplarer til påvisning af Zika-virus. Prøver betragtes som positive, når cyklustærskelværdien (Ct) er ≤38. Den stiplede røde linje tjener som en tærskel til bestemmelse af positive og negative prøver. Det røde spor angiver en positiv prøve, og det blå spor angiver en negativ prøve. ΔRn -værdien (delta Rn) repræsenterer den normaliserede størrelse af fluorescenssignalet, der detekteres af RT-qPCR-instrumentet for alle de testede prøver. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende protokolfil. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tal. Klik her for at downloade disse tal.
Discussion
Det kombinerede papirbaserede system, der er beskrevet her, kan bringe klinisk relevant molekylær diagnostik med ydeevne, der funktionelt kan sammenlignes med RT-qPCR, til behovspunktet6. Det er vigtigt, at tilgængeligheden af diagnostik på stedet for fjernindstillinger kan reducere tiden til resultater fra dage til timer. Ved at fremhæve programmerbarheden af denne tilgang kan den rørledning, der er beskrevet, bruges til at detektere stort set ethvert patogenmål. Vi har parret de molekylære værktøjer med en specialbygget bærbar pladelæser, som er kompakt og kompatibel med batteridrift (8-9 timer) og giver indbygget dataanalyse for at muliggøre distribuerede applikationer. I andet arbejde har vi valideret den kombinerede hardware- og Zika-virusdiagnostiske platform med 268 patientprøver parallelt med RT-qPCR og fundet en diagnostisk nøjagtighed på 98.5%24. Samlet set er vores mål at muliggøre teknologioverførsel af denne platform til forskere, så den kan genbruges og forbedres af samfundet for at imødekomme uopfyldte diagnostiske behov.
Design af in silico toehold switch-designprocessen er blevet integreret og automatiseret i en pipeline, der kan opdeles i tre faser. Den første fase genererer en pulje af tåholdskontaktdesign, der hybridiserer til målsekvensen i en nukleotidtrin. Den anden fase undersøger den sekundære struktur og tilgængeligheden af tåholdskontakten og eliminerer sensorer med for tidlige stopkodoner i rammen. En scoringsfunktion, der tager højde for flere faktorer (f.eks. defektniveau for tåholdskontakten, tilgængelighed af toehold-switch og tilgængelighed på målstedet) implementeres derefter for at vælge design af toptåholdskontakt baseret på samlede scorer. I den sidste fase genereres en liste over sekvenser for de øverste tåholdskontaktdesign og deres tilsvarende måludløsere. De øverste sensorsekvenser skal screenes for specificitet mod det humane transkriptom og nært beslægtede virale genomer ved hjælp af NCBI/Primer-BLAST25. Det er også bedste praksis at screene sensormålstederne for sekvensbevarelse i Zika-virusgenomet for at sikre, at sensorerne giver bred og robust detektion. Flere versioner af toehold switch design software er blevet udviklet, og designalgoritmen giver brugerne mulighed for at generere to versioner, enten serie A 6 eller serie B toehold switche6. I denne artikel har fokus været på serie B tåhold switch design.
Efter kommerciel DNA-syntese kan tåholdskontakterne hurtigt samles og derefter testes ved at udføre en indledende skærm mod en syntetisk måludløsersekvens, der svarer til korte regioner (200-300 nt) af målgenomet. Til screening af ydeevnen af tåholdskontaktbaserede sensorer er det ideelt at tilføje målsekvensen i form af RNA. I denne artikel er de trin, der kræves for at tilføje in vitro transkriberet trigger RNA, blevet skitseret. Men hvis de er tilgængelige, kan genomskabeloner i fuld længde såsom kvantificerede virale RNA-ekstrakter eller kommercielle syntetiske RNA-genomer eller -standarder anvendes. Brug af RNA-genomer i fuld længde til indledende toehold-switch-screening er gavnligt, da det kan informere om, hvorvidt yderligere faktorer, såsom RNA-sekundær struktur, vil påvirke sensorens ydeevne. For at optimere ON/OFF-forholdet mellem kandidatkontakter kan tåholdskontaktens DNA titreres til den cellefrie reaktion. Dette trin kan også tjene til at identificere højtydende tåholdsafbrydere (foldforstærkning eller højt ON / OFF-forhold) og udelade utætte tåholdskontakter (højt signal i fravær af mål-RNA'et) fra nedstrøms karakteriseringstrin.
