Summary
גישה לאבחון מבוזר, בעלות נמוכה ובקיבולת גבוהה שניתן לפרוס בקהילה לצורך בדיקות מבוזרות היא קריטית למאבק במשברי בריאות עולמיים. כתב יד זה מתאר כיצד לבנות אבחון מבוסס נייר עבור רצפי RNA ויראליים שניתן לזהות באמצעות קורא אופטי נייד.
Abstract
הגישה לאבחון מולקולרי בנטל נמוך שניתן לפרוס בקהילה לצורך בדיקה חשובה יותר ויותר ויש לה השלכות רחבות ומשמעותיות יותר על רווחתן של חברות ויציבות כלכלית. בשנים האחרונות צצו מספר שיטות אבחון איזותרמיות חדשות כדי לענות על הצורך באבחון מולקולרי מהיר בעלות נמוכה. תרמנו למאמץ זה באמצעות פיתוח ותיקוף מטופלים של אבחון מבוסס מתגי toehold, כולל אבחון עבור נגיפי זיקה וצ'יקונגוניה הנישאים על ידי יתושים, אשר סיפקו ביצועים דומים למבחנים מבוססי תגובת שרשרת פולימראז כמותית של שעתוק לאחור (RT-qPCR) בתקן זהב. אבחון זה זול לפיתוח ולייצור, ויש להם פוטנציאל לספק יכולת אבחון לסביבות דלות משאבים. כאן הפרוטוקול מספק את כל השלבים הדרושים לפיתוח בדיקה מבוססת מתג לזיהוי וירוס זיקה. המאמר לוקח את הקוראים דרך תהליך פיתוח האבחון המדורג. ראשית, רצפים גנומיים של וירוס זיקה משמשים כתשומות לתכנון חישובי של מתגים מועמדים באמצעות תוכנת קוד פתוח. לאחר מכן, מוצגת הרכבת החיישנים לסינון אמפירי עם רצפי RNA סינתטיים ואופטימיזציה של רגישות האבחון. לאחר השלמתו, האימות מתבצע עם דגימות מטופלים במקביל ל- RT-qPCR, וקורא אופטי ייעודי, PLUM. עבודה זו מספקת מפת דרכים טכנית לחוקרים לפיתוח חיישנים מבוססי מתגי Toehold בעלות נמוכה עבור יישומים בבריאות האדם, בחקלאות ובניטור סביבתי.
Introduction
RT-qPCR נותרה טכנולוגיית תקן הזהב לאבחון קליני בשל הרגישות והספציפיות המצוינות שלה. למרות שהיא חזקה מאוד, השיטה תלויה בציוד וריאגנטים יקרים ומתמחים הדורשים הפצה ואחסון מבוקרי טמפרטורה. הדבר מציב חסמים משמעותיים לנגישות של אבחון איכותי ברחבי העולם, במיוחד בתקופות של התפרצויות מחלות ובאזורים שבהם הגישה למעבדות מאובזרות היטב מוגבלתב-1,2. זה נצפה במהלך התפרצות נגיף זיקה 2015/2016 בברזיל. כאשר רק חמש מעבדות מרכזיות זמינות כדי לספק בדיקות RT-qPCR, נוצרו צווארי בקבוק משמעותיים שהגבילו את הגישה לאבחון. זה היה מאתגר במיוחד עבור אנשים במסגרות פרי-עירוניות, שנפגעו בצורה קשה יותר מההתפרצות 3,4. במאמץ לשפר את הגישה לאבחון, הפרוטוקול מציג פלטפורמה שפותחה עם פוטנציאל לספק אבחון מבוזר, בעלות נמוכה ובקיבולת גבוהה בסביבות דלות משאבים. כחלק מכך, הוקם צינור גילוי אבחוני, המשלב הגברה איזותרמית וחיישנים מבוססי מתגי RNA סינתטיים עם מערכות ביטוי ללא תאים מבוססות נייר 5,6.
מערכות סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS), במיוחד מערכות ללא תאים מבוססות E. coli, הן פלטפורמה אטרקטיבית למגוון רחב של יישומי ביוסנסינג מניטור סביבתי 7,8 ועד אבחון פתוגנים 5,6,9,10,11,12 . מערכות CFPS, הכוללות את הרכיבים הדרושים לתמלול ולתרגום, הן בעלות יתרונות משמעותיים על פני ביוסנסורים של תאים שלמים. באופן ספציפי, חישה אינה מוגבלת על ידי דופן התא, ובאופן כללי, הם מודולריים בעיצוב, biosafe, זול, וניתן לייבש בהקפאה לשימוש נייד. היכולת לייבש בהקפאה תגובות מבוססות מעגל גנים על מצעים כגון נייר או טקסטיל, מאפשרת הובלה, אחסון לטווח ארוך בטמפרטורת החדר5, ואף שילוב בטכנולוגיה לבישה13.
עבודות קודמות הראו כי ניתן להשתמש במערכות ללא תאי E. coli כדי לזהות אנליטים רבים, למשל, מתכות רעילות כגון כספית, אנטיביוטיקה כגון טטרציקלין 7,14, כימיקלים המשבשים את המערכת האנדוקרינית15,16, סמנים ביולוגיים כגון חומצה היפופורית 17, מולקולות חישת מניין הקשורות לפתוגנים9,18 וחומרים לא חוקיים כגון קוקאין17, וגמא הידרוקסיבוטיראט (GHB)19 . לצורך זיהוי ספציפי לרצף של חומצות גרעין, אסטרטגיות הסתמכו ברובן על שימוש בביוסנסורים מבוססי מתגים המצומדים לטכניקות הגברה איזותרמיות. מתגי Toehold הם ריבורגולטורים סינתטיים (המכונים גם פשוט 'מתגים' בשאר הטקסט) המכילים מבנה סיכות שיער החוסם תרגום במורד הזרם על ידי רצף אתר הקשירה הריבוזומלי (RBS) וקודון ההתחלה. עם אינטראקציה עם RNA טריגר המטרה שלהם, מבנה סיכת השיער הוא הקלה ולאחר מכן תרגום של כתב פתוח לקרוא מסגרת מופעלת20.
הגברה איזותרמית יכולה לשמש גם כאבחון מולקולרי21; עם זאת, שיטות אלה נוטות להגברה לא ספציפית, מה שיכול להפחית את הספציפיות ובכך את הדיוק של הבדיקה מתחת לזו של RT-qPCR 22. בעבודה שדווחה כאן, הגברה איזותרמית במעלה הזרם של חיישנים מבוססי מתגים שימשה כדי לספק הגברת אותות משולבת המאפשרת זיהוי רלוונטי מבחינה קלינית של חומצות גרעין (femtomolar to attomolar). זיווג זה של שתי השיטות מספק גם שני מחסומים ספציפיים לרצף, שבשילובם מספקים רמה גבוהה של ספציפיות. באמצעות גישה זו, עבודה קודמת הדגימה זיהוי של וירוסים כגון זיקה6, אבולה5, Norovirus10, כמו גם חיידקים פתוגניים כגון C. difficile23 ואנטיביוטיקה עמיד Typhoid12. לאחרונה, מתגי toehold ללא תאים הודגמו לזיהוי SARS-CoV-2 במאמצים לספק אבחון נגיש למגפת COVID-1911,12,13.
הפרוטוקול הבא מתאר את הפיתוח והאימות של בדיקת מתגי toehold סינתטיים נטולי תאים, מבוססי נייר, לזיהוי וירוס זיקה, החל מתכנון ביוסנסור סיליקו , דרך שלבי ההרכבה והאופטימיזציה, ועד לאימות שדה עם דגימות מטופלים. הפרוטוקול מתחיל בתכנון in silico של חיישנים מבוססי מתגי RNA toehold ופריימרים להגברה איזותרמית ספציפיים לרנ"א הנגיפי זיקה. למרות שקיימות שיטות הגברה איזותרמיות רבות, כאן הודגם השימוש בהגברה מבוססת רצף חומצות גרעין (NASBA) כדי להגדיל את ריכוז מטרת ה-RNA הנגיפית הקיימת בתגובה, מה שמאפשר רגישות משמעותית מבחינה קלינית. למעשה, שיטות הגברה איזותרמיות יש את היתרון של פעולה בטמפרטורה קבועה, ביטול הצורך בציוד מיוחד, כגון מחזורים תרמיים, אשר מוגבלים בדרך כלל למיקומים מרכזיים.
לאחר מכן, מתואר התהליך של הרכבת חיישני מתג toehold סינתטיים עם רצפי קידוד כתבים באמצעות PCR הרחבה חופפת, וסינון חיישני מתג toehold סינתטיים לביצועים אופטימליים במערכות ללא תאים באמצעות RNA סינתטי. עבור קבוצה זו של חיישני וירוס זיקה, בחרנו את הגן lacZ המקודד את האנזים β-גלקטוזידאז, אשר מסוגל לבקע מצע colorimetric, כלורופנול אדום-β-D-galactopyranoside (CPRG), כדי לייצר שינוי צבע צהוב עד סגול שניתן לזהות על ידי העין או עם קורא צלחת. לאחר זיהוי מתגים סינתטיים בעלי ביצועים מעולים, מתואר התהליך לסינון פריימרים להגברה איזותרמית מבוססת רצף חומצות גרעין של רצף המטרה המתאים באמצעות RNA סינתטי כדי למצוא קבוצות המספקות את הרגישות הטובה ביותר.
לבסוף, הביצועים של פלטפורמת האבחון מאומתים באתר באמריקה הלטינית (איור 1). כדי לקבוע את דיוק האבחון הקליני, הבדיקה נטולת התאים המבוססת על נייר מבוצעת באמצעות דגימות נגיף זיקה מחולים; במקביל מבוצעת בדיקת תקן זהב RT-qPCR לצורך השוואה. כדי לנטר מבחנים ללא תאים צבעוניים, אנו מאפשרים כימות באתר של תוצאות באזורים שבהם מחזוריות תרמית אינה זמינה. קורא הצלחות המורכב ביד הנקרא נייד, בעלות נמוכה, ידידותי למשתמש, Multimodal (PLUM; להלן נקרא קורא צלחות נייד) מוצג גם כאן24. קורא הצלחות הנייד, שפותח בתחילה כמכשיר נלווה לאבחון מתגי טוהולד סינתטיים ללא תאים, מציע דרך נגישה לדגור ולקרוא תוצאות באופן בעל תפוקה גבוהה, ומספק ניתוח תוכנה משולב ומבוסס ראייה ממוחשבת למשתמשים.
