Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Analyser av Actin Dynamics, ClutchKobling og Trekkraft Force for Growth Cone Advance

Published: October 21, 2021 doi: 10.3791/63227
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1Laboratory of Systems Neurobiology and Medicine, Division of Biological Science, Nara Institute of Science and Technology, 2Laboratory of Data-Driven Biology, Division of Biological Science, Nara Institute of Science and Technology

Summary

For å fremme må vekstkjegler utøve trekkraftkrefter mot det ytre miljø. Genereringen av trekkraftkrefter er avhengig av aktindynamikk og clutchkobling. Den nåværende studien beskriver metoder for å analysere aktindynamikk, clutchkobling og trekkraft krefter for vekst kjegle fremskritt.

Abstract

For å etablere funksjonelle nettverk må nevroner migrere til sine passende destinasjoner og deretter utvide axoner mot målcellene. Disse prosessene avhenger av fremskrittene av vekstkjegler som ligger på spissen av nevritter. Axonal vekst kjegler generere drivkrefter ved å føle sin lokale mikromiljø og modulere cytoskeletal dynamikk og actin-adhesion kobling (clutch kobling). Tiår med forskning har ført til identifisering av veiledningsmolekyler, deres reseptorer og nedstrøms signalkaskader for regulering av nevronmigrasjon og axonal veiledning; Imidlertid begynner de molekylære maskinene som kreves for å generere krefter for å drive vekstkjeglen fremover og navigasjonen bare å bli belyst. I forkant av nevronale vekstkjegler gjennomgår aktinfilamenter retrograd strømning, som drives av aktinpolymerisering og actomyosin-sammentrekning. En koblingskobling mellom F-aktin retrograde strømning og limsubstrat genererer trekkraftkrefter for vekstkjeglefremgang. Den nåværende studien beskriver en detaljert protokoll for overvåking av F-aktin retrograd strømning ved enkeltflekkavbildning. Viktig, når den kombineres med en F-aktinmarkør Lifeact, kan denne teknikken kvantifisere 1) F-aktinpolymeriseringshastigheten og 2) koblingskoblingseffektiviteten mellom F-aktin retrograd strømning og limsubstratet. Begge er kritiske variabler for å generere krefter for vekstkjeglefremgang og navigasjon. I tillegg beskriver den nåværende studien en detaljert protokoll for trekkraftmikroskopi, som kan kvantifisere 3) trekkraft generert av vekstkjegler. Ved å koble sammen analysene av enkeltflekkavbildning og trekkraftmikroskopi, kan etterforskerne derfor overvåke den molekylære mekanikken som ligger til grunn for vekstkjeglefremgang og navigasjon.

Introduction

I den utviklende virveldyrhjernen gjennomgår nevroner forseggjort organiserte migrasjoner og prosjektaksoner mot passende synaptiske partnere for å etablere funksjonelle nevronnettverk1,2,3. Vekstkjegler, som er sensoriske og motile strukturer plassert på spissen av nevritter, bestemmer hastigheten og retningen for nevronal migrasjon og axon utvekst3,4,5. Siden nevroner er omgitt av tettpakkede miljøer, må vekstkjegler utøve krefter mot miljøet for å komme seg fremover6,7. For å forstå mekanismene som ligger til grunn for nevronmigrasjon og axonal veiledning, er analyser av molekylærmekanikk for vekstkjeglefremgang avgjørende.

Tiår med analyse har avslørt at trekkraft for å drive vekstkjeglefremgang genereres av "clutch" -mekanismen; denne mekanismen antas å fungere ikke bare i axonal vekst kjegle, men også i den ledende prosessvekst kjegle av migrerende nevroner8,9,10,11,12. Nemlig, aktinfilamenter (F-aktiner) i vekstkjegler polymeriserer i forkant og depolymeriserer proksimalt, skyver ut den ledende membranen13,14,15. Den resulterende kraften, sammen med actomyosin-sammentrekning, induserer bakre bevegelse av F-aktiner kalt retrogradstrømning7,11,16,17,18,19,20,21. Clutch- og celleadhesjonsmolekyler formidler mekanisk kobling mellom F-aktin retrograde strømning og limsubstratet og overfører kraften til F-aktinstrøm på substratet, og genererer dermed trekkraft for vekstkjeglefremgang7,8,9,11,12,22 . Samtidig reduserer aktin-substratkoblingen F-aktinstrømningshastigheten og konverterer aktinpolymerisering til kraften for å stikke ut den ledende membranen9,10.

Axonal vekst kjegler føler lokale kjemiske signaler og transduce dem til en retningsmessig drivkraft for vekst kjegle navigasjon3,23,24,25. For eksempel stimulerer et axonveiledningsmolekyl netrin-1 reseptoren som er slettet i kolorektal kreft (DCC), og aktiverer Rho guanosin triphosfat (GTP)-bindende proteiner celledelingskontrollprotein 42 (Cdc42) og Ras-relatert C3 botulinumtoksin substrat 1 (Rac1), og deres nedstrøms kinase p21-aktiverte kinase 1 (Pak1)26. Cdc42 og Rac1 fremmer 1) aktinpolymerisering, og Pak1 fosforylater et clutchmolekyl shootin122,26. Shootin1 samhandler med F-aktin retrograd strømning via en aktinbindende protein cortactin27. Shootin1 samhandler også med L1 celleadhesjonsmolekyl (L1-CAM)20,24. Shootin1 fosforylering øker bindingsaffinitetene for kortlaktin og L1-CAM, og forbedrer shootin1-mediert 2) clutchkobling24,27. Innenfor vekstkjeglen øker asymmetriske aktiveringer av aktinpolymerisering og koblingskobling 3) trekkraft på siden av netrin-1-kilden, og genererer dermed retningsbestemt drivkraft for vekstkjegle dreining (figur 1)24. Intensiv forskning de siste tiårene med hensyn til nevron migrasjon og axon veiledning har forbedret forståelsen av veiledningsmolekyler, deres reseptorer og tilhørende nedstrøms signalkaskader2,10,28,29,30. Imidlertid begynner de molekylære maskinene å generere krefter for vekstkjeglefremgang bare å bli belyst; Dette kan tilskrives begrenset bruk av protokollene for mekanobiologiske analyser.

Den nåværende studien beskriver en detaljert protokoll for overvåking av F-aktin retrograd strømning ved enkeltflekkavbildning16,18. Overvåking av F-aktin retrograd strømning har blitt grundig utført ved hjelp av super-oppløsning mikroskopi, spinning-disk confocal mikroskopi og total interferens refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi25,31,32,33,34,35,36,37,38 . Protokollen i den nåværende studien bruker imidlertid et standard epifluorescensmikroskop og er dermed lett adopterbart1,16,18,20,22,23,24,27,39,40,41,42. Kombinert med F-aktinmerking av Lifeact43, gir enkel flekkete avbildning mulighet for kvantifisering av aktinpolymeriseringshastigheten og koblingskoblingseffektiviteten mellom F-aktin retrograd strømning og limsubstratet39,42. Den nåværende studien beskriver videre en detaljert protokoll for trekkraft kraftmikroskopi ved hjelp av en fluorescerende perle-innebygd polyakrylamid (PAA) gel11,22,23,24,27,39,41,42,44. Denne metoden oppdager og kvantifiserer trekkraft under vekstkjeglen ved å overvåke kraftinduserte perlebevegelser44,45. En åpen kildekode trekkraft analyse kode er gitt, og metoden for kvantifisering trekkraft under vekst kjegle migrasjon forklares i detalj. Ved hjelp av enkel flekkete avbildning og trekkraft kraftmikroskopi, vil det bli lagt til rette for forståelse av den molekylære mekanikken som ligger til grunn for vekstkjeglemigrasjon og navigasjon. Disse teknikkene gjelder også for å analysere molekylærmekanikken som ligger til grunn for dendritisk ryggradsforstørrelse, som er kjent for å være viktig i læring og hukommelse42.

