Summary
För att avancera måste tillväxtkoner utöva dragkrafter mot den yttre miljön. Genereringen av dragkrafter är beroende av aktindynamik och kopplingskoppling. Den aktuella studien beskriver metoder för att analysera aktindynamik, kopplingskoppling och dragkrafter för tillväxtkon framryckning.
Abstract
För att upprätta funktionella nätverk måste neuroner migrera till sina lämpliga destinationer och sedan förlänga axoner mot sina målceller. Dessa processer beror på framstegen hos tillväxtkoner som ligger vid spetsarna av neuriter. Axonal tillväxtkoner genererar drivkrafter genom att känna av sin lokala mikromiljö och modulera cytoskeletal dynamik och aktin-vidhäftningskoppling (kopplingskoppling). Årtionden av forskning har lett till identifiering av styrmolekyler, deras receptorer och nedströms signalkaskader för reglering av neuronal migration och axonal vägledning; Men de molekylära maskiner som krävs för att generera krafter för att driva tillväxtkonens framryckning och navigering börjar bara klargöras. I framkant av neuronala tillväxtkoner genomgår aktinfilament retrograd flöde, som drivs av aktinpolymerisering och aktomyosinkontraktion. En kopplingskoppling mellan F-aktin retrograde flöde och lim substrat genererar dragkrafter för tillväxt kon framryckning. Denna studie beskriver ett detaljerat protokoll för övervakning F-aktin retrograd flöde genom en enda speckle imaging. Viktigt, i kombination med en F-aktinmarkör Lifeact, kan denna teknik kvantifiera 1) F-aktinpolymeriseringshastigheten och 2) kopplingskopplingseffektiviteten mellan F-aktin retrograde flöde och det självhäftande substratet. Båda är kritiska variabler för att generera krafter för tillväxtkonens framryckning och navigering. Dessutom beskriver denna studie ett detaljerat protokoll av dragkraft mikroskopi, som kan kvantifiera 3) dragkraft genereras av tillväxt koner. Genom att koppla analyserna av single speckle imaging och traction force mikroskopi, kan utredare övervaka den molekylära mekaniken bakom tillväxt kon framsteg och navigering.
Introduction
I den utvecklande ryggradsdjur hjärnan genomgår nervceller noggrant organiserade migreringar och projekt axoner mot lämpliga synaptiska partners för att upprätta funktionella neuronala nätverk1,2,3. Tillväxtkoner, som är sensoriska och motila strukturer som ligger vid spetsen av neuriter, bestämmer hastigheten och riktningen för neuronal migration och axon utväxt3,4,5. Eftersom nervceller är omgivna av tätt packade miljöer måste tillväxtkoner utöva krafter mot sin miljö för att gå vidare6,7. För att förstå mekanismerna bakom neuronal migration och axonal vägledning, analyser av den molekylära mekaniken för tillväxt kon framsteg är viktiga.
Årtionden av analys har visat att dragkraft för att driva tillväxtkonens framryckning genereras av "kopplingsmekanismen". denna mekanism tros fungera inte bara i axonal tillväxt kon utan också i den ledande processen tillväxt kon av migrerande nervceller8,9,10,11,12. Aktinfilament (F-aktiner) i tillväxtkoner polymeriserar vid framkanten och depolymeriserar proximally och trycker ut det ledande membranet13,14,15. Den resulterande kraften, i samband med aktomyosinkontraktion, inducerar bakåtrörelse av F-aktiner som kallas retrograd flöde7,11,16,17,18,19,20,21. Kopplings- och cell vidhäftningsmolekyler förmedlar mekanisk koppling mellan F-aktin retrograde flöde och det självhäftande substratet och överför kraften i F-aktinflödet på substratet, vilket genererar dragkraft för tillväxtkonen advance7,8,9,11,12,22 . Samtidigt minskar kopplingen mellan aktin-substrat F-aktinflödet och omvandlar aktinpolymerisation till kraften för att sticka ut det ledande membranet9,10.
Axonal tillväxtkoner känner av lokala kemiska signaler och omvandlar dem till en riktningskraft för tillväxtkonnavigering3,23,24,25. Till exempel stimulerar en axon-molekyl netrin-1 sin receptor som raderas i kolorektal cancer (DCC), och aktiverar Rho guanosintrifosfat (GTP)-bindande proteiner celldelningskontrollprotein 42 (Cdc42) och Ras-relaterade C3 botulinumtoxin substrat 1 (Rac1), och deras nedströms kinas p21-aktiverade kinas 1 (Pak1)26. Cdc42 och Rac1 främjar 1) aktinpolymerisering, och Pak1 fosforyterar en kopplingsmolekyl shootin122,26. Shootin1 interagerar med F-aktin retrograde flöde via ett aktinbindande protein kortaktin27. Shootin1 interagerar också med L1-cells vidhäftningsmolekyl (L1-CAM)20,24. Shootin1 fosforylering ökar bindningstillhörigheten för kortaktin och L1-CAM, och förbättrar shootin1-medierad kopplingskoppling24,27. Inom tillväxtkonen ökar asymmetriska aktiveringar av aktinpolymerisering och kopplingskoppling 3) dragkraft på sidan av netrin-1-källan, vilket genererar riktningsdrivande kraft för tillväxtkonsvarvning (figur 1)24. Intensiv forskning under de senaste decennierna med avseende på neuronal migration och axon vägledning har ökat förståelsen för vägledningsmolekyler, deras receptorer och tillhörande nedströms signaleringskaskader2,10,28,29,30. Men de molekylära maskinerierna för att generera krafter för tillväxtkonens framryckning har just börjat klargöras; Detta kan hänföras till den begränsade användningen av protokollen för mekanobiologiska analyser.
Denna studie beskriver ett detaljerat protokoll för övervakning av F-aktin retrograd flöde genom en enda speckle imaging16,18. Övervakning av F-actin retrograde flöde har utförts i stor utsträckning med hjälp av superupplösning mikroskopi, spinning-disk confocal mikroskopi och total interferensreflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi25,31,32,33,34,35,36,37,38 . Protokollet i den aktuella studien använder dock ett standardeporescensmikroskop och är därmed lätt att anta11,16,18,20,22,23,24,27,39,40,41,42. I kombination med F-aktinmärkning av Lifeact43 möjliggör single speckle imaging kvantifieringar av aktinpolymerisationshastigheten och kopplingskopplingseffektiviteten mellan F-aktin retrograde flöde och det självhäftande substratet39,42. Denna studie beskriver vidare ett detaljerat protokoll för dragkraft mikroskopi med hjälp av en fluorescerande pärla-inbäddad polyakrylamid (PAA) gel11,22,23,24,27,39,41,42,44. Denna metod detekterar och kvantifierar dragkraft under tillväxtkonen genom att övervaka kraftinducerade pärlrörelser44,45. En analyskod för dragkraft med öppen källkod tillhandahålls, och metoden för kvantifiering av dragkraft under tillväxtkonmigrering förklaras i detalj. Med hjälp av single speckle imaging och traction force mikroskopi, förståelse av den molekylära mekaniken bakom tillväxt kon migration och navigering kommer att underlättas. Dessa tekniker är också tillämpliga för att analysera den molekylära mekaniken bakom dendritiska ryggraden utvidgningen, som är känd för att vara viktigt i lärande och minne42.