איור 1: זרימת עבודה לבדיקת דגימות מטופלים באמצעות תגובות מתג ללא תאים מבוססי נייר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Protocol
כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים צריכים להתבצע בהתאם לסטנדרטים אתיים והנחיות רלוונטיות, כולל העקרונות האתיים למחקר רפואי המערבים נבדקים אנושיים שנקבעו על ידי הצהרת הלסינקי של ההסתדרות הרפואית העולמית. מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של המחקר האנושי תחת פרוטוקול רישיון מספר CAAE: 80247417.4.0000.5190. הסכמה מדעת של כל המטופלים שנכללו במחקר זה ויתרה על ידי מועצת הביקורת המוסדית של Fiocruz-PE (IRB) לדגימות אבחון.
הערה: התקן PLUM ייקרא להלן 'קורא צלחות נייד'.
1. תכנון חישובי של פריימרים להגברה מבוססי רצף חומצות גרעין
- סרוק את הגנום של זיקה כדי לזהות קבוצה של אזורים מועמדים להגברה באורך של כ-200 נוקלאוטידים (nt) עד 300 nt על ידי הכנסת הרצף הגנומי ל-NCBI/Nucleotide BLAST25,26. השווה את הגנום לרצפי RNA ייחוס (refseq_rna) וחפש אתרים שנותרו שמורים מאוד ואין להם הומולוגיה עם הגנום האנושי (פרמטרים אחרים של BLAST נותרו ללא שינוי). בחר לפחות שני אתרים לעיצוב מתג ה-toehold הסינתטי.
- השתמש בקריטריוני הבחירה של Deiman et al.27 כדי ליצור זוגות של פריימרים מבוססי רצף חומצות גרעין קדימה ואחורה עבור כל אזור הגברה מועמד. בקצרה, עקוב אחר הקריטריונים הבאים לעיצוב פריימרים: (1) תוכן GC בין 40%-60%; (2) אורך של 20 עד 24 nt עם טמפרטורת המסת DNA מעל 41 מעלות צלזיוס; (3) אין ריצות של ארבעה נוקלאוטידים זהים או יותר; (4) הנוקלאוטיד הסופי של 3' הוא בסיס A; (5) מבנה משני פריימר נמוך והסתברות היווצרות דימר. מסך 8-10 זוגות פריימרים לכל אזור יעד (מומלץ).
- צרף את רצף הקידומת המכיל את רצף מקדם T7 AATTCTAATACGACTCACTATAGGG AGAAGG(רצף מקדם T7 מסומן בקו תחתון) לקצה 5' של הפריימרים הקדמיים כדי לאפשר שעתוק של האמפליקונים באמצעות T7 RNA פולימראז (RNAP). הזמינו את הפריימרים כאוליגוס דנ"א מחברת סינתזת דנ"א.
2. תכנון חישובי של מתגי toehold
- התקן את NUPACK28 גרסה 3.2 (חבילת עיצוב חומצות גרעין) בהתבסס על ההוראות באתר29. השתמש במערכת הפעלה UNIX וב-MATLAB (פלטפורמת מחשוב נומרי) כשפת התכנות (מומלץ).
- זהה את רצפי המטרה (למשל, גנום נגיפי) הספציפיים לפתוגן המעניין את עיצובי מתגי הטוהולד כמו בשלב 1.1. בחר את רצפי היעד של זיקה מתוך האמפליקונים המבוססים על רצף חומצות גרעין שנוצרו בשלב 1.2.
הערה: בפועל, ניתן לתכנן ולבדוק תחילה את פריימרים ההגברה המבוססים על רצף חומצות גרעין או את מתגי ה-toehold הסינתטיים, בהתאם לצרכי המשתמשים. אם כבר נקבעו אזורי יעד מסוימים בעלי עניין (למשל, מפרסומים קיימים או מפרוטוקולי אבחון), תכנון וסינון מתגי טוהולד עשויים להתרחש תחילה, ולאחר מכן תכנון וסינון עבור פריימרים להגברה מבוססי רצף חומצות גרעין. אם אין אזורי מטרה מבוססים, יש לסנן תחילה פריימרים מבוססי רצף חומצות גרעין כנגד הגנום המלא כדי לצמצם את המטרות הנבחרות תוך בחירה ביעילות הגברה של פריימר. אם קיימים רצפים מרובים עבור הפתוגן, עדיף לתכנן פריימרים המבוססים על רצפי חומצות גרעין המתמקדים באזורים שמורים מאוד (במקום לסרוק את הגנום כולו). - הורד והתקן את תוכנת MATLAB הנדרשת במחשב.
- הגדר את משתני הסביבה כדי לאפשר לפונקציות של חבילת העיצוב של חומצות גרעין להיקרא בתוכנה. לשם כך, פתח את התוכנה ולאחר מכן פתח (או צור) קובץ startup.m בתיקיית העבודה המוגדרת כברירת מחדל. לאחר מכן, העתק את שורות הקוד הבאות לקובץ startup.m ולבסוף, הוסף את התיקיה המכילה את הקבצים הבינאריים של חבילת עיצוב חומצות גרעין ל- PATH:
NUPACKINSTALL = '/משתמשים/[user_name]/.../nupack3.2.2';
setenv('NUPACKINSTALL', NUPACKINSTALL);
setenv('PATH',[getenv('PATH'), sprintf(':%s/build/bin',NUPACKINSTALL)]); - פתח את תוכנת פלטפורמת המחשוב המספרי ונווט אל תיקיית תוכנת העיצוב. הפעל את אלגוריתמי העיצוב הנגישים ב- https://github.com/AlexGreenLab/TSGEN.
- הזן את רצפי היעד לתוך design_input_file.csv הממוקם בתיקיית המשנה של הקלט. הקלטים כוללים שם, רצף חיצוני, רצף פנימי, טמפרטורה, שם פלט ורצף פלט כמוגדר בטבלה 1. אם עדיין לא נקבעו אתרי פרימינג עבור המטרה, שמרו על רצפים פנימיים וחיצוניים זהים. רק 29 nt הראשונים של הכתב ייחשבו במהלך תהליך העיצוב. בסיום, שמור וסגור את הגיליון האלקטרוני המעודכן.
הערה: רצף הפלט הוא הרצף של חלבון הכתב המתוכנן לשמש לבדיקה (לדוגמה, lacZ). ציון הרצפים הפנימיים והחיצוניים מבטיח שהאלגוריתם לא ייצור מתגי toehold סינתטיים החופפים לאף אחד מהפריימרים. זה גם מבטיח כי הבדיקה מזהה שלושה אתרים ייחודיים בגנום זיקה כדי לשפר את הספציפיות שלה. - בחר את הפרמטרים שישמשו לפונקציית העיצוב: toehold_switch_design_run(num_designs,input_file, אפשרויות). מלא את ערכי הפרמטרים כ:
- num_designs - מספר העיצובים המובילים עבור כל פלט יעד על ידי התוכנה. ברירת המחדל היא 6 וניתן לשנות אותה לפי הצורך (מומלץ לפחות שישה עיצובים לכל יעד).
- input_file - פרמטר זה מציין את שם הקובץ המספק את נתוני רצף הקלט. ערך ברירת המחדל הוא 'design_input_file.csv' וניתן לשנותו לפי הצורך.
- בחר מבין האפשרויות הבאות - (1) SeriesA ו- SeriesB: הגרסאות של מתג toehold שהקוד ייצור. הגדר את SeriesB ל- 1 ואת SeriesA ל- 0 כדי ליצור מתג toehold מסדרה B, שהוא הפורמט המשמש באבחון וירוס זיקה6; (2) מקביל: מוגדר ל-1 כדי לרתום ליבות מרובות לחישוב העיצובים; אחרת, הגדר ל- 0; (3) Antisense: מוגדר ל-1 כדי ליצור מתגי toehold שמכליאים את רצף האנטיסנס (כלומר, המשלים ההפוך) של קלט המטרה; אחרת, הגדר ל- 0.
- הפעל את פונקציית העיצוב באמצעות הפרמטרים שנבחרו: toehold_switch_design_run(num_designs,input_file,אפשרויות). לאחר מכן האלגוריתם יתחיל ליצור את עיצובי מתגי ה-toehold עבור המטרות המעניינות.
- עם השלמת העיצוב, אתר את רצפי העיצוב של מתג ה- toehold העליון ואת רצפי היעד המתאימים בתיקייה final_designs בצורה של גיליונות אלקטרוניים בפורמט .csv. רצפי הדנ"א של מתג הטוהולד שנוצרו על ידי האלגוריתם יכילו את רצף מקדם T7 בקצה 5' ואת רצף המקשר המשומר 21 nt AACCTGGCGGCGCGCAAAAG בקצה 3'.
- סנן את רצפי העיצוב של מתגי ה-toehold העליונים המתקבלים כנגד וירוסים נפוצים אחרים על-ידי הצבתם ב-NCBI-BLAST ובדיקת הומולוגיה של רצפים. קבל רצפים עם 40% הומולוגיה או פחות.
- הזמינו את רצפי סיכות השיער של הטוהולד כ-DNA oligos, ומאוחר יותר הרכיבו אותם עם הגן המדווח למתגים מתפקדים במלואם. הזמינו את פריימרי ה-PCR הדרושים להרכבת החיישן הבא בהתאם לחלבון הכתב המועדף.
| פרמטר | הגדרה |
| שם | השמות הרצויים של רצפי מתגי הפלט. |
| רצף חיצוני | תמליל נאס"א מלא שהופק מהגברה. |
| רצף פנימי | הרצף החיצוני למעט אתרי קשירת הפריימר. הוא תואם את הרצף החיצוני אך אינו כולל את חלקי התמלילים הנקשרים לפריימרים הקדמיים והאחוריים. |
| טמפרטורה | הטמפרטורה המשמשת את האלגוריתמים לחישוב מבני הרנ"א. |
| שם פלט | שם גן הפלט (למשל lacZ, gfp). |
| רצף פלט | רצף גן הפלט. |
טבלה 1: ההגדרה של כל פרמטר המשמש בתוכנת toehold switchdesign.
3. בניית מתגי טוהולד על ידי PCR
הערה: שלבים אלה מתארים את הבנייה של מתגי LacZ toehold על-ידי PCR הרחבה חופפת. כאן, אוליגו הדנ"א משמש כפריימר קדמי וה-T7 שליחות קטלנית משמש כפריימר הפוך. אנו משתמשים בפלסמיד pCOLADuet-LacZ כתבנית לגן lacZ (addgene: 75006). כל תבנית דנ"א אחרת המכילה את הרצף המתאים יכולה לשמש כתבניות, בתנאי ששליחות קטלנית T7 נכללת במבנה הסופי.