For at forbedre detektionsgrænsen for de bedst præsterende tåholdsswitchkandidater bruges NASBA til at øge klinisk relevante koncentrationer af mål Zika viralt RNA til et niveau, der kan detekteres ved tåholdskontakter6. Forskellige kombinationer af fremadgående og omvendte primersæt screenes for at bestemme de bedste NASBA-primer- og tåholdskontaktkombinationer for at muliggøre detektion ved klinisk relevante koncentrationer. Når et ideelt primersæt og tåholdskontaktkombination er blevet identificeret, føres analysen videre til klinisk validering. Det er vigtigt at bemærke, at tåholdskontakten og NASBA-screeningsfaserne kan være arbejds- og ressourceintensive, og derfor er testudvikling bedst egnet til velfinansierede forskningssteder. Selvom vi ikke har anvendt procesautomatisering, er det sandsynligt, at dette kan fremskynde den iterative design-, build- og testcyklus32. Heldigvis kan behandlingstiden fra sensordesign og test til implementering være bemærkelsesværdig kort (mindre end en uge), hvilket gør denne strategi ideel til tidskritiske situationer, såsom epidemiudbrud6.
Selv efter at en biosensor med klinisk relevant følsomhed er udviklet, er der tekniske udfordringer, der skal løses. Da denne protokol involverer manuel betjening og er en flertrinsprocedure, er der risiko for krydskontaminering mellem prøver. Vi gør vores bedste for at mindske denne risiko gennem omhyggelig laboratoriepraksis. I et nyligt klinisk forsøg med 268 patientprøver stødte vi ikke på nogen forureningsproblemer; Det er dog en vigtig overvejelse24. Med dette i tankerne forbliver protokollen et laboratorieassay og kræver en dygtig bruger med kommando af korrekte molekylærbiologiske teknikker. En yderligere overvejelse for implementering er RNA-isolering fra patientprøver. Her beskriver vi RNA-isolering ved hjælp af kolonnebaserede nukleinsyreekstraktionssæt. I andet arbejde har vi imidlertid demonstreret en effektiv og enkel kogende lysemetode (95 °C i 2 min) til behandling af patientprøver med lav belastning6. Denne strategi eliminerer næsten omkostningerne forbundet med RNA-ekstraktion og undgår brugen af kolonnebaserede nukleinsyreekstraktionssæt, hvilket kan udgøre en logistisk udfordring i lavressourceindstillinger eller forsyningskædeproblemer under kriser, såsom COVID-19-pandemien33.
Som vi har set under COVID-19-pandemien, kan de instrumenter, der bruges til at udføre RT-qPCR, i sig selv tjene som en flaskehals og begrænse patienternes adgang til test. Denne faktor, som også stort set er økonomisk, fører til en centraliseret testtilstand, der kan begrænse diagnostisk adgang. For eksempel var der under Zika-udbruddet i 2015/2016 kun fem nationale referencelaboratorier tilgængelige i Brasilien, hvilket forårsagede forsinkelser i patienttest. Uden at overveje den potentielle fordel ved stordriftsfordele er de nuværende vareomkostninger for den bærbare pladelæser ~ $ 500 USD, som selvom de øges fem gange for at tage højde for arbejdskraft og kommerciel margin, stadig giver et overkommeligt instrument. Dette kan sammenlignes godt med RT-qPCR-instrumenter, der varierer i omkostninger fra $ 15,000 - $ 90,000 USD34. Desuden er den anslåede pris pr. test for det cellefrie assay i Latinamerika omkring $ 5.48 USD, mens omkostningerne pr. Test af RT-qPCR i Brasilien var ~ $ 10-11 USD på tidspunktet for Zika-udbruddet36. Ud over omkostningerne ved udstyr har den bærbare pladelæser et lille fodaftryk (20 cm3), automatisk analyse, dataupload til skyen via internettet og kan køres på batteristrøm. Disse funktioner udvider dramatisk de potentielle indstillinger, hvor test kan implementeres, og udvider samtidig patientpopulationen, der kan betjenes.