Protocol
Alla experiment med laboratoriedjur utfördes med Institutional Animal Care and Use Committee vid Nara Institute of Science and Technology. Prövarna bör följa fastställda riktlinjer från sina institutionella och nationella djurtillsynskommittéer för vård och användning av försöksdjur.
1. Utarbetande av lösningar och medier
- Förbered lösningarna och kulturmedierna enligt sammanfattningen i Kompletterande fil 1
2. Beredning av poly-D-lysin (PDL)/lamininbelagda substrat
- Täck glasbottenfat med 14 mm diameter med 100 μg/ml PDL, upplöst i fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7.4), och inkubera för övernattning i en fuktad inkubator vid 37 °C.
OBS: Torka inte upp glasytorna efter detta steg - Ta bort PDL-lösningen och pipetten 1 ml PBS på glaset i 10 s tre gånger.
- Täck disken med 5 μg/ml laminin, upplöst i PBS, och inkubera för över natten i en fuktad inkubator vid 37 °C.
- Ta bort lamininlösningen och pipetten 1 ml PBS på glaset i 10 s tre gånger.
- Ta bort PBS och placera 0,5 ml av neurobasalmediet på glasytorna. Förvara disken i en fuktad inkubator vid 37 °C.
OBS: PDL/lamininbelagda rätter kan förvaras i 2-3 dagar i en fuktad inkubator vid 37 °C.
3. Dissekering och dissociation av hippocampus
- Avliva en gravid mus genom livmoderhalscancer förskjutning.
OBS: I denna studie används kommersiellt tillgängliga möss (se Materialförteckning). Prövare bör använda möss som föds upp och behandlas humant i en steriliserad miljö. - Dissekera embryonala dag-16 (E16) musembryon och placera dem på is.
- I en laminär flödeshuv, dissekera ut hjärnan med sax och placera dem på en steril 10 cm skål som innehåller 10 ml iskall dissekeringslösning.
- Med ett dissekeringstereomikroskop skalar du försiktigt bort hjärnhalvornas hjärnhalvor och dissekerar sedan hippocampi med tång.
- Överför hippocampi till 5 ml iskall matsmältningslösning i ett 15 ml-rör. Inkubera hippocampi i ett vattenbad i 20 min vid 37 °C.
- Ta bort matsmältningslösningen och tillsätt 3 ml dissekeringslösning.
- Rör försiktigt hippocampi fyra gånger med en Pasteur pipette.
- Inkubera hippocampi i ett vattenbad i 20 min vid 37 °C.
- Överför cellfjädringen till ett 50 ml centrifugrör. Tillsätt 3 ml ny dissekeringslösning till den odissocierade vävnaden.
- Upprepa steg 3.7-3.9 tills hippocampi är helt dissocierad.
- Ta bort de flytande aggregaten av DNA från cellupphängningen genom att virvla och aspirera med en Pasteur-pipett. Centrifugera cellfjädringen vid 180 x g i 20 min vid 4 °C.
OBS: DNA som härrör från skadade celler kommer att störa centrifugeringsprocessen. Om nervceller finns kvar i supernatanten, centrifugera cell suspensionen igen efter att noggrant ha tagit bort DNA. - Jämviktsneurobasalt medium innehållande 10% fetalt bovinserum (FBS), penicillin (100 U/ml) och streptomycin (100 μg/ml) i en fuktad inkubator vid 37 °C med 5% CO2.
4. Transfektion och odling av nervceller
- Ta bort supernatanten och tillsätt 5 ml iskall PBS i 50 ml-röret. Återsuspendera cellpelleten genom skonsam pipettering.
- Överför 10 μL av cellupphängningen till ett mikrocentrifugerör, tillsätt 10 μL 0,5% trypanblå lösning och räkna sedan antalet celler med en hemocytometer.
- Centrifugera cellfjädringen i 50 ml-röret vid 180 x g i 20 min vid 4 °C.
- Under tiden, alikvot för transfektion, 1 μg pFN21A-HaloTag-aktin och 3 μg pmNeonGreen-N1-Lifeact per 1 x 106 celler, i ett mikrocentrifugerör.
- Efter centrifugering, ta bort supernatanten och tillsätt 100 μL elektroporationsmedium (med hjälp av transfection kit) i 50 ml-röret. Återanvänd cellpelleten genom pipettering.
- Blanda cell suspensionen med den alikvoterade DNA-lösningen och överför blandningen till en cuvette (tillhandahålls av transfection kit).
OBS: Eftersom luftbubblor stör elektroporationen, ta bort dem från cellupphängningen. - Sätt in cuvettet i elektroporationsapparaten (Table of Materials) och utför elektroporation med program O-005.
- Tillsätt omedelbart 1 ml av det förvärmda och ekvilibrerade neurobasala mediet som innehåller 10% FBS, penicillin (100 U/ml) och streptomycin (100 μg/ml) till cuvettet.
- Överför cellfjädringen till ett 15 ml centrifugrör med hjälp av en plastpipett (tillhandahålls av transfekteringssatsen).
- Överför 10 μL av cellupphängningen till ett mikrorör, tillsätt 10 μL 0,5% trypanblå lösning och räkna sedan antalet celler med en hemocytometer.
- Ta ut PDL/lamininbelagda glasbottenrätter från inkubatorn och ta bort neurobasalmediet.
- Pipettering 0,5 ml av cellupphängningen som innehåller 2,0 x 105 celler per skål och inkubera i en fuktad inkubator vid 37 °C med 5% CO2 i 3 timmar.
- Ersätt mediet med 0,5 ml neurobasalt medium som innehåller 2% B-27 tillägg, glutamin (1 mM), penicillin (100 U/ml) och streptomycin (100 μg/mL). Odla nervcellerna i en fuktad inkubator i 3 dagar vid 37 °C med 5% CO2.
5. Single speckle imaging vid neuronala tillväxtkoner
- På dag in vitro (DIV) 3, behandla nervcellerna med tetrametyl-rhodamine (TMR) ligand vid en utspädning av 1:2000 utspädning i odlingsmedium. Behåll nervcellerna i 1 h vid 37 °C med 5% CO2.
- Tvätta TMR ligand tre gånger med förvärmd PBS.
- Ta bort PBS och pipetten 0,5 ml uppvärmd Leibovitz L-15 medium som innehåller 2% B-27 tillägg, glutamin (1 mM), penicillin (100 U/mL) och streptomycin (100 μg/mL).
- Behåll nervceller i 1 h vid 37 °C.
- Slå på ett epifluorescensmikroskop och ställ in inkubatorn på 37 °C.
OBS: Detta protokoll använder ett epifluorescensmikroskop utrustat med en kompletterande halvledarkamera för metalloxid, en 100x/1.40 NA-oljesänkning objektiv, en kvicksilverlampa och en bildförvärvsprogramvara (se Tabell över material). Andra epifluorescensmikroskop med likvärdiga specifikationer får också användas för denna analys. - Placera de TMR ligand-behandlade nervcellerna i glasbottenskålen på den uppvärmda inkubatorn.
