Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Herstellung und quantitative Messung von freiem und proteingebundenem Arginin und Methyl-Argininen mittels 1H-NMR-Spektroskopie.
Abstract
Proteingebundenes Arginin ist häufig in vielen Proteinen methyliert und reguliert ihre Funktion, indem es die physikalisch-chemischen Eigenschaften und ihre Wechselwirkung mit anderen Molekülen, einschließlich anderer Proteine oder Nukleinsäuren, verändert. Diese Arbeit stellt ein leicht implementierbares Protokoll zur Quantifizierung von Arginin und seinen Derivaten vor, einschließlich asymmetrischem und symmetrischem Dimethylarginin (ADMA bzw. SDMA) und Monomethylarginin (MMA). Nach der Proteinisolierung aus biologischen Körperflüssigkeiten, Geweben oder Zelllysaten wird eine einfache Methode zur Homogenisierung, Fällung von Proteinen und Proteinhydrolyse beschrieben. Da die Hydrolysate viele weitere Komponenten enthalten, wie z.B. andere Aminosäuren, Lipide und Nukleinsäuren, ist ein Reinigungsschritt mittels Festphasenextraktion (SPE) unerlässlich. SPE kann entweder manuell mit Zentrifugen oder einem Pipettierroboter durchgeführt werden. Die Empfindlichkeit für ADMA nach dem aktuellen Protokoll liegt bei etwa 100 nmol/L. Die obere Nachweisgrenze für Arginin liegt aufgrund der SPE-Sättigung bei 3 mmol/L. Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll eine robuste Methode, die von der biologischen Probenvorbereitung bis zum NMR-basierten Nachweis reicht und wertvolle Hinweise und Fallstricke für eine erfolgreiche Arbeit bei der Untersuchung des Arginin-Methyloms liefert.
Introduction
In den letzten zwei Jahrzehnten wurde die Methylierung von Argininresten als wesentliche posttranslationale Modifikation von Proteinen erkannt. Es beeinflusst grundlegende biologische Prozesse wie die Regulation der Transkription, die Signaltransduktion und vieles mehr1. Die Hauptproteine, die an der Regulation der Arginin-Methylierung beteiligt sind, sind Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMTs)2. Die wichtigsten Derivate von Arginin sind ω-(N G,N G)-asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA), ω-(N G,N'G)-symmetrisches Dimethylarginin (SDMA) und ω-N G-Monomethylarginin (MMA)2.
PRMTs verwenden S-Adenosyl-l-Methionin, um Methylgruppen auf die terminale Guanidinogruppe (mit zwei äquivalenten Aminogruppen) des proteingebundenen Arginins1 zu übertragen. Zwei Hauptenzyme können unterschieden werden: Sowohl Typ-I- als auch Typ-II-Enzyme katalysieren den ersten Methylierungsschritt zur Bildung von MMA (das dadurch seine Symmetrie verliert). Nach diesem Schritt verwenden Typ-I-Enzyme (z. B. PRMT1, 2, 3, 4, 6, 8) MMA als Substrat zur Bildung von ADMA, während Typ-II-Enzyme (hauptsächlich PRMT5 und PRMT9) SDMA produzieren. PRMT1 war das erste Protein Arginin-Methyltransferase, das aus Säugetierzellen isoliert wurde3. Dennoch wurden PRMTs evolutionär konserviert4 in anderen Tieren wie Nicht-Säugetier-Wirbeltieren, wirbellosen Chordatieren, Stachelhäutern, Arthropoden und Nematoden Nesseltiere5, Pflanzen6 und Protozoen, einschließlich Pilzen wie Hefe7. In vielen Fällen führt der Knockout eines der PRMTs zum Verlust der Lebensfähigkeit, was die wesentliche Rolle methylierter Argininspezies aufzeigt, die an grundlegenden zellulären Prozessen wie Transkription, Translation, Signaltransduktion, Apoptose und Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (d.h. der Bildung membranloser Organellen, z. B. Nukleolen) beteiligt sind, an denen regelmäßig Arginin-reiche Domänen beteiligt sind 8,9,10 . Dies wiederum beeinflusst die Physiologie und die Krankheitszustände, einschließlich Krebs 11,12,13, multiples Myelom 14, Herz-Kreislauf-Erkrankungen15, virale Pathogenese, spinale Muskelatrophie 16, Diabetes mellitus 17 und Alterung1. Es wird angenommen, dass erhöhte ADMA-Spiegel im Blutkreislauf, z. B. aus der Lunge18 aufgrund eines Proteinabbaus, mit endothelialer Dysfunktion, chronischer Lungenerkrankung19 und anderen Syndromen von Herz-Kreislauf-Erkrankungen20 verbunden sind. Es wurde festgestellt, dass eine Überexpression von PRMTs die Tumorentstehung beschleunigt und mit einer schlechten Prognose verbunden ist21,22. Außerdem löst die Ablation von PRMT6 und PRMT7 einen zellulären Seneszenz-Phänotyp23 aus. Eine signifikante Abnahme von ADMA und PRMT1 wurde während der Alterung von WI-38-Fibroblastengefunden 24.