Til dato er de mest almindelige kommercielle E. coli CFPS-platforme S30- og PURE-systemerne37; En vigtig overvejelse for at forbedre adgangen til diagnostik i lav- og mellemindkomstlande er imidlertid den begrænsede indenlandske tilgængelighed af disse reagenser. Et vigtigt skridt i retning af at løse denne udfordring er udviklingen af lokal CFPS-produktion. Federici-laboratoriet har for nylig gjort betydelige fremskridt i retning af at udvikle en ikke-kommerciel platform til implementering af toehold-switch-baserede sensorer i lysatbaserede cellefrie systemer og nåede en 2.7 fM LOD med Zika-virus RNA14. Denne præstation gør det ikke kun muligt at fremstille reagenserne i brugslandet, hvilket undgår importtold og forsinkelser, men lønomkostningerne skaleres også til lokale satser, og dermed kan de samlede omkostninger sænkes betydeligt. I det arbejde, der blev skitseret af Federici-gruppen, var omkostningerne ved at producere CFPS-ekspressionsreaktionen (5 μL) i Chile 6,9 cent (USD) 35,38, hvilket gav et dobbelt incitament (forbedret logistik og omkostninger) til implementering af lysatbaserede systemer 35,38.
Placeringen af RT-qPCR-sammenlignelig test i distribuerede diagnostiske netværk kan medføre betydelige fordele i forhold til nuværende praksis, der er afhængig af transport af prøver til centraliserede RT-qPCR-faciliteter. I bynære omgivelser, hvor zika-tilfælde var koncentreret, forsinker den fysiske afstand mellem en patient og diagnosefaciliteten diagnosen og øger risikoen for, at resultaterne ikke når patienten på et klinisk relevant tidspunkt. Det er vores håb, at det arbejde, der præsenteres her, kan bidrage til, at forskersamfundet gennem overførsel af viden kan skabe decentraliserede bioteknologier og bærbar hardware til menneskers sundhed, landbrug og miljøovervågning.
Disclosures
K.P. og A.A.G. er medopfindere af papirbaserede tåholdsensorrelaterede teknologier. Y.G., S.C. og K.P. er medstiftere af LSK Technologies, Inc. og er medopfindere af de PLUM-relaterede teknologier. M.K., K.P. og A.A.G. er medstiftere af En Carta Diagnostics Ltd. Andre forfattere har ingen interessekonflikter. Patenter: PLUM-enhed: Y.G., S.C. og K.P. patentansøgning blev indgivet af University of Toronto og tildelt LSK Technologies Inc. US Provisional Patent Application No. 62/982,323 indgivet 27. februar 2020; Toehold switch patent: A.A.G., P.Y., og J.J. C. "Riboregulatoriske sammensætninger og anvendelsesmetoder", Patent. WO2014074648A3 indgivet 6. november 2012; Papirbaseret diagnostisk patent: K.P. og J.J.C. "Papirbaserede syntetiske gennetværk" U.S. patent afventer nr. US15/963,831 indgivet 6. december 2013; Zika patent 1: K.P., A.A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F. og J.J.C., "Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform", US Provisional Patent Application No. 62/403,778 indgivet 4. oktober 2016; Zika patent 2: K.P., A. A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F. og J.J.C., "Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform", US Provisional Patent Application No. 62/341,221 indgivet 25. maj 2016.
Acknowledgments
Forfatterne takker alle medlemmer af Green, Pardee og Pena labs samt alle medforfattere af tidligere manuskripter vedrørende det arbejde, der er beskrevet i dette manuskript. S.J.R.d.S. blev støttet af et ph.d.-stipendium sponsoreret af Foundation for Science and Technology of Pernambuco (FACEPE), Brasilien, referencenummer IBPG-1321-2.12/18, og understøttes i øjeblikket af et postdoc-stipendium sponsoreret af University of Toronto, Canada. P.B. støttes af William Knapp Buckley Award fra Det Farmaceutiske Fakultet, University of Toronto. M.K. blev støttet af Precision Medicine Initiative (PRiME) ved University of Toronto interne stipendienummer PRMF2019-002. Dette arbejde blev støttet af midler til KP fra Canada Research Chairs Program (filer 950-231075 og 950-233107), University of Toronto's Major Research Project Management Fund, CIHR Foundation Grant Program (201610FDN-375469) og til L.P, A.A.G. og K.P gennem CIHR / IDRC Team Grant: Canada-Latin / America-Caribbean Zika Virus Program (FRN: 149783) samt af midler til K.P. fra Canadas International Development Research Centre (bevilling 109434-001) gennem den canadiske 2019 Novel Coronavirus (COVID-19) Rapid Research Funding Opportunity. Dette arbejde blev også støttet af midler til A.A.G. fra en Arizona Biomedical Research Commission New Investigator Award (ADHS16-162400), Gates Foundation (OPP1160667), en NIH Director's New Innovator Award (1DP2GM126892), en NIH R21-pris (1R21AI136571-01A1) til K.P./A.A.G og et Alfred P. Sloan Fellowship (FG-2017-9108). Figur 1 blev oprettet med Biorender.com under akademisk licens til K.P.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384 well plate covers - aluminum | Sarstedt | 95.1995 | Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the PLUM reader |