Protocol

Alle eksperimenter ved hjelp av laboratoriedyr ble utført med Institutional Animal Care and Use Committee of Nara Institute of Science and Technology. Etterforskere bør følge etablerte retningslinjer fra sine institusjonelle og nasjonale dyrereguleringskomiteer for pleie og bruk av forsøksdyr.

1. Utarbeidelse av løsninger og medier

  1. Forbered løsningene og kulturmediene som oppsummert i Tilleggsfil 1

2. Fremstilling av poly-D-lysin (PDL)/lamininbelagte substrater

  1. Frakk 14 mm diameter glassbunnsretter med 100 μg/ml PDL, oppløst i fosfatbufret saltvann (PBS, pH 7,4) og inkuber for natten i en fuktet inkubator ved 37 °C.
    MERK: Ikke tørk opp glassoverflatene etter dette trinnet
  2. Fjern PDL-oppløsningen og pipetten 1 ml PBS på glasset i 10 s tre ganger.
  3. Belegge rettene med 5 μg/ml laminin, oppløst i PBS, og inkuber for natten i en fuktet inkubator ved 37 °C.
  4. Fjern lamininoppløsningen og pipetten 1 ml PBS på glasset i 10 s tre ganger.
  5. Fjern PBS og plasser 0,5 ml av nevrobasalmediet på glassflatene. Oppbevar rettene i en fuktet inkubator ved 37 °C.
    MERK: PDL/lamininbelagte retter kan oppbevares i 2-3 dager i en fuktet inkubator ved 37 °C.

3. Disseksjon og dissosiasjon av hippocampus

  1. Euthanize en gravid mus ved cervical dislokasjon.
    MERK: Den nåværende studien bruker kommersielt tilgjengelige mus (se Materialtabell). Etterforskere bør bruke mus som er avlet og humant behandlet i et sterilisert miljø.
  2. Disseker ut embryonale dag-16 (E16) museembryoer, og legg dem på is.
  3. I en laminær strømningshette dissekerer du hjernen med saks og legger dem på en steril 10 cm tallerken som inneholder 10 ml iskald disseksjonsløsning.
  4. Med et disseksjon stereomikroskop, skrell forsiktig bort meningene på hjernehalvdelene og disseker deretter ut hippocampi ved hjelp av tang.
  5. Overfør hippocampi til 5 ml iskald fordøyelsesløsning i et 15 ml rør. Inkuber hippocampi i et vannbad i 20 min ved 37 °C.
  6. Fjern fordøyelsesløsningen og tilsett 3 ml disseksjonsløsning.
  7. Forsiktig pipette hippocampi fire ganger med en Pasteur pipette.
  8. Inkuber hippocampi i et vannbad i 20 min ved 37 °C.
  9. Overfør cellefjæringen til et 50 ml sentrifugerør. Tilsett 3 ml ny disseksjonsløsning til det udissosierte vevet.
  10. Gjenta trinn 3.7-3.9 til hippocampi er fullstendig dissosiert.
  11. Fjern de flytende aggregatene av DNA fra cellefjæringen ved å virvle og aspirere med en Pasteur pipette. Sentrifuger cellefjæringen ved 180 x g i 20 min ved 4 °C.
    MERK: DNA avledet fra skadede celler vil forstyrre sentrifugeringsprosessen. Hvis nevroner forblir i supernatanten, sentrifuger cellefjæringen igjen etter nøye fjerning av DNA.
  12. Likevekts neurobasal medium som inneholder 10% foster bovint serum (FBS), penicillin (100 U / ml) og streptomycin (100 μg / ml) i en fuktet inkubator ved 37 °C med 5 % CO2.

4. Transfeksjon og culturing nevroner

  1. Fjern supernatanten og tilsett 5 ml iskald PBS i 50 ml-røret. Resuspend cellepellet ved skånsom pipettering.
  2. Overfør 10 μL av cellefjæringen til et mikrosenterrør, tilsett 10 μL 0,5% trypan blå løsning, og tell deretter antall celler med hemocytometer.
  3. Sentrifuger cellefjæringen i 50 ml-røret ved 180 x g i 20 minutter ved 4 °C.
  4. I mellomtiden, aliquot for transfection, 1 μg pFN21A-HaloTag-actin og 3 μg pmNeonGreen-N1-Lifeact per 1 x 106 celler, inn i et mikrocentrifuge rør.
  5. Etter sentrifugering fjerner du supernatanten og tilsetter 100 μL elektroporasjonsmedium (levert av transfeksjonssett) i 50 ml-røret. Resuspend cellepellet ved pipettering.
  6. Bland cellefjæringen med den alisitterte DNA-løsningen og overfør blandingen til en cuvette (levert av transfeksjonssettet).
    MERK: Siden luftbobler forstyrrer elektroporasjonen, må du fjerne dem fra celleopphenget.
  7. Sett cuvette inn i elektroporasjonsapparatet (Materialbord), og utfør elektroporasjon ved hjelp av programmet O-005.
  8. Tilsett umiddelbart 1 ml av det forvarmede og likevektede nevrobasale mediet som inneholder 10 % FBS, penicillin (100 U/ml) og streptomycin (100 μg/ml) i cuvette.
  9. Overfør cellefjæringen til et 15 ml sentrifugerør ved hjelp av en plastpipette (levert av transfeksjonssettet).
  10. Overfør 10 μL av cellefjæringen til et mikrorør, tilsett 10 μL 0,5% trypan blå løsning, og tell deretter antall celler med et hemocytometer.
  11. Ta ut PDL/lamininbelagte glassbunnsretter fra inkubatoren og fjern det nevrobasale mediet.
  12. Pipette 0,5 ml av cellesuspensjonen som inneholder 2,0 x 105 celler per tallerken og inkuberer i en fuktet inkubator ved 37 °C med 5 % CO2 i 3 timer.
  13. Bytt ut mediet med 0,5 ml nevrobasalt medium som inneholder 2 % B-27-tilskudd, glutamin (1 mM), penicillin (100 U/ml) og streptomycin (100 μg/ml). Kultur nevronene i en fuktet inkubator i 3 dager ved 37 °C med 5 % CO2.