Die Herausforderung besteht darin, zu verstehen, wie die Methylierung in (patho)physiologischen Prozessen wirkt, indem sie die Protein-Arginin-Methylierung identifiziert und quantifiziert. Die meisten aktuellen Ansätze verwenden Antikörper, um methylierte Arginine nachzuweisen. Diese Antikörper sind jedoch immer noch kontextspezifisch und können möglicherweise verschiedene Motive von Arginin-methylierten Proteinen nicht erkennen25,26. In dem beschriebenen Protokoll können alle oben genannten Arginin-Derivate zuverlässig durch Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) quantifiziert werden, d.h. allein, in Kombination oder, wie in den meisten Fällen, innerhalb komplexer biologischer Matrices wie eukaryotischen Zellen (z.B. aus Hefe, Maus oder menschlichem Ursprung) und Geweben27 sowie Serum28. Für Proteine und diese komplexen Matrices ist die Proteinhydrolyse29 eine Voraussetzung, um freie (modifizierte) Aminosäuren wie Arginin, MMA, SDMA und ADMA zu erzeugen. Die Festphasenextraktion (SPE)30 ermöglicht die Anreicherung der interessierenden Verbindungen. Schließlich ermöglicht die 1-H-NMR-Spektroskopie den parallelen Nachweis von Arginin und allen wichtigen Methylderivaten von Arginin. Die NMR-Spektroskopie hat den Vorteil, dass sie wirklich quantitativ, hoch reproduzierbar und eine robuste Technik ist31,32. Die abschließenden NMR-Messungen können anschließend durchgeführt werden, wenn viele Proben entnommen und vorbereitet wurden. Schließlich konzentriert sich dieses Protokoll hauptsächlich auf die Probenvorbereitung, da hierfür kein eigenes NMR-Spektrometer erforderlich ist. Es kann in den meisten biochemischen Laboratorien durchgeführt werden. Dennoch werden in dieser Arbeit einige Hinweise gegeben, welche NMR-Spektroskopie-Messungen durchgeführt werden sollten.
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Protocol
Hefeproteinhydrolysate wurden als Proben für die repräsentativen Ergebnisse dieser Arbeit verwendet. Das gesamte Protokoll ist in Abbildung 1 zusammengefasst.
1. Aufbereitung von Materialien und Reagenzien
- Methanol/Wasser: Herstellen einer Mischung aus zwei Teilen 99%igem Methanol (MeOH) und einem Teil H2O, bezeichnet als MeOH/H2O. LagernSie reines MeOH und MeOH/H2Obei -20 °C, um die Alkoholverdampfung zu minimieren und die Probenstabilität zu erhöhen.
- Salzsäure (HCl): 9 mol/L aus konzentriertem HCl (12,0 mol/L oder 37%) sowie 0,1 mol/L HCl verdünnen. Die höher konzentrierte (9 mol/L) Lösung wird für die Proteinhydrolyse verwendet, während die niedriger konzentrierte (0,1 mol/L) für die Festphasenextraktion verwendet wird.
VORSICHT: Arbeiten Sie innerhalb des Abzugs. - Bereiten Sie eine Ersatzlösung für SPE vor, die 10 % gesättigte Ammoniaklösung (Bestand: 30 % Gew.-% Ammoniak), 50 % Methanol und 40 % Wasser (v/v) enthält.
- NMR-Puffer: 5,56 g Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4, 0,08 mol/L), 0,4 g 3-(Trimethylsilyl)propionsäure-2,2,3,3-d4-Natriumsalz (TSP, 5 mmol/L), 0,04 % (w/v) Natriumazid (NaN3) in 500 mL Deuteriumdioxid (D2O) lösen und auf pH 7,4 einstellen (unter Verwendung von HCl oder NaOH, (siehe Materialtabelle). Überprüfen Sie die Reinheit jeder neuen Puffercharge durch NMR-Spektroskopie.
HINWEIS: Die Menge an Verunreinigungen (z. B. Ethanol) sollte so gering wie möglich sein. - Füllen Sie die Auflöseröhrchen mit Zirkonoxidkügelchen (2 ml Röhrchen und 1,4 mm Kügelchen sind für die meisten Anwendungen geeignet, es sind jedoch verschiedene Varianten erhältlich) (siehe Materialtabelle). Füllen Sie ca. 10-20 Perlen von Hand oder kaufen Sie vorgefüllte Röhrchen, die ebenfalls erhältlich sind.
- Halten Sie Pipetten und die entsprechenden Spitzen im Bereich von 10-1.000 μL bereit.
ANMERKUNG: Während der gesamten Arbeiten wurde hochreines Wasser verwendet, das alsH2O bezeichnetwird und sich durch einen hohen Widerstand von ≥18,2 MΩ·cm-1 auszeichnet. Es entspricht doppelt destilliertem Wasser.
2. Probenentnahme und Lagerung
- Die flüssigen Proben (Serum/Plasma, Zellkulturüberstand etc.) werden mit flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert.
- Bereiten Sie die festen Materialien wie unten beschrieben vor.
- Sammeln Sie die Zellen aus Zellkulturen (3-5 Millionen Zellen) entweder durch Sammeln adhärenter Zellen, nach dem Waschen mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung, dem Abkratzen und Zentrifugieren oder dem direkten Zentrifugieren von Zellen, die in Suspension gezüchtet wurden.
- Die Zellüberstände (die für weitere Analysen gesammelt werden können, entweder durch aufeinanderfolgende direkte Messung, siehe Schritt 6, oder nach Fällung löslicher Proteine, siehe Schritt 3.1), werden entfernt, die Pellets werden mit flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C gelagert. Zur weiteren Verarbeitung siehe Schritt 3.2.
- Lagerung und Sammlung der Gewebe gemäß dem Ziel der Studie. Bei sehr homogenen Geweben, wie Leber oder Muskeln, analysieren Sie einen Teil davon. Bestimmen Sie beispielsweise im Falle eines Mäusegehirns die globale Arginin-Methylierung des gesamten Gehirns oder der Gehirnabschnitte.