| 384 well plate covers - transparent | Sarstedt | 95.1994 | Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the BioTek plate reader |
| 384 well plates | VWR | CA11006-180 | 2 mm paper-based diagnostics are placed into the wells of these plates for quantification |
| Agarose | BioShop Canada | AGA001.500 | Gel electrophoresis |
| BSA | BioShop Canada | ALB001.500 | Blocking agent for the Whatman filter paper |
| Cell free reactions | New England Biolabs | E6800L | PURExpress |
| CPRG | Roche | 10884308001 | Chlorophenol red-b-D-galactopyranoside |
| Disposable Sterile Biopsy Punches | Integra Miltex | 23233-31 | Used to create 2 mm paper discs that fit into a 384-well plate |
| DNAse I | Thermo Scientific | K2981 | Digests template DNA following incubation of the in vitro transcription reaction |
| DNAse I Kit | Thermo Scientific | 74104 | DNase I Kit For removing template DNA from IVT RNA |
| dNTPs | New England Biolabs | N0446S | Used for PCRs |
| electrophoresis system | Bio-Rad | 1704487 | Used to run the agarose gels |
| Gel imaging station | Bio-Rad | 1708265 | ChemiDoc XRS+ Imaging System |
| IVT kit | New England Biolabs | E2040S | Used for in vitro transcribing template (trigger) RNA for switch screening |
| Nanodrop One | Thermo Scientific | ND-ONE-W | Used for determining nucleic acid concentrations |
| NASBA kit | Life Sciences Advanced Technologies | NWK-1 | Isothermal amplification reaction components |
| Nuclease free H20 | invitrogen | 10977015 | Added to reaction mixes |
| PAGE electrophoresis system | Biorad | 1658001FC | Used to cast and run polyacrylamide gels |
| pCOLADuet-LacZ DNA | Addgene | 75006 | https://www.addgene.org/75006/ |
| Phusion polymerase/reactioin buffer | New England Biolabs | M0530L | Used for PCRs |
| Plate reader | BioTek | BioTek NEO2 | Multi Mode Plate Reader, Synergy Neo2 |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom oligo synthesis | |
| Q5 polymerase/reaction buffer | New England Biolabs | M0491L | Used for PCRs |
| Qiagen PCR Puriifcation Kit | QIAGEN | 27106 | QIAprep Spin Miniprep Kit |
| RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | 2X RNA loading dye |
| RNA Purification Kit | QIAGEN | EN0521 | QIAamp Viral RNA extraction kit |
| RNase inhibitor | New England Biolabs | M0314S | Used to prevent contamination of RNases A, B, and C |
| RT-qPCR kit | QIAGEN | 208352 | QuantiNova Probe RT-PCR Kit |
| SYBR Gold | Invitrogen S11494 | S11494 | PAGE gel stain for nucleic acids |
| TAE Buffer | BioShop Canada | TAE222.4 | Gel electrophoresis buffer |
| Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | Used for temperature cycling and incubating reactions |
| Whatman 42 filter paper | GE Healthcare | 1442-042 | Used to imbed molecular components for paper-based diagnostics |
References
- Urdea, M., et al. Requirements for high impact diagnostics in the developing world. Nature. 444, Suppl 1 73-79 (2006).
- Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annual Review of Biomedical Engineering. 10, 107-144 (2008).
- Faria, N. R., et al. Mobile real-time surveillance of Zika virus in Brazil. Genome Medicine. 8 (1), 97 (2016).
- Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: Early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
- Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
- Pardee, K., et al. Rapid, low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Duyen, T. T. M., et al. Paper-based colorimetric biosensor for antibiotics inhibiting bacterial protein synthesis. Journal of Bioscience and Bioengineering. 123 (1), 96-100 (2017).
- Jung, J. K., et al. Cell-free biosensors for rapid detection of water contaminants. Nature Biotechnology. 38 (12), 1451-1459 (2020).
- Yang, Y. H., et al. Cell-free Escherichia coli-based system to screen for quorum-sensing molecules interacting with quorum receptor proteins of streptomyces coelicolor. Applied and Environmental Microbiology. 75 (19), 6367 (2009).
- Ma, D., Shen, L., Wu, K., Diehnelt, C. W., Green, A. A. Low-cost detection of norovirus using paper-based cell-free systems and synbody-based viral enrichment. Synthetic Biology. 3 (1), (2018).
- Park, S., Lee, J. W. Detection of coronaviruses using RNA toehold switch sensors. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1-13 (2021).
- Amalfitano, E., et al. A glucose meter interface for point-of-care gene circuit-based diagnostics. Nature Communications. 12 (1), 1-10 (2021).
- Nguyen, P. Q., et al. Wearable materials with embedded synthetic biology sensors for biomolecule detection. Nature Biotechnology. 39 (11), 1366-1374 (2021).
- Pellinen, T., Huovinen, T., Karp, M. A cell-free biosensor for the detection of transcriptional inducers using firefly luciferase as a reporter. Analytical Biochemistry. 330 (1), 52-57 (2004).
- Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis approach to biosensing hTRβ-specific endocrine disruptors. Analytical Chemistry. 89 (6), 3395-3401 (2017).
- Salehi, A. S. M., et al. Biosensing estrogenic endocrine disruptors in human blood and urine: A RAPID cell-free protein synthesis approach. Toxicology and Applied Pharmacology. 345, 19-25 (2018).
- Voyvodic, P. L., et al. Plug-and-play metabolic transducers expand the chemical detection space of cell-free biosensors. Nature Communications. 10 (1), 1-8 (2019).
- Yang, W. C., Patel, K. G., Wong, H. E., Swartz, J. R. Simplifying and streamlining Escherichia coli-based cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 28 (2), 413-420 (2012).
- Gräwe, A., et al. A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs. PLOS One. 14 (3), 0210940 (2019).
- Green, A. A., Silver, P. A., Collins, J. J., Yin, P. Toehold Switches: De-Novo-Designed Regulators of Gene Expression. Cell. 159 (4), 925-939 (2014).
- Craw, P., Balachandran, W. Isothermal nucleic acid amplification technologies for point-of-care diagnostics: a critical review. Lab on a Chip. 12 (14), 2469-2486 (2012).
- Zyrina, N. V., Antipova, V. N. Nonspecific Synthesis in the Reactions of Isothermal Nucleic Acid Amplification. Biochemistry (Moscow). 86 (7), 887-897 (2021).
- Takahashi, M. K., et al. A low-cost paper-based synthetic biology platform for analyzing gut microbiota and host biomarkers. Nature Communications. 9 (1), 1-12 (2018).
- Karlikow, M., et al. Field validation of the performance of paper-based tests for the detection of the Zika and chikungunya viruses in serum samples. Nature Biomedical Engineering. 6 (3), 246-256 (2022).
- Agarwala, R., et al. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 44 (1), 7-19 (2016).
- BLAST: Basic Local Alignment Search Tool. , Available from: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (2022).
- Deiman, B., Van Aarle, P., Sillekens, P. Characteristics and applications of nucleic acid sequence-based amplification (NASBA). Molecular Biotechnology. 20 (2), 163-179 (2002).
- Zadeh, J. N., Wolfe, B. R., Pierce, N. A. Nucleic acid sequence design via efficient ensemble defect optimization. Journal of Computational Chemistry. 32 (3), 439-452 (2011).
- NUPACK: Nucleic Acid Package. , Available from: http://www.nupack.org/ (2022).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , Cambridge, MA. (2021).
- Lanciotti, R. S., et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerging Infectious Diseases. 14 (8), 1232 (2008).
- Walsh, D. I., et al. Standardizing automated DNA assembly: Best practices, metrics, and protocols using robots. SLAS Technology. 24 (3), 282 (2019).
- Silva, S. J. R., de Magalhães, J. J. F., de Pena, L. Simultaneous circulation of DENV, CHIKV, ZIKV and SARS-CoV-2 in Brazil: An inconvenient truth. One Health. 12, 100205 (2021).
- Kimura, S., Fujinaga, K., Sekiya, T. PCR machine. Tanpakushitsu kakusan koso. Protein, Nucleic Acid, Enzyme. 41 (5), 514-517 (1996).
- Arce, A., et al. Decentralizing cell-free RNA sensing with the use of low-cost cell extracts. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 727584 (2021).
- Silva, S. J. R., Pardee, K., Balasuriya, U. B. R., Pena, L. Development and validation of a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of ZIKV in patient samples from Brazil. Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).
- Shimizu, Y. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
- Lavickova, B., Maerkl, S. J. A simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system. ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).