5. Enkel flekkete avbildning ved nevronale vekstkjegler

  1. På dag in vitro (DIV) 3, behandle nevronene med tetrametyl-rhodamin (TMR) ligand ved en fortynning av 1:2000 fortynning i kulturmediet. Vedlikehold nevronene i 1 time ved 37 °C med 5 % CO2.
  2. Vask TMR-ligaen tre ganger med forvarmet PBS.
  3. Fjern PBS og pipette 0,5 ml oppvarmet Leibovitz L-15 medium som inneholder 2% B-27 supplement, glutamin (1 mM), penicillin (100 U/ml) og streptomycin (100 μg/ml).
  4. Vedlikehold nevroner i 1 time ved 37 °C.
  5. Slå på et epifluorescensmikroskop og sett trinn-topp inkubatoren til 37 °C.
    MERK: Den nåværende protokollen bruker et epifluorescensmikroskop utstyrt med et komplementært metalloksid halvlederkamera, en 100x / 1,40 NA oljeinnlevelse objektiv linse, en kvikksølvlampe og en bildeanskaffelsesprogramvare (se Tabell over materialer). Andre epifluorescence mikroskoper med tilsvarende spesifikasjoner kan også brukes til denne analysen.
  6. Plasser de TMR ligandbehandlede nevronene i glassbunnsfatet på den oppvarmede trinn-topp inkubatoren.
  7. Angi bildeanskaffelsesparametrene som følger: eksponeringstid, 500 ms for Lifeact og HaloTag-actin fluorescerende kanaler; binning, 1 x 1 (0,065 μm × 0,065 μm per piksel); tidsintervall, 3 s; varighet, 50 bilder.
  8. Velg en vekstkegle som sterkt uttrykker Lifeact og svakt uttrykker HaloTag-actin.
    MERK: Lifeact-uttrykket skal være sterkt nok til å visualisere vekstkjeksmorfologi. HaloTag-aktinuttrykk bør være svakt utilstrekkelig til å oppdages (figur 2A). Nivåene av fluorescerende proteinuttrykk kan justeres ved å variere mengden DNA for transfeksjon.
  9. Lukk feltet på membranen for å belyse et minimumsområde som inkluderer vekstkjeglen (figur 2B).
    MERK: Belysningen av et minimumsområde reduserer bakgrunnssignalet og øker fluorescenssignalet til støyforholdet (S/N), noe som muliggjør påvisning av aktinflekker (figur 2B). For å øke S/N-forholdet ytterligere, anbefales det å belyse vekstkjeglen uten å redusere lyset med nøytrale tetthetsfiltre.
  10. Hent tidsforløpbilder (tilleggsfil 2). Lagre som et flerkanals tidsforløpsstakkbilde (tiffformat).

6. Kvantifiseringer av F-aktinstrømningshastighet og polymerisasjonshastighet ved hjelp av en bildebehandlings- og analyseprogramvare Fiji

MERK: Se Tilleggsfil 3 for øvingsdata for kvantifisering av F-aktinstrømningshastighet og aktinpolymeriseringshastigheten.

  1. Åpne flerkanals tidsforløpstakkbildet på Fiji.
  2. Velg Analyser > Angi skala, og angi pikselstørrelsen på bildene.
  3. Finn en aktinflekk som flyter retrogradely i minst fem tidsrammer i en F-aktinbunt i filopodia eller lamellipodia.
  4. Velg Bilde > Transformer > Roter, og juster vinkelen på bildene slik at F-aktinbunten peker oppover (figur 3A).
  5. Klikk Rektangel på verktøylinjen, og tegn en boks som inneholder aktinflekker og spissen av F-aktinbunten (figur 3B, 1 og 2).
    MERK: Signalene fra HaloTag-aktinflekker er svake. I tillegg er Lifeact-signaler på de distale spissene til vekstkjeglen svake og svake (figur 2B) fordi de distale spissene til vekstkjeglen er tynne sammenlignet med den proksimale delen. Undersøkere bør forbedre signalene for å optimalisere kvantifiseringene av F-aktinstrømningshastighet og polymerisasjonshastighet (figur 3B). Selv om Lifeact-signalet ved den proksimale vekstkjeglen blir mettet, vil dette ikke forstyrre bestemmelsen av den distale enden av F-aktiner (figur 3E, gul linje).
  6. Velg Bilde > Dupliser og skriv inn de fem tidsrammene (figur 3B, 3-5).
  7. Velg Bilde > stabler > Lag montasje, og skriv inn parameterne: Kolonner, 5; Rader, 1; Skalafaktor, 1.
  8. Klikk på OK. Bildemontasjen vises på skjermen.
  9. Velg Bilde > farge > delte kanaler. Dette skiller de to fluorescerende kanalene.
  10. Kvantifisering av F-aktinstrømningshastighet.
    1. Velg Analyser > Angi mål, og velg Område- og markeringsrektangel.
    2. Klikk Ellipse på verktøylinjen, og tegn en sirkel på en aktinflekk (figur 3C, 1 og 2).
    3. Velg Bilde > overlegg > Legg til markering. Sirkelen legges over bildemontasjen (figur 3C, 3 og 4).
      MERK: Fargen på overlappingen kan endres på Rediger > Alternativer > Farger.
    4. Gjenta overlappingen av sirkler for de resterende flekkene (figur 3C, 5).
      MERK: For å nøyaktig bestemme sentrene for aktinflekk, bør etterforskerne legge sirkler over flekkene.
    5. Klikk Rett på verktøylinjen, og tegn en linje som kobler sammen midten av sirklene (figur 3D, 1 og 2).
    6. Velg Analyser > mål. Resultatet vises på skjermen (figur 3D, 3).
      MERK: Høyden som vises i resultatet indikerer translokasjonsavstanden til aktinflekken under observasjonen (figur 3D, 3).
    7. Beregn F-aktinstrømningshastigheten ved å dele translokasjonsavstanden med observasjonstiden.
  11. Kvantifisering av F-aktinpolymerisasjonshastigheten.
    1. Tegn en linje som forbinder tipsene til F-aktinbunten (figur 3E, 1).
    2. Velg Analyser > mål. Resultatet vises på skjermen (figur 3E, 2).
      MERK: Høyde i resultatet indikerer forlengelseslengden på F-aktinbunten under observasjonen (figur 3E, 2).
    3. Beregn F-aktinforlengelseshastigheten ved å dele forlengelseslengden på observasjonstiden.
    4. Beregn F-aktinpolymerisasjonshastigheten som summen av F-aktinstrømningshastigheten og forlengelseshastigheten (figur 3F).

7. Tilberedning av en PAA gel for trekkraft mikroskopi og nevronkulturer

  1. Tilberedning av PAA-geler som kreves for trekkraftmikroskopi (figur 4)
    1. Pipette 0,5 ml NaOH (100 mM), oppløst i destillert H2O, på 27 mm-diameter glassbunnsretter, og inkuberer i 15 minutter ved romtemperatur (RT).
    2. Tilsett 50 μL 3-aminopropyltrimethyoksysilane (APTMS) i NaOH-løsningen på rettene og bland løsningene ved skånsom pipettering, og inkuber i 15 min på RT.
    3. Vask glassbunnsrettene med destillert H2O og tørk.
    4. Pipette 0,5 ml 0,5 % glutaraldehydoppløsning, oppløst i PBS, på den APTMS-behandlede glassbunnsfatet og inkuberes i 30 minutter ved RT.
    5. Vask glassbunnsrettene med destillert H2O og tørk.
    6. Forbered en løsning som inneholder destillert H2O (412 μL), 30% (w/v) akrylamidoppløsning (63 μL), 2,5% (w/v) bis-akrylamidoppløsning (6 μL) og karboksylatmodifisert mikrosfære (fluorescerende perle) oppløsning (20 μL).
      MERK: Virvel den fluorescerende perleløsningen for å fjerne aggregerte perler før du tilsetter akrylamidoppløsningen.
    7. Degas løsningen i et vakuumkammer i 30 min ved RT.
    8. Til denne løsningen, tilsett 1 μL 10% (w / v) ammoniumpersulfat (APS), oppløst i destillert H2O, og 1 μL N, N', N'-tetrametylethylenediamine (TEMED), og bland ved skånsom pipettering.
    9. Legg en glassdeksleslip (18 mm diameter) på hetten på et 15 ml sentrifugerør.
    10. Tilsett straks 25 μL av løsningen på dekslene, og legg deretter forsiktig en omvendt glassbunnsfat på dekslene. La akrylamidet polymerisere i 1 time ved RT.
    11. Påfør destillert H2O på dekslene og skrell den bort fra gelen ved hjelp av en sprøytenål med bøyd spiss.
    12. Fjern H2O og tilsett sulfo-SANPAH (1 mM), oppløst i PBS, til gelen.
    13. Under sterile forhold, utsett gelene for ultrafiolett lys i 5 min. Vask gelen tre ganger med PBS i 15 min per vask.
  2. Bestemmelse av gelstivhet med en mikrosfæreinnrykksmetode (figur 5A)44.
    1. Overfør en mikrosfære som er spesifisert for diameter og tetthet, til gelen og plasser den deretter på prøvestadiet av et laserskanningskonfokalt mikroskop.
    2. Fokuser på geloverflaten og registrer z-posisjonen (figur 5B).
    3. Fokuser på bunnen av mikrosfæren på samme måte, og registrer z-posisjonen (figur 5C).
    4. Beregn innrykksdybden som bestemt av forskjellen mellom geloverflatens z-posisjoner og bunnen av mikrosfæren.
    5. Beregn Youngs modulus E av gelen ved å:
      Equation 1
      der f er oppdriftskorrigert vekt av mikrosfæren, d er gelens innrykksdybde, r er mikrosfærens radius, og v er Poissons forhold (hvis verdi er 0,3, som bestemt tidligere46).
  3. Belegge gelene med PDL og laminin som beskrevet i avsnitt 2.
  4. Som beskrevet i avsnitt 3 og 4, dissekerer du ut E16 museembryoer, dissosierer hippocampi og transfekterer med 5 μg pEGFP-C1 per 1,0 x 106 celler. Frø 2,0 x 105 celler på PDL/lamininbelagte geler.
    MERK: For trekkraftanalyse er mikroskopisk avbildning av fluorescerende merkede celler nødvendig for å bestemme vekstkjegleområdet.