- Ställ in parametrarna för bildförvärv enligt följande: exponeringstid, 500 ms för fluorescerande kanaler för Lifeact och HaloTag-aktin; binning, 1 x 1 (0,065 μm × 0,065 μm per pixel); Tidsintervall, 3 s; varaktighet, 50 bildrutor.
- Välj en tillväxtkon som starkt uttrycker Lifeact och svagt uttrycker HaloTag-aktin.
OBS: Lifeact uttryck bör vara tillräckligt stark för att visualisera tillväxt kon morfologi. HaloTag-aktinuttrycket bör vara svagt otillräckligt för att upptäckas (figur 2A). Nivåerna av fluorescerande proteinuttryck kan justeras genom att variera mängden DNA för transfektion. - Stäng membranets fält för att belysa ett minimiområde som inkluderar tillväxtkonen (figur 2B).
OBS: Belysningen av ett minimiområde minskar bakgrundssignalen och ökar fluorescenssignalen till brusförhållandet (S/N), vilket möjliggör detektion av aktinfläckar (figur 2B). För att ytterligare öka S/N-förhållandet rekommenderas belysning av tillväxtkonen utan att minska ljuset genom neutrala densitetsfilter. - Hämta timelapse-bilder (kompletterande fil 2). Spara som en flerkanalig stackbild för tidsfördröjning (tiff-format).
6. Kvantifieringar av F-aktinflödeshastighet och polymerisationshastighet med hjälp av en bildbehandlings- och analysprogramvara Fiji
OBS: Se Kompletterande fil 3 för övningsdata för kvantifiering av F-aktinflödeshastigheten och aktinpolymeriseringshastigheten.
- Öppna stackbilden för tidsfördröjning i flera kanaler på Fiji.
- Välj Analysera > Ange skala och ange bildstorleken för bilderna.
- Hitta en aktinfläck som flödar bakåt i minst fem tidsramar i ett F-aktinpaket i filopodi eller lamellipodi.
- Välj Bild > Omforma > Rotera och justera vinkeln på bilderna så att F-aktin-bunten pekar uppåt (bild 3A).
- Klicka på Rectangle i verktygsfältet och rita en ruta som innehåller aktinfläckar och spetsen på F-aktin-paketet (bild 3B, 1 och 2).
OBS: Signalerna från HaloTag-aktin-fläckar är svaga. Dessutom är Lifeact-signalerna vid tillväxtkonens distala spetsar svaga och svaga (figur 2B) eftersom tillväxtkonens distala spetsar är tunna jämfört med den proximala delen. Utredarna bör förbättra signalerna för att optimera kvantifieringarna av F-aktinflödeshastighet och polymerisationshastighet (figur 3B). Även om Lifeact-signalen vid den proximala tillväxtkonen blir mättad, kommer detta inte att störa bestämningen av den distala änden av F-aktiner (figur 3E, gul linje). - Välj Bild > Duplicera och ange de fem tidsramarna (bild 3B, 3-5).
- Välj Bild > staplar > gör montage och mata in parametrarna: Kolumner, 5; Rader, 1; Skalfaktor, 1.
- Klicka på OK. Bildmontaget visas på skärmen.
- Välj Bild > Färg > Dela kanaler. Detta skiljer de två fluorescerande kanalerna åt.
- Kvantifiering av F-aktinflödeshastigheten.
- Välj Analysera > Ange mått och välj Område och Begränsningsrektangel.
- Klicka på Oval i verktygsfältet och rita en cirkel på en aktinfläck (bild 3C, 1 och 2).
- Välj Bild > överlägg > Lägg till markering. Cirkeln läggs över på bildmontaget (bild 3C, 3 och 4).
Färgen på överlägget kan ändras på Redigera > Alternativ > färger. - Upprepa överlagringen av cirklar för de återstående fläckarna (bild 3C, 5).
OBS: För att exakt bestämma centra av aktin speckle, bör utredare lägga över cirklar på fläckarna. - Klicka på Rakt i verktygsfältet och rita en linje som länkar cirklarnas mittpunkter (bild 3D, 1 och 2).
- Välj Analysera > mått. Resultatet visas på skärmen (bild 3D, 3).
OBS: Höjden som visas i resultatet anger flyttningsavståndet för aktinfläcken under observationen (figur 3D, 3). - Beräkna F-aktinflödets hastighet genom att dividera flyttningsavståndet med observationstiden.
- Kvantifiering av F-aktinpolymerisationshastigheten.
- Rita en linje som länkar spetsarna i F-aktin-paketet (bild 3E, 1).
- Välj Analysera > mått. Resultatet visas på skärmen (bild 3E, 2).
OBS: Höjden i resultatet anger F-aktinbuntens förlängningslängd under observationen (figur 3E, 2). - Beräkna F-aktinförlängningshastigheten genom att dividera förlängningslängden med observationstiden.
- Beräkna F-aktinpolymeriseringshastigheten som summan av F-aktinflödeshastigheten och förlängningshastigheten (bild 3F).
7. Beredning av en PAA-gel för dragkraftmikroskopi och neuronkulturer
- Beredning av PAA-geler som krävs för dragkraftmikroskopi (figur 4)
- Pipett 0,5 ml NaOH (100 mM), upplöst i destillerad H2O, på glasbottenfat med 27 mm diameter, och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Tillsätt 50 μL 3-aminopropyltrimethyoxysilane (APTMS) i NaOH-lösningen på disken och blanda lösningarna genom skonsam pipettering och inkubera i 15 minuter vid RT.
- Tvätta glasbottenfaten med destillerad H2O och torka.
- Pipetten 0,5 ml 0,5% glutaraldehydlösning, upplöst i PBS, på den APTMS-behandlade glasbottenskålen och inkubera i 30 minuter vid RT.
- Tvätta glasbottenfaten med destillerad H2O och torka.
- Förbered en lösning som innehåller destillerad H2O (412 μL), 30% (w/v) akrylamidlösning (63 μL), 2,5% (w/v) bis-akrylamidlösning (6 μL) och karboxoxylatmodifierad mikrosfärlösning (lysrörspärla).
OBS: Vortex den fluorescerande pärla lösningen för att separera aggregerade pärlor innan du lägger till akrylamidlösningen. - Avgas lösningen i en vakuumkammare i 30 min på RT.
- Tillsätt 1 μL ammoniumpersulfost (APS), upplöst i destillerat H2O och 1 μL N,N,N',N'-tetrametylendiamin (TEMED) och blanda genom skonsam pipettering.
- Placera ett glasöverdrag (18 mm diameter) på locket på ett 15 ml centrifugrör.
- Tillsätt omedelbart 25 μL av lösningen till täckslipet och placera sedan försiktigt en inverterad glasbottenskål på täckslipet. Låt akrylamiden polymerisera i 1 h vid RT.
- Applicera destillerad H2O på täcket och skala bort det från gelén med en sprutnål med böjd spets.
- Ta bort H2O och tillsätt sulfo-SANPAH (1 mM), upplöst i PBS, till gelén.
- Under sterila förhållanden, utsätt gelerna för ultraviolett ljus i 5 min. Tvätta gelén tre gånger med PBS i 15 min per tvätt.