HINWEIS: Das Idealgewicht der zu verarbeitenden Gewebe beträgt 30-60 mg. Es ist ratsam, das gesamte Gehirn einzufrieren und zu pulverisieren und Aliquots davon zu verwenden. Alternativ können bestimmte Gehirnteile (z. B. Stirn-, Kleinhirn-, Okzipitalregionen oder eine Hemisphäre mit einem Gewicht von ~ 250 mg) verwendet werden.
3. Vorprobenvorbereitung
HINWEIS: Führen Sie die Arbeit auf Eis durch und halten Sie MeOH kalt. Die Proben müssen auch auf Eis gehalten werden, um einen Proteinabbau zu vermeiden.
- Bei flüssigen Proben werden 400 μl eiskaltes Methanol zu 200 μl der Probe gegeben. Fahren Sie mit Schritt 3.3 fort.
HINWEIS: Wenn weniger Probe verfügbar ist, passen Sie die Lautstärken entsprechend an. Die NMR-Empfindlichkeit ist in der Regel für kleinere Probenmengen hoch genug, muss aber individuell getestet werden. - Bei Feststoffen sind ausreichend 1,5-ml-Röhrchen für die Lysate vorzubereiten (Verwendung für die Zentrifugation nach der Homogenisierung).
- Vorsichtig, aber gründlich werden die Zellpellets in 600 μL MeOH/H2Oresuspendiert und die gesamte flüssige Phase in die Aufschlussröhrchen überführt.
- Legen Sie die Tücher in die Aufschlussröhrchen (Sie können sie direkt in die Röhrchen wiegen) und fügen Sie 600 μL MeOH / H2O hinzu (für 30-60 mg; anpassen, wenn das Gewicht erheblich abweicht).
- Die Röhrchen werden in den Gewebehomogenisator (siehe Materialtabelle) gegeben und entweder einmal für 20 s mit starkem Schütteln (für Zellpellets, Weichteile) oder zweimal für jeweils 20 s (oder länger, falls erforderlich) mit einem Abstand von 5 min dazwischen (für steife Gewebe) homogenisiert.
- Nach der Homogenisierung werden die Proben sofort wieder auf das Eis gelegt und die gesamten Lysate in neue 1,5-ml-Röhrchen überführt.
- Lagern Sie die Proben für mindestens 30 Minuten (bis zu mehreren Tagen) bei -20 °C, bevor sie weiterverarbeitet werden.
- Zentrifuge bei 10.000 x g für 30 min bei 4 °C. Bereiten Sie in der Zwischenzeit genügend 1,5-ml-Röhrchen vor, um die Überstände zu sammeln.
HINWEIS: Dieser Überstand (in Abbildung 1 als "( 1)" bezeichnet) kann verworfen, lyophilisiert und direkt für NMR verarbeitet werden (Schritt 6) oder anderweitig analysiert werden. - In diesem Protokoll wird der MeOH-Niederschlag (= Pellet, das nach Schritt 3.1 bzw. 3.2.2 erhalten wird) für weitere Analysen verwendet, die unter anderem Komponenten wie Nukleinsäuren und Lipide, Arginin-methylierte Proteine, enthalten. Fahren Sie mit der Proteinhydrolyse fort oder lagern Sie die Pellets einige Tage bei -20 °C.
4. Proteinhydrolyse
- Fügen Sie jeder Probe 500 μL 9 mol/l HCl hinzu. Schneiden Sie dann die Kappen jedes Röhrchens mit einer Schere ab und setzen Sie sie in die Glaskulturröhrchen ein (Abbildung 2A). Verschließen Sie die roten Kappen vorsichtig, aber fest (und überprüfen Sie so die Versiegelung).
HINWEIS: Überprüfen Sie vor dem Gebrauch immer jede Versiegelung (graue PTFE-Folie in den roten Schraubverschlüssen) auf ordnungsgemäßes Festziehen und reinigen Sie sie regelmäßig mit Wasser. - Wenn Sie fertig sind, legen Sie die Röhrchen in ein teilweise mit Sand gefülltes Becherglas (für eine bessere Wärmeübertragung) und hydrolysieren Sie die Proben für ca. 16 h bei 110 °C in einer Trockenkammer.
- Nach der Hydrolyse werden die Proben abgekühlt (~1 h).
- Danach wird über Nacht mit einer Zentrifuge im Hochvakuum (unter 100 Pa) lyophilisiert.
- Die Pellets werden - wenn sie vollständig getrocknet sind (wenn nicht, setzen Sie die Lyophilisation fort) - in 1 ml 0,1 mol/L HCl gelöst und 50 μL Chloroform (CHCl 3) in jedes Röhrchen gegeben. das Pellet mit einer 1.000 μL Pipette gründlich auflösen, dabei die Flüssigkeiten vermischen, und anschließend das komplette Volumen in ein neues Röhrchen überführen.
VORSICHT: Arbeiten Sie immer mit kleinen Mengen, um eine starke Verdunstung zu minimieren. - Anschließend wird bei 8.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugiert.
- Die obere Phase der zweiphasigen Flüssigkeit, die die wasserlösliche Fraktion enthält (Abbildung 2B, die Fraktion mit der geringsten Dichte), wird vorsichtig mit einer Pipette gesammelt und in neue Röhrchen gefüllt. Verwenden Sie 1,5-ml-Röhrchen für manuelle SPE (Abschnitt 5.2) oder Glasfläschchen für Roboter-SPE (Abschnitt 5.3 und Abbildung 2D). Vermeiden Sie das Verschütten vonCHCl 3 und seinem Inhalt (Abbildung 2C).
5. Festphasenextraktion (SPE)
- Reinigen Sie die SPE-Kartuschen vor dem ersten Gebrauch zweimal mit 1 ml der Ersatzlösung (Schritt 1.3), gefolgt von einer Zentrifugation bei 800 x g für 1 min bei Raumtemperatur (in 15-ml-Röhrchen). Sie können jeweils 10-20 Mal verwendet werden.
- Manuelle SPE
- Die Kartuschen (siehe Materialtabelle) werden bei jedem Durchlauf mit 1 ml reinem Methanol und 2 x 1 ml PBS vorkonditioniert, jeweils gefolgt von einer Zentrifugation bei 800 x g für 1 min bei Raumtemperatur (in 15 ml Röhrchen).
- Danach werden die Proben (aus Schritt 4.7) auf die SPE-Kartuschen geladen und bei 600 x g für 2 min bei Raumtemperatur zentrifugiert.
- Wenden Sie dann einen Waschgang an, wie unten beschrieben.
- Dreimal 1 mlH2Ozugeben (jeweils gefolgt von Zentrifugation für 1 min bei 800 x g bei Raumtemperatur).
- Fünfmal 1 ml 0,1 mol/L HCl zugeben (jeweils gefolgt von Zentrifugation für 1 min bei 800 x g bei Raumtemperatur).
- Geben Sie zweimal 1 ml MeOH hinzu (jeweils gefolgt von einer Zentrifugation für 1 min bei 800 x g bei Raumtemperatur).
- Dann werden Arginin und seine Derivate mit 3 x 1 ml Ersatzlösung (gefolgt von Zentrifugation 1 min bei 800 x g bei Raumtemperatur) in ein einzelnes 15-ml-Röhrchen eluiert.
HINWEIS: Die Ersatzlösung dient als Elutionsmittel für Arginin und Derivate und wird auch zur Reinigung der Kartuschen verwendet (alle Substanzen werden entweder vor der Elution oder beim basischen pH-Wert der Ersatzlösung ausgewaschen). Um eine Kontamination im Laufe der Zeit zu vermeiden, sollte die Wiederverwendung jedoch begrenzt werden (siehe Schritt 5.1).
- Roboter-SPE
HINWEIS: Hier wird ein Pipettierroboter (der Hauptteil besteht aus einer Pipettiernadel, einer Waschstation für die Nadel, einer Reagenzienversorgung und Positionen für Proben und Eluate, siehe Materialtabelle) mit einem Kartuschenhalter für die SPE-Säulen geliefert. Stellen Sie bei anderen Instrumenten sicher, dass Sie mit allen aufgeführten Dingen ausgestattet sind.- Füllen Sie den Überstand (aus Schritt 4.7) direkt in Glasfläschchen mit PTFE-Versiegelung (Abbildung 2D), bereiten Sie genügend Reagenzien (jeweils 100 ml, d. h. Ersatzlösung, 99% MeOH, PBS,H2Ound 0,1 mol/L HCl), 5 ml-Röhrchen für die Elution und Waschlösung für die Nadel des Roboters (normalerweiseH2O) vor.
- Verwenden Sie eine Anwendung oder Methode in der Software des Roboters, die genau auf den Schritten basiert, die für die manuelle SPE (Schritt 5.2) beschrieben sind.
HINWEIS: Die Details können je nach Gerätelieferant sehr unterschiedlich sein, daher finden Sie im Software-Handbuch des jeweiligen Roboters Informationen zur Programmierung. Ein Pipettierroboter arbeitet normalerweise, indem er Luftdruck auf die Kartuschen ausübt, anstatt zu zentrifugieren, was der Hauptunterschied ist. Wenn das Protokoll erstellt und zum ersten Mal ausgeführt wird, schließen Sie Kontrollen (z. B. L-Arginin mit bekannter Konzentration) ein, um einen optimalen Arbeitsablauf zu überprüfen.
6. Abschließende Vorbereitung für die NMR
- Lyophilisieren Sie die Proben über Nacht, um die Trocknung zu vervollständigen, um Ammoniak und H2O loszuwerden.
- Jede Probe wird in 500 μL NMR-Puffer gelöst (Schritt 1.4) und in NMR-Röhrchen überführt. Wichtig ist, dass das Volumen in allen Röhrchen gleich ist und die Proben homogen sind (frei von Rückständen und Lipiden, die zur Aggregation neigen).
ANMERKUNG: Die Einzelheiten der NMR-Spektroskopie gehen über diese Methodenübersicht hinaus und werden an anderer Stelle27 ausführlicher beschrieben. Hier werden nur die wichtigsten Anforderungen und Schritte erläutert. Die Quantifizierung von Arginin und seinen Metaboliten erfolgt auf einem 600 MHz NMR-Spektrometer (siehe Materialtabelle). Prinzipiell können beliebige andere NMR-Spektrometer/NMR-Feldstärken verwendet werden, sofern die NMR-Signale von Arginin und methylierten Argininen mit ausreichender Empfindlichkeit und ohne Signalüberlappung detektiert werden können. Jeder Sondenkopf mit z-Achsen-Gradienten, der 1H-Spektren aufzeichnen kann, kann verwendet werden, sofern die Pulssequenzen entsprechend eingestellt sind. - Aufnahme eines 1D-Spektrums mit der CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill) Pulssequenz33,34 (cpmgpr1d, 512 Scans, Größe von fid 73728, 11904,76 Hz spektrale Breite auf einem 600 MHz NMR, Recyclingverzögerung 4 s) mit Wassersignalunterdrückung mittels Präsättigung.
- Entfernen Sie in diesen Experimenten die 1-H-Skalarkopplungen durch virtuelle Entkopplung, wodurch die Signalüberlappung reduziert wird. Zeichnen Sie zusätzliche Spektren für spezifische Fragestellungen und/oder komplexe Proben oder Matrizen auf, z. B. 1 H-13C-heteronukleare Einzelquantenkohärenzspektren (HSQC)27.
ANMERKUNG: Für komplexere Matrices, in denen 1 H NMR-Signale von methylierten Argininen teilweise mit 1 H NMR-Signalen anderer Metaboliten (z. B. Lysin) überlappt werden können, sind 1H homonukleäre J-aufgelöste Spektren (JRES)35 erforderlich. - Führen Sie eine absolute Quantifizierung durch, indem Sie die jeweiligen Spitzenintensitäten von Standards einer bekannten Konzentration, z. B. 100 μmol/Arginin, integrieren.
HINWEIS: Routinemäßig werden ADMA, SDMA und MMA (siehe Materialtabelle) als Verhältnis zu Arginin angegeben. Dies hat den entscheidenden Vorteil, dass keine separate Normalisierung (z.B. Zellzahl, Gewebemasse, Proteinkonzentrationen) durchgeführt werden muss. In diesem Fall dient Arginin als interner Standard, und eine relative Quantifizierung ist ausreichend, um biologisch relevante Informationen zu erhalten. - Zur Differenzierung von SDMA und MMA werden die Proben erneut lyophilisiert, umD2Oloszuwerden (wenn sie zuvor in NMR-Puffer resuspendiert wurden), das dann durch deuteriertes Dimethylsulfoxid (d6-DMSO) ersetzt wird, was die Auflösung von Methylresonanzenermöglicht 27. Daher werden die Proben aus den NMR-Röhrchen mit Pasteur-Pipetten abgesaugt, lyophilisiert und in 500 μLd6-DMSO gelöst.
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Representative Results
Routinemäßig werden 1H 1D-Projektionen von 2D J-aufgelösten (JRES), virtuell entkoppelten NMR-Spektren für Peakzuordnungen und Quantifizierungen in unserem Laborverwendet 36. Abbildung 3 zeigt repräsentative JRES-Spektren von Hefeproteinhydrolysaten, die unter Verwendung des vorliegenden SPE-Protokolls gereinigt wurden. Wenn auch in sehr unterschiedlichen Konzentrationen, können beide Substanzen in einer zellulären Matrix getrennt und quantifiziert werden. Basierend auf der Anzahl der Protonen der spezifischen Methyl- (-CH3) oder Methylengruppe (-CH2-) bei der jeweiligen chemischen Verschiebung ermöglicht die 1-H-NMR-Spektroskopie eine präzise Quantifizierung. Wie im Protokoll (Schritt 0) dargelegt, ist die relative Quantifizierung eines Methyl-Arginin-Derivats im Vergleich zu Arginin hauptsächlich ausreichend, um biologische Prozesse zu beobachten, z.B. Veränderungen der Arginin-Methylierung als Reaktion auf Modulationen, wie z.B. Knock-down/Überexpression von Genen, Veränderungen der Nährstoffe oder Behandlung mit Inhibitoren.
Wie bereits27 gezeigt, können L-Arginin und ADMA durch ihre unterschiedlichen charakteristischen chemischen Verschiebungen bei 3,25 bzw. 3,02 ppm gut unterschieden werden. SDMA- und MMA-Methylprotonen zeigen überlappende Peaks inD2O(dem in Schritt 1.4 beschriebenen NMR-Puffer) bei einer chemischen Verschiebung von 2,85 ppm. Wenn an der jeweiligen Position ein Peak vorhanden ist, kann man SDMA und MMA trennen, indem man die Proben in d 6-DMSO auflöst, wie in Schritt6.6 des Protokolls beschrieben. Mit diesem Ansatz können die chemischen Verschiebungen der 1-H-NMR von SDMA und MMA getrennt und mit charakteristischen chemischen Verschiebungenbei 2,76 ppm (SDMA) und 2,74 ppm (MMA) quantifiziert werden27. Abbildung 3B zeigt repräsentative Daten von SDMA und MMA (beide 100 μmol/L) inD2Obzw. d6-DMSO. Entsprechende Daten von SMDA und MMA, die in verschiedenen Zellen und Geweben nachgewiesen wurden, wurden kürzlichberichtet 27. Wie in den Schritten 6.4-6.5 des Prüfplans beschrieben, können Referenzstandards bekannter Konzentrationen zur Quantifizierung verwendet werden. Alle im Text genannten Referenznormen sind im Handel erhältlich.
Abbildung 1: Überblick über die Probenvorbereitung. Schema, das die wesentlichen Schritte von der Probenentnahme bis zur NMR-Messung aufzeigt. Die schwarzen Kästchen verweisen auf die Nummerierung in den Protokollabschnitten. Zusätzlich wird die ungefähre Anzahl der Tage (abhängig von der Anzahl der Proben) angezeigt. Inhomogene flüssige Proben können vor Zugabe von MeOH zentrifugiert werden (Schritt 3.1), um die Rückstände zu entfernen (nicht dargestellt). Der Überstand nach anfänglicher Zentrifugation (1), der z. B. intrazelluläre Metaboliten oder nicht-proteingebundene Arginin-Metaboliten enthält, kann zur weiteren Analyse bei -20 °C gelagert werden. Routinemäßig werden die MeOH-Pellets (2) weiter analysiert. Abkürzungen: CHCl3, Chloroform; HCl, Salzsäure; MeOH, Methanol; NMR, Kernspinresonanz; o/n, über Nacht; SN, Überstand; SPE, Festphasenextraktion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Handhabung von Proteinhydrolysaten und Vorbereitung für die Festphasenextraktion. (A) Mit Sand gefülltes Becherglas, Glasröhrchen, Schraubverschlüsse mit grauer Polytetrafluorethylen (PTFE)-Dichtungsfolie und Proben in 1,5-ml-Röhrchen nach dem Abschneiden der Kappen. (B) Röhrchen nach Zentrifugation (Schritt 4.6) und (C) nach Entfernung des wässrigen Überstands (Schritt 4.7): etwas Restwasser (~ 50 μL) kann zurückbleiben. Der schwarze Rückstand enthält unlösliche, verkohlte organische Reste. Dennoch können einige Proben farbige Substanzen (D) enthalten, die die L-Arginin-Messung nicht stören. Dies ist zum Teil auf die anschließende Festphasenextraktion (SPE) zurückzuführen, entweder mit aufeinanderfolgenden Zentrifugationsschritten (E) oder einem Pipettierroboter (F). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Typische NMR-Spektren von L-Arginin und seinen Methylderivaten. 1 H 1D-projizierte J-aufgelöste NMR-Spektren konnten die δ-(CH2)-Protonen von L-Arginin (3,25 ppm) und die ω-N-CH-3-Protonen von asymmetrischem Dimethylarginin (ADMA, bei3,02 ppm) leicht unterscheiden. Proben von Hefepellets (A), die unterschiedliche Mengen an ADMA zeigen, können durch Integration von Signalintensitäten auch in Gegenwart hoher Mengen an Arginin quantifiziert werden (beachten Sie, dass der vollständige Arginin-Peak nicht gezeigt wird). (B) Da ω-(N G,N'G)-symmetrisches Dimethylarginin (SDMA) und ω-N G-Monomethylarginin (MMA) in Deuteriumoxidpuffer (D2O) kaum unterschieden werden können, müssen die Proben in deuteriertem Dimethylsulfoxid (d6-DMSO) gelöst werden, wobei die Peaks (in diesem Fall 100 μmol/L jeder Substanz) leicht voneinander unterschieden werden können (Peaks bei 2,75 und 2,76 ppm, bzw. quantifiziert werden. Alle Spektrogramme wurden direkt aus der Steuerungssoftware des NMR-Spektrometers exportiert. Die Software zeigt die primären Ergebnisse an, die überprüft werden müssen, bevor eine detailliertere Analyse, einschließlich Statistiken vieler Proben, durchgeführt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Im folgenden Abschnitt liegt das Hauptaugenmerk auf der Methode selbst; Die biologischen Implikationen der Arginin-Methylierung werden im Abschnitt Einleitung beschrieben.
Erstens können Gewebe mit unterschiedlicher Steifigkeit eine Anpassung der Probenlyse erfordern: Zellen aus Zellkulturen (einschließlich Bakterien, Hefe usw.) und Gewebe wie Gehirn, junge Leber, glatte Muskulatur usw. können schnell homogenisiert werden. Bei Geweben mit hoher Steifigkeit (einschließlich Leber älterer Probanden, Arterien, Knochen usw.) muss die Homogenisierung zweimal durchgeführt werden (siehe Schritt 3.2.3). Dennoch sollte dieser Prozess nicht öfter fortgesetzt werden, auch wenn einige unlösliche Reste übrig bleiben. Stattdessen sollten die Proben für 10 min bei 10.000 x g zentrifugiert und die Überstände zur weiteren Analyse gesammelt werden (um den Probenabbau zu minimieren).
Bei jedem Schritt, in dem die Proben eingefroren werden (zunächst nach Zugabe von MeOH, Schritte 3.3, 3.4 bzw. 3.5) oder nach der Gefriertrocknung (Schritte 4.4 und 6.1), können die Proben vor der Weiterverarbeitung einige Tage gelagert werden. Zusätzlich kann der Überstand aus Schritt 3.4 (nach der Homogenisierung; in Abbildung 1 als "(1)" bezeichnet) auch für weitere Analysen aufbewahrt werden, z. B. für die Messung anderer Metaboliten als Methyl-Arginine36,37,38.
Kritische Schritte sind zum einen die Lagerung von Proben, da der Abbau von Proteinen das Ergebnis verändern kann. Wenn der Proteinabbau vor der MeOH-Fällung stattfindet, können Arginin und seine Methylderivate unterschätzt werden. Daher ist die Lagerung von Proben unumgänglich, z.B. vor und nach der Zell- oder Gewebelyse bei -20 °C oder, wann immer möglich, bei -80 °C. Vor oder nach der Homogenisierung (Schritt 3.2) sollten die Proben auf Eis aufbewahrt werden.
Auf der anderen Seite verändert die Methanol-Vorbehandlung von Proben zur Ausfällung von Proteinen das Methylierungsmuster von Arginin nicht. Dies wurde mit Lysozym- und Escherichia coli-Proteinextrakten (die kein methyliertes Arginin enthalten) getestet27. Frühere Berichte haben jedoch gezeigt, dass MeOH die terminalen Carboxylgruppen von Glutamat und Aspartat39 methylieren kann.
Bei der Proteinhydrolyse ist darauf zu achten, dass die Dichtungen der Schraubverschlüsse intakt sind (Schritt 4.1). Ist dies nicht der Fall, kann die Verdunstung von HCl die Trockenkammer beeinträchtigen. Die Konzentration der Analyten kann jedoch nicht kritisch verändert werden, da sie nicht verdampfen und restliches HCl später durch Lyophilisation verdampft wird. Niedrigere HCl-Konzentrationen, z. B. 6 mol/l, können verwendet werden, erfordern jedoch möglicherweise eine längere Hydrolysezeit. Nach der Hydrolyse können die Proben bei Raumtemperatur behandelt werden. Die richtige Entfernung von Lipiden ist jedoch unerlässlich. Lipide können später während der NMR-Messung zweiphasige Gemische in Wasser (bzw.D2O) bilden. Diese Inhomogenitäten führen zu einer Verbreiterung der NMR-Peaks und beeinträchtigen möglicherweise die Qualität und Empfindlichkeit von NMR-Experimenten.
Wenn für SPE kein Pipettierroboter zur Verfügung steht, lohnt sich die Investition (er kann auch für andere Zwecke eingesetzt werden). Die Proben auf dem SPE-Pipettierroboter werden sequentiell verarbeitet, und im vorliegenden Setup benötigt eine Probe ~ 40 Minuten für einen vollständigen Durchlauf. Aufgrund begrenzter Reagenzienkapazitäten (d.h. 100 ml) können nur 19 Proben auf einmal verarbeitet werden (insgesamt ~ 13 h). Dennoch ist die Hands-on-Zeit viel kürzer als beim manuellen SPE-Verfahren und erfordert weniger Material. Während dieser Zeit können die Proben bis zur Gefriertrocknung bei Raumtemperatur im Roboter gelagert werden. Gleichwertige Produkte können die verwendeten SPE-Matrizen und Kartuschen ersetzen. Dennoch empfiehlt es sich, das SPE-Protokoll zu evaluieren und gegebenenfalls anzupassen.
Die Nachweisgrenze für ADMA liegt bei ~100 nmol/L, wie zuvor durch serielle Verdünnungen und unter Verwendung der angegebenen NMR-Messzeiten ermittelt. Auf der anderen Seite können hohe Arginin-Konzentrationen auch das Verhältnis von ADMA zu Arginin überschätzen (das normalerweise im Bereich von 5% -15% liegt). Dies liegt daran, dass über 3 mmol / L Arginin; Die SPE-Säulenbindungskapazität kann die Sättigung27 erreichen. Zur Überprüfung der Sensitivität und Spezifität des gesamten Workflows im Falle unerwarteter Ergebnisse (z. B. keine Peaks oder überlappenden Peaks in den 1-H-NMR-Spektren bei den gemeldeten chemischen Verschiebungen) stehen Standards von ADMA, SDMA und MMA von kommerziellen Anbietern zur Verfügung (siehe Materialtabelle). Wenn ein Labor über kein NMR-Spektrometer verfügt, können alle Schritte, einschließlich der abschließenden Gefriertrocknung (Schritt 6.1), im entsprechenden Labor durchgeführt werden, und die Proben können zur Analyse an eine NMR-Anlage geschickt werden.
Im Vergleich zu anderen Methoden, wie z.B. der Massenspektrometrie, ist keine Markierung der Analyten erforderlich und es kann ohne interne Standards für die Quantifizierung durchgeführt werden. Auf der anderen Seite ist die Empfindlichkeit der NMR etwas geringer, was in den meisten biologischen Fällen jedoch keine Rolle spielt, da Arginin und seine Methylderivate in allen Arten von eukaryotischen Zellen oder Geweben leicht nachgewiesen werden können. Wie bereits erwähnt, reichen 3 Millionen Zellen aus, um proteingebundene ADMA zu quantifizieren - mehrere Zellen, die mit den meisten Zelllinien leicht erreicht werden können. Im Falle von langsam wachsenden, nicht modifizierten Primärzellen menschlichen Ursprungs wie adulten Stammzellen40 können Zellen über einen längeren Zeitraum gezüchtet oder aus separaten Experimenten gepoolt werden. Gleiches gilt für Gewebeproben. ~30 mg Gewebe, das vielen Organen, z. B. von Mäusen (teilweise oder ganz, z. B. kleinen Muskeln) oder Biopsieproben entspricht, reichen aus, um genügend Lysat und Proteinhydrolysat für die NMR-Messung herzustellen27. Andere Methoden zur Messung der Protein-Arginin-Methylierung umfassen die Verwendung von enzymgekoppelten Lumineszenz-Assays41 oder 3H-markiertes S-Adenosyl-Methionin (SAM)42. Die Empfindlichkeit ist hoch und kann durch die Verwendung von 14C-markierten SAMs erhöht werden, jedoch auf Kosten erhöhter Kosten. Darüber hinaus verursacht die Verwendung von radioaktiven Stoffen (einschließlich der Flüssigkeiten für die Szintillationszählung) eine spezielle Abfallentsorgung, die mit dem aktuellen Protokoll nicht erforderlich ist.
Eine komplementäre Methode zum vorliegenden Protokoll, die 2D-heteronukleäre NMR-Spektroskopie, kann ortsspezifische Methylierungsmuster innerhalb isolierter Proteine aufdecken. Es wurde kürzlich veröffentlicht und enthält eine detaillierte Beschreibung des Nachweises von Methyl-Argininen durch NMR-Spektroskopie im Allgemeinen43. Das aktuelle Protokoll liefert keine Informationen über die ortsspezifische Arginin-Methylierung innerhalb von Proteinen. Dennoch ist die globale Methylierung auf zellulärer und physiologischer Ebene verändert, einschließlich Zellwachstum und -differenzierung, Alterung, Krebs 1,2,12, kardiovaskulär20 und neurodegenerative Erkrankungen 8,44. Die Details über die genauen Mechanismen sind noch nicht vollständig geklärt, und mögliche Arzneimittelkandidaten, die die Protein-Arginin-Methylierung11 sowohl in vitro als auch in vivo stören, müssen weiter erforschtwerden 1. Die Untersuchung der Kinetik der Methylierung (die unsere Gruppe kürzlich gezeigt hat)27 ist wichtig, um Einblicke in die Arginin-Modifikation und die Proteinabbaumechanismen zu erhalten. Globale Arginin-Methylierungsmessungen und kinetische Experimente (Proben können jederzeit eingefroren werden), die von einzelnen Proteinen bis hin zu Proben aus ganzen Organismen reichen, können mit diesem Protokoll unkompliziert durchgeführt werden. Es bietet daher eine robuste Methode, die leicht für zukünftige Forschung angepasst werden kann.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Artikel bestehen.
Acknowledgments
Die Arbeit wurde unterstützt durch die FWF-Förderungen P28854, I3792, doc.funds BioMolStruct DOC 130, DK-MCD W1226 BioTechMed-Graz (Flaggschiffprojekt DYNIMO), die Österreichische Forschungsförderungsgesellschaft (FFG) Grants 864690 und 870454, das Integrative Metabolism Research Center Graz; Österreichisches Infrastrukturprogramm 2016/2017, des Zukunftsfonds Steiermark und des Startup-Fonds für hochkarätige Talente der Fujian Medical University (XRCZX2021020). Wir danken dem Zentrum für Medizinische Forschung für den Zugang zu Zellkulturanlagen. F.Z. wurde im Rahmen des PhD-Programms Molekulare Medizin an der Medizinischen Universität Graz ausgebildet. Q.Z. wurde im Rahmen des PhD-Programms Metabolische und kardiovaskuläre Erkrankungen an der Medizinischen Universität Graz ausgebildet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | Greiner Bio One | 188271 | |
| 3-(trimethylsilyl) propionic acid-2,2,3,3-d4 sodium salt (TSP) | Alfa Aesar | A1448 | |
| 5 mL tubes, round bottom | Greiner Bio One | 115101 | |
| Ammonia Solution 32% | Roth | A990.1 | |
| Bruker 600 MHz NMR spectrometer, equipped with a TXI probe head | Bruker | - | |
| Centrifuge, refrigerated, e.g. 5430 R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chloroform ≥99% p.a. | Roth | 3313.1 | |
| Cryocool | Thermo Scientific | SCC1 | heat transfer fluid for SpeedVac System |
| Deuterium Oxide (D2O) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-10-PK | |
| Dimethyl sulfoxide-d6 (d6-DMSO) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-6-1000 | |
| Drying Chamber | Binder | 9090-0018 | |
| DURAN culture tubes, 13 x 100mm, GL 14, 9 mL | VWR International | 212-0375 | |
| Edwards Deep vacuum oil pump RV5 | Thermo Scientific | 16234611 | part of the SpeedVac System |
| Eppendorf 1.5 mL tubes | Greiner Bio One | 616201 | |
| Gilson pipetting robot GX-241 Aspec | Gilson Inc. | 26150008 | |
| L-arginine | AppliChem | A3675 | |
| Methanol ≥99% | Roth | 8388.4 | |
| Milli-Q water aparatus | Millipore | ZIQ7000T0 | |
| Oasis MCX 1cc/30 mg, 1 mL cartridges | Waters | 186000252 | https://www.waters.com/waters/en_US/Waters-Oasis-Sample-Extraction-SPE-Products/ |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | LONBE17-512F | |
| Precellys 24 tissue homogenizer | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | https://www.bertin-instruments.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys24-tissue-homogenizer/ |
| Precellys tubes (pulping tubes) | VWR International | 432-0351 | |
| Precellyse 1.4 mm zirconium oxide beads | VWR International | 432-0356 | |
| Reacti-Therm/ReactiVap Heating, Stirring, and Evaporation Modules | Thermo Scientific | TS-18820 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/TS-18820 |
| Rotor for 1.5 mL tubes, FA-45-30-11 | Eppendorf | 5427753001 | |
| Savant Refrigerated Cooling Trap | Thermo Scientific | 15996161 | part of the SpeedVac System |
| Savant SpeedVac vacuum concentrator SPD210 | Thermo Scientific | 15906181 | part of the SpeedVac System; equipped with rotor for 1.5 ml tubes |
| Screw caps for glas vials with PTFE sealing, DN9 | Dr. R. Forche Chromatographie | CT11B3011 | |
| Seasand | Roth | 8441.3 | |
| Short thread glas vials 1.5 mL, ND9 | Dr. R. Forche Chromatographie | VT1100309 | |
| Sodium azide (NaN3) | Roth | K305.1 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | VWR | BDH7363-4 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | VWR | 80731-078 | |
| TopSpin 4.0 (Software) | Bruker | - | https://www.bruker.com |
| ω-NG-asymmetric dimethylarginine (ADMA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-208093 | |
| ω-NG-monomethylarginine (MMA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-200739A | |
| ω-NG-NG'-symmetric dimethylarginine (SDMA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-202235A |
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