8. Trekkraft kraftmikroskopi ved nevronal vekstkjegler

  1. På DIV3 erstatter du kulturmediet med 0,5 ml oppvarmet Leibovitz L-15 medium som inneholder 2% B-27 supplement, glutamin (1 mM), penicillin (100 U/ml) og streptomycin (100 μg/ml). Vedlikehold nevronene i 1 time ved 37 °C.
  2. Slå på et konfokalt mikroskop for laserskanning og sett trinn-topp inkubatoren til 37 °C.
    MERK: Den nåværende studien bruker et laserskanningskonfokalt mikroskop utstyrt med en 63x/1.2 NA vanninnlevelse objektiv linse og en bildeinnhentings- og analyseprogramvare (se Materialfortegnelse).
  3. Plasser nevronene i glassbunnsfatet på den forvarmede trinn-topp inkubatoren.
  4. Angi bildeanskaffelsesparametere på følgende måte: skannestørrelse, 512 × 512 piksler; skanneområde, 1,5-3x zoom; skannehastighet, ~ 1 s per ramme; laserbølgelengde, 561 nm (eksitasjonsbølgelengden for fluorescerende perler) og 488 nm (eksitasjonsbølgelengden for forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP)); tidsintervall, 3 s; varighet, 50 bilder.
  5. For å visualisere vekstkjeglemorfologien, velg en vekstkegle som sterkt uttrykker EGFP.
  6. Fokuser på geloverflaten og få tidsforløpbilder (figur 6A og tilleggsfil 4).
    MERK: For trekkraftanalyse, bruk to fluorescerende kanaler (for fluorescerende perler og EGFP) og en lysfeltkanal (det anbefales å fange differensialinterferenskontrastbilder (DIC) eller fasekontrastbilder).
  7. Bruk en bildebehandlingsprogramvare (f.eks. Fiji) til å produsere enkanals tidsforløp RGB-bildestakker og lagre disse bildene som tiff-filer.
    MERK: Det er viktig at etterforskerne også lagrer rådataene.
  8. Påfør 100 μL av 10% (w / v) natriumdodecylsulfat (SDS), oppløst i destillert H2O, til glassbunnsfatet for å slappe av gelsubstratet ved å frigjøre nevroner fra substratet. Inkuber retten i 5 min ved 37 °C for å stabilisere temperaturen.
    MERK: Bildet av perlene i et ubegrunnet substrat brukes til å referere til de opprinnelige perleposisjonene under trekkraftsanalyse (figur 6C). Påføring av SDS-løsning endrer xyz-posisjonene på grunn av termisk endring i inkubatoren og avslapning av den celleinduserte deformasjonen. Etterforskere må derfor korrigere fokusplanet og x-y-posisjonen.
  9. Fokuser på geloverflaten, og få et bilde av perlene i det ubegrensede substratet (figur 6B).
  10. Lag et enkanals RGB-bilde av perlene i det ubegrensede underlaget, og lagre dette bildet som en TIFF-fil.
  11. Korrigering av x-y-posisjonen til perlebildet i det ubegrensede substratet ved hjelp av Fiji
    1. I Fiji åpner du perlebildet i det ubegrensede substratet og tidsforløpstakkbildet av fluorescerende perler.
    2. Velg Bilde > stabler > verktøy > kjeder sammen. Det vises en dialogboks på skjermen (figur 7A, 1).
    3. Velg perlebildet i det ubegrensede substratet og tidsforløpstakkbildet av fluorescerende perler i henholdsvis Bilde1 og Bilde2 (figur 7A, 2).
    4. Klikk på OK. Perlebildet i det ubegrensede substratet legges til i bildet av tidsforløpstakken (figur 7A, 3).
    5. Bruk rullefeltet (figur 7B, 1, rød ramme) til å vise den andre rammen i stakkbildet (rød pil).
    6. Velg Plugins > StackReg (figur 7B, 2). Det vises en dialogboks på skjermen (figur 7B, 3).
    7. Velg Stiv kropp fra rullegardinlisten (figur 7B, 3, rød ramme) og klikk på OK. Korrigeringen av x-y-posisjonen begynner deretter.
    8. Bruk rullefeltet til å vise den første rammen i det plasseringskorrigerte stakkbildet i x-y.
    9. Velg Bilde > Dupliser (figur 7C, 1). Det vises en dialogboks på skjermen (figur 7B, 2).
    10. Skriv inn 1 i området, fjern merket for Duplikatstakk (figur 7C, 2), og klikk OK. Det x-y posisjonskorrigerte perlebildet i det ubegrensede substratet vises på skjermen (figur 7C, 3). Lagre dette bildet som en TIFF-fil.
  12. Kvantifisering av trekkraft
    MERK: Metoden som er beskrevet her for trekkraft kraftanalyse bruker MATLAB og to MATLAB verktøykasser, 'Image Processing Toolbox' og 'Parallel Computing Toolbox'. Etterforskere må installere dem før analysen. Trekkraft analyse kode ble utviklet basert på MATLAB versjon 2018a. Derfor må MATLAB versjon 2018a (eller nyere) brukes til analysen. Algoritmene som ble brukt til trekkraftsanalyse ble beskrevet tidligere22.
    1. Last ned trekkraft analysekode TFM2021 fra Supplemental File 5. Åpne TFM 2021 i MATLAB
    2. Åpne hoved.m i TFM2021 og kjør den. Et grafisk brukergrensesnitt (GUI) vises på skjermen (figur 8A).
    3. Klikk på Last inn ubelastet substratbilde og velg x-y posisjonskorrigert perlebilde i ubegrunnet substrat.
    4. Klikk på Last fluorescerende perlebilder og velg tidsforløp stack bildet av perler.
    5. Klikk på Last inn lysfeltbilder og velg tidsforløpstakkbildet av lysfelt.
    6. Klikk på Last inn GFP-bilder og velg tidsforløpstakkbildet av EGFP.
    7. Velg GFP fra rullegardinlisten i GUI (figur 8A, rød boks).
    8. Klikk på avkastning for å angi rektangelområdet av interesse (ROI), inkludert vekstkjeglen, ved å klikke på to punkter på cellebildet som vises på GUI (figur 8B).
    9. Klikk på Lagre-knappen på GUI (figur 8A, rød pil). De valgte stakkbildene, sammen med avkastningen, lagres i en .mat-fil (MATLAB-formatfil).
    10. Klikk på Spot detect. Det vises en dialogboks på skjermen.
    11. Skriv inn en verdi (vanligvis 50-150) i dialogboksen for å bestemme en terskel for perledeteksjon. Hvis du klikker OK , startes beregningen.
    12. Når du er ferdig med beregningen, klikker du på Plott spor for å forstørre regionen som er valgt i trinn 8.12.8 og vise de oppdagede perlene som hvite prikker (figur 8C, 1).
      MERK: Bead detection (hvite prikker) overlapper med fluorescerende perler. Perledeteksjon kan også oppdage bakgrunnsstøy. Hvis du vil redusere denne eksterne interferensen, endrer du terskelverdien på Spot Detect. I tillegg velger du de riktige prikkene manuelt i trinn 8.12.13.
    13. Klikk på Velg perler, og avgrense et polygonalt område som inkluderer de riktige prikkene under vekstkjeglen. Trykk ENTER på tastaturet. De hvite prikkene i det mangekantede området endres til en rød farge (figur 8C, 2).
    14. Klikk på Estimatkraft på GUI. Deretter skriver du inn verdier for følgende parametere: pikselstørrelse, μm/piksel; Youngs modulus, verdien beregnet i trinn 7.2.5; Poissons forhold, 0,3.
    15. Utfør estimatkraft for å starte beregningen. Programvaren vil lagre beregningsresultatene i et regneark format fil automatisk.
      MERK: Regnearket viser x-komponenten, y-komponenten og kraftstørrelse ved hver tidsramme (figur 8D). Se Tilleggsfil 6 for øvingsdata for kvantifisering av trekkraft.

