Summary
Der Zugang zu dezentralen, kostengünstigen Diagnosen mit hoher Kapazität, die für dezentrale Tests in der Community eingesetzt werden können, ist entscheidend für die Bekämpfung globaler Gesundheitskrisen. Dieses Manuskript beschreibt, wie eine papierbasierte Diagnostik für virale RNA-Sequenzen aufgebaut werden kann, die mit einem tragbaren optischen Lesegerät nachgewiesen werden können.
Abstract
Der Zugang zu Molekulardiagnostika mit geringer Belastung, die in der Gemeinschaft zu Testzwecken eingesetzt werden kann, wird immer wichtiger und hat weitreichende Auswirkungen auf das Wohlergehen von Gesellschaften und die wirtschaftliche Stabilität. In den letzten Jahren sind mehrere neue isotherme Diagnosemodalitäten entstanden, um dem Bedarf an schneller und kostengünstiger molekularer Diagnostik gerecht zu werden. Wir haben zu diesen Bemühungen durch die Entwicklung und Patientenvalidierung von Toehold-Switch-basierten Diagnostika beigetragen, einschließlich der Diagnostik für die durch Moskitos übertragenen Zika- und Chikungunya-Viren, die eine Leistung bieten, die mit Goldstandard-Reverse-Transkription-quantitativen Polymerase-Kettenreaktions-Assays (RT-qPCR) vergleichbar ist. Diese Diagnosen sind kostengünstig in der Entwicklung und Herstellung und haben das Potenzial, Diagnosekapazitäten für ressourcenarme Umgebungen bereitzustellen. Hier liefert das Protokoll alle notwendigen Schritte für die Entwicklung eines switchbasierten Assays zum Nachweis von Zika-Viren. Der Artikel führt die Leser durch den schrittweisen diagnostischen Entwicklungsprozess. Erstens dienen genomische Sequenzen des Zika-Virus als Eingaben für das rechnerische Design von Kandidatenschaltern unter Verwendung von Open-Source-Software. Als nächstes wird der Aufbau der Sensoren für das empirische Screening mit synthetischen RNA-Sequenzen und die Optimierung der diagnostischen Sensitivität gezeigt. Nach Abschluss der Validierung erfolgt die Validierung mit Patientenproben parallel zur RT-qPCR und einem speziell entwickelten optischen Lesegerät, PLUM. Diese Arbeit bietet Forschern eine technische Roadmap für die Entwicklung kostengünstiger Toehold-Schalter-basierter Sensoren für Anwendungen in der menschlichen Gesundheit, Landwirtschaft und Umweltüberwachung.
Introduction
Die RT-qPCR ist aufgrund ihrer hervorragenden Sensitivität und Spezifität der Goldstandard für die klinische Diagnostik geblieben. Obwohl das Verfahren sehr robust ist, hängt es von teuren, spezialisierten Geräten und Reagenzien ab, die eine temperaturkontrollierte Verteilung und Lagerung erfordern. Dies stellt weltweit erhebliche Hindernisse für den Zugang zu qualitativ hochwertiger Diagnostik dar, insbesondere in Zeiten von Krankheitsausbrüchen und in Regionen, in denen der Zugang zu gut ausgestatteten Labors begrenzt ist 1,2. Dies wurde während des Zika-Virus-Ausbruchs 2015/2016 in Brasilien beobachtet. Da nur fünf zentralisierte Labore für RT-qPCR-Tests zur Verfügung standen, ergaben sich erhebliche Engpässe, die den Zugang zur Diagnostik einschränkten. Dies war besonders schwierig für Personen in stadtnahen Umgebungen, die stärker vom Ausbruch betroffen waren 3,4. Um den Zugriff auf Diagnosen zu verbessern, zeigt das Protokoll eine Plattform, die mit dem Potenzial entwickelt wurde, dezentrale, kostengünstige Diagnosen mit hoher Kapazität in ressourcenarmen Umgebungen bereitzustellen. Als Teil davon wurde eine diagnostische Entdeckungspipeline eingerichtet, die isotherme Amplifikation und synthetische RNA-Switch-basierte Sensoren mit papierbasierten zellfreien Expressionssystemen 5,6 koppelt.
Zellfreie Proteinsynthesesysteme (CFPS), insbesondere zellfreie E. coli-basierte Systeme, sind eine attraktive Plattform für eine breite Palette von Biosensoranwendungen von der Umweltüberwachung 7,8 bis zur Erregerdiagnostik 5,6,9,10,11,12 . CFPS-Systeme umfassen die für die Transkription und Translation notwendigen Komponenten und haben signifikante Vorteile gegenüber Ganzzell-Biosensoren. Insbesondere ist die Sensorik nicht durch eine Zellwand begrenzt und im Allgemeinen sind sie modular aufgebaut, biosicher, kostengünstig und können für den tragbaren Einsatz gefriergetrocknet werden. Die Fähigkeit, auf Genschaltkreisen basierende Reaktionen auf Substraten wie Papier oder Textilien gefriertrocken zu lassen, ermöglicht den Transport, die Langzeitlagerung bei Raumtemperatur5 und sogar die Integration in tragbare Technologie13.
Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass zellfreie E. coli-Systeme zum Nachweis zahlreicher Analyten verwendet werden können, beispielsweise toxische Metalle wie Quecksilber, Antibiotika wie Tetracyclin7,14, endokrin wirksame Chemikalien15,16, Biomarker wie Hippursäure 17, pathogenassoziierte Quorum Sensing-Moleküle 9,18 und illegale Substanzen wie Kokain 17 und Gammahydroxybutyrat (GHB)19 . Für den sequenzspezifischen Nachweis von Nukleinsäuren setzen Strategien bisher meist auf den Einsatz von schalterbasierten Biosensoren, die an isotherme Amplifikationstechniken gekoppelt sind. Toehold-Schalter sind synthetische Riboregulatoren (im Rest des Textes auch einfach als "Schalter" bezeichnet), die eine Haarnadelstruktur enthalten, die die nachgeschaltete Translation blockiert, indem sie die ribosomale Bindungsstelle (RBS) und das Startcodon sequestriert. Bei Interaktion mit ihrer Zieltrigger-RNA wird die Haarnadelstruktur entlastet und die anschließende Translation eines offenen Leserahmens des Reporters ermöglicht20.
Die isotherme Amplifikation kann auch als molekulare Diagnostik21 verwendet werden; Diese Methoden sind jedoch anfällig für unspezifische Amplifikation, was die Spezifität und damit die Genauigkeit des Tests unter die der RT-qPCR 22 reduzieren kann. In der hier berichteten Arbeit wurde die isotherme Verstärkung vor den schalterbasierten Sensoren verwendet, um eine kombinierte Signalverstärkung bereitzustellen, die einen klinisch relevanten Nachweis von Nukleinsäuren (femtomolar bis attomolar) ermöglicht. Diese Paarung der beiden Methoden bietet auch zwei sequenzspezifische Checkpoints, die in Kombination ein hohes Maß an Spezifität bieten. Mit diesem Ansatz haben frühere Arbeiten den Nachweis von Viren wie Zika6, Ebola5, Norovirus10 sowie pathogenen Bakterien wie C. difficile23 und antibiotikaresistentem Typhus12 gezeigt. In jüngster Zeit wurden zellfreie Zehenschalter für den SARS-CoV-2-Nachweis demonstriert, um eine zugängliche Diagnose für die COVID-19-Pandemiebereitzustellen 11,12,13.
Das folgende Protokoll beschreibt die Entwicklung und Validierung von zellfreien, papierbasierten synthetischen Zehenschalter-Assays für den Zika-Virusnachweis, vom Design des In-silico-Biosensors über die Montage- und Optimierungsschritte bis hin zur Feldvalidierung mit Patientenproben. Das Protokoll beginnt mit dem In-silico-Design von RNA-Toehold-Switch-basierten Sensoren und isothermen Amplifikationsprimern, die spezifisch für die Zika-Virus-RNA sind. Obwohl zahlreiche isotherme Amplifikationsmethoden existieren, wurde hier die Verwendung von Nukleinsäuresequenz-basierter Amplifikation (NASBA) gezeigt, um die Konzentration des in der Reaktion vorhandenen viralen RNA-Ziels zu erhöhen, was eine klinisch signifikante Sensitivität ermöglicht. In der Praxis haben isotherme Verstärkungsmethoden den Vorteil, dass sie bei einer konstanten Temperatur arbeiten, wodurch die Notwendigkeit spezieller Geräte wie Thermocycler entfällt, die im Allgemeinen auf zentrale Standorte beschränkt sind.
Als nächstes wird der Prozess der Montage der synthetischen Zehenschaltersensoren mit Reportercodierungssequenzen durch Überlappungsverlängerungs-PCR und das Screening der synthetischen Zehenschaltersensoren auf optimale Leistung in zellfreien Systemen mit synthetischer RNA beschrieben. Für diesen Satz von Zika-Virussensoren haben wir das lacZ-Gen ausgewählt, das für das Enzym β-Galactosidase kodiert, das in der Lage ist, ein kolorimetrisches Substrat, Chlorphenolrot-β-D-Galactopyranosid (CPRG), zu spalten, um eine gelbe bis violette Farbänderung zu erzeugen, die mit dem Auge oder mit einem Plattenleser erkannt werden kann. Sobald die leistungsfähigsten synthetischen Schalter identifiziert sind, wird der Prozess zum Screening von Primern auf Nukleinsäuresequenz-basierte isotherme Amplifikation der entsprechenden Zielsequenz unter Verwendung synthetischer RNA beschrieben, um Sets zu finden, die die beste Empfindlichkeit bieten.