- Bestämning av gelstelhet med en mikrosfärindragsmetod (figur 5A)44.
- Överför en mikrosfär som är specificerad för diametern och densiteten, till gelén och placera den sedan på provstadiet i ett laserskanningskonfokalt mikroskop.
- Fokusera på gelytan och registrera z-positionen (figur 5B).
- På samma sätt, fokusera på botten av mikrosfären och registrera z-positionen (figur 5C).
- Beräkna indragsdjupet som bestäms av skillnaden mellan gelytans z-lägen och mikrosfärens botten.
- Beräkna Youngs modulus E av gelén genom att:
där f är mikrosfärens flyt korrigerade vikt, d är geléns indragsdjup, r är mikrosfärens radie och v är Poissons förhållande (vars värde är 0,3, enligt tidigare fastställts46).
- Belägga gelerna med PDL och laminin enligt beskrivningen i avsnitt 2.
- Som beskrivs i avsnitten 3 och 4 dissekerar du E16-musembryon, separerar hippocampi och transfekterar med 5 μg pEGFP-C1 per 1,0 x 106 celler. Frö 2,0 x 105 celler på PDL/lamininbelagda geler.
OBS: För traktionskraftanalys är mikroskopisk avbildning av fluorescerande märkta celler nödvändig för att bestämma tillväxtkonområdet.
8. Dragkraftsmikroskopi vid neuronala tillväxtkoner
- På DIV3, ersätt odlingsmediet med 0,5 ml uppvärmd Leibovitz L-15 medium som innehåller 2% B-27 tillägg, glutamin (1 mM), penicillin (100 U/mL) och streptomycin (100 μg/mL). Behåll nervcellerna i 1 h vid 37 °C.
- Slå på ett konfokalt mikroskop för laserskanning och ställ in inkubatorn på 37 °C.
OBS: Denna studie använder ett laserskanningskonokalmikroskop utrustat med en 63x/ 1.2 NA vattensänkning objektiv och en bildförvärv och analys programvara (se tabell över material). - Placera nervcellerna i glasbottenskålen på den förvärmda inkubatorn.
- Ställ in parametrarna för bildförvärv enligt följande: skanningsstorlek, 512 × 512 pixlar; skanningsområde, 1,5-3x zoom; skanningshastighet, ~1 s per bildruta; Laservåglängd, 561 nm (excitationsvåglängden för fluorescerande pärlor) och 488 nm (excitationsvåglängden för förbättrat grönt fluorescerande protein (EGFP)); Tidsintervall, 3 s; varaktighet, 50 bildrutor.
- Om du vill visualisera tillväxtkonens morfologi väljer du en tillväxtkon som starkt uttrycker EGFP.
- Fokusera på gelytan och skaffa timelapse-bilder (figur 6A och kompletterande fil 4).
OBS: För dragkraftsanalys, använd två fluorescerande kanaler (för fluorescerande pärlor och EGFP) och en ljusfältskanal (fånga differentialstörningskontrast (DIC) eller faskontrastbilder rekommenderas). - Använd en bildbehandlingsprogramvara (t.ex. Fiji) för att producera enkanaliga RGB-bildstaplar med en kanal och spara dessa bilder som tiff-filer.
OBS: Det är viktigt att utredarna också sparar rådata. - Applicera 100 μL 10% (w/v) natriumdodecylsulfat (SDS), upplöst i destillerad H2O, på glasbottenskålen för att slappna av gelsubstratet genom att släppa nervceller från substratet. Inkubera skålen i 5 min vid 37°C för att stabilisera temperaturen.
OBS: Bilden av pärlorna i ett otränat substrat används för att referera till de ursprungliga pärlpositionerna vid traktionskraftanalys (figur 6C). Applicering av SDS-lösning förändrar xyz-positionerna på grund av termisk förändring i inkubatorn och avslappning av den cellinducerade deformationen. Utredarna måste därför korrigera fokalplanet och x-y-positionen. - Fokusera på gelytan och skaffa en bild av pärlorna i det otränade substratet (figur 6B).
- Skapa en RGB-bild med en kanal av pärlorna i det otränade substratet och spara den här bilden som en tiff-fil.
- Korrigering av pärlbildens x-y-position i det otränade substratet med Fiji
- I Fiji öppnar du pärlbilden i det otränade substratet och timelapse stack bilden av fluorescerande pärlor.
- Välj Bild > staplar > verktyg > Sammanfoga. En dialogruta visas på skärmen (bild 7A, 1).
- Välj pärlbilden i det otränade substratet och bilden av tidsfördröjningsstacken av fluorescerande pärlor i bild 1 respektive bild2 (figur 7A, 2).
- Klicka på OK. Pärlbilden i det otränade substratet läggs till i stackbilden för tidsfördröjning (figur 7A, 3).
- Visa den andra bildrutan i stapelbilden (röd pil) med hjälp av rullningslisten (bild 7B, 1, röd ram).
- Välj Plugins > StackReg (bild 7B, 2). En dialogruta visas på skärmen (bild 7B, 3).
- Välj Rigid Body i listrutan (bild 7B, 3, röd ram) och klicka på OK. Korrigeringen av x-y-positionen börjar sedan.
- Använd rullningslisten för att visa den första ramen i den x-y positionskorrigerade stackbilden.
- Välj Bild > duplicera (bild 7C, 1). En dialogruta visas på skärmen (bild 7B, 2).
- Mata in 1 i intervallet, avmarkera Dubblettstapel (bild 7C, 2) och klicka på OK. Den x-y positionskorrigerade pärlbilden i det otränade substratet visas på skärmen (bild 7C, 3). Spara den här bilden som en tiff-fil.
- Kvantifiering av dragkraft
OBS: Metoden som beskrivs här för dragkraftsanalys använder MATLAB och två MATLAB-verktygslådor, "Image Processing Toolbox" och "Parallel Computing Toolbox". Utredarna måste installera dem före analysen. Traktionskraftanalyskoden utvecklades baserat på MATLAB version 2018a. Därför måste MATLAB version 2018a (eller senare) användas för analysen. Algoritmerna som används för traktionskraftanalys beskrevs tidigare22.- Ladda ner traction force analyskoden TFM2021 från Kompletterande fil 5. Öppna TFM 2021 i MATLAB
- Öppna main.m i TFM2021 och kör den. Ett grafiskt användargränssnitt (GUI) visas på skärmen (bild 8A).
- Klicka på Ladda otränad substratbild och välj x-y positionskorrigerad pärla i otränat substrat.
- Klicka på Ladda fluorescerande pärlbilder och välj timelapse stack bilden av pärlor.
- Klicka på Ladda bilder med ljusfält och välj tidsfördröjningsstackbilden av ljusfält.
- Klicka på Ladda GFP-bilder och välj timelapse-stackbilden av EGFP.
- Välj GFP i listrutan i gui-gränssnittet (bild 8A, röd ruta).
- Klicka på ROI för att ange rektangelområdet (ROI), inklusive tillväxtkonen, genom att klicka på två punkter på cellbilden som visas på gui (bild 8B).
- Klicka på knappen Spara på gui:et (bild 8A, röd pil). De markerade stackbilderna, tillsammans med AVKASTNINGEN, sparas i en .mat-fil (MATLAB-formatfil).
- Klicka på Spot detect. En dialogruta visas på skärmen.
- Ange ett värde (vanligtvis 50-150) i dialogrutan för att fastställa ett tröskelvärde för identifiering av pärlor. Om du klickar på OK startas beräkningen.
- När du har avslutat beräkningen klickar du på Ritbanan för att förstora det område som valdes i steg 8.12.8 och visar de upptäckta pärlorna som vita prickar (figur 8C, 1).
OBS: Bekräfta om pärldetektering (vita prickar) överlappar fluorescerande pärlor. Identifiering av pärlor kan också upptäcka bakgrundsljud. Om du vill minska den här externa störningen ändrar du tröskelvärdet vid Spot detect. Välj dessutom manuellt rätt prickar i steg 8.12.13. - Klicka på Välj pärlor och avgränsa en polygonal region som innehåller rätt prickar under tillväxtkonen. Tryck på Retur på tangentbordet. De vita prickarna i polygonområdet ändras till en röd färg (figur 8C, 2).
- Klicka på Uppskatta force på gui. Sedan indatavärden för följande parametrar: pixelstorlek, μm/pixel; Youngs modulus, det värde som beräknas i steg 7.2.5; Poissons förhållande, 0,3.
- Kör uppskattningsstyrkan för att initiera beräkningen. Programvaran sparar beräkningsresultaten automatiskt i en kalkylbladsformatfil.
Kalkylbladet visar x-komponenten, y-komponenten och kraftnituden vid varje tidsram (bild 8D). Se Kompletterande fil 6 för övningsdata för kvantifiering av dragkraft.
Representative Results
Enkel fläckavbildning för att kvantifiera aktinpolymeriseringshastighet och kopplingskopplingseffektivitet
Ett högt Lifeact-uttryck tillåter F-aktinvisualisering i tillväxtkonen; ett lågt HaloTag-aktin-uttryck gör det möjligt att övervaka F-aktin retrograde flöde (figur 3, kompletterande fil 2). Spårning av aktinfläckarna gör det möjligt att mäta F-aktinflödeshastigheten (figur 3C,D). Eftersom den mekaniska kopplingen av F-actin retrograde flöde och det självhäftande substratet minskar F-aktin flödeshastigheten, kan kopplingskopplingseffektiviteten uppskattas från hastigheten. Dessutom underlättar F-aktinmärkning med Lifeact visualisering av F-aktinförlängning och är användbar för kvantifiering av aktinpolymerisationshastigheten (figur 3E,F).
Kvantitativ analys av dragkraft
Strikt efterlevnad av den metod som presenteras här kommer att avslöja rörelserna av fluorescerande pärlor under tillväxtkonen (figur 6C, kompletterande fil 4). F-aktin retrograd flöde på substratet genererar dragkraft orsakar fluorescerande pärlor att flytta bakåt under tillväxtkonen. Dragkraftsanalyskoden uppskattar dragkraft från fluorescerande pärlförskjutning och uttrycker den beräknade dragkraften som en kraftvektor. Dragkraftens riktning och storlek bestäms utifrån kraftvektorns x- och y-komponenter (figur 8C,D). Den röda rutan i figur 8D representerar x- och y-komponenterna i en kraftvektor. Figur 8C visar motsvarande tillväxtkon. När det gäller x-y-koordinater pekar vektorn på -93,8° mot x-axeln. Denna orientering riktas mot baksidan av tillväxtkonen (figur 8C). Dragkraften F:s storlek beräknades på följande sätt:
Figur 1: En tillväxtkonmaskin för kraftgenerering och tillväxtkonnavigering. En netrin-1 chemoattractant gradient inducera asymmetrisk stimulering av dess receptor DCC på en axonal tillväxt kon. Detta aktiverar Rac1 och Cdc42, och deras nedströms kinas Pak1. Rac1 och Cdc42 främjar (1) aktinpolymerisering, medan Pak1 fosforylater skjuter1, vilket förbättrar shootin1-medierad (2) kopplingskoppling. Den asymmetriska aktiveringen av aktindynamiken och kopplingskopplingen i tillväxtkonen ökar (3) dragkraften på sidan av netrin-1-källan, vilket genererar en riktningskraft för tillväxtkon attraktion. Protokollen som presenteras här möjliggör kvantifiering av nyckelvariablerna (1)-(3) för tillväxtkonnavigering. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Fluorescensbilder av en neuronal tillväxtkon under ett helt öppet och smalt membran. Tillväxtkonen uttrycker Lifeact och HaloTag-aktin. (A) Ett högt Lifeact-uttryck tillåter visualisering av tillväxtkonmorfologi. Å andra sidan är HaloTag-aktin-uttrycksnivåerna mycket låga, med dunkla signaler när membranet är helt öppet. (B) När membranet är lämpligt smalt minskar bakgrundssignalerna och enstaka aktinfläckar uppträder i tillväxtkonen. Skalningsstaplar: 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Steg för kvantifiering av F-aktinflödeshastighet och aktinpolymeriseringshastighet med hjälp av en bildbehandlings- och analysprogramvara Fiji. (1) Hitta och välj en aktinfläck (pilspets) som flödar i ett F-aktinpaket. (2) Välj Bild > omforma > rotera. (3) Ställ in vinkeln så att F-aktin-bunten riktas uppåt. (4) Bildens vinkel kommer att ändras. B) Avgränsa regionen, inklusive aktin-fläcken och F-aktinbunten. (1) Klicka på Rektangel i verktygsfältet. (2) Avgränsa en region på bilden. Bildens ljusstyrka och kontrast ökas för att möjliggöra tydlig visualisering av aktinfläcken och spetsen på F-aktin-bunten. (3) Välj Bild > Duplicera. (4) Ange de fem tidsramar som visar aktinfläckflöde i F-aktin-bunten. (5) Den valda stackbilden visas på skärmen. C) Överlägg cirklar på aktin speckle. (1) Klicka på Oval i verktygsfältet. (2) Rita en cirkel på en aktinfläck. (3) Välj Bild > överlägg > Lägg till markering. (4) Cirkeln är överlagrad. 5) Upprepa överläggningen av cirklarna på de återstående aktinfläckarna. D) Mät flyttningsavståndet för aktinfläckar under de fem tidsramarna. (1) Klicka på Rakt i verktygsfältet. (2) Rita en linje som länkar cirklarnas mittpunkter. (3) Välj Analysera > mått. Resultatet, som indikeras av parametern Höjd (röd låda), vidarebefordrar aktin speckle flyttningsavståndet. e) Mät förändringen i längden på F-aktinutskjutningen under de fem tidsramarna. (1) Rita en linje som länkar F-aktins utskjutning. (2) Välj Analysera > mått. Resultatet (röd ruta), Höjd, anger F-aktin-buntens förlängningslängd. F) Aktinpolymeriseringshastigheten beräknas utifrån summan av F-aktinflödeshastigheten och förlängningshastigheten. Se även Kompletterande fil 2. Kompletterande fil 3 hjälper utredare att tillämpa den metod som beskrivs ovan. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Steg för PAA-gelberedningen. Se steg 7.1 för en detaljerad beskrivning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Bestämning av PAA-gelstyvhet. A) En mikrosfärindragsmetod. När en mikrosfär placeras på en fluorescerande pärla-inbäddad PAA-gel orsakar mikrosfärens vikt en fördjupning i gelén. Indragsdjupet beräknas genom att subtrahera Z-positionerna på PAA-gelytan från botten av mikrosfären (B,C) Fluorescensbilder av en PAA-gel indragen av en mikrosfär och som innehåller fluorescerande pärlor. Ett laserskanningskonokalmikroskop användes för att fånga bilder av gelytan (B) och botten av mikrosfären (C). Signaler från fluorescerande pärlor är inte synliga på gelytan i den indragna regionen (B, cirkel). De kan dock observeras längst ner i mikrosfären. Skalningsstaplar: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Force mappning av en neuronal tillväxtkon. (A-C) Fluorescens bilder av pärlor inbäddade i en PAA gel och en neural tillväxt kon visualiseras med EGFP. Efter förvärvet av timelapse bilder (A), släpptes neuron från gelsubstratet genom att applicera SDS-lösningen, och en bild av pärlor i det otränade substratet fångades (B). C) Bilden av pärlorna i det otränade substratet visar pärlorna i sina ursprungliga (gröna) och förskjutna (röda) positioner. EGFP-signalen för tillväxtkonen visas i blått. Kymographs (höger) visar rörelserna hos pärlor med 3 s intervaller under en varaktighet av 147 s, vilket indikeras av pilarna i de boxade områdena 1 och 2. Pärlan i område 2 är en referenspärla. Skalstänger: 2 μm för (A), (B) och (C, vänster) och 1 μm för (C, mitten). Se även Kompletterande fil 4. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 7: Steg för korrigering av x-y-positionen för pärlbilden i otränat substrat med fijiansk (A) Sammanfoga pärlbilden i otränat substrat med tidsfördröjningsstapelbilden av fluorescerande pärlor. (1) Välj Bild - > stackar > verktyg > sammanfoga. (2) Välj pärlor bilden i otränat substrat och timelapse stack bilden av fluorescerande pärlor i Bild1 respektive Bild2. Klicka på OK. (3) Pärlbilden i det otränade substratet läggs till i bilden av tidsfördröjningsstacken. (B) Korrigera x-y-positionen för den fluorescerande pärlans bild. (1) Använd rullningslisten (röd ram) för att markera den andra bildrutan (röd pil) i bildstapeln. (2) Välj plugins > StackReg. (3) Välj Styv kropp i listrutan (röd ram) och klicka på OK. Korrigeringen av x-y-positionen börjar. (C) Spara den x-y positionskorrigerade pärlan. När du har valt den första bildrutan i den x-y positionskorrigerade stackbilden väljer du Bild > Duplicera. (2) Mata in 1 i intervallet och avmarkera Dupliceringsstapeln. Klicka sedan på OK. (3) Den x-y positionskorrigerade pärlbilden i det otränade substratet visas på skärmen. Spara den här bilden som en tiff-fil. Kompletterande fil 6 hjälper utredare att tillämpa den metod som beskrivs ovan. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 8: Analys av dragkraft under en neuronal tillväxtkon med hjälp av en analyskod med öppen källkod. (A) GUI för analys av dragkraft. Tidsfördröjningsbilder som valts på det grafiska gränssnittet kan bekräftas från listrutan och med skjutreglaget angiven (röd ruta). (B) Välj en region som innehåller tillväxtkonen. (1) Klicka på ROI på gui. Med muspekaren anger du två punkter (pilspetsar) på cellbilden. (2) En röd ruta visas på cellbilden. Två klick avgör var två hörn finns. (C) Välj de upptäckta pärlorna (vita prickar) under tillväxtkonen. (1) Klicka på Välj pärlor på GUI och avgränsa en polygonal region som innehåller tillväxtkonen genom att klicka. Tryck på Retur . (2) De vita prickarna inom polygonområdet kommer att ändras till en röd färg. (D) Beräknade resultat av dragkraftens riktning och storlek. Den röda rutan i kalkylbladet representerar kraftvektorns x- och y-komponenter, som uppskattas genom dragkraftsanalys. På x-y-koordinaten i den högra panelen pekar kraftvektorn som genereras av tillväxtkonen till -93,8° mot x-axeln. denna orientering riktas mot baksidan av tillväxtkonen i (C). Kompletterande fil 6 hjälper utredare att tillämpa den metod som beskrivs ovan. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Kompletterande fil 1: Recept av lösningar och media som används i denna studie. Se text för detaljerad användning. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 2: Fluorescensavbildning av Lifeact och fluorescerande fläckavbildning av HaloTag-aktin i en nervtillväxtkon. Lifeact (grön) och HaloTag-aktin (magenta). Bilder förvärvades var tredje s för en total varaktighet av 147 s. Skalstång: 2 μm. Se även bild 3. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 3: Öva data för kvantifiering av F-aktinflödeshastighet och aktinpolymeriseringshastigheten. En flerkanalig timelapse-stackbild av Lifeact (grön) och HaloTag-aktin (magenta). Se även figur 3. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 4: En kraftkartläggningsvideo som detekterar dragkraft vid en neuronal tillväxtkon. Pärlornas ursprungliga (gröna) och förskjutna (röda) positioner. EGFP-signalen i tillväxtkonen visas i blått. Bilder förvärvades var tredje s för 147 s. Skalstång: 2 μm. Se även figur 6. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 5: Traction force analys kod. Se steg 8.12 för detaljerad användning. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 6: Övningsdata för kvantifiering av dragkraft. En enkanalig RGB-bild av pärlor i otränat substrat och enkanalig tidsfördröjningsstack RGB-bilder av fluorescerande pärlor under en tillväxtkon, EGFP och ljusfält. Se även figurerna 7 och 8. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Protokollen som beskrivs i denna studie använder kommersiellt tillgängliga material och mikroskopiutrustning som rutinmässigt finns i alla laboratorier, institut och universitet. Därför kan prövare enkelt anta den nuvarande single speckle imaging och traction force mikroskopi i sina studier.
Fläckavbildningen kan analysera aktinpolymerisering och kopplingskoppling. Dessutom kan speckle imaging övervaka det bakåtsträvande flödet av kopplingsmolekyler som shootin1 och kortaktin, som interagerar med F-aktin retrograde flöde. Med hjälp av ett TIRF-mikroskop kan även cell vidhäftningsmolekylen L1-CAM:s retrogradeflöde övervakas23,41. L1-CAM genomgår grepp- och glidbeteenden som återspeglar kopplingskopplingseffektiviteten23,41. Även om denna studie använder TMR-HaloTag-systemet för fläckavbildning, finns även andra fluorescerande proteiner, såsom EGFP och monomeriskt rött fluorescerande protein, tillgängliga i analysen16,18,20,23,24,27,39. Det väsentliga för att visualisera aktinfläckar är en låg uttrycksnivå för fluorescerande aktin och belysning av ett minimiområde (figur 2). I detta protokoll förvärvas Lifeact- och HaloTag-aktinsignaler sekventiellt. Eftersom aktin retrograde flödet är relativt långsamt (4,5 ± 0,1 μm/min)24, analys av F-aktin retrograd flöde och aktin polymerisation påverkas inte av sekventiell bild förvärv av olika fluorescerande kanaler (~ 1 s intervall). Lifeact är en allmänt använd F-aktinmarkör, men kan konkurrera med aktinbindande proteiner47. Av ytterligare betydelse kan Lifeact förändra aktindynamiken och därmed påverka F-aktinstrukturer och cellmorfologin47,48,49.
Dragkraftmikroskopi kan upptäcka krafter för att driva tillväxtkonens framryckning. Genom att montera nervcellerna i en extracellulär matris kan utredarna också analysera krafter som genereras i en semi-3D-miljö11. Hög förstoringsavbildning är viktigt för noggrann kvantifiering av dragkraft eftersom tillväxtkoner genererar svaga dragkrafter7. Även om andra metoder med nanopillar eller stresskänsliga biosensorer också används för att mäta dragkraft50,51, är PAA-gelbaserad metod mycket anpassningsbar och möjliggör justering av substratestelhet genom att variera koncentrationerna av akrylamid och bis-akrylamid41,44,52. I detta protokoll framställs PAA-gelen vid en slutlig koncentration av 3,75% akrylamid och 0,03% bis-akrylamid; Youngs modulus är ~270 Pa22 och denna styvhet ligger inom intervallet för hjärnvävnad (100-10 000 Pa)53,54,55. På grund av tjockleken på PAA-gelen (~ 100 μm) begränsar denna metod användningen av högförstoringslinser under mikroskopi. För att få bilder med hög förstoring bör utredarna använda zoomfunktionen i ett konfokalt mikroskop med laserskanning.
Sammanfattningsvis möjliggör den nuvarande speckle imaging och traction force mikroskopi kvantitativa analyser av de viktigaste händelserna i kraft generationer. Denna information kommer att vara ovärderlig för att förbättra förståelsen av de mekanismer som ligger till grund för tillväxtkonens framsteg och navigering.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes delvis av AMED under bidragsnummer 21gm0810011h0005 (N.I. och Y.S.), JSPS KAKENHI (JP19H03223, N.I.) och JSPS Grants-in-Aid for Early-Career Scientists (JP19K16258, T.M.), Osaka Medical Research Foundation for Incurable Diseases (T.M.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% trypan blue stain solution | Nacalai | 29853-34 | |
| 3-aminopropyltrimethyoxysilane | Sigma | 281778-100ML | |
| Acrylamide monomer | Nacalai | 00809-85 | |
| Ammonium persulphate | Cytiva | 17-1311-1 | |
| Axio Observer Z1 | Zeiss | 431007-9902-000 | Epi-fluorescence microscope (single speckle imaging) |
| B-27 supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Bovine serum albmine | Sigma | A7906-10G | |
| C-Apochromat 63x/1.2 W Corr | Zeiss | 421787-9970-799 | Objective lens (traction force microscopy) |
| Coverslip (diameter 18 mm) | Matsunami | C018001 | |
| D-glucose | Nacalai | 16806-25 | |
| DNaseI | Sigma | DN25-100MG | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Fiji | Open source software package | https://imagej.net/software/fiji/ | |
| FluoSpheres carboxylate-modified 0.2 mm, red (580/605), 2% solid | Thermo Fisher Scientific | F8810 | carboxylate-modified microspheres |
| Glass bottom dish (14 mm diameter) | Matsunami | D1130H | |
| Glass bottom dish (27 mm diameter) | Matsunami | D1140H | |
| Glutaraldehyde solution | Sigma | G5882-10X10ML | |
| HaloTag TMR ligand | Promega | G8251 | |
| HBO103 W/2 | Osram | 4050300382128 | Mercury lamp (single speckle imaging) |
| Image Processing Toolbox | MathWork | https://www.mathworks.com/products/image.html | |
| Laminin solution from mouse EHS tumor | Wako | 120-05751 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| L-glutamine | Nacalai | 16919-42 | |
| LSM710 | Zeiss | N/A | Conforcal laser microscope (traction force microscopy) |
| MATLAB2018a | MathWork | https://www.mathworks.com/products/new_products/release2018a.html | |
| Mouse C57BL/6 | Japan SLC | N/A | |
| Mouse neuron nucleofector kit | Lonza | VPG-1001 | |
| N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai | 33401-72 | |
| N,N’-methylenebisacrylamide | Nacalai | 22402-02 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
| Nucleofector I | Amaxa | AAD-1001 | Electroporation apparatus |
| ORCA Flash 4.0 V2 | Hamamatsu | C11440-22CU | CMOS camera (single speckle imaging) |
| Papain | Nacalai | 26036-34 | |
| Parallel Computing Toolbox | MathWork | https://www.mathworks.com/products/parallel-computing.html | |
| pEGFP-C1 | Clontech | 1528177 | |
| Penicillin-streptomycin (100x) | Nacalai Tesque | 26253-84 | |
| pFN21A-HaloTag-actin | (Minegishi et al., 2018) | N/A | |
| Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011-044 | |
| Plan-Apochromat 100x/1.4 Oil | Zeiss | 420790-9901-000 | Objective lens (single speckle imaging) |
| pmNeonGreen-N1-Lifeact | (Kastian et al., 2021) | N/A | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P6407-5MG | |
| Slulfo-SAMPHA | Thermo Fisher Scientific | 22589 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Nacalai | 08933-05 | |
| Sodium hydrate (NaOH) | Nacalai | 31511-05 | |
| Steel ball | Sako tekkou | N/A | Microshpere to determin PAA gel rigidity. 0.6 mm diameter, 7.87 g/cm3. |
| ZEN2009 | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction | Image acquisition software (traction force microscopy) |
| ZEN2012 | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction | Image acquisition software (single speckle imaging) |
References
- TessierLavigne, M., Goodman, C. S. The molecular biology of axon guidance. Science. 274, 1123-1133 (1996).
- Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 001834 (2010).
- Vitriol, E. A., Zheng, J. Q. Growth cone travel in space and time: the cellular ensemble of cytoskeleton, adhesion, and membrane. Neuron. 73 (6), 1068-1081 (2012).
- Cooper, J. A. Cell biology in neuroscience: mechanisms of cell migration in the nervous system. Journal of Cell Biology. 202, 725-734 (2013).
- Dupraz, S., et al. RhoA controls axon extension independent of specification in the developing brain. Current Biology. 29, 3874-3886 (2019).
- Suter, D. M., Miller, K. E. The emerging role of forces in axonal elongation. Progress in Neurobiology. 94, 91-101 (2011).
- Franze, K. Integrating chemistry and mechanics: the forces driving axon growth. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 61-83 (2020).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Cytoskeletal dynamics and nerve growth. Neuron. 1, 761-772 (1988).
- Suter, D. M., Forscher, P. Substrate-cytoskeletal coupling as a mechanism for the regulation of growth cone motility and guidance. Journal of Neurobiology. 44, 97-113 (2000).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 332-343 (2009).
- Minegishi, T., et al. Shootin1b mediates a mechanical clutch to produce force for neuronal migration. Cell Reports. 25, 624-639 (2018).
- Minegishi, T., Inagaki, N. Forces to drive neuronal migration steps. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 863 (2020).
- Forscher, P., Smith, S. J. Actions of cytochalasins on the organization of actin filaments and microtubules in a neuronal growth cone. Journal of Cell Biology. 107, 1505-1516 (1988).
- Suter, D. M., Forscher, P. An emerging link between cytoskeletal dynamics and cell adhesion molecules in growth cone guidance. Current Opinion in Neurobiology. 8, 106-116 (1998).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112, 453-465 (2003).
- Waterman-Storer, C. M., Desai, A., Bulinski, J. C., Salmon, E. D. Fluorescent speckle microscopy, a method to visualize the dynamics of protein assemblies in living cells. Current Biology. 8, 1227-1230 (1998).
- Katoh, K., Hammar, K., Smith, P. J., Oldenbourg, R. Birefringence imaging directly reveals architectural dynamics of filamentous actin in living growth cones. Molecular Biology of the Cell. 10, 197-210 (1999).
- Watanabe, N., Mitchison, T. J. Single-molecule speckle analysis of actin filament turnover in lamellipodia. Science. 295, 1083-1086 (2002).
- Medeiros, N. A., Burnette, D. T., Forscher, P. Myosin II functions in actin-bundle turnover in neuronal growth cones. Nature Cell Biology. 8, 215-226 (2006).
- Shimada, T., et al. Shootin1 interacts with actin retrograde flow and L1-CAM to promote axon outgrowth. Journal of Cell Biology. 181, 817-829 (2008).
- He, M., Zhang, Z. H., Guan, C. B., Xia, D., Yuan, X. B. Leading tip drives soma translocation via forward F-actin flow during neuronal migration. Jounal of Neuroscience. 30, 10885-10898 (2010).
- Toriyama, M., Kozawa, S., Sakumura, Y., Inagaki, N. Conversion of a signal into forces for axon outgrowth through Pak1-mediated shootin1 phosphorylation. Current Biology. 23, 529-534 (2013).
- Abe, K., et al. Grip and slip of L1-CAM on adhesive substrates direct growth cone haptotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 2764-2769 (2018).
- Baba, K., et al. Gradient-reading and mechano-effector machinery for netrin-1-induced axon guidance. Elife. 7, 34593 (2018).
- Nichol, R. I., Hagen, K. M., Lumbard, D. C., Dent, E. W., Gomez, T. M. Guidance of axons by local coupling of retrograde flow to point contact adhesions. Journal of Neuroscience. 36, 2267-2282 (2016).
- Shekarabi, M., et al. Deleted in colorectal cancer binding netrin-1 mediates cell substrate adhesion and recruits Cdc42, Rac1, Pak1, and N-WASP into an intracellular signaling complex that promotes growth cone expansion. Journal of Neuroscience. 25, 3132-3141 (2005).
- Kubo, Y., et al. Shootin1-cortactin interaction mediates signal-force transduction for axon outgrowth. Journal of Cell Biology. 210, 663-676 (2015).
- Huber, A. B., Kolodkin, A. L., Ginty, D. D., Cloutier, J. F. Signaling at the growth cone: ligand-receptor complexes and the control of axon growth and guidance. Annual Review of Neuroscience. 26, 509-563 (2003).
- Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, 001727 (2011).
- Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128, 29-43 (2007).
- Tatavarty, V., Kim, E. J., Rodionov, V., Yu, J. Investigating sub-spine actin dynamics in rat hippocampal neurons with super-resolution optical imaging. PLoS One. 4, 7724 (2009).
- Frost, N. A., Shroff, H., Kong, H., Betzig, E., Blanpied, T. A. Single-molecule discrimination of discrete perisynaptic and distributed sites of actin filament assembly within dendritic spines. Neuron. 67, 86-99 (2010).
- Chazeau, A., et al. Nanoscale segregation of actin nucleation and elongation factors determines dendritic spine protrusion. EMBO Journal. 33, 2745-2764 (2014).
- Garcia, M., et al. Two-tiered coupling between flowing actin and immobilized N-cadherin/catenin complexes in neuronal growth cones. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 6997-7002 (2015).
- Swaminathan, V., et al. Actin retrograde flow actively aligns and orients ligand-engaged integrins in focal adhesions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 10648-10653 (2017).
- Tsai, T. Y., et al. Efficient front-rear coupling in neutrophil chemotaxis by dynamic myosin II localization. Developmental Cell. 49, 189-205 (2019).
- Zhang, X. F., et al. Regulation of axon growth by myosin II-dependent mechanocatalysis of cofilin activity. Journal of Cell Biology. 218 (7), 2329-2349 (2019).
- Reversat, A., et al. Cellular locomotion using environmental topography. Nature. 582, 582-585 (2020).
- Katsuno, H., et al. Actin migration driven by directional assembly and disassembly of membrane-anchored actin filaments. Cell Reports. 12, 648-660 (2015).
- Urasaki, A., et al. Shootins mediate collective cell migration and organogenesis of the zebrafish posterior lateral line system. Scientific Reports. 9, 12156 (2019).
- Abe, K., et al. Mechanosensitive axon outgrowth mediated by L1-laminin clutch interface. Biophysical Journal. 120, 3566-3576 (2021).
- Kastian, R. F., et al. Shootin1a-mediated actin-adhesion coupling generates force to trigger structural plasticity of dendritic spines. Cell Reports. 35, 109130 (2021).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
- Chan, C. E., Odde, D. J. Traction dynamics of filopodia on compliant substrates. Science. 322, 1687-1691 (2008).
- Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
- Li, Y., Hu, Z., Li, C. New method for measuring poisson's ratio in polymer gels. Journal of Applied Polymer Science. 50, 1107-1111 (1993).
- Belyy, A., Merino, F., Sitsel, O., Raunser, S. Structure of the Lifeact-F-actin complex. PLoS Biology. 18, 3000925 (2020).
- Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour. Scientific Reports. 9, 3241 (2019).
- Kumari, A., Kesarwani, S., Javoor, M. G., Vinothkumar, K. R., Sirajuddin, M. Structural insights into actin filament recognition by commonly used cellular actin markers. EMBO Journal. 39, 104006 (2020).
- du Roure, O., et al. Force mapping in epithelial cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2390-2395 (2005).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466, 263-266 (2010).
- Koch, D., Rosoff, W. J., Jiang, J., Geller, H. M., Urbach, J. S. Strength in the periphery: growth cone biomechanics and substrate rigidity response in peripheral and central nervous system neurons. Biophysical Journal. 102 (3), 452-460 (2012).
- Barnes, J. M., Przybyla, L., Weaver, V. M. Tissue mechanics regulate brain development, homeostasis and disease. Journal of Cell Science. 130, 71-82 (2017).
- Moore, S. W., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. Stretchy proteins on stretchy substrates: the important elements of integrin-mediated rigidity sensing. Developmental Cell. 19, 194-206 (2010).
- Tyler, W. J. The mechanobiology of brain function. Nature Reviews Neuroscience. 13, 867-878 (2012).