Representative Results

Enkel flekkavbildning for å kvantifisere aktinpolymeriseringshastighet og clutchkoblingseffektivitet
Et høyt Lifeact-uttrykk tillater F-aktinvisualisering i vekstkjeglen; et lavt HaloTag-aktinuttrykk gjør det mulig å overvåke F-aktin retrograd strømning (figur 3, tilleggsfil 2). Sporing av aktinflekker tillater måling av F-aktinstrømningshastighet (figur 3C,D). Siden den mekaniske koblingen av F-aktin retrograde strømning og limsubstratet reduserer F-aktinstrømningshastigheten, kan koblingskoblingseffektiviteten estimeres ut fra hastigheten. Videre hjelper F-aktinmerking med Lifeact visualisering av F-aktinforlengelse og er nyttig for å kvantifisere aktinpolymeriseringsraten (figur 3E, F).

Kvantitativ analyse av trekkraft
Streng overholdelse av metodikken som presenteres her, vil avsløre bevegelsene til fluorescerende perler under vekstkjeglen (Figur 6C, Supplemental File 4). F-aktin retrograd strømning på substratet genererer trekkraft kraft forårsaker fluorescerende perler å bevege seg bakover under vekst kjeglen. Trekkraft analyse kode estimerer trekkraft kraft fra fluorescerende perle forskyvning, og uttrykker den beregnede trekkraft kraft som en kraft vektor. Retningen og størrelsen på trekkraften bestemmes fra x- og y-komponentene i kraftvektoren (figur 8C,D). Den røde boksen i figur 8D representerer x- og y-komponentene i en kraftvektor. Figur 8C viser den tilsvarende vekstkjeglen. Når det gjelder x-y-koordinater, peker vektoren til -93,8° mot x-aksen; denne retningen er rettet mot baksiden av vekstkjeglen (figur 8C). Størrelsen på trekkraften F ble beregnet som følger:

Equation 2

Figure 1
Figur 1: Et vekstkjeglemaskiner for kraftgenerering og vekstkjeglenavigasjon. En netrin-1 kjemoattractant gradient induserer asymmetrisk stimulering av reseptoren DCC på en axonal vekstkegle. Dette aktiverer Rac1 og Cdc42, og deres nedstrøms kinase Pak1. Rac1 og Cdc42 fremmer (1) aktinpolymerisering, mens Pak1 fosforylater shootin1, forbedrer shootin1-mediert (2) clutchkobling. Den asymmetriske aktiveringen av aktindynamikk og clutchkoblingen i vekstkjeglen øker (3) trekkraft på siden av netrin-1-kilden, og genererer dermed en retningsbestemt drivkraft for vekstkjegletiltrekning. Protokollene som presenteres her tillater kvantifisering av nøkkelvariablene (1)-(3) for vekstkjeglenavigasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Fluorescensbilder av en nevronal vekstkegle under en fullt åpnet og innsnevret membran. Vekstkjeglen uttrykker Lifeact og HaloTag-actin. (A) Et høyt Lifeact-uttrykk tillater visualisering av vekstkjeglemorfologi. På den annen side er HaloTag-aktinuttrykksnivåene svært lave, med svake signaler når membranen er helt åpnet. (B) Når membranen er riktig innsnevret, reduseres bakgrunnssignalene, og enkelt aktinflekker vises i vekstkjeglen. Skalastenger: 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Trinn for kvantifisering av F-aktinstrømningshastighet og aktinpolymeriseringshastighet ved hjelp av en bildebehandlings- og analyseprogramvare Fiji. (A) Juster vinkelen på bildet for analyse. (1) Finn og velg en aktinflekk (pilspiss) som strømmer i en F-aktinbunt. (2) Velg Bilde > Transformer > Roter. (3) Still inn vinkelen slik at F-aktinbunten er rettet oppover. (4) Vinkelen på bildet vil bli endret. (B) Avgrense regionen, inkludert aktinflekken og F-aktinbunten. (1) Klikk på Rektangel på verktøylinjen. (2) Avgrense et område på bildet. Lysstyrken og kontrasten til bildet økes for å tillate klar visualisering av aktinflekken og spissen av F-aktinbunten. (3) Velg Bilde > Dupliser. (4) Angi de fem tidsrammene som viser aktinflekkstrøm i F-aktinbunten. (5) Det valgte stakkbildet vises på skjermen. (C) Overlegg sirkler på aktinflekken. (1) Klikk på Oval på verktøylinjen. (2) Tegn en sirkel på en aktinflekk. (3) Velg Bilde > overlegg > Legg til utvalg. (4) Sirkelen er lagt over. 5) Gjenta overlegging av sirklene på de resterende aktinflekker. (D) Mål translokasjonsavstanden til aktinflekker i løpet av de fem tidsrammene. (1) Klikk på Rett på verktøylinjen. (2) Tegn en linje som forbinder midten av sirklene. (3) Velg Analyser > Mål. Resultatet, angitt av parameteren Height (rød boks), som sender actin speckle-translokasjonsavstanden. (E) Mål endringen i lengden på F-aktinprotrudering i løpet av de fem tidsrammene. (1) Tegn en linje som forbinder spissene på F-aktin-fremspringet. (2) Velg Analyser > mål. Resultatet (rød boks), Height, angir forlengelseslengden på F-aktinbunten. (F) Aktinpolymeriseringshastigheten beregnes ut fra summen av F-aktinstrømningshastigheten og forlengelseshastigheten. Se også Tilleggsfil 2. Supplemental File 3 hjelper etterforskere med å praktisere metodikken beskrevet ovenfor. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Trinn for PAA gelpreparat. Se trinn 7.1 for en detaljert beskrivelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Bestemmelse av PAA gelstivhet. (A) En mikrosfæreinnrykksmetode. Når en mikrosfære er plassert på en fluorescerende perle-innebygd PAA gel, forårsaker mikrosfærens vekt en innrykk i gelen. Innrykksdybden beregnes ved å trekke z-posisjonene til PAA geloverflaten fra bunnen av mikrosfæren (B,C) Fluorescensbilder av en PAA gel rykket inn av en mikrosfære og inneholder fluorescerende perler. Et laserskanningskonfokalt mikroskop ble brukt til å ta bilder av geloverflaten (B) og bunnen av mikrosfæren (C). Signaler fra fluorescerende perler er ikke synlige på geloverflaten i det innrykkede området (B, sirkel). De kan imidlertid observeres på bunnen av mikrosfæren. Skalastenger: 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Kraftkartlegging av en nevron vekstkjegle. (A-C) Fluorescensbilder av perler innebygd i en PAA gel og en nevral vekst kjegle visualisert med EGFP. Etter oppkjøpet av tidsforløpbilder (A) ble nevronen frigjort fra gelunderlaget ved å bruke SDS-løsning, og et bilde av perlene i det ubegrensede substratet ble fanget (B). (C) Bildet av perlene i det ubegrensede substratet viser perlene i sine opprinnelige (grønne) og fordrevne (røde) posisjoner. EGFP-signalet til vekstkjeglen er vist i blått. Kymografier (høyre) viser bevegelsene til perler med 3 s intervaller i en varighet på 147 s, angitt av pilene i innkapslede områder 1 og 2. Perlen i område 2 er en referanseperle. Skalastenger: 2 μm for (A), (B) og (C, venstre) og 1 μm for (C, midten). Se også Tilleggsfil 4. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Trinn for korrigering av x-y-posisjonen til perlebildet i ubegrunnet substrat ved hjelp av Fiji. (A) Sett sammen perlebildet i ubegrunnet substrat med tidsforløpstabelbildet av fluorescerende perler. (1) Velg Image > Stacks > Tools > Concatenate. (2) Velg perlebildet i ubegrensede substrat og tidsforløp stack-bildet av fluorescerende perler i henholdsvis Bilde1 og Bilde2. Klikk på OK. (3) Perlebildet i det ubegrensede substratet legges til i bildet av tidsforløpstakken. (B) Korrigere x-y-posisjonen til det fluorescerende perlebildet. (1) Bruk rullefeltet (rød ramme) for å velge den andre rammen (rød pil) i bildestakken. (2) Velg Plugins > StackReg. (3) Velg Stiv kropp fra rullegardinlisten (rød ramme) og klikk på OK. Rettelsen av x-y-posisjonen begynner. (C) Lagre det x-y posisjonskorrigerte perlebildet. Når du har valgt den første rammen i det plasseringskorrigerte stakkbildet i x-y, velger du Bilde > Dupliser. (2) skriv inn 1 i området og fjern merket for Duplikatstakk. Klikk deretter på OK. (3) det x-y posisjonskorrigerte perlebildet i det ubegrensede substratet vises på skjermen. Lagre dette bildet som en TIFF-fil. Supplemental File 6 hjelper etterforskere med å praktisere metodikken beskrevet ovenfor. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Analyse av trekkraft under en nevronal vekstkegle ved hjelp av en åpen kildekode-trekkraftanalysekode. (A) GUI for å analysere trekkraft. Tidsforløpbilder som er valgt i brukergrensesnittet, kan bekreftes fra rullegardinlisten og med glidebryteren angitt (rød boks). (B) Velg et område som inkluderer vekstkjeglen. (1) Klikk på avkastning på GUI. Med musepekeren angir du to punkt (pilspisser) på cellebildet. (2) En rød boks vises på cellebildet. To klikk bestemmer plasseringen av to hjørner. (C) Velg de oppdagede perlene (hvite prikker) under vekstkjeglen. (1) På GUI, klikk på Velg perler, og avgrense et polygonalt område som inkluderer vekstkjeglen ved å klikke. Trykk ENTER . (2) De hvite prikkene i det polygonale området endres til en rød farge. (D) Beregnede resultater av trekkraftens retning og størrelse. Den røde boksen i regnearket representerer x- og y-komponentene i kraftvektoren, estimert av trekkraftanalyse. På x-y-koordinaten i høyre panel peker kraftvektoren generert av vekstkjeglen til -93,8° mot x-aksen; denne retningen er rettet mot baksiden av vekstkjeglen i (C). Supplemental File 6 hjelper etterforskere med å praktisere metodikken beskrevet ovenfor. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfil 1: Oppskrifter på løsninger og medier som brukes i denne studien. Se tekst for detaljert bruk. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende fil 2: Fluorescensavbildning av Lifeact og fluorescerende flekkete avbildning av HaloTag-aktin i en nervevekstkegle. Lifeact (grønn) og HaloTag-aktin (magenta). Bilder ble anskaffet hver tredje s for en total varighet på 147 s. Skala bar: 2 μm. Se også figur 3. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende fil 3: Øv på data for kvantifisering av F-aktinstrømningshastighet og aktinpolymeriseringshastigheten. Et tidsforløpsstakkbilde med flere kanaler av Lifeact (grønn) og HaloTag-aktin (magenta). Se også figur 3. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende fil 4: En kraftkartleggingsvideo som oppdager trekkraft ved en nevronal vekstkjegle. De opprinnelige (grønne) og fordrevne (røde) posisjonene til perlene. EGFP-signalet i vekstkjeglen vises i blått. Bilder ble anskaffet hver tredje s for 147 s. Skala bar: 2 μm. Se også figur 6. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 5: Trekkraft kraftanalysekode. Se trinn 8.12 for detaljert bruk. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 6: Øv på data for kvantifisering av trekkraft. Et enkanals RGB-bilde av perlene i ubegrensede substrat- og enkanals tidsforløpstakk RGB-bilder av fluorescerende perler under en vekstkegle, EGFP og lysfelt. Se også figur 7 og 8. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Protokollene beskrevet i denne studien bruker kommersielt tilgjengelige materialer og mikroskopiutstyr som rutinemessig finnes i alle laboratorier, institutter og universiteter. Derfor kan etterforskere enkelt ta i bruk den nåværende enkeltflekkavbildningen og trekkraft kraftmikroskopi i studiene.

Flekkete avbildning kan analysere aktinpolymerisering og koblingskobling. I tillegg kan flekkete avbildning overvåke retrogradstrømmen av clutchmolekyler som shootin1 og cortactin, som samhandler med F-aktin retrograd strømning. Ved å bruke et TIRF-mikroskop kan den retrograde strømmen av celleadhesjonsmolekylet L1-CAM også overvåkes23,41; L1-CAM gjennomgår grep og skliatferd som gjenspeiler koblingseffektiviteten23,41. Selv om den nåværende studien benytter TMR-HaloTag-systemet for flekkete avbildning, er andre fluorescerende proteiner, som EGFP og monomerisk rødt fluorescerende protein, også tilgjengelig i analysen16,18,20,23,24,27,39. Det viktigste for å visualisere aktinflekker er et lavt uttrykksnivå av fluorescerende aktin og belysningen av et minimumsområde (figur 2). I denne protokollen innhentes Signalene Lifeact og HaloTag-actin sekvensielt. Fordi aktin retrograd strømning er relativt langsom (4,5 ± 0,1 μm/min)24, er analysen av F-aktin retrograd strømning og aktinpolymerisering upåvirket av sekvensiell bildeinnhenting av forskjellige fluorescerende kanaler (~1 s intervall). Lifeact er en mye brukt F-aktinmarkør, men kan konkurrere med aktinbindende proteiner47. Av ytterligere betydning kan Lifeact endre aktindynamikk, og dermed påvirke F-aktinstrukturer og cellemorfologien47,48,49.