- לאחר שהתקבלו אוליגואים סינתטיים של דנ"א מהספק המסחרי, הכינו תמיסות של הדנ"א הסינתטי ופריימר הגברה הפוכה בריכוז של 10 מיקרומטר במים נטולי נוקלאז. הרכיבו תגובות בצינורות PCR על קרח לפי טבלה 2.
הערה: ניתן לשנות את קנה המידה של אמצעי אחסון PCR לפי הצורך. השתמש בכמות מינימלית (0.1-1 ננוגרם) של תבנית דנ"א pCOLADuet-LacZ כדי למנוע את הצורך בשלב נוסף להסרת פלסמיד או אות LacZ ברקע. לקבלת כמויות גבוהות יותר של תבניות DNA, עקוב אחר ה-PCR עם תקציר אנזים הגבלת DpnI כדי להסיר את תבנית הפלסמיד השיורית. - מקם את התגובות במחזור תרמי, בהתאם לתנאי המחזור המפורטים בטבלה 3. נתחו את תוצרי ה-PCR על ג'ל אגרוז (איור 2; ראו פרוטוקול משלים ו-30).
- טהרו את מוצרי ה-PCR באמצעות ערכת טיהור PCR מבוססת עמודת ספין ושתו את הדנ"א ב-15-30 מיקרון של מים נטולי נוקלאז, בהתאם להוראות היצרן. לכמת את הדנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר.
| רכיב | נפח | ריכוז |
| מאגר תגובה 5X Q5 | 10 מיקרוגרם | פי 1 |
| 10 mM dNTPs | 1 מיקרון | 200 מיקרומטר |
| פריימר קדמי 10 mM (מתג סינתטי DNA FW) | 2.5 מיקרון ליטר | 0.5 מיקרומטר |
| פריימר הפוך 10 mM (T7 שליחות קטלנית RV) | 2.5 מיקרון ליטר | 0.5 מיקרומטר |
| תבנית דנ"א (pCOLADuet-LacZ) | משתנה | <1 ננוגת |
| Q5 פולימראז DNA באיכות גבוהה | 0.5 מיקרון | 0.02 U/μL |
| מים נטולי נוקלאז | עד 50 מיקרון | - |
טבלה 2: רכיבי ה-PCR המשמשים לבניית מתגי toehold.
| צעד | טמפרטורה | זמן | |
| דנטורציה ראשונית | 98 °C | 30 שניות | |
| 35 מחזורים | דנטורציה | 98 °C | 10 שניות |
| חישול | 60 מעלות צלזיוס | 20 שניות | |
| סיומת | 72 °C | 1.45 דקות | |
| הארכה סופית | 72 °C | 5 דק' | |
| אחז | 4 °C | - | |
טבלה 3: תנאי המחזור המשמשים במהלך בניית מתגי toehold על ידי PCR.
4. הכנת יעד RNA סינתטי (טריגר)
- באמצעות תוכנה לתכנון ביולוגיה מולקולרית, שנה את תבניות ה-RNA הסינתטיות (שנבחרו בשלב 1.1) כך שיכללו רצף מקדם T7 במעלה הזרם, כדי להבטיח שהתבנית המלאה תישאר קצרה (<200 bp). תכנון פריימרים קדימה ואחורה כדי להגביר את פריימר רצף ההדק (לרצפי אוליגו ראו פרוטוקול משלים).
- סדרו את הרצפים כאוליגוס דנ"א. לאחר קבלתו, שחזרו את דנ"א ההדק הסינתטי ואת פריימרים להגברה ל-10 מיקרומטר במים נטולי נוקלאזה. הרכיבו את ה-PCR המתאימים בצינורות בעלי דופן דקה על קרח בהתאם לטבלה 2 והשתמשו ב-0.5 μL של אולטרמר הדנ"א של ההדק (ריכוז סופי של 0.1 מיקרומטר) כדנ"א של התבנית.
- מקם את התגובות במחזור תרמי והשתמש בתנאי הרכיבה המפורטים בטבלה 3. השתמש בזמן הארכה של 15 שניות. הערך את האיכות וטיהור מוצרי PCR כמתואר בשלב 3.3 ובפרוטוקול המשלים.
הערה: כדי לזרז את התהליך, ניתן להשתמש ישירות במוצרי PCR של טריגרים מטוהרים באמצעות עמודות גם לסינון ראשוני של מתגי toehold.
5. תעתיק במבחנה של רצפי טריגרים נבחרים
- הרכיבו רכיבי תגובה על קרח לפי טבלה 4.
- תגובות שעתוקאינדוגרט i n vitro (IVT) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות, ולאחר מכן טיפול DNase I להסרת הדנ"א של התבנית. עבור שלב DNase I, יש להוסיף 70 μL של מים נטולי נוקלאז, 10 μL של 10x DNase I Buffer, ו-2 μL של DNase I (ללא RNase), ולדגור בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות. אם לא ממשיכים לשלב 5.4 באופן מיידי, השביתו את DNase I עם תוספת של 50 mM EDTA והפסקת חום ב-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- שלב אופציונלי: בצע ניתוח אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד דנטורינג (לדוגמה, אוריאה-פייג') במוצרי IVT כדי להעריך את איכות הרנ"א כמתואר בפרוטוקול המשלים.
- טהרו את מוצרי ה-IVT באמצעות ערכת ניקוי RNA מבוססת עמודות על פי הוראות היצרן, ולאחר מכן כמתו את ריכוז ה-RNA והטוהר באמצעות ספקטרופוטומטריה. ראה פרוטוקול משלים לקבלת הוראות כיצד לקבוע את הטוחנות ואת מספר ההעתקה/μL של הרנ"א.
| רכיב | נפח | ריכוז |
| מאגר תגובה 10X | 1.5 מיקרון | 0.75x |
| תערובת NTP של 25 מ"מ | 6 מיקרון | 7.5 מ"מ |
| תבנית טריגר דנ"א | X μL | 1 מיקרוגרם |
| תערובת T7 RNA פולימראז | 1.5 מיקרון | - |
| מים נטולי נוקלאז | X μL | עד 20 מיקרון |
טבלה 4: תעתיק חוץ גופי (IVT) של רצפי טריגרים נבחרים.
6. סינון ראשוני של המתגים
הערה: סעיף זה מתאר את השלבים המשויכים להגדרת תגובות מתג toehold ללא תאים, המבוססות על נייר, וכיצד לסנן מתגי toehold בעלי ביצועים גבוהים. יש להכין מראש את נייר הסינון החסום BSA המשמש בשלב 6.10 כמתואר בפרוטוקול המשלים.
- הכינו תמיסת מלאי החייאה על ידי המסת 25 מ"ג מהאבקה ב-1 מ"ל של מים נטולי נוקלאזות. שמור את התמיסה על קרח בכל עת ואחסן בטמפרטורה של -20°C לשימוש ארוך טווח.
- קבע את מספר התגובות להגדרה. עבור כל מתג toehold שהוערך, כלול בקרה ללא תבנית (ללא מתג וללא RNA מטרה המכונה גם בקרה ללא תאים בלבד) כדי לקחת בחשבון כל אות רקע שעשוי לנבוע מתערובת המאסטר. כלול בקרת מתג בלבד כדי להעריך את דליפת מתג הרקע או קצב הכיבוי בהיעדר RNA מטרה.
- הרכיבו תערובת אב של תגובה ללא תאים של תמיסה A, תמיסה B, מעכב RNase ו-CPRG על קרח בהתאם לפרוטוקול הסטנדרטי המפורט בטבלה 5.
הערה: השלבים המתוארים כאן מיועדים לתערובת אב שתספיק לקבוצה משולשת של תגובות 1.8 μL עם תוספת נפח של 10% כדי להסביר את שגיאת הפינטר. יש להתאים את עוצמת הקול של תערובת המאסטר לפי הצורך בהתאם למספר מתגי ה-toehold המוקרנים. - עבור כל תגובה משולשת ללא תאים, יש לפזר את התערובת הראשית לתוך צינור PCR, תוך שמירה על כל הצינורות על הקרח. עבור הצינור שהונח בצד כבקרה נטולת תאים בלבד, הוסיפו מים נטולי נוקלאז לנפח סופי של 5.84 μL, ערבבו על ידי צנרת למעלה ולמטה, וצנטריפוגות לזמן קצר. עבור שאר הצינורות, יש להוסיף את ה-DNA של ה-toehold המטוהר ב-PCR לריכוז סופי של 33 ננומטר.
- עבור צינורות המונחים בצד כבקרות מתג בלבד, יש להוסיף מים נטולי נוקלאז לנפח סופי של 5.84 μL. עבור צינורות המיועדים לבדיקת מתג ה-toehold ושילוב ה-RNA של המטרה, הוסיפו RNA מטרה מתועתק במבחנה לריכוז סופי של 1 μM. לאחר מכן, הוסיפו מים נטולי נוקלאז לנפח סופי של 5.84 μL. ערבבו היטב את כל התגובות על ידי צנרת למעלה ולמטה, וצנטריפוגות לזמן קצר.
- הוסיפו 30 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז לבארות המקיפות את בארות התגובה על צלחת שחורה בעלת תחתית צלולה בגודל 384 בארות. זה ממזער את האידוי במהלך הניסוי ומשפר את יכולת השחזור.
הערה: אם אתה משתמש במכשיר קורא הצלחות הנייד, הנח רדיד PCR על הצלחת והשתמש בסכין מדויקת כדי לחתוך את הבארות המיועדות לתגובתך, כמו גם כל אחת מארבע הבארות הפינתיות. רדיד ה-PCR מונע ממצלמת קורא הצלחות הנייד חשיפת יתר מבארות ריקות. - באמצעות ניקוב ביופסיה ופינצטה של 2 מ"מ, חותכים דיסקי נייר סינון חסומים על ידי BSA ומניחים אותם בבארות התגובה על ידי הוצאת האגרוף או באמצעות פינצטה (ראו פרוטוקול משלים להכנת נייר סינון חסום BSA). יש לחלק נפחים משולשים של 1.8 μL מכל צינור תגובה על דיסקיות נייר הסינון בלוח 384 הבאר, תוך שמירה על כל הדגימות, כמו גם על צלחת 384 בארות, על קרח בכל עת.
הערה: אם אתה משתמש בהתקן קורא הצלחות הנייד, הוסף 1.8 μL של CPRG (0.6 מ"ג/מ"ל) לכל אחת מארבע הפינות של לוח 384 הבאר. הצבע הצהוב של ה- CPRG מספק זיהוי תבנית לקורא הלוחות הנייד ליישור תבנית הלוחות הדיגיטליים מרובי הצלעות בניתוח תמונה. מכסים את בארות הצלחת בסרט PCR כדי למנוע אידוי. - מניחים את הצלחת בקורא צלחות, קוראים את OD570 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כל דקה למשך 130 דקות.
| רכיב | נפח | ריכוז סופי לכל תגובה |
| פתרון א' | 2.38 מיקרון ליטר | 40% |
| פתרון ב' | 1.78 מיקרון | 30% |
| מעכב RNase | 0.03 מיקרון | 0.5% v/v |
| החייאה (25 מ"ג/מ"ל) | 0.14 מיקרון | 0.6 מ"ג/מ"ל |
| מתג טוהולד | X μL | 33 נאנומטר |
| רנ"א מטרה | X μL | 1 מיקרומטר |
| מים נטולי נוקלאז | עד 5.94 מיקרון | - |
| נפח כולל: | 5.94 מיקרון | |
טבלה 5: רכיבי תגובת תמלול-תרגום ללא תאים של PURExpress.
7. זיהוי מתגי toehold בעלי ביצועים גבוהים
הערה: סעיף זה מתאר כיצד לנתח נתונים משלב 6 כדי לבחור את מתגי ה-toehold בעלי הביצועים הטובים ביותר להתקדם איתם.
- התחל בניתוח נתונים על-ידי נרמול תחילה לספיגת OD570 ברקע. לשם כך, הפחת את מדידות OD 570 של תגובות שאין להן מתג או רנ"א מטרה (כלומר, בארות בודדות נטולות תאים) ממדידות OD570 האחרות.
- החלק את הנתונים המנורמלים באמצעות ממוצע נע של שלוש נקודות והתאם את הערך המינימלי של כל באר לאפס. ראו איור 3 לדוגמה של נתוני מסלול זמן מנורמלים שנאספו עבור מתגי ה-toehold 27B, 33B ו-47B.
- באמצעות נתונים מעובדים אלה, חשב את שינוי הקיפול (או יחס הפעלה/כיבוי) על-ידי קביעת ההפרש בקצב שינוי הצבע (כלומר, שינוי ב- OD570 לאורך זמן) בין מתג ה- toehold לבין בארות היעד והמתג בלבד (ראה פרוטוקול משלים לחישוב היחס; איור 4).
- בחר מתגים עם שינוי קיפול ההפעלה/כיבוי הגבוה ביותר לאפיון נוסף. השמט את מתגי ה-toehold בעלי הביצועים הגרועים המציגים את שינוי הקיפול הנמוך ביותר.
8. בדיקת פריימר הגברה מבוססת רצף חומצות גרעין ורגישות
הערה: בשלבים הבאים, תחילה נעשה מסך עבור פריימרים של הגברה איזותרמית פונקציונלית, ולאחר מכן הרגישות שלהם מוערכת על ידי קביעת מספר עותקי RNA היעד לכל μL של RNA סינתטי שמתג toehold נתון יכול לזהות באופן מהימן כאשר הוא משולב עם הגברה איזותרמית. לאחר הגברה איזותרמית, בצע תגובות ללא תאים כדי לזהות קבוצות ראשוניות מוצלחות מבוססות רצף חומצות גרעין. עם זאת, ייתכן שיהיה חסכוני יותר להפעיל ג'לים פוליאקרילאמיד או אגרוז על תגובות הגברה מבוססות רצף חומצות גרעין כדי לצמצם תחילה את מאגר ערכות הפריימרים המועמדים. במקרה כזה, קבוצות פריימר הגברה מבוססות רצף חומצות גרעין שמייצרות פס על הג'ל בגודל האמפליקון המתאים יכולות להיות ברשימה קצרה להקרנה הבאה ללא תאים.
- הכינו תמיסת מלאי של 25 מיקרומטר של כל ערכות הפריימרים קדימה ואחורה במים נטולי נוקלאז (ראו פרוטוקול משלים). קבע את מספר תגובות ההגברה המבוססות על רצף חומצות גרעין ותגובות ללא תאים לאחר מכן שיש להגדיר. הדבר תלוי במספר מתגי ה-toehold וערכות הפריימר המתאימות.
הערה: בעת סינון הפריימרים, חשוב תמיד לכלול פקד ללא תבנית עבור כל ערכת פריימרים כדי לקחת בחשבון את כל תוצרי הרקע שעלולים להיווצר עקב הגברה לא ספציפית הקשורה לפריימר. - הגדר תגובה אחת של 5 μL באופן הבא (קנה מידה זה לפי הצורך). להפשיר את כל הריאגנטים על הקרח. הרכיבו תערובת מאסטר תגובה של מאגר התגובה, תערובת הנוקלאוטידים ומעכב RNase על פי טבלה 6. מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה עד שהמשקעים הלבנים מסיסים, ולאחר מכן מחלקים אליקוטים לצינורות PCR.
- אם תערובת האב מיועדת לסינון פריימרים המבוססים על רצף חומצות גרעין, אל תכלול את הפריימרים מהתערובת הראשית בהתחלה (יש להוציא 2.55 μL של תערובת מאסטר). אחרת, אם מבצעים ניתוח רגישות פריימר, ניתן לכלול את הפריימרים בתמהיל הראשי (ובמקרה זה יש לחלק 2.75 μL aliquots). מוסיפים את תערובת האנזימים לאחר שלבי הדנטורציה ושיווי המשקל.
- אם מסננים פריימרים המבוססים על רצף חומצות גרעין, הוסיפו את הפריימרים קדימה ואחורה לצינורות המתאימים. על מחזור תרמי, הגדר את פרוטוקול הדגירה כמתואר בטבלה 7.
- הוסיפו 1 μL של מים נטולי נוקלאז או 1 μL של RNA טריגר מטרה ב-2 pM או כ-10 6 עותקים/μL, והקפידו לסמן את הצינורות בהתאם. מערבבים על ידי צנרת עדינה ומסובבים לזמן קצר את הצינורות.
הערה: עבור סינון ערכת פריימר, השתמש בריכוז של RNA טריגר מטרה שהוא גבוה מספיק כדי לא לפגוע בגבול התחתון של זיהוי שיטת ההגברה האיזותרמית, אך לא גבוה מספיק כדי לספק הפעלה של מתג ה-toehold אם לא תתרחש הגברה. - העבר את הצינורות למחזור התרמי והתחל את הדגירה. לאחר 12 דקות, הסר את הצינורות והוסף 1.25 μL של תערובת האנזימים לכל צינור. מערבבים על ידי צנרת למעלה ולמטה וצנטריפוגה קצרה של הצינורות.
הערה: בשלב זה, ניתן לשמור את הצינורות בטמפרטורת החדר; עם זאת, תערובת האנזימים צריכה להישמר על קרח עד להוספה לצינורות. - החזירו את הצינורות למחזור התרמי, תוך דילוג על שלב ההחזקה של 41 מעלות צלזיוס כדי להתחיל את הדגירה של תגובה של שעה אחת.
הערה: לאחר הדגירה, ניתן להניח את התגובות על קרח לעיבוד באותו יום או להקפיא בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לעיבוד מאוחר יותר. - בצע את שלבים 6.2-6.7 וטבלה 8 כדי להרכיב תגובות מתג ללא תאים המבוססות על נייר כדי להעריך את ביצועי הפריימר. נתחו נתונים כמתואר בשלבים 7.1-7.2 ובאיור 3.
הערה: בנוסף לפקדים שהוזכרו קודם לכן, חשוב לכלול גם את הבקרה השלילית כדי לקחת בחשבון כל אות רקע שעשוי לנבוע מהתגובה. בנוסף, חשוב לכלול גם בקרה עם המתג ו-2 pM (ריכוז סופי) של רנ"א מטרה, כבקרת הגברה ללא NASBA. - זהה זוגות פריימרים מועמדים כדי להתקדם עם ניתוח רגישות. זוגות פריימרים נבחרים על סמך השאלה אם הפעלת מתג toehold מתרחשת בעקבות הוספת התגובה הדוגרת. במידת הצורך, חזור על מסך הפריימר עם שילובי פריימר נוספים.
- שמירה על דגימות RNA על קרח בכל עת, בצע את מערך הדילול הסדרתי הבא של רנ"א מטרה במים נטולי נוקלאז: 104, 103, 10 2, 101 ו- 100 עותקי RNA / μL. חזור על הגברה מבוססת רצף חומצות גרעין ותגובות ללא תאים עם ערכות הפריימר שנבחרו (שלבים 8.2-8.7), בדיקת סדרת הדילול הסדרתי על מנת לזהות את ערכות הפריימר המספקות את הרגישות הטובה ביותר. ראו איור 5 כדוגמה לתוצאות לקביעת הרגישות של קבוצת הפריימרים.
הערה: באופן אידיאלי, מתג ה-toehold שנבחר וזוג הפריימרים צריכים לזהות עד 1-100 עותקי RNA יעד לכל μL של ה-RNA (ריכוז תמיסת מלאי). - חזור על ניסוי הרגישות להגברה המבוססת על רצף חומצות גרעין במשולש ביולוגי. שלב זה משמש כדי לאשר את שכפול התוצאות לפני המעבר לניסויים עם דגימות המטופל.
- אופציונלי: כדי שיהיה מקור אמין לדנ"א של המתג לשימוש ארוך טווח ולהובלה, שכפלו את רצפי המתגים שנבחרו לפלסמיד באמצעות כל שיטת שיבוט קונבנציונלית. באופן דומה, ניתן גם לשכפל את רצף ה-RNA של טריגר המטרה לפלסמיד לבחירה לאחסון.
| רכיב | נפח לכל תגובה | ריכוז סופי |
| מאגר התגובה של נאס"א | 1.67 מיקרון | פי 1 |
| תערובת נוקלאוטידים של NASBA | 0.833 מיקרון | פי 1 |
| פריימר קדמי 25 μM | 0.1 מיקרון | 0.5 מיקרומטר |
| פריימר הפוך 25 μM | 0.1 מיקרון | 0.5 מיקרומטר |
| מעכב RNase (40 U/μL) | 0.05 מיקרון | 0.4 U/μL |
| רנ"א מטרה | 1 מיקרון | |
| תערובת אנזימים NASBA | 1.25 מיקרון ליטר | פי 1 |
| נפח כולל | 5 מיקרון |
טבלה 6: רכיבי התגובה של NASBA.
| צעד | טמפרטורה | זמן |
| דנטורציה | 65 °C | 2 דק' |
| שיווי משקל | 41 מעלות צלזיוס | 10 דק' |
| אחז | 41 מעלות צלזיוס | ∞ |
| דגירה | 41 מעלות צלזיוס | 1 שעה |
| אחז | 4 °C | - |
טבלה 7: תנאי התגובה של ה-NASBA.
| רכיב | נפח | ריכוז סופי לכל תגובה |
| פתרון א' | 2.38 מיקרון ליטר | 40% |
| פתרון ב' | 1.78 מיקרון | 30% |
| מעכב RNase | 0.03 מיקרון | 0.5% v/v |
| החייאה (25 מ"ג/מ"ל) | 0.14 מיקרון | 0.6 מ"ג/מ"ל |
| מתג טוהולד | X μL | 33 נאנומטר |
| רנ"א מטרה (אם רלוונטי) | X μL | 1 מיקרומטר |
| נאס"א (אם רלוונטי) | 0.85 מיקרון | 1:7 |
| מים נטולי נוקלאז | עד 5.94 מיקרון | - |
| נפח כולל: | 5.94 מיקרון | |
טבלה 8: רכיבי תגובה נטולת תאים מבוססי נייר.
9. איסוף דגימות מטופלים ומיצוי RNA ויראלי
הערה: סעיף זה מתאר את הפרוטוקול לאיסוף דגימות מטופלים ולחילוץ הרנ"א באמצעות ערכת טיהור RNA. הפרוטוקול שלהלן משמש לקבלת סרום מדם היקפי. הדגימות ששימשו במחקר זה נאספו מחולים המציגים חום, אקסנתמה, ארתרלגיה או תסמינים קשורים אחרים של זיהום arbovirus במדינת פרנמבוקו, ברזיל.
- לאסוף דגימות דם היקפיות מחולים החשודים כנגועים בארבו-וירוס. בצע venipuncture (צינור דם שלם) באמצעות טכניקה אספטית סטנדרטית. תייג את צינורות הדגימה עם קוד אנונימי ואת תאריך איסוף הדגימה.
- דם צנטריפוגה כדי להפריד את הסרום ב 2,300 x גרם במשך 10 דקות. באמצעות פיפטה, הכינו אליקוטים של סרום (200 μL) שישמשו להפקת RNA בצינורות 1.5 מ"ל.
הערה: אם לא ניתן לבצע את מיצוי הרנ"א זמן קצר לאחר איסוף הדגימה, יש לאחסן דגימות סרום בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לפני יישומים במורד הזרם. - פיפטה 560 μL של Buffer AVL מוכן (חיץ ליזיס ויראלי) המכיל את הרנ"א המוביל לתוך צינור 1.5 מ"ל. הוסיפו 140 מיקרוגרם של סרום לתערובת ה-RNA של Buffer AVL/carrier בצינור. מערבבים על ידי מערבולת דופק במשך 15 שניות.
- דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן צנטריפוגה קצרה את הדגימה כדי לאסוף את התוכן בתחתית הצינור. הוסיפו 560 μL של אתנול (96%-100%) לדגימה וערבבו לפי מערבולת דופק במשך 15 שניות. לאחר הערבוב, צנטריפוגה את הדגימה כדי לאסוף את התוכן בתחתית הצינור.
- הוסיפו בזהירות 630 μL של התמיסה משלב 9.4 לעמוד הספין מבלי להרטיב את החישוק. לאחר שלב זה, סגור את המכסה, וצנטריפוגה ב 6,000 x גרם למשך דקה אחת. הכניסו את עמוד הספין לצינור איסוף נקי של 2 מ"ל והשליכו את צינור האיסוף המשומש המכיל את הסינון.
- פתח בזהירות את עמודת הסיבוב וחזור על שלב 9.5. פתחו בזהירות את עמודת הספין והוסיפו 500 מיקרון של Buffer AW1 (מאגר כביסה 1). סגור את המכסה, וצנטריפוגה בגודל 6,000 x g למשך דקה אחת. הכניסו את עמוד הספין לצינור איסוף נקי של 2 מ"ל והשליכו את צינור האיסוף המשומש המכיל את הסינון.
- פתח בזהירות את עמודת הסיבוב והוסף 500 μL של Buffer AW2 (מאגר כביסה 2). סגרו את המכסה ואת הצנטריפוגה ב-20,000 x גרם למשך 3 דקות. הכניסו את עמוד הספין לצינור איסוף נקי של 2 מ"ל, והשליכו את צינור האיסוף המשומש המכיל את הסינון.
- כדי למנוע זיהום על ידי חיץ שיורי AW2, שעלול לגרום לבעיות בתגובות אנזימטיות במורד הזרם, הנח את עמוד הספין לתוך צינור איסוף נקי של 2 מ"ל והשלך את צינור האיסוף המשומש עם התנין. צנטריפוגה ב 20,000 x גרם במשך דקה אחת.
- מניחים את עמוד הספין בצינור נקי של 1.5 מ"ל ומשליכים את צינור האיסוף המשומש עם התנין. פתח בזהירות את עמודת הספין והוסף 60 μL של Buffer AVE (חיץ אלוטיון) בשיווי משקל לטמפרטורת החדר. לאחר שלב זה, סגרו את הפקק, ודגרו בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת.
- צנטריפוגה ב-6,000 x גרם למשך דקה. לאחר מכן ניתן להשתמש ב-RNA המלוטש כקלט עבור ה-NASBA וה-RT-qPCR במקביל.
- בצע את שלבים 8.3 עד 8.11 כדי לבצע הגברה מבוססת רצף חומצות גרעין ותגובות מבוססות נייר ללא תאים באמצעות 1 μL של RNA המטופל שחולץ, תוך הקפדה לכלול תגובות בקרה שליליות וחיוביות. לאחר התגובות, הכינו את לוחית התגובה בעלת 384 הבארות והפעילו את הבדיקה במכשיר קורא הצלחות הנייד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (ראו פירוט בפרוטוקול המשלים).
הערה: שני ריכוזי RNA של 104 ו-102 PFU/mL, המופקים מנגיף זיקה בתרבית, משמשים כבקרות חיוביות לכל הניסויים במהלך האימות הקליני. בנוסף לפקדים שהוזכרו קודם לכן, חשוב לכלול גם את ההדק (10 ng/μL) כבקרה חיובית. - בסוף כל ניסוי, ניתן להעלות את הנתונים הגולמיים (קובץ .csv) מקורא לוחות המחוונים למסד נתונים מאובטח באינטרנט. בנוסף, קורא הצלחות הנייד מפיק דוח המציין אם הדגימות חיוביות או שליליות לנגיף זיקה (איור 6); עיין בסעיף התוצאות המייצגות לקבלת דוגמאות של כל הגרפים שהתקבלו במהלך הדגירה (איור 7).
הערה: משתמשים יכולים גם להעביר קבצים מקורא הצלחות הנייד למחשב שלהם באמצעות ה-USB.
10. מכשיר קורא צלחות נייד
- מכשיר קורא הצלחות הנייד (איור 8) יכול לשמש כחלופה לקורא צלחותרגיל 24. לקבלת הפרוטוקול והתוצאות המייצגות, ראה פרוטוקול משלים.
11. RT-qPCR לזיהוי וירוס זיקה
הערה: סעיף זה מתאר את השלבים לביצוע RT-qPCR לזיהוי וירוס זיקה מדגימות מטופלים (ראה פרוטוקול משלים).
- כדי למנוע זיהום, הרכיבו את רכיבי RT-qPCR באזור מבודד מתהליך ההגברה (למשל, מכסה מנוע נקי). הניחו את מאגר RT-qPCR, האנזימים והפריימר/בדיקות על קרח או על בלוק קר. לאחר מכן, הוסיפו את התגובות לצלחת של 384 בארות על קרח לפי טבלה 9.
הערה: בקרה שלילית (בקרת מיצוי ובקרה שאינה תבנית [NTC]) ובקרה חיובית (104 PFU/mL) מומלצות לכל הניסויים. - לאחר הוספת הריאגנטים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, ערבבו את התגובה על ידי צנרת למעלה ולמטה (אל תערבבו), והעבירו 6.5 μL לכל באר. הוסף 3.5 μL מכל תבנית RNA במשולש.
- הניחו סרט PCR מעל החלק העליון של הצלחת. צנטריפוגה צלחת 384-באר ב 600 x גרם במשך 2 דקות.
- הנח את הלוחית במכונת RT-qPCR באמצעות תנאי המחזור הבאים המתוארים בטבלה 10. כדי לנתח את התוצאות, השתמש בתוכנת התכנון והניתוח של מכונת RT-qPCR ושקול את הסף והבסיס האוטומטיים (ראה פרטים בפרוטוקול המשלים).
| רכיב | נפח | ריכוז |
| 2X QuantiNova Probe RT-PCR מאסטר מיקס | 5 מיקרון | פי 1 |
| פריימר קדמי 100 μM | 0.08 מיקרון | 0.8 מיקרומטר |
| פריימר הפוך 100 μM | 0.08 מיקרון | 0.8 מיקרומטר |
| 25 מיקרומטר בדיקה | 0.04 מיקרון | 0.1 מיקרומטר |
| QuantiNova ROX צבע ייחוס | 0.05 מיקרון | פי 1 |
| QuantiNova Probe RT Mix | 0.1 מיקרון | פי 1 |
| תבנית RNA | 3.5 מיקרון | - |
| מים נטולי נוקלאז | עד 10 מיקרון | - |
טבלה 9: רכיבי RT-qPCR להגברת RNA של נגיף זיקה בהתבסס על פרוטוקול המרכז לבקרת מחלות ומניעתן-CDC ארה"ב לזיהוי נגיף זיקה מדגימות חולים31.
| צעד | טמפרטורה | זמן | |
| תמלול לאחור | 45 מעלות צלזיוס | 15 דק' | |
| שלב ההפעלה הראשונית של PCR | 95 °C | 5 דק' | |
| 45 מחזורים | דנטורציה | 95 °C | 5 שניות |
| חישול/הארכה משולבים | 60 מעלות צלזיוס | 45 שניות | |
טבלה 10: תנאי מחזור עבור RT-qPCR.
Representative Results
בעקבות צינור התכנון החישובי, בניית שלושה מתגי toehold בוצעה על ידי PCR. מוצרי ה-PCR נותחו באמצעות אלקטרופורזה בג'ל אגרוז (איור 2). נוכחותו של פס ברור סביב 3,000 bp, בערך בגודל של הגן lacZ המוצמד למתג toehold, בדרך כלל מצביעה על תגובה מוצלחת. לחלופין, נתיב ללא רצועה, רצועות מרובות או רצועה בגודל שגוי, מציין PCR כושל. במקרה של PCR כושל, יש למטב את תנאי התגובה ו/או רצפי הפריימר.
מתגי ה-toehold שהורכבו נבדקו כדי להעריך כל חיישן מול הרנ"א המתועתק במבחנה שלו (איור 3). בעוד שכל שלושת החיישנים הציגו ספיגת OD570 מוגברת, למתג 27B (איור 3A) היה הקצב המהיר ביותר. מתגים 33B, ובמידה פחותה יותר, 47B, הראו ספיגה מוגברת של OD570 בהיעדר RNA של טריגר מטרה, מה שמצביע על כך שלמתגים אלה יש פעילות רקע או דליפה מסוימת (איור 3B,C) - תכונה שאינה רצויה בחיישן מועמד מכיוון שהיא יכולה להפחית את הספציפיות. כדי לזהות בצורה ברורה יותר את החיישן עם יחס אות ההפעלה/כיבוי הגבוה ביותר, חושב שינוי הקיפול של ספיגת OD570 (ראה מידע משלים סעיף 5) והתווה (איור 4). מניתוח זה, ברור כי מתג 27B הוא החיישן בעל הביצועים הטובים ביותר עם יחס הפעלה/כיבוי של כ-60.
הרגישות של מתג ה-toehold בעל הביצועים הטובים ביותר (27B) הוערכה לאחר מכן על ידי קביעת ריכוז ה-RNA הנמוך ביותר הנדרש להפעלת מתג ה-toehold בשילוב עם תגובת NASBA. הגרף ממחיש כי חיישני זיקה בעלי הביצועים הטובים ביותר יכולים לזהות RNA בריכוזים נמוכים של עד 1.24 מולקולות לכל μL (שווה ערך ל~2 aM; איור 5).
לאחר שמתג 27B זוהה ואומת, חומרי החיישנים חולקו לחברי הצוות ברסיפה במדינת פרנמבוקו בברזיל. בברזיל, הדיוק האבחוני הקליני של פלטפורמת אבחון הווירוסים זיקה הוערך באמצעות דגימות של חולי נגיף זיקה, במקביל ל- RT-qPCR לצורך השוואה. כדי לאמת את פלטפורמת אבחון זיקה מבוססת נייר, נעשה שימוש בקורא הצלחות הנייד, המסוגל לדגור ולקרוא את הפלט הצבעוני של חיישנים מבוססי נייר. שינוי הצבע מצהוב לסגול משמש לזיהוי דגימה חיובית, בעוד שדגימה שלילית נשארת צהובה (איור 6). אפשרות נוספת להמחשת התוצאות שמפיק קורא הלוחות הניידים (איור 8) היא להתוות את התגובה הצבעונית עבור כל תגובה מבוססת נייר לאורך זמן. דגימות נבדקו במשולש ואלה שעברו את הסף (קו אדום שנקבע ל-1) נחשבו חיוביות, בעוד שדגימות מתחת לסף נחשבו שליליות (איור 6 ואיור 7).
לבסוף, כדי להעריך ולהשוות את הביצועים הקליניים של חיישן מתג זיקה טוהולד עם שיטת תקן הזהב הנוכחית לאבחון זיהום בנגיף זיקה, כל דגימות המטופלים נבדקו במקביל ל- RT-qPCR. חלקת ההגברה של שתי דגימות מטופלות מייצגות נבדקה במשולש לזיהוי נגיף זיקה על ידי RT-qPCR (איור 9). הדגימות נחשבות חיוביות כאשר ערך סף המחזור (Ct) הוא ≤38; הקו האדום מציין דגימה חיובית והקו הכחול מציין דגימה שלילית לנגיף זיקה.
איור 2: אלקטרופורזה בג'ל אגרוז להערכת האיכות של מוצרי PCR. מוצרי PCR מנותחים על ג'ל אגרוז 1% ב 1X TAE, לרוץ ב 80 V במשך 90 דקות. רצועה אחת ברורה מעידה בדרך כלל על תגובה מוצלחת. נתיב 1: סולם דנ"א של 1 קילובייט; נתיבים 2-4: 27B מתג DNA, 33B דנ"א טריגר, ו 47B מפעיל DNA, בהתאמה. המספרים בצד שמאל מייצגים את גודל הרצועה ב-bp. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: יצירת אב-טיפוס של שלושה מתגי טו-הולד עבור חיישני זיקה מבוססי נייר. הביצועים של שלושה חיישני מתגי RNA מבוססי-נייר נמדדו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך יותר מ-130 דקות. כל גרף מכיל שני עקבות, האחד מייצג את פקד המתג בלבד, ואילו השני מייצג את המתג וההדק. שלושת הגרפים מייצגים נתונים שנרכשו באמצעות חיישני מתג 27B (A), 33B (B) ו- 47B (C). קווי שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע (SEM) משלושה עותקים משוכפלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: חיישנים בעלי ביצועים מעולים מזוהים על-ידי חישוב שינוי הקיפול בספיגה ב-570 ננומטר. שינוי קיפול (או יחס הפעלה/כיבוי מרבי) מחושב על ידי מדידת יחס הספיגה (OD570) ב-130 דקות בין בקרת המתג בלבד, לבין בדיקת CFPS של המתג בתוספת ההדק. קווי שגיאה מייצגים SEM משלושה עותקים משוכפלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: הערכת רגישות של מתג בעל ביצועים מעולים. רנ"א זיקה מתועתק במבחנה מוחדר לתגובות NASBA. לאחר דגירה של שעה אחת, התגובות נוספו לתגובות PURExpress נטולות תאים על דיסקיות נייר ביחס של 1:7. שינוי הקיפול לאחר 130 דקות ב-37 מעלות צלזיוס מתווה. נתון זה הועתקמ-24. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: דף לכידה של קורא לוחות נייד עמוס בנתוני תמונה שנלכדו. איור זה מציג תמונה לדוגמה של התמונה הסופית שצולמה על-ידי קורא הלוחות הניידים במהלך הרצת איסוף נתונים. חותמת התאריך/שעה המקורית גלויה בראש התמונה. צבע צהוב מציין שליטה או תגובות שליליות, והצבע הסגול מציין תגובה חיובית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 7: מצב ניתוח נתונים. בצד שמאל, משתמשים בוחרים את ערכות הנתונים שהם רוצים להתוות; לאחר מכן, התרשימים מוצגים מימין עם צבעים ייחודיים עבור כל דגימה או ערכת פקדים. הקו האדום המקווקו משמש סף לקביעת דגימות חיוביות ושליליות. דגימות שנבדקו במשולש החורגות מהסף נחשבות חיוביות, בעוד שדגימות מתחת לסף נחשבות שליליות. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן (SD) משלושה עותקים משוכפלים. Ctrl 1 עד Ctrl 5 מציין פקדים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
תרשים 8. PLUM, קורא צלחות נייד. קורא צלחות נייד זה פועל כמעבדה בקופסה ומשמש כקורא צלחות מבוקר טמפרטורה לדגירה ולניטור תגובות צבעיות. מכשיר נייד זה יכול לספק מדידות כמותיות ותפוקה גבוהה של חיישני זיקה מבוססי נייר באתר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 9: תרשים RT-qPCR של הגברה של שתי דגימות מטופלים שנבדקו במשולש לזיהוי נגיף זיקה. דגימות נחשבות חיוביות כאשר ערך סף המחזור (Ct) הוא ≤38. הקו האדום המקווקו משמש סף לקביעת דגימות חיוביות ושליליות. העקבה האדומה מציינת דגימה חיובית, והעקבה הכחולה מציינת דגימה שלילית. ערך ΔRn (delta Rn) מייצג את הגודל המנורמל של אות הפלואורסצנציה שזוהה על ידי מכשיר RT-qPCR עבור כל הדגימות שנבדקו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
קובץ פרוטוקול משלים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
נתונים משלימים. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתונים אלה.
Discussion
המערכת המשולבת מבוססת הנייר המתוארת כאן יכולה להביא אבחון מולקולרי רלוונטי מבחינה קלינית, עם ביצועים דומים מבחינה פונקציונלית ל- RT-qPCR, לנקודת הצורך6. חשוב לציין, עבור הגדרות מרוחקות, הזמינות של אבחון באתר יכולה לקצר את הזמן לתוצאות מימים לשעות. הדגשת יכולת התכנות של גישה זו, הצינור שתואר יכול לשמש לזיהוי כמעט כל יעד פתוגן. שילבנו את הכלים המולקולריים עם קורא צלחות נייד ייעודי, שהוא קומפקטי ותואם לפעולת הסוללה (8-9 שעות) ומספק ניתוח נתונים מובנה כדי לאפשר יישומים מבוזרים . בעבודות אחרות, אימתנו את החומרה המשולבת ואת פלטפורמת אבחון הווירוסים זיקה עם 268 דגימות מטופלים, במקביל ל- RT-qPCR, ומצאנו דיוק אבחוני של 98.5%24. יחד, המטרה שלנו היא לאפשר את העברת הטכנולוגיה של פלטפורמה זו לחוקרים, כך שהקהילה תוכל לשנות את ייעודה ולשפר אותה כדי לענות על צרכי אבחון שלא נענו.
תהליך תכנון מתגי ה- in silico toehold שולב ואוטומטי לצינור שניתן לחלק לשלושה שלבים. השלב הראשון מייצר מאגר של עיצובי מתגי טוהולד המשתלבים לרצף המטרה במרווחים של נוקלאוטיד אחד. השלב השני בוחן את המבנה המשני ואת זמינות מתגי ה-toehold ומבטל חיישנים עם קודוני עצירה מוקדמים בתוך המסגרת. לאחר מכן, פונקציית ניקוד הלוקחת בחשבון גורמים מרובים (לדוגמה, רמת הפגם של מתג toehold, זמינות מתג toehold ונגישות אתר היעד) מיושמת לאחר מכן כדי לבחור עיצובים של מתגי toehold מובילים בהתבסס על הציונים הכוללים. בשלב הסופי, נוצרת רשימה של רצפים עבור עיצובי מתגי הטוהולד העליונים וגורמי המטרה המתאימים להם. יש לבדוק את רצפי החיישנים העליונים כדי לבדוק את הספציפיות מול התעתיק האנושי והגנומים הנגיפיים הקשורים זה לזה באמצעות NCBI/Primer-BLAST25. כמו כן, מומלץ לסנן את אתרי המטרה של החיישן לצורך שימור רצף בגנום הנגיפי של זיקה כדי להבטיח שהחיישנים יספקו זיהוי רחב וחזק. מספר גרסאות של תוכנת תכנון מתגי toehold פותחו ואלגוריתם העיצוב מאפשר למשתמשים ליצור שתי גרסאות, או סדרה A 6 או סדרה B toehold מתגים6. במאמר זה, ההתמקדות הייתה בעיצוב מתגי Toehold מסדרה B.
לאחר סינתזת דנ"א מסחרית, ניתן להרכיב במהירות את מתגי ה-toehold, ולאחר מכן לבדוק אותם על ידי ביצוע בדיקה ראשונית כנגד רצף טריגר מטרה סינתטי המתאים לאזורים קצרים (200-300 nt) של גנום המטרה. לסינון הביצועים של חיישנים מבוססי מתג toehold, זה אידיאלי להוסיף את רצף המטרה בצורה של RNA. במאמר זה תוארו השלבים הנדרשים להוספת RNA טריגר מתועתק במבחנה . עם זאת, אם הן זמינות, ניתן להשתמש בתבניות גנום באורך מלא כגון תמציות RNA נגיפיות מכומתות או גנומים מסחריים של RNA סינתטי או תקנים. שימוש בגנומים של רנ"א באורך מלא לסינון ראשוני של מתגי ה-toehold מועיל מכיוון שהוא יכול להודיע אם גורמים נוספים, כגון מבנה משני של RNA, ישפיעו על ביצועי החיישן. כדי למטב את יחס ההפעלה/כיבוי של מתגים מועמדים, ניתן להפוך את הדנ"א של מתג ה-toehold לתגובה נטולת תאים. שלב זה יכול לשמש גם לזיהוי מתגי toehold בעלי ביצועים גבוהים (הגברה בקיפול, או יחס ON/OFF גבוה) ולהשמטת מתגי toehold דולפים (אות גבוה בהיעדר RNA המטרה) משלבי אפיון במורד הזרם.
כדי לשפר את גבול הזיהוי של המועמדים בעלי הביצועים הטובים ביותר למתג toehold, NASBA משמש להגדלת הריכוזים הרלוונטיים מבחינה קלינית של RNA נגיפי זיקה למטרה לרמה שניתן לזהות על ידי מתגי toehold6. שילובים שונים של ערכות פריימרים קדימה ואחורה נבדקים כדי לקבוע את שילובי הפריימר והמתגים הטובים ביותר של NASBA כדי לאפשר זיהוי בריכוזים רלוונטיים מבחינה קלינית. לאחר שזוהתה ערכת פריימרים אידיאלית ושילוב מתגי toehold, הבדיקה מועברת לאימות קליני. חשוב לציין כי מתג ה-toehold ושלבי הסינון של NASBA יכולים להיות עתירי עבודה ומשאבים ולכן פיתוח הבדיקות מתאים ביותר לאתרי מחקר עתירי משאבים. למרות שלא יישמנו אוטומציה של תהליכים, סביר להניח שהדבר עשוי להאיץ את מחזור התכנון, הבנייה והבדיקה האיטרטיבי32. למרבה המזל, זמן התפנית מתכנון חיישנים ובדיקות לפריסה יכול להיות קצר להפליא (פחות משבוע), מה שהופך אסטרטגיה זו לאידיאלית למצבים קריטיים בזמן, כגון התפרצויות מגיפה6.
גם לאחר שפותח ביוסנסור בעל רגישות רלוונטית מבחינה קלינית, ישנם אתגרים טכניים שיש לטפל בהם. מכיוון שפרוטוקול זה כרוך בהפעלה ידנית והוא הליך רב-שלבי, קיים סיכון לזיהום צולב בין דגימות. אנו עושים כמיטב יכולתנו כדי להפחית סיכון זה באמצעות תרגול מעבדה זהיר. בניסוי קליני שנערך לאחרונה בהשתתפות 268 דגימות של מטופלים, לא נתקלנו בבעיות זיהום; עם זאת, זהו שיקול חשוב24. בהתחשב בכך, הפרוטוקול נשאר מבחן מעבדה ודורש משתמש מיומן עם שליטה בטכניקות ביולוגיה מולקולרית מתאימות. שיקול נוסף לפריסה הוא בידוד הרנ"א מדגימות המטופלים. כאן אנו מתארים בידוד RNA באמצעות ערכות מיצוי חומצות גרעין מבוססות עמודה. עם זאת, בעבודות אחרות, הדגמנו שיטת תזה רותחת יעילה ופשוטה (95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות) לעיבוד דגימת מטופלים בנטל נמוך6. אסטרטגיה זו כמעט מבטלת את העלות הכרוכה במיצוי RNA ונמנעת משימוש בערכות מיצוי חומצות גרעין מבוססות עמודה, שיכולות להוות אתגר לוגיסטי במסגרות דלות משאבים או בבעיות בשרשרת האספקה במהלך משברים, כגון מגיפת COVID-1933.
כפי שראינו במהלך מגיפת COVID-19, המכשירים המשמשים לביצוע RT-qPCR יכולים בעצמם לשמש צוואר בקבוק ולהגביל את גישת המטופלים לבדיקות. גורם זה, שהוא גם פיננסי במידה רבה, מוביל למצב בדיקה מרכזי שיכול להגביל את הגישה לאבחון. לדוגמה, במהלך התפרצות זיקה 2015/2016, רק חמש מעבדות ייחוס לאומיות היו זמינות בברזיל, מה שגרם לעיכובים בבדיקות המטופלים. מבלי לקחת בחשבון את היתרון הפוטנציאלי של יתרונות לגודל, העלות הנוכחית של סחורות עבור קורא הצלחות הנייד היא ~ 500 דולר ארה"ב, אשר גם אם גדל פי חמישה כדי להסביר את העבודה ואת המרווח המסחרי, עדיין מספק מכשיר זול. זאת בהשוואה למכשירי RT-qPCR שעלותם נעה בין 15,000 ל-90,000 דולר34 דולר. יתר על כן, העלות המשוערת לבדיקה ללא תאים באמריקה הלטינית היא סביב $5.48 USD, בעוד שהעלות לבדיקה של RT-qPCR בברזיל הייתה ~$10-11 USD בזמן התפרצות זיקה36. מעבר לעלות הציוד, לקורא הצלחות הנייד יש טביעת רגל קטנה (20 ס"מ3), ניתוח אוטומטי, העלאת נתונים לענן דרך האינטרנט, וניתן להפעיל אותו על כוח סוללה. תכונות אלה מרחיבות באופן דרמטי את ההגדרות הפוטנציאליות שבהן ניתן לפרוס בדיקות ומרחיבות במקביל את אוכלוסיית המטופלים שניתן לשרת.
נכון להיום פלטפורמות E. coli CFPS המסחריות הנפוצות ביותר הן מערכות S30 ו- PURE37; עם זאת, שיקול מרכזי בשיפור הגישה לאבחון במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית הוא הזמינות המקומית המוגבלת של ריאגנטים אלה. צעד חשוב לקראת פתרון אתגר זה הוא פיתוח ייצור CFPS מקומי. מעבדת פדריצ'י עשתה לאחרונה התקדמות משמעותית לקראת פיתוח פלטפורמה לא מסחרית להטמעת חיישנים מבוססי מתגי toehold במערכות נטולות תאים מבוססות ליזאט, המגיעים ל-LOD של 2.7 fM עם נגיף זיקה RNA14. לא רק שהישג זה מאפשר לייצר את הריאגנטים בארץ השימוש, תוך הימנעות ממכסי יבוא ועיכובים, אלא שעלויות העבודה גם מתרחבות לתעריפים המקומיים וכך ניתן להוריד משמעותית את העלות הכוללת. בעבודה שהתוותה קבוצת פדריצ'י, עלות הפקת תגובת הביטוי CFPS (5 μL) בצ'ילה הייתה 6.9 סנט (USD)35,38, וסיפקה תמריץ כפול (לוגיסטיקה ועלות משופרות) ליישום מערכות מבוססות ליזאט 35,38.
המיקום של בדיקות דומות ל- RT-qPCR ברשתות אבחון מבוזרות עשוי להביא יתרונות משמעותיים על פני שיטות העבודה הנוכחיות התלויות בהובלת דגימות למתקני RT-qPCR מרכזיים. במסגרות פרי-עירוניות, שבהן התרכזו מקרי זיקה, המרחק הפיזי בין המטופל למכון האבחון מאט את האבחון ומגביר את הסיכון שהתוצאות לא יגיעו למטופל בזמן רלוונטי מבחינה קלינית. תקוותנו היא שהעבודה המוצגת כאן תוכל לתרום לאפשר לקהילת המחקר, באמצעות העברת ידע, ליצור ביוטכנולוגיות מבוזרות וחומרה ניידת לבריאות האדם, לחקלאות ולניטור סביבתי.
Disclosures
K.P. ו-A.A.G. הם ממציאים שותפים של טכנולוגיות הקשורות לחיישני טוהולד מבוססי נייר. Y.G., S.C., ו- K.P. הם מייסדים משותפים של LSK Technologies, Inc. והם ממציאים שותפים של טכנולוגיות הקשורות ל- PLUM. מ.ק., ק.פ. וא.א.ג. הם מייסדים שותפים של אן כרטא דיאגנוסטיקה בע"מ. למחברים אחרים אין ניגודי עניינים. פטנטים: מכשיר PLUM: Y.G., S.C., ו- K.P. בקשת הפטנט הוגשה על ידי אוניברסיטת טורונטו והוקצתה ל- LSK Technologies Inc. U. S. בקשת פטנט זמנית מס '62/982,323 שהוגשה 27 בפברואר 2020; טוהולד מתג פטנט: A.A.G., P.Y., ו- J.J. C. "הרכבי ריבורגולטור ושיטות שימוש", פטנט. WO2014074648A3 הגיש 6 בנובמבר 2012; פטנט אבחון מבוסס נייר: K.P. ו- J.J.C. "רשתות גנים סינתטיות מבוססות נייר" בארה"ב. פטנט בהמתנה לא. US15/963,831 הגיש 6 בדצמבר 2013; פטנט זיקה 1: K.P., A.A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F., ו- J.J.C., "פלטפורמה ניידת וזולה לזיהוי וירוסים וזיהוי מתח", בקשת פטנט זמנית מס' 62/403,778 שהוגשה ב-4 באוקטובר 2016; פטנט זיקה 2: K.P., A. A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F., ו- J.J.C., "פלטפורמה ניידת וזולה לזיהוי וירוסים וזיהוי מתח", בקשת פטנט זמנית מס' 62/341,221 שהוגשה ב-25 במאי 2016.
Acknowledgments
המחברים מודים לכל חברי מעבדות גרין, פארדי ופנה, כמו גם לכל המחברים השותפים של כתבי יד קודמים הנוגעים לעבודה המתגלה בכתב יד זה. S.J.R.d.S. נתמך על ידי מלגת דוקטורט בחסות הקרן למדע וטכנולוגיה של פרנמבוקו (FACEPE), ברזיל, מספר הפניה IBPG-1321-2.12/18, וכיום נתמך על ידי מלגת פוסט-דוקטורט בחסות אוניברסיטת טורונטו, קנדה. P.B. נתמך על ידי פרס ויליאם קנאפ באקלי מהפקולטה לרוקחות, אוניברסיטת טורונטו. M.K. נתמך על ידי יוזמת הרפואה המדויקת (PRiME) באוניברסיטת טורונטו מספר מלגה פנימית PRMF2019-002. עבודה זו נתמכה על ידי כספים ל- K.P מתוכנית כסאות המחקר של קנדה (קבצים 950-231075 ו- 950-233107), הקרן לניהול פרויקטי מחקר גדולים של אוניברסיטת טורונטו, תוכנית המענקים של קרן CIHR (201610FDN-375469), ול- L.P, A.A.G., ו- K.P באמצעות מענק צוות CIHR / IDRC: תוכנית וירוס זיקה קנדה-לטינית/אמריקה-קריביים (FRN: 149783), כמו גם על ידי כספים ל- K.P. ממרכז המחקר לפיתוח בינלאומי של קנדה (מענק 109434-001) דרך הזדמנות מימון המחקר המהיר של נגיף הקורונה החדש (COVID-19) הקנדי לשנת 2019. עבודה זו נתמכה גם על ידי כספים ל- A.A.G. מפרס חוקר חדש של ועדת המחקר הביו-רפואית של אריזונה (ADHS16-162400), קרן גייטס (OPP1160667), פרס חדשן חדש של מנהל NIH (1DP2GM126892), פרס NIH R21 (1R21AI136571-01A1) ל- K.P./A.A.G, ומלגת אלפרד פ. סלואן (FG-2017-9108). איור 1 נוצר עם Biorender.com תחת רישיון אקדמי ל-K.P.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384 well plate covers - aluminum | Sarstedt | 95.1995 | Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the PLUM reader |
| 384 well plate covers - transparent | Sarstedt | 95.1994 | Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the BioTek plate reader |
| 384 well plates | VWR | CA11006-180 | 2 mm paper-based diagnostics are placed into the wells of these plates for quantification |
| Agarose | BioShop Canada | AGA001.500 | Gel electrophoresis |
| BSA | BioShop Canada | ALB001.500 | Blocking agent for the Whatman filter paper |
| Cell free reactions | New England Biolabs | E6800L | PURExpress |
| CPRG | Roche | 10884308001 | Chlorophenol red-b-D-galactopyranoside |
| Disposable Sterile Biopsy Punches | Integra Miltex | 23233-31 | Used to create 2 mm paper discs that fit into a 384-well plate |
| DNAse I | Thermo Scientific | K2981 | Digests template DNA following incubation of the in vitro transcription reaction |
| DNAse I Kit | Thermo Scientific | 74104 | DNase I Kit For removing template DNA from IVT RNA |
| dNTPs | New England Biolabs | N0446S | Used for PCRs |
| electrophoresis system | Bio-Rad | 1704487 | Used to run the agarose gels |
| Gel imaging station | Bio-Rad | 1708265 | ChemiDoc XRS+ Imaging System |
| IVT kit | New England Biolabs | E2040S | Used for in vitro transcribing template (trigger) RNA for switch screening |
| Nanodrop One | Thermo Scientific | ND-ONE-W | Used for determining nucleic acid concentrations |
| NASBA kit | Life Sciences Advanced Technologies | NWK-1 | Isothermal amplification reaction components |
| Nuclease free H20 | invitrogen | 10977015 | Added to reaction mixes |
| PAGE electrophoresis system | Biorad | 1658001FC | Used to cast and run polyacrylamide gels |
| pCOLADuet-LacZ DNA | Addgene | 75006 | https://www.addgene.org/75006/ |
| Phusion polymerase/reactioin buffer | New England Biolabs | M0530L | Used for PCRs |
| Plate reader | BioTek | BioTek NEO2 | Multi Mode Plate Reader, Synergy Neo2 |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom oligo synthesis | |
| Q5 polymerase/reaction buffer | New England Biolabs | M0491L | Used for PCRs |
| Qiagen PCR Puriifcation Kit | QIAGEN | 27106 | QIAprep Spin Miniprep Kit |
| RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | 2X RNA loading dye |
| RNA Purification Kit | QIAGEN | EN0521 | QIAamp Viral RNA extraction kit |
| RNase inhibitor | New England Biolabs | M0314S | Used to prevent contamination of RNases A, B, and C |
| RT-qPCR kit | QIAGEN | 208352 | QuantiNova Probe RT-PCR Kit |
| SYBR Gold | Invitrogen S11494 | S11494 | PAGE gel stain for nucleic acids |
| TAE Buffer | BioShop Canada | TAE222.4 | Gel electrophoresis buffer |
| Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | Used for temperature cycling and incubating reactions |
| Whatman 42 filter paper | GE Healthcare | 1442-042 | Used to imbed molecular components for paper-based diagnostics |
References
- Urdea, M., et al. Requirements for high impact diagnostics in the developing world. Nature. 444, Suppl 1 73-79 (2006).
- Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annual Review of Biomedical Engineering. 10, 107-144 (2008).
- Faria, N. R., et al. Mobile real-time surveillance of Zika virus in Brazil. Genome Medicine. 8 (1), 97 (2016).
- Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: Early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
- Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
- Pardee, K., et al. Rapid, low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Duyen, T. T. M., et al. Paper-based colorimetric biosensor for antibiotics inhibiting bacterial protein synthesis. Journal of Bioscience and Bioengineering. 123 (1), 96-100 (2017).
- Jung, J. K., et al. Cell-free biosensors for rapid detection of water contaminants. Nature Biotechnology. 38 (12), 1451-1459 (2020).
- Yang, Y. H., et al. Cell-free Escherichia coli-based system to screen for quorum-sensing molecules interacting with quorum receptor proteins of streptomyces coelicolor. Applied and Environmental Microbiology. 75 (19), 6367 (2009).
- Ma, D., Shen, L., Wu, K., Diehnelt, C. W., Green, A. A. Low-cost detection of norovirus using paper-based cell-free systems and synbody-based viral enrichment. Synthetic Biology. 3 (1), (2018).
- Park, S., Lee, J. W. Detection of coronaviruses using RNA toehold switch sensors. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1-13 (2021).
- Amalfitano, E., et al. A glucose meter interface for point-of-care gene circuit-based diagnostics. Nature Communications. 12 (1), 1-10 (2021).
- Nguyen, P. Q., et al. Wearable materials with embedded synthetic biology sensors for biomolecule detection. Nature Biotechnology. 39 (11), 1366-1374 (2021).
- Pellinen, T., Huovinen, T., Karp, M. A cell-free biosensor for the detection of transcriptional inducers using firefly luciferase as a reporter. Analytical Biochemistry. 330 (1), 52-57 (2004).
- Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis approach to biosensing hTRβ-specific endocrine disruptors. Analytical Chemistry. 89 (6), 3395-3401 (2017).
- Salehi, A. S. M., et al. Biosensing estrogenic endocrine disruptors in human blood and urine: A RAPID cell-free protein synthesis approach. Toxicology and Applied Pharmacology. 345, 19-25 (2018).
- Voyvodic, P. L., et al. Plug-and-play metabolic transducers expand the chemical detection space of cell-free biosensors. Nature Communications. 10 (1), 1-8 (2019).
- Yang, W. C., Patel, K. G., Wong, H. E., Swartz, J. R. Simplifying and streamlining Escherichia coli-based cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 28 (2), 413-420 (2012).
- Gräwe, A., et al. A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs. PLOS One. 14 (3), 0210940 (2019).
- Green, A. A., Silver, P. A., Collins, J. J., Yin, P. Toehold Switches: De-Novo-Designed Regulators of Gene Expression. Cell. 159 (4), 925-939 (2014).
- Craw, P., Balachandran, W. Isothermal nucleic acid amplification technologies for point-of-care diagnostics: a critical review. Lab on a Chip. 12 (14), 2469-2486 (2012).
- Zyrina, N. V., Antipova, V. N. Nonspecific Synthesis in the Reactions of Isothermal Nucleic Acid Amplification. Biochemistry (Moscow). 86 (7), 887-897 (2021).
- Takahashi, M. K., et al. A low-cost paper-based synthetic biology platform for analyzing gut microbiota and host biomarkers. Nature Communications. 9 (1), 1-12 (2018).
- Karlikow, M., et al. Field validation of the performance of paper-based tests for the detection of the Zika and chikungunya viruses in serum samples. Nature Biomedical Engineering. 6 (3), 246-256 (2022).
- Agarwala, R., et al. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 44 (1), 7-19 (2016).
- BLAST: Basic Local Alignment Search Tool. , Available from: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (2022).
- Deiman, B., Van Aarle, P., Sillekens, P. Characteristics and applications of nucleic acid sequence-based amplification (NASBA). Molecular Biotechnology. 20 (2), 163-179 (2002).
- Zadeh, J. N., Wolfe, B. R., Pierce, N. A. Nucleic acid sequence design via efficient ensemble defect optimization. Journal of Computational Chemistry. 32 (3), 439-452 (2011).
- NUPACK: Nucleic Acid Package. , Available from: http://www.nupack.org/ (2022).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , Cambridge, MA. (2021).
- Lanciotti, R. S., et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerging Infectious Diseases. 14 (8), 1232 (2008).
- Walsh, D. I., et al. Standardizing automated DNA assembly: Best practices, metrics, and protocols using robots. SLAS Technology. 24 (3), 282 (2019).
- Silva, S. J. R., de Magalhães, J. J. F., de Pena, L. Simultaneous circulation of DENV, CHIKV, ZIKV and SARS-CoV-2 in Brazil: An inconvenient truth. One Health. 12, 100205 (2021).
- Kimura, S., Fujinaga, K., Sekiya, T. PCR machine. Tanpakushitsu kakusan koso. Protein, Nucleic Acid, Enzyme. 41 (5), 514-517 (1996).
- Arce, A., et al. Decentralizing cell-free RNA sensing with the use of low-cost cell extracts. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 727584 (2021).
- Silva, S. J. R., Pardee, K., Balasuriya, U. B. R., Pena, L. Development and validation of a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of ZIKV in patient samples from Brazil. Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).
- Shimizu, Y. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
- Lavickova, B., Maerkl, S. J. A simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system. ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).