Schließlich wird die Leistung der Diagnoseplattform vor Ort in Lateinamerika validiert (Abbildung 1). Um die klinische diagnostische Genauigkeit zu bestimmen, wird der papierbasierte zellfreie Assay mit Zika-Virusproben von Patienten durchgeführt; parallel dazu wird ein Goldstandard RT-qPCR Assay zum Vergleich durchgeführt. Zur Überwachung kolorimetrischer zellfreier Assays ermöglichen wir die Vor-Ort-Quantifizierung der Ergebnisse in Regionen, in denen keine Thermocycler verfügbar sind. Der handmontierte Plattenleser namens Portable, Low-Cost, User-friendly, Multimodal (PLUM; im Folgenden als tragbarer Plattenleser bezeichnet) wird hier ebenfallsvorgestellt 24. Ursprünglich als Begleitgerät für die zellfreie Diagnose synthetischer Zehenschalter entwickelt, bietet der tragbare Plattenleser eine zugängliche Möglichkeit, Ergebnisse mit hohem Durchsatz zu inkubieren und zu lesen, und bietet integrierte, auf Computer Vision basierende Softwareanalyse für Benutzer.
Abbildung 1: Arbeitsablauf für die Testung von Patientenproben mit papierbasierten zellfreien Zehengriff-Schalterreaktionen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Protocol
Alle Verfahren, an denen menschliche Teilnehmer beteiligt sind, müssen in Übereinstimmung mit ethischen Standards und einschlägigen Richtlinien durchgeführt werden, einschließlich der ethischen Grundsätze für medizinische Forschung am Menschen, die in der Erklärung des Weltärztebundes von Helsinki festgelegt wurden. Diese Studie wurde von der Ethikkommission für Humanforschung unter der Lizenzprotokollnummer CAAE: 80247417.4.0000.5190 genehmigt. Das Fiocruz-PE Institutional Review Board (IRB) verzichtete auf die Einwilligung nach Aufklärung aller Patienten, die in diese Studie einbezogen wurden, für diagnostische Proben.
HINWEIS: Das PLUM-Gerät wird im Folgenden als "tragbares Plattenlesegerät" bezeichnet.
1. Computergestütztes Design von Nukleinsäuresequenz-basierten Amplifikationsprimern
- Scannen Sie das Zika-Genom, um eine Reihe von Kandidatenregionen für die Amplifikation zu identifizieren, die etwa 200 Nukleotide (nt) bis 300 nt lang sind, indem Sie die genomische Sequenz in NCBI / Nukleotid BLAST25,26 einfügen. Vergleichen Sie das Genom mit Referenz-RNA-Sequenzen (refseq_rna) und suchen Sie nach Stellen, die hochkonserviert bleiben und keine Homologie mit dem menschlichen Genom aufweisen (andere BLAST-Parameter bleiben unverändert). Wählen Sie mindestens zwei Standorte aus, um den synthetischen Zehenhalteschalter zu entwerfen.
- Verwenden Sie die Auswahlkriterien von Deiman et al.27 , um Paare von vorwärts- und rückwärts Nukleinsäuresequenz-basierten Amplifikationsprimern für jede mögliche Amplifikationsregion zu generieren. Kurz gesagt, befolgen Sie diese Kriterien für die Gestaltung von Primern: (1) GC-Gehalt zwischen 40% -60%; (2) 20 bis 24 nt lang mit DNA-Schmelztemperatur über 41 °C; (3) keine Läufe von vier oder mehr identischen Nukleotiden; (4) das letzte 3'-Nukleotid ist eine A-Base; (5) geringe Wahrscheinlichkeit der Primer-Sekundärstruktur und Dimerbildung. Bildschirm 8-10 Primerpaare für jede Zielregion (empfohlen).
- Die Präfixsequenz, die die T7-Promotorsequenz AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG (T7-Promotorsequenz unterstrichen) enthält, wird an das 5'-Ende der Vorwärtsprimer angehängt, um die Transkription der Amplicons unter Verwendung der T7-RNA-Polymerase (RNAP) zu ermöglichen. Bestellen Sie die Primer als DNA-Oligos bei einem DNA-Syntheseunternehmen.
2. Computergestütztes Design von Zehenhalteschaltern
- Installieren Sie NUPACK28 Version 3.2 (Nukleinsäure-Design-Suite) basierend auf den Anweisungen auf der Website29. Verwenden Sie ein UNIX-Betriebssystem und MATLAB (Numeric Computing Platform) als Programmiersprache (empfohlen).
- Identifizieren Sie die Zielsequenzen (z. B. virales Genom), die spezifisch für den Erreger sind, der für die Zehenschalterdesigns von Interesse ist, wie in Schritt 1.1. Wählen Sie die Zika-Zielsequenzen aus den in Schritt 1.2 generierten Nukleinsäuresequenz-basierten Amplikons aus.
HINWEIS: In der Praxis können je nach Bedarf der Benutzer entweder die auf Nukleinsäuresequenz basierenden Amplifikationsprimer oder die synthetischen Zehenhalteschalter zuerst entworfen und getestet werden. Wenn bestimmte Zielregionen von Interesse bereits festgelegt wurden (z. B. aus bestehenden Publikationen oder Diagnoseprotokollen), kann zuerst das Design und Screening von Zehengriffschaltern erfolgen, gefolgt von Design und Screening für nukleinsäuresequenzbasierte Amplifikationsprimer. Wenn es keine festgelegten Zielregionen gibt, screenen Sie zunächst Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikationsprimer gegen das vollständige Genom, um die Ziele der Wahl einzugrenzen, während Sie für die Effizienz der Primeramplifikation auswählen. Wenn mehrere Sequenzen für den Erreger verfügbar sind, ist es am besten, nukleinsäuresequenzbasierte Amplifikationsprimer zu entwerfen, die sich auf hochkonservierte Regionen konzentrieren (anstatt das gesamte Genom zu untersuchen). - Laden Sie die erforderliche MATLAB-Software herunter und installieren Sie sie auf dem Computer.
- Richten Sie die Umgebungsvariablen so ein, dass die Funktionen der Nukleinsäure-Designsuite in der Software aufgerufen werden können. Öffnen Sie dazu die Software, und öffnen (oder erstellen) Sie dann eine Datei startup.m im Standardarbeitsordner. Kopieren Sie als Nächstes die folgenden Codezeilen in die Datei startup.m, und fügen Sie schließlich den Ordner mit den Binärdateien der Nucleic Acid Design Suite zum PATH hinzu:
NUPACKINSTALL = '/Benutzer/[user_name]/.../nupack3.2.2';
setenv('NUPACKINSTALL',NUPACKINSTALL);
setenv('PATH',[getenv('PATH'),sprintf(':%s/build/bin',NUPACKINSTALL)]); - Öffnen Sie die Numeric Computing Platform-Software, und navigieren Sie zum Ordner Design Software. Führen Sie die Entwurfsalgorithmen aus, auf die auf https://github.com/AlexGreenLab/TSGEN zugegriffen werden kann.
- Geben Sie die Zielsequenzen in die design_input_file.csv ein, die sich im Eingabeunterordner befindet. Zu den Eingaben gehören Name, äußere Sequenz, innere Sequenz, Temperatur, Ausgabename und Ausgabesequenz, wie in Tabelle 1 definiert. Wenn noch keine Grundierungsstellen für das Ziel festgelegt sind, halten Sie innere und äußere Sequenzen gleich. Nur die ersten 29 nt des Reporters werden während des Designprozesses berücksichtigt. Wenn Sie fertig sind, speichern und schließen Sie die aktualisierte Tabelle.
HINWEIS: Die Ausgabesequenz ist die Sequenz des Reporterproteins, das für den Assay verwendet werden soll (z. B. lacZ). Durch die Angabe der inneren und äußeren Sequenzen wird sichergestellt, dass der Algorithmus keine synthetischen Zehenhalteschalter erzeugt, die sich mit einem der Primer überlappen. Es stellt auch sicher, dass der Assay drei einzigartige Stellen im Zika-Genom erkennt, um seine Spezifität zu verbessern. - Wählen Sie die Parameter aus, die für die Designfunktion verwendet werden sollen: toehold_switch_design_run(num_designs,input_file, Optionen). Füllen Sie die Parameterwerte wie folgt aus:
- num_designs - die Anzahl der Top-Designs für jede Zielausgabe durch die Software. Der Standardwert ist 6 und kann bei Bedarf geändert werden (mindestens sechs Designs für jedes Ziel werden empfohlen).
- input_file - Dieser Parameter gibt den Namen der Datei an, die die Eingabesequenzinformationen bereitstellt. Der Standardwert ist 'design_input_file.csv' und kann bei Bedarf geändert werden.
- Wählen Sie aus den folgenden Optionen - (1) SerieA und SerieB: die Version(en) des Zehenschalters, die der Code generiert. Setzen Sie SeriesB auf 1 und SeriesA auf 0, um den Zehenschalter der Serie B zu generieren, das das Format ist, das in der Zika-Virusdiagnose6 verwendet wird. (2) Parallel: auf 1 gesetzt, um mehrere Kerne zur Berechnung der Designs zu nutzen; Andernfalls auf 0 gesetzt. (3) Antisense: auf 1 gesetzt, um Zehengriffschalter zu erzeugen, die die Antisense-Sequenz (d.h. das umgekehrte Komplement) des Zieleingangs hybridisieren; Andernfalls auf 0 festgelegt.
- Führen Sie die Designfunktion mit den ausgewählten Parametern aus: toehold_switch_design_run(num_designs,input_file,options). Der Algorithmus beginnt dann, die Zehenhalteschalterdesigns für die interessierenden Ziele zu generieren.
- Suchen Sie nach Abschluss des Entwurfs die Designsequenzen des oberen Zehenschalters und die entsprechenden Zielsequenzen im Ordner final_designs in Form von Tabellen im .csv Format. Die vom Algorithmus erzeugten Zehenschalter-DNA-Sequenzen enthalten die T7-Promotorsequenz am 5'-Ende und die konservierte 21-nt-Linkersequenz AACCTGGCGGCAGCGCAAAG am 3'-Ende.
- Screenen Sie die resultierenden Top-Toehold-Switch-Designsequenzen gegen andere gängige Viren, indem Sie sie auf NCBI-BLAST legen und auf Sequenzhomologie prüfen. Akzeptieren Sie Sequenzen mit 40% Homologie oder weniger.
- Ordnen Sie die Zehenschalter-Haarnadelsequenzen als DNA-Oligos an und setzen Sie sie später mit dem Reportergen zu voll funktionsfähigen Schaltern zusammen. Bestellen Sie die notwendigen PCR-Primer für die anschließende Sensormontage in Abhängigkeit vom Reporterprotein Ihrer Wahl.
| Parameter | Definition |
| Name | Die gewünschten Namen der Ausgangs-Zehenschaltersequenzen. |
| Äußere Sequenz | Vollständiges NASBA-Transkript aus Amplifikation. |
| Innere Reihenfolge | Die äußere Sequenz ohne die Primerbindungsstellen. Es stimmt mit der äußeren Sequenz überein, schließt jedoch die Teile der Transkripte aus, die an die Vorwärts- und Rückwärtsprimer binden. |
| Temperatur | Die Temperatur, die von den Algorithmen verwendet wird, um die RNA-Strukturen zu berechnen. |
| Name der Ausgabe | Der Name des Ausgangsgens (z. B. lacZ, gfp). |
| Ausgabereihenfolge | Die Sequenz des Ausgabegens. |
Tabelle 1: Die Definition der einzelnen Parameter, die in der Toehold Switchdesign Software verwendet werden.
3. Konstruktion von Zehengriffschaltern mittels PCR
HINWEIS: Diese Schritte beschreiben den Aufbau von LacZ-Zehenschaltern mittels Überlappungsverlängerungs-PCR. Hier wird der DNA-Oligo als Vorwärtsprimer und der T7-Terminator als Reverse-Primer verwendet. Wir verwenden das pCOLADuet-LacZ-Plasmid als Vorlage für das lacZ-Gen (addgene: 75006). Alle anderen DNA-Vorlagen, die die entsprechende Sequenz enthalten, können als Vorlagen verwendet werden, sofern der T7-Terminator im endgültigen Konstrukt enthalten ist.
- Sobald synthetische DNA-Oligos vom kommerziellen Anbieter erhalten wurden, werden Lösungen der synthetischen DNA und des Reverse-Amplifikationsprimers in einer Konzentration von 10 μM in nukleasefreiem Wasser hergestellt. Reaktionen in PCR-Röhrchen auf Eis gemäß Tabelle 2 zusammensetzen.
HINWEIS: PCR-Volumina können nach Bedarf skaliert werden. Verwenden Sie eine minimale Menge (0,1-1 ng) der pCOLADuet-LacZ-DNA-Vorlage, um die Notwendigkeit eines zusätzlichen Plasmidentfernungsschritts oder Hintergrund-LacZ-Signals zu vermeiden. Für höhere DNA-Vorlagenmengen folgen Sie der PCR mit einem DpnI-Restriktionsenzymverdauen, um die Restplasmidvorlage zu entfernen. - Legen Sie die Reaktionen gemäß den in Tabelle 3 aufgeführten Zyklusbedingungen in einen Thermocycler. Analysieren Sie die PCR-Produkte auf einem Agarosegel (Abbildung 2; siehe Zusatzprotokoll und30).
- Reinigen Sie die PCR-Produkte mit einem Spinsäulen-basierten PCR-Aufreinigungskoffer und eluieren Sie die DNA in 15-30 μL nukleasefreiem Wasser gemäß den Anweisungen des Herstellers. Quantifizieren Sie die DNA mit einem Spektralphotometer.
| Bestandteil | Volumen | Konzentration |
| 5X Q5 Reaktionspuffer | 10 μL | 1x |
| 10 mM dNTPs | 1 μL | 200 μM |
| 10 mM Forward Primer (synthetischer Switch DNA FW) | 2,5 μL | 0,5 μM |
| 10 mM Reverse Primer (T7 Terminator RV) | 2,5 μL | 0,5 μM |
| Template-DNA (pCOLADuet-LacZ) | Variable | <1 ng |
| Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase | 0,5 μL | 0,02 U/μL |
| Nukleasefreies Wasser | bis 50 μL | - |
Tabelle 2: Die PCR-Komponenten, die zur Konstruktion von Zehenschaltern verwendet werden.
| Schritt | Temperatur | Zeit | |
| Erste Denaturierung | 98 °C | 30 s | |
| 35 Zyklen | Denaturierung | 98 °C | 10 s |
| Glühen | 60 °C | 20 s | |
| Erweiterung | 72 °C | 1.45 min | |
| Endgültige Verlängerung | 72 °C | 5 Minuten | |
| Halten | 4 °C | - | |
Tabelle 3: Zyklische Bedingungen, die beim Bau von Zehenhalteschaltern mittels PCR verwendet wurden.
4. Vorbereitung des synthetischen RNA-Targets (Trigger)
- Modifizieren Sie mithilfe einer molekularbiologischen Designsoftware die synthetischen Trigger-RNA-Vorlagen (ausgewählt in Schritt 1.1), um eine vorgeschaltete T7-Promotorsequenz aufzunehmen, um sicherzustellen, dass die vollständige Vorlage kurz bleibt (<200 bp). Entwerfen Sie Vorwärts- und Rückwärtsprimer, um den Triggersequenzprimer zu verstärken (für Oligosequenzen siehe Zusatzprotokoll).
- Ordnen Sie die Sequenzen als DNA-Oligos. Nach Erhalt rekonstituieren Sie die synthetische Trigger-DNA und Amplifikationsprimer auf 10 μM in nukleasefreiem Wasser. Die entsprechenden PCRs werden in dünnwandigen Röhrchen auf Eis gemäß Tabelle 2 zusammengesetzt und 0,5 μL des Trigger-DNA-Ultramers (Endkonzentration von 0,1 μM) als Template-DNA verwendet.
- Legen Sie die Reaktionen in einen Thermocycler und verwenden Sie die in Tabelle 3 aufgeführten Zyklusbedingungen. Verwenden Sie eine Verlängerungszeit von 15 s. Bewerten Sie die Qualität und reinigen Sie PCR-Produkte, wie in Schritt 3.3 und Zusatzprotokoll beschrieben.
HINWEIS: Um den Prozess zu beschleunigen, können säulengereinigte Trigger-PCR-Produkte auch direkt für das erste Zehenhalteschalter-Screening verwendet werden.
5. In-vitro-Transkription ausgewählter Triggersequenzen
- Reaktionskomponenten auf Eis gemäß Tabelle 4 zusammenbauen.
- Inkubieren von I-n-vitro-Transkriptionsreaktionen (IVT) bei 37 °C für 4 h, gefolgt von einer DNase-I-Behandlung, um dieTemplate-DNA zu entfernen. Für den DNase I-Schritt fügen Sie 70 μL nukleasefreies Wasser, 10 μL 10x DNase I Buffer und 2 μL DNase I (RNase-frei) hinzu und inkubieren bei 37 °C für 15 min. Wenn Sie nicht sofort mit Schritt 5.4 fortfahren, inaktivieren Sie DNase I mit der Zugabe von 50 mM EDTA und Wärmeinaktivierung bei 65 °C für 10 min.
- Optionaler Schritt: Führen Sie eine denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Analyse (z. B. Harnstoff-PAGE) an den IVT-Produkten durch, um die RNA-Qualität wie im Zusatzprotokoll beschrieben zu beurteilen.
- Reinigen Sie die Trigger-IVT-Produkte mit einem säulenbasierten RNA-Cleanup-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers und quantifizieren Sie dann die RNA-Konzentration und -Reinheit mittels Spektrophotometrie. Anweisungen zur Bestimmung der Molarität und Kopienzahl/μL der RNA finden Sie im Zusatzprotokoll .
| Bestandteil | Volumen | Konzentration |
| 10X Reaktionspuffer | 1,5 μL | 0,75x |
| 25 mM NTP-Mischung | 6 μL | 7,5 mM |
| Template-Trigger-DNA | X μL | 1 μg |
| T7-RNA-Polymerase-Mix | 1,5 μL | - |
| Nukleasefreies Wasser | X μL | Bis 20 μL |
Tabelle 4: In-vitro-Transkription (IVT) ausgewählter Triggersequenzen.
6. Erstprüfung der Schalter
HINWEIS: In diesem Abschnitt werden die Schritte beschrieben, die mit der Einrichtung von zellfreien, papierbasierten Zehenschalterreaktionen verbunden sind, und wie Sie nach leistungsstarken Zehenschaltern suchen. Das in Schritt 6.10 verwendete BSA-blockierte Filterpapier sollte im Voraus wie im Zusatzprotokoll beschrieben vorbereitet werden.
- Bereiten Sie eine CPRG-Stammlösung vor, indem Sie 25 mg des Pulvers in 1 ml nukleasefreiem Wasser auflösen. Bewahren Sie die Lösung immer auf Eis auf und lagern Sie sie bei -20 °C für eine langfristige Anwendung.
- Bestimmen Sie die Anzahl der einzurichtenden Reaktionen. Fügen Sie für jeden bewerteten Zehengriffschalter eine No-Template-Kontrolle (kein Schalter und keine Ziel-RNA - auch bekannt als zellfreie Alleinkontrolle) hinzu, um jedes Hintergrundsignal zu berücksichtigen, das aus dem Master-Mix entstehen kann. Fügen Sie eine Schaltersteuerung hinzu, um die Leckigkeit des Hintergrundschalters oder die OFF-Rate in Abwesenheit von Ziel-RNA zu beurteilen.
- Eine zellfreie Reaktionsmastermischung aus Lösung A, Lösung B, RNase-Inhibitor und CPRG wird gemäß dem in Tabelle 5 aufgeführten Standardprotokoll auf Eis zusammengestellt.
HINWEIS: Die hier beschriebenen Schritte gelten für eine Mastermischung, die für einen dreifachen Satz von 1,8 μL-Reaktionen mit zusätzlichem 10%-Volumen ausreicht, um den Pipettierfehler zu berücksichtigen. Die Master-Mix-Lautstärke sollte je nach Anzahl der abgeschirmten Zehenschalter nach Bedarf angepasst werden. - Für jede dreifache zellfreie Reaktion die Mastermischung in ein PCR-Röhrchen geben und alle Röhrchen auf Eis halten. Für das Röhrchen, das als zellfreie alleinige Kontrolle beiseite gelegt wird, fügen Sie nukleasefreies Wasser zu einem Endvolumen von 5,84 μL hinzu, mischen Sie durch Pipettieren auf und ab und zentrifugieren Sie kurz. Für den Rest der Röhrchen fügen Sie PCR-gereinigte Zehenschalter-DNA zu einer Endkonzentration von 33 nM hinzu.
- Für Röhrchen, die als Schalter allein vorgesehen sind, fügen Sie nukleasefreies Wasser zu einem Endvolumen von 5,84 μL hinzu. Für Röhrchen, die zum Testen der Zehengriffschalter- und Ziel-RNA-Kombination beiseite gelegt werden, fügen Sie in vitro transkribierte Ziel-RNA zu einer Endkonzentration von 1 μM hinzu. Dann fügen Sie nukleasefreies Wasser zu einem Endvolumen von 5,84 μL hinzu. Mischen Sie alle Reaktionen gründlich, indem Sie auf und ab pipettieren, und zentrifugieren Sie kurz.
- Fügen Sie 30 μL nukleasefreies Wasser in die Vertiefungen rund um die Reaktionstöpfe auf einer schwarzen 384-Well-Platte mit klarem Boden hinzu. Dies minimiert die Verdunstung im Verlauf des Experiments und verbessert die Reproduzierbarkeit.
HINWEIS: Wenn Sie das tragbare Plattenlesegerät verwenden, legen Sie eine PCR-Folie über die Platte und schneiden Sie mit einem Präzisionsmesser die für Ihre Reaktion vorgesehenen Vertiefungen sowie jede der vier Eckmulden aus. Die PCR-Folie verhindert die Überbelichtung der tragbaren Plattenleserkamera aus leeren Vertiefungen. - Schneiden Sie BSA-blockierte Filterpapierscheiben mit einem 2-mm-Biopsiestempel und einer Pinzette in die Reaktionsmulden und legen Sie sie entweder durch Auswerfen des Stempels oder mit einer Pinzette in die Reaktionsmulden (siehe Zusatzprotokoll zur Herstellung von BSA-blockiertem Filterpapier). Geben Sie dreifache 1,8-μL-Volumina aus jedem Reaktionsröhrchen auf die Filterpapierscheiben in der 384-Well-Platte, wobei alle Proben sowie die 384-Well-Platte jederzeit auf Eis bleiben.
HINWEIS: Wenn Sie das tragbare Plattenlesegerät verwenden, fügen Sie 1,8 μL CPRG (0,6 mg/ml) zu jeder der vier Ecken der 384-Well-Platte hinzu. Die gelbe Farbe des CPRG bietet Mustererkennung für den tragbaren Plattenleser zur Ausrichtung der digitalen Multiwell-Plattenvorlage in der Bildanalyse. Decken Sie die Vertiefungen der Platte mit PCR-Film ab, um eine Verdunstung zu verhindern. - Legen Sie die Platte in ein Plattenlesegerät, lesen Sie OD570 bei 37 °C alle min für 130 min.
| Bestandteil | Volumen | Endkonzentration pro Reaktion |
| Lösung A | 2,38 μL | 40% |
| Lösung B | 1,78 μL | 30% |
| RNase-Inhibitor | 0,03 μL | 0,5% v/v |
| CPRG (25 mg / ml) | 0,14 μL | 0,6 mg/ml |
| Zehenschalter | X μL | 33 nM |
| Ziel-RNA | X μL | 1 μM |
| Nukleasefreies Wasser | bis 5,94 μL | - |
| Gesamtvolumen: | 5,94 μL | |
Tabelle 5: PURExpress-zellfreie Transkriptions-Translationsreaktionskomponenten.
7. Identifizieren von leistungsstarken Zehenhalteschaltern
HINWEIS: In diesem Abschnitt wird beschrieben, wie Sie Daten aus Schritt 6 analysieren, um die leistungsstärksten Zehenschalter auszuwählen.
- Beginnen Sie mit der Datenanalyse, indem Sie zunächst die OD570-Absorption im Hintergrund normalisieren. Um dies zu tun, subtrahieren Sie die OD 570-Messungen von Reaktionen, die keine Schalter- oder Ziel-RNA haben (d.h. zellfreie Alone-Wells) von den anderen OD570-Messungen.
- Glätten Sie die normalisierten Daten mit einem gleitenden Drei-Punkte-Durchschnitt und stellen Sie den Mindestwert jedes Wells auf Null ein. In Abbildung 3 sehen Sie ein Beispiel für normalisierte Zeitverlaufsdaten, die für die Zehenhalteschalter 27B, 33B und 47B erfasst wurden.
- Berechnen Sie anhand dieser verarbeiteten Daten die Faltenänderung (oder das ON/OFF-Verhältnis), indem Sie die Differenz in der Farbänderungsrate (d. h. Änderung des OD570 im Laufe der Zeit) zwischen dem Zehenhalteschalter und den Ziel- und Schalterwells allein bestimmen (siehe Zusatzprotokoll zur Berechnung des Verhältnisses ; Abbildung 4).
- Wählen Sie Schalter mit dem höchsten ON/OFF-Faltwechsel zur weiteren Charakterisierung. Lassen Sie die schlecht funktionierenden Zehenhalteschalter weg, die die niedrigste Faltänderung anzeigen.
8. Nukleinsäuresequenz-basiertes Amplifikationsprimer-Screening und Empfindlichkeit
HINWEIS: In den folgenden Schritten wird zuerst ein Screening auf funktionelle isotherme Amplifikationsprimer durchgeführt, und dann wird ihre Empfindlichkeit bewertet, indem die Anzahl der Ziel-RNA-Kopien pro μL synthetischer RNA bestimmt wird, die ein bestimmter Zehengriffschalter zuverlässig erkennen kann, wenn er mit isothermer Amplifikation gekoppelt ist. Führen Sie nach der isothermen Amplifikation zellfreie Reaktionen durch, um erfolgreiche Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikationsprimer-Sets zu identifizieren. Es kann jedoch kostengünstiger sein, Polyacrylamid- oder Agarosegele auf Nukleinsäuresequenz-basierten Amplifikationsreaktionen laufen zu lassen, um zunächst den Pool der Kandidatenprimer-Sets einzugrenzen. In diesem Fall können nukleinsäuresequenzbasierte Amplifikationsprimer-Sets, die eine Bande auf dem Gel in der entsprechenden Amplikongröße erzeugen, für ein anschließendes zellfreies Screening in die engere Wahl gezogen werden.
- Aus allen Vorwärts- und Rückwärtsprimersätzen wird eine 25-μM-Stammlösung in nukleasefreiem Wasser hergestellt (siehe Zusatzprotokoll). Bestimmen Sie die Anzahl der auf Nukleinsäuresequenzen basierenden Amplifikationsreaktionen und nachfolgender zellfreier Reaktionen, die eingerichtet werden müssen. Dies hängt von der Anzahl der Zehenhalteschalter und den jeweiligen Primer-Sets ab.
HINWEIS: Beim Screening der Primer ist es wichtig, für jeden Primersatz immer ein No-Template-Steuerelement einzuschließen, um Hintergrundartefakte zu berücksichtigen, die aufgrund einer unspezifischen Verstärkung im Zusammenhang mit dem Primer auftreten können. - Richten Sie eine 5-μL-Reaktion wie folgt ein (skalieren Sie diese nach Bedarf). Alle Reagenzien auf Eis auftauen. Eine Reaktionsmastermischung aus Reaktionspuffer, Nukleotidmischung und RNase-Inhibitor wird gemäß Tabelle 6 zusammengestellt. Mischen Sie gründlich, indem Sie auf und ab pipettieren, bis der weiße Niederschlag gelöst ist, und geben Sie dann Aliquots in PCR-Röhrchen ab.
- Wenn die Mastermischung für das Screening von Nukleinsäuresequenz-basierten Amplifikationsprimern bestimmt ist, schließen Sie die Primer zunächst aus der Mastermischung aus (2,55 μL Master-Mix abgeben). Andernfalls, wenn eine Primersensitivitätsanalyse durchgeführt wird, können die Primer in die Mastermischung aufgenommen werden (in diesem Fall 2,75 μL Aliquots abgeben). Fügen Sie die Enzymmischung nach den Denaturierungs- und Gleichgewichtsphasen hinzu.
- Wenn Sie Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikationsprimer untersuchen, fügen Sie die Vorwärts- und Rückwärtsprimer zu den entsprechenden Röhrchen hinzu. Richten Sie auf einem Thermocycler das Inkubationsprotokoll wie in Tabelle 7 beschrieben ein.
- Fügen Sie 1 μL entweder nukleasefreies Wasser oder 1 μL Zieltrigger-RNA bei 2 pM oder etwa 106 Kopien/μL hinzu, wobei Sie die Röhrchen entsprechend kennzeichnen. Durch vorsichtiges Pipettieren mischen und die Röhrchen kurz herunterschleudern.
HINWEIS: Verwenden Sie für das Primer-Set-Screening eine Konzentration der Zieltrigger-RNA, die hoch genug ist, um nicht auf die untere Nachweisgrenze der isothermen Amplifikationsmethode zu treffen, aber nicht hoch genug, um den Zehenhalteschalter zu aktivieren, wenn keine Amplifikation stattfinden würde. - Bewegen Sie die Röhrchen zum Thermocycler und starten Sie die Inkubation. Nach 12 min die Röhrchen entfernen und 1,25 μL der Enzymmischung zu jedem Röhrchen geben. Durch Pipettieren auf und ab mischen und die Röhrchen kurz zentrifugieren.
HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können die Rohre bei Raumtemperatur aufbewahrt werden; Die Enzymmischung sollte jedoch auf Eis gehalten werden, bis sie in die Röhrchen gegeben wird. - Bringen Sie die Röhrchen zum Thermocycler zurück und überspringen Sie den 41 °C Hold-Schritt, um die 1-stündige Reaktionsinkubation zu starten.
HINWEIS: Nach der Inkubation können die Reaktionen zur Verarbeitung am selben Tag auf Eis gelegt oder für die spätere Verarbeitung bei -20 °C eingefroren werden. - Führen Sie die Schritte 6.2-6.7 und Tabelle 8 aus, um zellfreie Zehenschalterreaktionen auf Papierbasis zusammenzustellen und die Primerleistung zu bewerten. Analysieren Sie die Daten wie in den Schritten 7.1-7.2 und Abbildung 3 beschrieben.
HINWEIS: Zusätzlich zu den zuvor genannten Kontrollen ist es wichtig, auch die Negativkontrolle einzubeziehen, um Hintergrundsignale zu berücksichtigen, die aus der Reaktion entstehen könnten. Darüber hinaus ist es wichtig, auch eine Kontrolle mit dem Schalter und 2 pM (Endkonzentration) der Ziel-RNA als No-NASBA-Amplifikationskontrolle einzubeziehen. - Identifizieren Sie mögliche Primerpaare, um mit der Sensitivitätsanalyse fortzufahren. Primerpaare werden basierend darauf ausgewählt, ob die Aktivierung des Zehengriffschalters nach der Zugabe der inkubierten Reaktion erfolgt. Wiederholen Sie bei Bedarf das Primer-Screen mit weiteren Primer-Kombinationen.
- Wenn Sie die RNA-Proben immer auf Eis halten, machen Sie den folgenden seriellen Verdünnungssatz von Ziel-RNAs in nukleasefreiem Wasser: 104, 103, 10 2, 101 und 100 RNA-Kopien/μL. Wiederholen Sie die auf Nukleinsäuresequenz basierende Amplifikation und zellfreie Reaktionen mit den ausgewählten Primer-Sets (Schritte 8.2-8.7), und testen Sie die serielle Verdünnungsserie, um die Primer-Sets zu identifizieren, die die beste Empfindlichkeit bieten. In Abbildung 5 finden Sie ein Beispiel für Ergebnisse zur Bestimmung der Primer-Set-Empfindlichkeit.
HINWEIS: Idealerweise sollten der ausgewählte Zehenschalter und das Primerpaar nur 1-100 Ziel-RNA-Kopien pro μL der RNA (Stammlösungskonzentration) nachweisen. - Wiederholen Sie das auf Nukleinsäuresequenzen basierende Amplifikationssensitivitätsexperiment in biologischer dreifacher Ausfertigung. Dieser Schritt dient dazu, die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu bestätigen, bevor zu Experimenten mit Patientenproben übergegangen wird.
- Wahlfrei: Um eine zuverlässige Quelle der Switch-DNA für den Langzeitgebrauch und den Transport zu erhalten, klonen Sie die ausgewählte(n) Switch-Sequenz(en) mit einer herkömmlichen Klonierungsmethode in ein Plasmid. In ähnlicher Weise kann die Zieltrigger-RNA-Sequenz auch zur Speicherung in ein Plasmid der Wahl kloniert werden.
| Bestandteil | Volumen pro Reaktion | Endkonzentration |
| NASBA-Reaktionspuffer | 1,67 μL | 1x |
| NASBA-Nukleotid-Mix | 0,833 μL | 1x |
| 25 μM Vorwärtsprimer | 0,1 μL | 0,5 μM |
| 25 μM Reverse Primer | 0,1 μL | 0,5 μM |
| RNase-Inhibitor (40 U/μL) | 0,05 μL | 0,4 U/μL |
| Ziel-RNA | 1 μL | |
| NASBA Enzymmischung | 1,25 μL | 1x |
| Gesamtvolumen | 5 μL |
Tabelle 6: NASBA-Reaktionskomponenten.
| Schritt | Temperatur | Zeit |
| Denaturierung | 65 °C | 2 Minuten |
| Gleichgewicht | 41 °C | 10 Minuten |
| Halten | 41 °C | ∞ |
| Inkubation | 41 °C | 1 Std. |
| Halten | 4 °C | - |
Tabelle 7: Reaktionsbedingungen für die NASBA.
| Bestandteil | Volumen | Endkonzentration pro Reaktion |
| Lösung A | 2,38 μL | 40% |
| Lösung B | 1,78 μL | 30% |
| RNase-Inhibitor | 0,03 μL | 0,5% v/v |
| CPRG (25 mg / ml) | 0,14 μL | 0,6 mg/ml |
| Zehenschalter | X μL | 33 nM |
| Ziel-RNA (falls zutreffend) | X μL | 1 μM |
| NASBA (falls zutreffend) | 0,85 μL | 1:7 |
| Nukleasefreies Wasser | bis 5,94 μL | - |
| Gesamtvolumen: | 5,94 μL | |
Tabelle 8: Papierbasierte zellfreie Reaktionskomponenten.
9. Entnahme von Patientenproben und Extraktion viraler RNA
HINWEIS: In diesem Abschnitt wird das Protokoll zur Entnahme von Patientenproben und zur Extraktion der RNA mit einem RNA-Reinigungskit beschrieben. Das folgende Protokoll wird verwendet, um Serum aus peripherem Blut zu gewinnen. Die in dieser Studie verwendeten Proben wurden von Patienten mit Fieber, Exanthem, Arthralgie oder anderen verwandten Symptomen einer Arbovirus-Infektion im Bundesstaat Pernambuco, Brasilien, gesammelt.
- Sammeln Sie periphere Blutproben von mit Verdacht auf Arbovirus infizierte Patienten. Führen Sie Venenpunktion (Vollblutröhrchen) mit einer aseptischen Standardtechnik durch. Beschriften Sie die Probenröhrchen mit einem anonymen Code und dem Datum der Probenentnahme.
- Zentrifugieren Sie das Blut, um das Serum bei 2.300 x g für 10 min zu trennen. Bereiten Sie mit einer Pipette Aliquots von Serum (200 μL) vor, die für die RNA-Extraktion in 1,5-ml-Röhrchen verwendet werden.
HINWEIS: Wenn es nicht möglich ist, die RNA-Extraktion kurz nach der Probenentnahme durchzuführen, sollten Serumproben vor der nachgeschalteten Anwendung bei -80 °C gelagert werden. - 560 μL des vorbereiteten Puffers AVL (viraler Lysepuffer), der die Träger-RNA enthält, werden in ein 1,5 ml Röhrchen pipettiert. Geben Sie 140 μL Serum in die Buffer AVL/Carrier RNA-Mischung im Röhrchen. Mischen Sie durch Pulswirbeln für 15 s.
- Inkubieren Sie für 10 min bei Raumtemperatur und zentrifugieren Sie dann kurz die Probe, um den Inhalt am Boden des Röhrchens zu sammeln. 560 μL Ethanol (96%-100%) in die Probe geben und durch Impulswirbeln für 15 s mischen. Zentrifugieren Sie die Probe nach dem Mischen, um den Inhalt am Boden des Röhrchens zu sammeln.
- 630 μL der Lösung aus Schritt 9.4 werden vorsichtig in die Spinsäule gegeben, ohne den Rand zu benetzen. Nach diesem Schritt schließen Sie die Kappe und zentrifugieren Sie bei 6.000 x g für 1 Minute. Legen Sie die Spin-Säule in ein sauberes 2-ml-Sammelröhrchen und entsorgen Sie das gebrauchte Sammelröhrchen mit dem Filtrat.
- Öffnen Sie vorsichtig die Spin-Spalte und wiederholen Sie Schritt 9.5. Öffnen Sie vorsichtig die Schleudersäule und fügen Sie 500 μL Puffer AW1 (Waschpuffer 1) hinzu. Schließen Sie die Kappe und zentrifugieren Sie bei 6.000 x g für 1 Minute. Legen Sie die Spin-Säule in ein sauberes 2-ml-Sammelröhrchen und entsorgen Sie das gebrauchte Sammelröhrchen mit dem Filtrat.
- Öffnen Sie vorsichtig die Schleudersäule und fügen Sie 500 μL Puffer AW2 (Waschpuffer 2) hinzu. Kappe schließen und bei 20.000 x g für 3 min zentrifugieren. Legen Sie die Spin-Säule in ein sauberes 2-ml-Sammelröhrchen und entsorgen Sie das gebrauchte Sammelröhrchen mit dem Filtrat.
- Um eine Kontamination durch Restpuffer AW2 zu vermeiden, die Probleme bei nachgeschalteten enzymatischen Reaktionen verursachen könnte, legen Sie die Spin-Säule in ein sauberes 2-ml-Sammelröhrchen und entsorgen Sie das gebrauchte Sammelröhrchen mit dem Filtrat. Zentrifugieren bei 20.000 x g für 1 min.
- Legen Sie die Spin-Säule in ein sauberes 1,5-ml-Röhrchen und entsorgen Sie das gebrauchte Sammelröhrchen mit dem Filtrat. Öffnen Sie vorsichtig die Spin-Säule und fügen Sie 60 μL Buffer AVE (Elutionspuffer) auf Raumtemperatur ein. Nach diesem Schritt schließen Sie die Kappe und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 1 Minute.
- Zentrifuge bei 6.000 x g für 1 min. Die eluierte RNA kann dann parallel als Input für die NASBA und RT-qPCRs verwendet werden.
- Befolgen Sie die Schritte 8.3 bis 8.11, um die nukleinsäuresequenzbasierte Amplifikation und papierbasierte zellfreie Reaktionen unter Verwendung von 1 μL extrahierter Patienten-RNA durchzuführen, wobei sichergestellt wird, dass negative und positive Kontrollreaktionen eingeschlossen sind. Nach den Reaktionen ist die Reaktionsplatte 384 Well vorzubereiten und den Assay im tragbaren Plattenlesegerät bei 37 °C durchzuführen (siehe Einzelheiten im Zusatzprotokoll).
HINWEIS: Zwei RNA-Konzentrationen von 104 und 102 PFU/ml, extrahiert aus kultiviertem Zika-Virus, werden während der klinischen Validierung als Positivkontrollen für alle Experimente verwendet. Zusätzlich zu den zuvor genannten Kontrollen ist es wichtig, auch den Trigger (10 ng/μL) als Positivkontrolle einzubeziehen. - Am Ende jedes Experiments können die Rohdaten (.csv Datei) aus dem prtable Plattenleser online in eine sichere Datenbank hochgeladen werden. Darüber hinaus generiert das tragbare Plattenlesegerät einen Bericht, der angibt, ob die Proben positiv oder negativ für das Zika-Virus sind (Abbildung 6); Beispiele für alle während der Inkubation erhaltenen Diagramme finden Sie im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse (Abbildung 7).
HINWEIS: Benutzer können Dateien auch vom tragbaren Plattenleser über USB auf ihren eigenen Computer übertragen.
10. Tragbares Plattenlesegerät
- Die tragbare Plattenlesevorrichtung (Bild 8) kann als Alternative zu einem herkömmlichen Plattenlesegerät24 verwendet werden. Das Protokoll und die repräsentativen Ergebnisse finden Sie unter Zusatzprotokoll.
11. RT-qPCR zum Nachweis des Zika-Virus
HINWEIS: In diesem Abschnitt werden die Schritte zur Durchführung der RT-qPCR zum Nachweis des Zika-Virus anhand von Patientenproben beschrieben (siehe Zusatzprotokoll).
- Um eine Kontamination zu vermeiden, montieren Sie die RT-qPCR-Komponenten in einem vom Amplifikationsprozess isolierten Bereich (z. B. Clean-Hood). Legen Sie den RT-qPCR-Puffer, die Enzyme und den Primer/die Sonden auf Eis oder einen Cold-Block. Anschließend fügen Sie die Reaktionen zu einer 384-Well-Platte auf Eis gemäß Tabelle 9 hinzu.
HINWEIS: Negative (Extraktionskontrolle und Nicht-Schablonenkontrolle [NTC]) und Positivkontrolle (104 PFU/ml) werden für alle Experimente empfohlen. - Nachdem Sie die Reagenzien in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben haben, mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren auf und ab (nicht vortex) und geben Sie 6,5 μL in jede Vertiefung ab. Fügen Sie 3,5 μL jeder RNA-Vorlage in dreifacher Ausfertigung hinzu.
- Legen Sie einen PCR-Film über die Oberseite der Platte. Zentrifugieren Sie die 384-Well-Platte bei 600 x g für 2 min.
- Legen Sie die Platte unter Verwendung der folgenden in Tabelle 10 beschriebenen Zyklusbedingungen in ein RT-qPCR-Gerät. Um die Ergebnisse zu analysieren, verwenden Sie die RT-qPCR Maschinendesign- und Analysesoftware und berücksichtigen Sie den automatischen Schwellenwert und die Baseline (siehe Details im Zusatzprotokoll).
| Bestandteil | Volumen | Konzentration |
| 2X QuantiNova Sonde RT-PCR Master Mix | 5 μL | 1 x |
| 100 μM Vorwärtsprimer | 0,08 μL | 0,8 μM |
| 100 μM Reverse Primer | 0,08 μL | 0,8 μM |
| 25 μM Sonde | 0,04 μL | 0,1 μM |
| QuantiNova ROX Referenzfarbstoff | 0,05 μL | 1 x |
| QuantiNova Sonde RT Mix | 0,1 μL | 1 x |
| Template-RNA | 3,5 μL | - |
| Nukleasefreies Wasser | bis 10 μL | - |
Tabelle 9: RT-qPCR-Komponenten zur Amplifikation der Zika-Virus-RNA basierend auf dem Protokoll der Centers for Disease Control and Prevention-CDC USA zum Nachweis des Zika-Virus aus Patientenproben31.
| Schritt | Temperatur | Zeit | |
| Reverse Transkription | 45 °C | 15 Minuten | |
| PCR-Initialer Aktivierungsschritt | 95 °C | 5 Minuten | |
| 45 Zyklen | Denaturierung | 95 °C | 5 s |
| Kombiniertes Glühen/Ausdehnen | 60 °C | 45 s | |
Tabelle 10: Zyklusbedingungen für RT-qPCR.
Representative Results
Im Anschluss an die Computational Design Pipeline wurde der Bau von drei Zehenhalteschaltern mittels PCR durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden mittels Agarose-Gelelektrophorese analysiert (Abbildung 2). Das Vorhandensein einer klaren Bande um 3.000 bp, etwa so groß wie das lacZ-Gen , das an einen Zehenschalter gekoppelt ist, deutet typischerweise auf eine erfolgreiche Reaktion hin. Alternativ weist eine Lane ohne Band, mehrere Bänder oder ein Band der falschen Größe auf eine fehlgeschlagene PCR hin. Im Falle einer fehlgeschlagenen PCR sollten die Reaktionsbedingungen und/oder Primersequenzen optimiert werden.
Die zusammengebauten Zehenschalter wurden gescreent, um jeden Sensor anhand seiner jeweiligen in vitro transkribierten Trigger-RNA zu bewerten (Abbildung 3). Während alle drei Sensoren eine erhöhte OD570-Absorption aufwiesen, hatte der Schalter 27B (Abbildung 3A) die schnellste On-Rate. Die Schalter 33B und in geringerem Maße 47B zeigten eine erhöhte OD570-Absorption in Abwesenheit von Zieltrigger-RNA, was darauf hindeutet, dass diese Schalter eine gewisse Hintergrundaktivität oder Undichtigkeit aufweisen (Abbildung 3B, C) - ein Merkmal, das in einem Kandidatensensor nicht erwünscht ist, da es die Spezifität reduzieren kann. Um den Sensor mit dem höchsten ON/OFF-Signalverhältnis eindeutiger zu identifizieren, wurde die Faltenänderung der OD570-Absorption berechnet (siehe ergänzende Informationen Abschnitt 5) und aufgetragen (Abbildung 4). Aus dieser Analyse geht hervor, dass der Schalter 27B mit einem ON/OFF-Verhältnis von rund 60 der Sensor mit der besten Leistung ist.
Die Empfindlichkeit des leistungsstärksten Zehengriffschalters (27B) wurde dann bewertet, indem die niedrigste RNA-Konzentration bestimmt wurde, die erforderlich ist, um den Zehenhalteschalter in Verbindung mit einer NASBA-Reaktion zu aktivieren. Die Grafik zeigt, dass die leistungsfähigsten Zika-Sensoren RNA in Konzentrationen von nur 1,24 Molekülen pro μL (entspricht ~2 aM; Abbildung 5).
Nachdem Schalter 27B identifiziert und validiert war, wurden die Sensormaterialien an die Teammitglieder in Recife im brasilianischen Bundesstaat Pernambuco verteilt. In Brasilien wurde die klinische diagnostische Genauigkeit der Zika-Virus-Diagnoseplattform anhand von Zika-Virus-Patientenproben parallel zur RT-qPCR zum Vergleich bewertet. Zur Validierung der papierbasierten Zika-Diagnoseplattform wurde der tragbare Plattenleser verwendet, der in der Lage ist, die kolorimetrische Ausgabe von papierbasierten Sensoren zu inkubieren und zu lesen. Die Farbänderung von gelb zu violett wird verwendet, um eine positive Probe zu identifizieren, während eine negative Probe gelb bleibt (Abbildung 6). Eine weitere Option zur Visualisierung der vom tragbaren Plattenlesegerät generierten Ergebnisse (Abbildung 8) besteht darin, die kolorimetrische Reaktion für jede papierbasierte Reaktion im Zeitverlauf darzustellen. Die Proben wurden dreifach getestet und diejenigen, die den Schwellenwert überschritten (rote Linie auf 1 gesetzt), wurden als positiv eingestuft, während Proben unterhalb des Schwellenwerts als negativ eingestuft wurden (Abbildung 6 und Abbildung 7).
Um schließlich die klinische Leistung des Zika-Zehenschaltersensors mit der aktuellen Goldstandardmethode zur Diagnose einer Zika-Virusinfektion zu bewerten und zu vergleichen, wurden alle Patientenproben parallel zur RT-qPCR getestet. Das Amplifikationsdiagramm von zwei repräsentativen Patientenproben wurde in dreifacher Ausfertigung auf den Nachweis des Zika-Virus mittels RT-qPCR getestet (Abbildung 9). Die Proben gelten als positiv, wenn der Zyklusschwellenwert (Ct) ≤38 beträgt; Die rote Linie zeigt eine positive Probe an und die blaue Linie zeigt eine negative Probe für das Zika-Virus an.
Abbildung 2: Agarose-Gelelektrophorese zur Beurteilung der Qualität von PCR-Produkten. PCR-Produkte werden auf einem 1% igen Agarosegel in 1X TAE analysiert, das bei 80 V für 90 min betrieben wird. Ein einzelnes klares Band zeigt typischerweise eine erfolgreiche Reaktion an. Bahn 1: 1 kb DNA-Leiter; Bahnen 2-4: 27B-Schalter-DNA, 33B-Trigger-DNA bzw. 47B-Trigger-DNA. Die Zahlen auf der linken Seite stellen die Bandgröße in bp dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Prototyping von drei Zehenhalteschaltern für papierbasierte Zika-Sensoren. Die Leistung von drei papierbasierten RNA-Zehenschaltersensoren wurde bei 37 °C über 130 min gemessen. Jedes Diagramm enthält zwei Ablaufverfolgungen, von denen eine das Nur-Switch-Steuerelement darstellt, während die andere den Schalter und den Trigger darstellt. Die drei Diagramme stellen Daten dar, die mit den Zehenschaltersensoren 27B (A), 33B (B) und 47B (C) erfasst wurden. Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts (REM) aus drei Replikaten dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Leistungsstarke Sensoren werden durch Berechnung der Faltenänderung der Absorption bei 570 nm identifiziert. Der Faltwechsel (oder das maximale ON/OFF-Verhältnis) wird berechnet, indem das Absorptionsverhältnis (OD570) bei 130 Minuten zwischen der reinen Schaltsteuerung und dem Schalter plus Trigger-CFPS-Assay gemessen wird. Fehlerbalken stellen SEM aus drei Replikaten dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Sensitivitätsbewertung des leistungsstärksten Schalters. In vitro transkribierte Zika-RNA wird in NASBA-Reaktionen titriert. Nach einer 1 h Inkubation wurden die Reaktionen zu zellfreien PURExpress-Reaktionen auf Papierscheiben im Verhältnis 1:7 addiert. Der Faltenwechsel nach 130 min bei 37 °C wird aufgetragen. Diese Zahl wurde von24 reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Tragbare Plattenlesegeräte-Aufnahmeseite mit erfassten Bilddaten geladen. Diese Abbildung zeigt ein Beispielbild des endgültigen Bildes, das vom tragbaren Plattenleser während einer Datenerfassungsfahrt aufgenommen wurde. Der ursprüngliche Datums-/Zeitstempel ist oben im Bild sichtbar. Die gelbe Farbe zeigt Kontroll- oder negative Reaktionen an, und die violette Farbe zeigt eine positive Reaktion an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Datenanalysemodus. Auf der linken Seite wählen Benutzer die Datensätze aus, die sie plotten möchten. Die Diagramme werden dann auf der rechten Seite mit eindeutigen Farben für jedes Beispiel oder Kontrollset angezeigt. Die gestrichelte rote Linie dient als Schwellenwert für die Bestimmung positiver und negativer Proben. In dreifacher Ausfertigung getestete Proben, die den Schwellenwert überschreiten, gelten als positiv, während Proben unterhalb des Schwellenwerts als negativ gelten. Fehlerindikatoren stellen die Standardabweichung (SD) von drei Replikaten dar. Strg 1 bis Strg 5 kennzeichnet Steuerelemente. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 8. PLUM, ein tragbarer Plattenleser. Dieser tragbare Plattenleser fungiert als Lab-in-a-Box und dient als temperaturgesteuerter Plattenleser zur Inkubation und Überwachung kolorimetrischer Reaktionen. Dieses tragbare Gerät kann quantitative und Hochdurchsatzmessungen der papierbasierten Zika-Sensoren vor Ort durchführen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 9: RT-qPCR-Diagramm der Amplifikation von zwei Patientenproben, die in dreifacher Ausfertigung zum Nachweis des Zika-Virus getestet wurden. Proben gelten als positiv, wenn der Zyklusschwellenwert (Ct) ≤38 beträgt. Die gestrichelte rote Linie dient als Schwellenwert für die Bestimmung positiver und negativer Proben. Die rote Spur zeigt eine positive Probe an, und die blaue Spur zeigt eine negative Probe an. Der ΔRn-Wert (delta Rn) stellt die normalisierte Größe des Fluoreszenzsignals dar, das vom RT-qPCR-Instrument für alle getesteten Proben detektiert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Protokolldatei. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Zahlen. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildungen herunterzuladen.
Discussion
Das hier beschriebene kombinierte papierbasierte System kann klinisch relevante molekulare Diagnostik mit einer Leistung, die funktionell mit der RT-qPCR vergleichbar ist, an den Point-of-Needbringen 6. Wichtig ist, dass bei Remote-Einstellungen die Verfügbarkeit von Diagnosen vor Ort die Zeit bis zum Ergebnis von Tagen auf Stunden verkürzen kann. Um die Programmierbarkeit dieses Ansatzes hervorzuheben, kann die beschriebene Pipeline verwendet werden, um praktisch jedes Erregerziel zu erkennen. Wir haben die molekularen Werkzeuge mit einem speziell entwickelten tragbaren Plattenleser kombiniert, der kompakt und mit dem Batteriebetrieb (8-9 h) kompatibel ist und eine integrierte Datenanalyse bietet, um verteilte Anwendungen zu ermöglichen. In anderen Arbeiten haben wir die kombinierte Hardware und die Zika-Virus-Diagnoseplattform mit 268 Patientenproben parallel zur RT-qPCR validiert und eine diagnostische Genauigkeit von 98,5% gefunden24. Zusammengenommen ist es unser Ziel, den Technologietransfer dieser Plattform an Forscher zu ermöglichen, damit sie von der Gemeinschaft umfunktioniert und verbessert werden kann, um unerfüllte diagnostische Bedürfnisse zu adressieren.
Der Designprozess von In-silico-Zehenschaltern wurde in eine Pipeline integriert und automatisiert, die in drei Stufen unterteilt werden kann. Die erste Stufe erzeugt einen Pool von Zehenschalterdesigns, die in einem Nukleotidschritt zur Zielsequenz hybridisiert werden. Die zweite Stufe untersucht die Sekundärstruktur und die Verfügbarkeit von Zehenhalteschaltern und eliminiert Sensoren mit vorzeitigen Stopp-Codons im Rahmen. Eine Bewertungsfunktion, die mehrere Faktoren berücksichtigt (z. B. Fehlergrad des Zehenschalters, Verfügbarkeit des Zehengriffschalters und Zugänglichkeit des Zielstandorts), wird dann implementiert, um die besten Zehenschalterdesigns basierend auf den Gesamtergebnissen auszuwählen. In der letzten Phase wird eine Liste von Sequenzen für die oberen Zehengriffschalterdesigns und die entsprechenden Zielauslöser generiert. Die Top-Sensorsequenzen sollten unter Verwendung von NCBI/Primer-BLAST25 auf Spezifität gegen das menschliche Transkriptom und eng verwandte virale Genome untersucht werden. Es ist auch eine bewährte Methode, die Sensorzielstellen auf Sequenzkonservierung im Zika-Virusgenom zu untersuchen, um sicherzustellen, dass die Sensoren eine breite und robuste Detektion bieten. Es wurden mehrere Versionen der Zehenschalter-Designsoftware entwickelt, und der Designalgorithmus ermöglicht es Benutzern, zwei Versionen zu generieren, entweder Serie A 6 oder Serie B Zehenschalter6. In diesem Artikel lag der Fokus auf dem Design der Zehenschalter der Serie B.
Nach der kommerziellen DNA-Synthese können die Zehengriffschalter schnell zusammengesetzt und dann getestet werden, indem ein erstes Screening gegen eine synthetische Zieltriggersequenz durchgeführt wird, die kurzen Regionen (200-300 nt) des Zielgenoms entspricht. Um die Leistung von Zehenschalter-basierten Sensoren zu überprüfen, ist es ideal, die Zielsequenz in Form von RNA hinzuzufügen. In diesem Artikel wurden die Schritte beschrieben, die erforderlich sind, um in vitro transkribierte Trigger-RNA hinzuzufügen. Falls verfügbar, können jedoch vollständige Genomvorlagen wie quantifizierte virale RNA-Extrakte oder kommerzielle synthetische RNA-Genome oder -Standards verwendet werden. Die Verwendung von RNA-Genomen in voller Länge für das anfängliche Zehenschalter-Screening ist von Vorteil, da es Aufschluss darüber geben kann, ob zusätzliche Faktoren, wie die RNA-Sekundärstruktur, die Sensorleistung beeinflussen. Um das ON/OFF-Verhältnis von Kandidatenschaltern zu optimieren, kann die Toehold-Schalter-DNA in die zellfreie Reaktion titriert werden. Dieser Schritt kann auch dazu dienen, leistungsstarke Zehenhalteschalter (Faltverstärkung oder hohes ON/OFF-Verhältnis) zu identifizieren und undichte Zehenhalteschalter (hohes Signal in Abwesenheit der Ziel-RNA) aus nachgeschalteten Charakterisierungsschritten auszulassen.
Um die Nachweisgrenze der leistungsstärksten Toehold-Switch-Kandidaten zu verbessern, wird NASBA verwendet, um klinisch relevante Konzentrationen von Ziel-Zika-viraler RNA auf ein Niveau zu erhöhen, das mit Zehenschaltern nachgewiesen werden kann6. Verschiedene Kombinationen von Vorwärts- und Rückwärts-Primer-Sets werden gescreent, um die besten NASBA-Primer- und Zehenhalteschalterkombinationen zu bestimmen, um eine Detektion bei klinisch relevanten Konzentrationen zu ermöglichen. Sobald eine ideale Kombination aus Primer-Set und Zehenhalteschalter identifiziert wurde, wird der Assay zur klinischen Validierung weitergeleitet. Es ist wichtig zu beachten, dass die Zehenschalter- und NASBA-Screening-Stufen arbeits- und ressourcenintensiv sein können und daher die Testentwicklung am besten für gut ausgestattete Forschungsstandorte geeignet ist. Obwohl wir keine Prozessautomatisierung angewendet haben, ist es wahrscheinlich, dass dies den iterativen Entwurfs-, Erstellungs- und Testzyklusbeschleunigen könnte 32. Glücklicherweise kann die Bearbeitungszeit vom Sensordesign und -test bis zur Bereitstellung bemerkenswert kurz sein (weniger als eine Woche), was diese Strategie ideal für zeitkritische Situationen wie Epidemieausbrüche macht6.
Auch nach der Entwicklung eines Biosensors mit klinisch relevanter Sensitivität gibt es technische Herausforderungen, die angegangen werden müssen. Da dieses Protokoll eine manuelle Bedienung erfordert und ein mehrstufiges Verfahren ist, besteht die Gefahr einer Kreuzkontamination zwischen den Proben. Wir tun unser Bestes, um dieses Risiko durch sorgfältige Laborpraxis zu verringern. In einer kürzlich durchgeführten klinischen Studie mit 268 Patientenproben traten keine Kontaminationsprobleme auf. Dies ist jedoch eine wichtige Überlegung24. Vor diesem Hintergrund bleibt das Protokoll ein Laborassay und erfordert einen erfahrenen Benutzer mit der Beherrschung der richtigen molekularbiologischen Techniken. Eine weitere Überlegung für den Einsatz ist die RNA-Isolierung aus Patientenproben. Hier beschreiben wir die RNA-Isolierung mit säulenbasierten Nukleinsäure-Extraktionskits. In anderen Arbeiten haben wir jedoch eine effektive und einfache Siedelysemethode (95 °C für 2 min) für die Probenverarbeitung von Patienten mit geringer Belastung demonstriert6. Diese Strategie eliminiert nahezu die mit der RNA-Extraktion verbundenen Kosten und vermeidet die Verwendung von säulenbasierten Nukleinsäure-Extraktionskits, die in ressourcenarmen Umgebungen oder Lieferkettenproblemen während Krisen wie der COVID-19-Pandemie eine logistische Herausforderung darstellen können33.
Wie wir während der COVID-19-Pandemie gesehen haben, können die Instrumente, die zur Durchführung der RT-qPCR verwendet werden, selbst als Engpass dienen und den Zugang der Patienten zu Tests einschränken. Dieser Faktor, der auch weitgehend finanzieller Natur ist, führt zu einem zentralisierten Testmodus, der den Diagnosezugriff einschränken kann. Während des Zika-Ausbruchs 2015/2016 standen beispielsweise nur fünf nationale Referenzlabore in Brasilien zur Verfügung, was zu Verzögerungen bei Patiententests führte. Ohne den potenziellen Nutzen von Skaleneffekten zu berücksichtigen, betragen die aktuellen Warenkosten für den tragbaren Plattenleser ~ 500 USD, was selbst wenn es um das Fünffache erhöht wird, um die Arbeits- und Handelsmarge zu berücksichtigen, immer noch ein erschwingliches Instrument darstellt. Dies ist gut vergleichbar mit RT-qPCR-Instrumenten, deren Kosten zwischen 15.000 und 90.000 USD34 liegen. Darüber hinaus betragen die geschätzten Kosten pro Test für den zellfreien Assay in Lateinamerika rund 5,48 USD, während die Kosten pro Test der RT-qPCR in Brasilien zum Zeitpunkt des Zika-Ausbruchs ~ 10-11 USD betrugen36. Neben den Kosten für die Ausrüstung hat der tragbare Plattenleser eine geringe Stellfläche (20 cm3), automatische Analyse, Datenupload in die Cloud über das Internet und kann mit Batteriestrom betrieben werden. Diese Funktionen erweitern die potenziellen Umgebungen, in denen Tests eingesetzt werden können, drastisch und erweitern gleichzeitig die Patientenpopulation, die versorgt werden kann.
Bis heute sind die gebräuchlichsten kommerziellen E. coli CFPS-Plattformen die Systeme S30 und PURE37; Ein wichtiger Aspekt bei der Verbesserung des Zugangs zu Diagnostika in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen ist jedoch die begrenzte Verfügbarkeit dieser Reagenzien im Inland. Ein wichtiger Schritt zur Lösung dieser Herausforderung ist der Ausbau der lokalen CFPS-Produktion. Das Federici-Labor hat kürzlich bedeutende Fortschritte bei der Entwicklung einer nichtkommerziellen Plattform zur Implementierung von Zehenschalter-basierten Sensoren in zellfreien Systemen auf Lysatbasis erzielt und mit Zika-Virus-RNA14 eine LOD von 2,7 fM erreicht. Diese Leistung ermöglicht nicht nur, dass die Reagenzien im Einsatzland hergestellt werden, wodurch Einfuhrzölle und Verzögerungen vermieden werden, sondern die Arbeitskosten skalieren auch auf lokale Tarife, wodurch die Gesamtkosten erheblich gesenkt werden können. In der von der Federici-Gruppe skizzierten Arbeit beliefen sich die Kosten für die Herstellung der CFPS-Expressionsreaktion (5 μL) in Chile auf 6,9 Cent (USD) 35,38, was einen doppelten Anreiz (verbesserte Logistik und Kosten) für die Implementierung lysatbasierter Systeme darstellt 35,38.
Die Platzierung von RT-qPCR-vergleichbaren Tests in verteilten Diagnosenetzwerken könnte erhebliche Vorteile gegenüber den derzeitigen Praktiken bringen, die vom Transport von Proben zu zentralisierten RT-qPCR-Einrichtungen abhängen. In peri-urbanen Umgebungen, in denen Zika-Fälle konzentriert waren, verlangsamt die physische Entfernung zwischen einem Patienten und der Diagnoseeinrichtung die Diagnose und erhöht das Risiko, dass die Ergebnisse den Patienten zu einem klinisch relevanten Zeitpunkt nicht erreichen. Wir hoffen, dass die hier vorgestellte Arbeit dazu beitragen kann, dass die Forschungsgemeinschaft durch Wissenstransfer dezentrale Biotechnologien und tragbare Hardware für die Überwachung der menschlichen Gesundheit, der Landwirtschaft und der Umwelt schaffen kann.
Disclosures
K.P. und A.A.G. sind Miterfinder papierbasierter Zehensensortechnologien. Y.G., S.C. und K.P. sind Mitbegründer von LSK Technologies, Inc. und Miterfinder der PLUM-bezogenen Technologien. M.K., K.P. und A.A.G. sind Mitbegründer von En Carta Diagnostics Ltd. Andere Autoren haben keine Interessenkonflikte. Patente: PLUM-Gerät: Y.G., S.C. und K.P. Die Patentanmeldung wurde von der University of Toronto eingereicht und LSK Technologies Inc. zugewiesen. U. S. Provisional Patent Application No. 62/982,323, eingereicht am 27. Februar 2020; Zehenschalterpatent: A.A.G., P.Y. und J.J. C. "Riboregulator compositions and methods of use", Patent. WO2014074648A3 eingereicht am 6. November 2012; Papierbasiertes diagnostisches Patent: K.P. und J.J.C. "Paper-based synthetic gene networks" U.S. Patent angemeldet Nr. US15/963.831, eingereicht am 6. Dezember 2013; Zika-Patent 1: K.P., A.A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F. und J.J.C., "Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform", vorläufige US-Patentanmeldung Nr. 62/403,778, eingereicht am 4. Oktober 2016; Zika-Patent 2: K.P., A. A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F. und J.J.C., "Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform", vorläufige US-Patentanmeldung Nr. 62/341,221, eingereicht am 25. Mai 2016.
Acknowledgments
Die Autoren danken allen Mitgliedern der Green-, Pardee- und Pena-Labore sowie allen Co-Autoren früherer Manuskripte, die sich auf die in diesem Manuskript offenbarte Arbeit beziehen. S.J.R.d.S. wurde durch ein PhD-Stipendium der Foundation for Science and Technology of Pernambuco (FACEPE), Brasilien, Referenznummer IBPG-1321-2.12/18, unterstützt und wird derzeit durch ein Postdoc-Stipendium der University of Toronto, Kanada, unterstützt. P.B. wird durch den William Knapp Buckley Award der Fakultät für Pharmazie der University of Toronto unterstützt. M.K. wurde von der Precision Medicine Initiative (PRiME) an der University of Toronto mit der internen Fellowship-Nummer PRMF2019-002 unterstützt. Diese Arbeit wurde durch Mittel an K.P aus dem Canada Research Chairs Program (Dateien 950-231075 und 950-233107), den Major Research Project Management Fund der University of Toronto, das CIHR Foundation Grant Program (201610FDN-375469) und an L.P, A.A.G. und K.P durch den CIHR/IDRC Team Grant: Canada-Latin/America-Caribbean Zika Virus Program (FRN: 149783) sowie durch Mittel an K.P. vom kanadischen International Development Research Centre (Zuschuss 109434-001) über die Canadian 2019 Novel Coronavirus (COVID-19) Rapid Research Funding Opportunity. Diese Arbeit wurde auch durch Mittel an A.A.G. von einem Arizona Biomedical Research Commission New Investigator Award (ADHS16-162400), der Gates Foundation (OPP1160667), einem NIH Director's New Innovator Award (1DP2GM126892), einem NIH R21 Award (1R21AI136571-01A1) an K.P. / A.A.G und einem Alfred P. Sloan Fellowship (FG-2017-9108) unterstützt. Abbildung 1 wurde mit Biorender.com unter akademischer Lizenz an K.P.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384 well plate covers - aluminum | Sarstedt | 95.1995 | Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the PLUM reader |
| 384 well plate covers - transparent | Sarstedt | 95.1994 | Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the BioTek plate reader |
| 384 well plates | VWR | CA11006-180 | 2 mm paper-based diagnostics are placed into the wells of these plates for quantification |
| Agarose | BioShop Canada | AGA001.500 | Gel electrophoresis |
| BSA | BioShop Canada | ALB001.500 | Blocking agent for the Whatman filter paper |
| Cell free reactions | New England Biolabs | E6800L | PURExpress |
| CPRG | Roche | 10884308001 | Chlorophenol red-b-D-galactopyranoside |
| Disposable Sterile Biopsy Punches | Integra Miltex | 23233-31 | Used to create 2 mm paper discs that fit into a 384-well plate |
| DNAse I | Thermo Scientific | K2981 | Digests template DNA following incubation of the in vitro transcription reaction |
| DNAse I Kit | Thermo Scientific | 74104 | DNase I Kit For removing template DNA from IVT RNA |
| dNTPs | New England Biolabs | N0446S | Used for PCRs |
| electrophoresis system | Bio-Rad | 1704487 | Used to run the agarose gels |
| Gel imaging station | Bio-Rad | 1708265 | ChemiDoc XRS+ Imaging System |
| IVT kit | New England Biolabs | E2040S | Used for in vitro transcribing template (trigger) RNA for switch screening |
| Nanodrop One | Thermo Scientific | ND-ONE-W | Used for determining nucleic acid concentrations |
| NASBA kit | Life Sciences Advanced Technologies | NWK-1 | Isothermal amplification reaction components |
| Nuclease free H20 | invitrogen | 10977015 | Added to reaction mixes |
| PAGE electrophoresis system | Biorad | 1658001FC | Used to cast and run polyacrylamide gels |
| pCOLADuet-LacZ DNA | Addgene | 75006 | https://www.addgene.org/75006/ |
| Phusion polymerase/reactioin buffer | New England Biolabs | M0530L | Used for PCRs |
| Plate reader | BioTek | BioTek NEO2 | Multi Mode Plate Reader, Synergy Neo2 |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom oligo synthesis | |
| Q5 polymerase/reaction buffer | New England Biolabs | M0491L | Used for PCRs |
| Qiagen PCR Puriifcation Kit | QIAGEN | 27106 | QIAprep Spin Miniprep Kit |
| RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | 2X RNA loading dye |
| RNA Purification Kit | QIAGEN | EN0521 | QIAamp Viral RNA extraction kit |
| RNase inhibitor | New England Biolabs | M0314S | Used to prevent contamination of RNases A, B, and C |
| RT-qPCR kit | QIAGEN | 208352 | QuantiNova Probe RT-PCR Kit |
| SYBR Gold | Invitrogen S11494 | S11494 | PAGE gel stain for nucleic acids |
| TAE Buffer | BioShop Canada | TAE222.4 | Gel electrophoresis buffer |
| Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | Used for temperature cycling and incubating reactions |
| Whatman 42 filter paper | GE Healthcare | 1442-042 | Used to imbed molecular components for paper-based diagnostics |
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