Trekkraft mikroskopi kan oppdage krefter for å drive vekst kjegle forhånd. Ved å montere nevronene i en ekstracellulær matrise, kan etterforskere også analysere krefter generert i et semi-3D-miljø11. Høyforstørrelsesavbildning er viktig for nøyaktig kvantifisering av trekkraft fordi vekstkjegler genererer svake trekkraftkrefter7. Selv om andre metoder med nanopillarer eller stressfølsomme biosensorer også brukes til å måle trekkraft force50,51, er PAA gelbasert metode svært tilpasningsdyktig og muliggjør justering av substratstivitet ved å variere konsentrasjonene av akrylamid og bis-akrylamid41,44,52. I denne protokollen fremstilles PAA gel ved en endelig konsentrasjon på 3,75% akrylamid og 0,03% bis-akrylamid; Youngs modulus er ~ 270 Pa22 og denne stivheten er innenfor rekkevidden av hjernevev (100-10,000 Pa)53,54,55. På grunn av tykkelsen på PAA gel (~ 100 μm), begrenser denne metoden bruken av høyforstørrelseslinser under mikroskopi. For å få bilder med høy forstørrelse, bør undersøkere bruke zoomfunksjonen i et konfokalt mikroskop for laserskanning.

Avslutningsvis muliggjør dagens flekkavbildning og trekkraftmikroskopi kvantitative analyser av de viktigste hendelsene i kraftgenerasjoner. Denne informasjonen vil være uvurderlig for å forbedre forståelsen av mekanismene som ligger til grunn for vekstkjegleutvikling og navigasjon.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble delvis støttet av AMED under tilskuddsnummer 21gm0810011h0005 (N.I. og Y.S.), JSPS KAKENHI (JP19H03223, N.I.) og JSPS Grants-in-Aid for forskere i tidlig karriere (JP19K16258, T.M.), Osaka Medical Research Foundation for Uhelbredelige sykdommer (T.M.), og NAIST Next Generation Interdisciplinary Research Project (Y.S.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% trypan blue stain solution Nacalai 29853-34
3-aminopropyltrimethyoxysilane Sigma 281778-100ML
Acrylamide monomer Nacalai 00809-85
Ammonium persulphate Cytiva 17-1311-1
Axio Observer Z1 Zeiss 431007-9902-000 Epi-fluorescence microscope (single speckle imaging)
B-27 supplement (50x) Thermo Fisher Scientific 17504-044
Bovine serum albmine Sigma A7906-10G
C-Apochromat 63x/1.2 W Corr Zeiss 421787-9970-799 Objective lens (traction force microscopy)
Coverslip (diameter 18 mm) Matsunami C018001
D-glucose Nacalai 16806-25
DNaseI Sigma DN25-100MG
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 10270-106
Fiji Open source software package https://imagej.net/software/fiji/
FluoSpheres carboxylate-modified 0.2 mm, red (580/605), 2% solid Thermo Fisher Scientific F8810 carboxylate-modified microspheres
Glass bottom dish (14 mm diameter) Matsunami D1130H
Glass bottom dish (27 mm diameter) Matsunami D1140H
Glutaraldehyde solution Sigma G5882-10X10ML
HaloTag TMR ligand Promega G8251
HBO103 W/2 Osram 4050300382128 Mercury lamp (single speckle imaging)
Image Processing Toolbox MathWork https://www.mathworks.com/products/image.html
Laminin solution from mouse EHS tumor Wako 120-05751
Leibovitz’s L-15 medium Thermo Fisher Scientific 11415064
L-glutamine Nacalai 16919-42
LSM710 Zeiss N/A Conforcal laser microscope (traction force microscopy)
MATLAB2018a MathWork https://www.mathworks.com/products/new_products/release2018a.html
Mouse C57BL/6 Japan SLC N/A
Mouse neuron nucleofector kit Lonza VPG-1001
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) Nacalai 33401-72
N,N’-methylenebisacrylamide Nacalai 22402-02
Neurobasal medium Thermo Fisher Scientific 21103-049
Nucleofector I Amaxa AAD-1001 Electroporation apparatus
ORCA Flash 4.0 V2 Hamamatsu C11440-22CU CMOS camera (single speckle imaging)
Papain Nacalai 26036-34
Parallel Computing Toolbox MathWork https://www.mathworks.com/products/parallel-computing.html
pEGFP-C1 Clontech 1528177
Penicillin-streptomycin (100x) Nacalai Tesque 26253-84
pFN21A-HaloTag-actin (Minegishi et al., 2018) N/A
Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 (10x) Thermo Fisher Scientific 70011-044
Plan-Apochromat 100x/1.4 Oil Zeiss 420790-9901-000 Objective lens (single speckle imaging)
pmNeonGreen-N1-Lifeact (Kastian et al., 2021) N/A
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma P6407-5MG
Slulfo-SAMPHA Thermo Fisher Scientific 22589
Sodium dodecyl sulfate Nacalai 08933-05
Sodium hydrate (NaOH) Nacalai 31511-05
Steel ball Sako tekkou N/A Microshpere to determin PAA gel rigidity. 0.6 mm diameter, 7.87 g/cm3.
ZEN2009 Zeiss https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction Image acquisition software (traction force microscopy)
ZEN2012 Zeiss https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction Image acquisition software (single speckle imaging)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. TessierLavigne, M., Goodman, C. S. The molecular biology of axon guidance. Science. 274, 1123-1133 (1996).
  2. Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 001834 (2010).
  3. Vitriol, E. A., Zheng, J. Q. Growth cone travel in space and time: the cellular ensemble of cytoskeleton, adhesion, and membrane. Neuron. 73 (6), 1068-1081 (2012).
  4. Cooper, J. A. Cell biology in neuroscience: mechanisms of cell migration in the nervous system. Journal of Cell Biology. 202, 725-734 (2013).
  5. Dupraz, S., et al. RhoA controls axon extension independent of specification in the developing brain. Current Biology. 29, 3874-3886 (2019).
  6. Suter, D. M., Miller, K. E. The emerging role of forces in axonal elongation. Progress in Neurobiology. 94, 91-101 (2011).
  7. Franze, K. Integrating chemistry and mechanics: the forces driving axon growth. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 61-83 (2020).
  8. Mitchison, T., Kirschner, M. Cytoskeletal dynamics and nerve growth. Neuron. 1, 761-772 (1988).
  9. Suter, D. M., Forscher, P. Substrate-cytoskeletal coupling as a mechanism for the regulation of growth cone motility and guidance. Journal of Neurobiology. 44, 97-113 (2000).
  10. Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 332-343 (2009).
  11. Minegishi, T., et al. Shootin1b mediates a mechanical clutch to produce force for neuronal migration. Cell Reports. 25, 624-639 (2018).
  12. Minegishi, T., Inagaki, N. Forces to drive neuronal migration steps. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 863 (2020).
  13. Forscher, P., Smith, S. J. Actions of cytochalasins on the organization of actin filaments and microtubules in a neuronal growth cone. Journal of Cell Biology. 107, 1505-1516 (1988).
  14. Suter, D. M., Forscher, P. An emerging link between cytoskeletal dynamics and cell adhesion molecules in growth cone guidance. Current Opinion in Neurobiology. 8, 106-116 (1998).
  15. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112, 453-465 (2003).
  16. Waterman-Storer, C. M., Desai, A., Bulinski, J. C., Salmon, E. D. Fluorescent speckle microscopy, a method to visualize the dynamics of protein assemblies in living cells. Current Biology. 8, 1227-1230 (1998).
  17. Katoh, K., Hammar, K., Smith, P. J., Oldenbourg, R. Birefringence imaging directly reveals architectural dynamics of filamentous actin in living growth cones. Molecular Biology of the Cell. 10, 197-210 (1999).
  18. Watanabe, N., Mitchison, T. J. Single-molecule speckle analysis of actin filament turnover in lamellipodia. Science. 295, 1083-1086 (2002).
  19. Medeiros, N. A., Burnette, D. T., Forscher, P. Myosin II functions in actin-bundle turnover in neuronal growth cones. Nature Cell Biology. 8, 215-226 (2006).
  20. Shimada, T., et al. Shootin1 interacts with actin retrograde flow and L1-CAM to promote axon outgrowth. Journal of Cell Biology. 181, 817-829 (2008).
  21. He, M., Zhang, Z. H., Guan, C. B., Xia, D., Yuan, X. B. Leading tip drives soma translocation via forward F-actin flow during neuronal migration. Jounal of Neuroscience. 30, 10885-10898 (2010).
  22. Toriyama, M., Kozawa, S., Sakumura, Y., Inagaki, N. Conversion of a signal into forces for axon outgrowth through Pak1-mediated shootin1 phosphorylation. Current Biology. 23, 529-534 (2013).
  23. Abe, K., et al. Grip and slip of L1-CAM on adhesive substrates direct growth cone haptotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 2764-2769 (2018).
  24. Baba, K., et al. Gradient-reading and mechano-effector machinery for netrin-1-induced axon guidance. Elife. 7, 34593 (2018).
  25. Nichol, R. I., Hagen, K. M., Lumbard, D. C., Dent, E. W., Gomez, T. M. Guidance of axons by local coupling of retrograde flow to point contact adhesions. Journal of Neuroscience. 36, 2267-2282 (2016).
  26. Shekarabi, M., et al. Deleted in colorectal cancer binding netrin-1 mediates cell substrate adhesion and recruits Cdc42, Rac1, Pak1, and N-WASP into an intracellular signaling complex that promotes growth cone expansion. Journal of Neuroscience. 25, 3132-3141 (2005).
  27. Kubo, Y., et al. Shootin1-cortactin interaction mediates signal-force transduction for axon outgrowth. Journal of Cell Biology. 210, 663-676 (2015).
  28. Huber, A. B., Kolodkin, A. L., Ginty, D. D., Cloutier, J. F. Signaling at the growth cone: ligand-receptor complexes and the control of axon growth and guidance. Annual Review of Neuroscience. 26, 509-563 (2003).
  29. Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, 001727 (2011).
  30. Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128, 29-43 (2007).
  31. Tatavarty, V., Kim, E. J., Rodionov, V., Yu, J. Investigating sub-spine actin dynamics in rat hippocampal neurons with super-resolution optical imaging. PLoS One. 4, 7724 (2009).
  32. Frost, N. A., Shroff, H., Kong, H., Betzig, E., Blanpied, T. A. Single-molecule discrimination of discrete perisynaptic and distributed sites of actin filament assembly within dendritic spines. Neuron. 67, 86-99 (2010).
  33. Chazeau, A., et al. Nanoscale segregation of actin nucleation and elongation factors determines dendritic spine protrusion. EMBO Journal. 33, 2745-2764 (2014).
  34. Garcia, M., et al. Two-tiered coupling between flowing actin and immobilized N-cadherin/catenin complexes in neuronal growth cones. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 6997-7002 (2015).
  35. Swaminathan, V., et al. Actin retrograde flow actively aligns and orients ligand-engaged integrins in focal adhesions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 10648-10653 (2017).
  36. Tsai, T. Y., et al. Efficient front-rear coupling in neutrophil chemotaxis by dynamic myosin II localization. Developmental Cell. 49, 189-205 (2019).
  37. Zhang, X. F., et al. Regulation of axon growth by myosin II-dependent mechanocatalysis of cofilin activity. Journal of Cell Biology. 218 (7), 2329-2349 (2019).
  38. Reversat, A., et al. Cellular locomotion using environmental topography. Nature. 582, 582-585 (2020).
  39. Katsuno, H., et al. Actin migration driven by directional assembly and disassembly of membrane-anchored actin filaments. Cell Reports. 12, 648-660 (2015).
  40. Urasaki, A., et al. Shootins mediate collective cell migration and organogenesis of the zebrafish posterior lateral line system. Scientific Reports. 9, 12156 (2019).
  41. Abe, K., et al. Mechanosensitive axon outgrowth mediated by L1-laminin clutch interface. Biophysical Journal. 120, 3566-3576 (2021).
  42. Kastian, R. F., et al. Shootin1a-mediated actin-adhesion coupling generates force to trigger structural plasticity of dendritic spines. Cell Reports. 35, 109130 (2021).
  43. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
  44. Chan, C. E., Odde, D. J. Traction dynamics of filopodia on compliant substrates. Science. 322, 1687-1691 (2008).
  45. Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
  46. Li, Y., Hu, Z., Li, C. New method for measuring poisson's ratio in polymer gels. Journal of Applied Polymer Science. 50, 1107-1111 (1993).
  47. Belyy, A., Merino, F., Sitsel, O., Raunser, S. Structure of the Lifeact-F-actin complex. PLoS Biology. 18, 3000925 (2020).
  48. Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour. Scientific Reports. 9, 3241 (2019).
  49. Kumari, A., Kesarwani, S., Javoor, M. G., Vinothkumar, K. R., Sirajuddin, M. Structural insights into actin filament recognition by commonly used cellular actin markers. EMBO Journal. 39, 104006 (2020).
  50. du Roure, O., et al. Force mapping in epithelial cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2390-2395 (2005).
  51. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466, 263-266 (2010).
  52. Koch, D., Rosoff, W. J., Jiang, J., Geller, H. M., Urbach, J. S. Strength in the periphery: growth cone biomechanics and substrate rigidity response in peripheral and central nervous system neurons. Biophysical Journal. 102 (3), 452-460 (2012).
  53. Barnes, J. M., Przybyla, L., Weaver, V. M. Tissue mechanics regulate brain development, homeostasis and disease. Journal of Cell Science. 130, 71-82 (2017).
  54. Moore, S. W., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. Stretchy proteins on stretchy substrates: the important elements of integrin-mediated rigidity sensing. Developmental Cell. 19, 194-206 (2010).
  55. Tyler, W. J. The mechanobiology of brain function. Nature Reviews Neuroscience. 13, 867-878 (2012).

Tags

Nevrovitenskap Utgave 176 vekstkjegle aktin retrograd strømning clutchmolekyl celleadhesjonsmolekyl enkeltflekkavbildning trekkraftmikroskopi nevronmigrasjon axonveiledning
Analyser av Actin Dynamics, ClutchKobling og Trekkraft Force for Growth Cone Advance
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Minegishi, T., Fujikawa, R.,… More

Minegishi, T., Fujikawa, R., Kastian, R. F., Sakumura, Y., Inagaki, N. Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance. J. Vis. Exp. (176), e63227, doi:10.3791/63227 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter