Summary
Denne protokollen beskriver fremstilling og kvantitativ måling av fri og proteinbundet arginin og metylargininer ved 1H-NMR-spektroskopi.
Abstract
Proteinbundet arginin er vanligvis metylert i mange proteiner og regulerer deres funksjon ved å endre de fysisk-kjemiske egenskapene, deres interaksjon med andre molekyler, inkludert andre proteiner eller nukleinsyrer. Dette arbeidet presenterer en lett implementerbar protokoll for kvantifisering av arginin og dets derivater, inkludert asymmetrisk og symmetrisk dimetylarginin (henholdsvis ADMA og SDMA) og monometylarginin (MMA). Etter proteinisolering fra biologiske kroppsvæsker, vev eller cellelysater, beskrives en enkel metode for homogenisering, utfelling av proteiner og proteinhydrolyse. Siden hydrolysatene inneholder mange andre komponenter, som andre aminosyrer, lipider og nukleinsyrer, er et rensetrinn ved bruk av fastfaseekstraksjon (SPE) avgjørende. SPE kan enten utføres manuelt ved hjelp av sentrifuger eller en pipetteringsrobot. Sensitiviteten for ADMA ved bruk av gjeldende protokoll er ca. 100 nmol / L. Den øvre deteksjonsgrensen for arginin er 3 mmol / l på grunn av SPE-metning. Oppsummert beskriver denne protokollen en robust metode, som spenner fra biologisk prøvepreparering til NMR-basert deteksjon, og gir verdifulle hint og fallgruver for vellykket arbeid når man studerer argininmetylomet.
Introduction
I løpet av de siste to tiårene har metylering av argininrester blitt anerkjent som en viktig posttranslasjonell modifikasjon av proteiner. Det påvirker grunnleggende biologiske prosesser som regulering av transkripsjon, signaltransduksjon og mange flere1. De viktigste proteinene som er involvert i reguleringen av argininmetylering er proteinargininmetyltransferaser (PRMT)2. De viktigste derivatene av arginin er ω-(N G,N G)-asymmetrisk dimetylarginin (ADMA), ω-(N G,N'G)-symmetrisk dimetylarginin (SDMA) og ω-N G-monometylarginin (MMA)2.
PRMTer bruker S-adenosyl-l-metionin for å overføre metylgrupper til den terminale guanidinogruppen (med to ekvivalente aminogrupper) av proteinbundet arginin1. To hovedenzymer kan skilles: Både type I og type II enzymer katalyserer det første metyleringstrinnet for å danne MMA (som dermed mister sin symmetri). Etter dette trinnet bruker type I-enzymer (f.eks. PRMT1, 2, 3, 4, 6, 8) MMA som substrat for å danne ADMA, mens type II-enzymer (primært PRMT5 og PRMT9) produserer SDMA. PRMT1 var det første proteinet argininmetyltransferase som ble isolert fra pattedyrceller3. Likevel har PRMT blitt evolusjonært bevart4 i andre dyr som ikke-pattedyrvirveldyr, virvelløse akkordater, pigghuder, leddyr og nematoder cnidarians5, planter6 og protozoer, inkludert sopp som gjær7. I mange tilfeller fører knockout av en av PRMTene til tap av levedyktighet, noe som avslører den essensielle rollen til metylerte argininarter involvert i grunnleggende cellulære prosesser som transkripsjon, translasjon, signaltransduksjon, apoptose og væske-væskefaseseparasjon (som betyr dannelse av membranløse organeller, f.eks. nukleoli), som regelmessig involverer argininrike domener 8,9,10 . I sin tur påvirker dette fysiologi og sykdomstilstander, inkludert kreft 11,12,13, multippelt myelom14, kardiovaskulære sykdommer15, viral patogenese, spinal muskelatrofi 16, diabetes mellitus 17 og aldring1. Økte ADMA-nivåer i blodet, for eksempel avledet fra lunge18 på grunn av proteinnedbrytning, antas å være forbundet med endoteldysfunksjon, kronisk lungesykdom19 og andre syndromer av kardiovaskulær sykdom20. Overekspresjon av PRMT har vist seg å akselerere tumorigenese og er assosiert med dårlig prognose21,22. Dessuten utløser ablasjon av PRMT6 og PRMT7 en cellulær senescensfenotype23. Signifikant redusert ADMA og PRMT1 har blitt funnet under aldring av WI-38 fibroblaster24.
Utfordringen er å forstå hvordan metylering virker i (pato)fysiologiske prosesser er å identifisere og kvantifisere proteinargininmetylering. De fleste av de nåværende tilnærmingene bruker antistoffer for å oppdage metylerte argininer. Imidlertid er disse antistoffene fortsatt kontekstspesifikke og kan ikke gjenkjenne forskjellige motiver av argininmetylerte proteiner25,26. I den beskrevne protokollen kan alle argininderivatene nevnt ovenfor kvantifiseres pålitelig ved kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, dvs. alene, i kombinasjon, eller, som i de fleste tilfeller, innenfor komplekse biologiske matriser som eukaryote celler (f.eks. Fra gjær, mus eller menneskelig opprinnelse) og vev27, samt serum28. For proteiner og de komplekse matrisene er proteinhydrolyse29 en forutsetning for å generere frie (modifiserte) aminosyrer, som arginin, MMA, SDMA og ADMA. Fastfaseekstraksjon (SPE)30 muliggjør anrikning av de interessante forbindelsene. Endelig tillater 1H-NMR-spektroskopi parallell påvisning av arginin og alle de viktigste metylderivatene av arginin. NMR-spektroskopi kommer med fordelen at den er genuint kvantitativ, svært reproduserbar og en robust teknikk31,32. De endelige NMR-målingene kan gjøres i etterkant når mange prøver er samlet inn og klargjort. Til slutt fokuserer denne protokollen hovedsakelig på prøvepreparering, da dette ikke krever et eget NMR-spektrometer. Det kan utføres i de fleste biokjemiske laboratorier. Likevel gis det noen hint om hvilke NMR-spektroskopimålinger som bør gjøres i dette arbeidet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Gjærproteinhydrolysater ble brukt som prøver for de representative resultatene av dette arbeidet. Hele protokollen er oppsummert i figur 1.
1. Fremstilling av materialer og reagenser
- Metanol / vann: lag en blanding av to deler 99% metanol (MeOH) og en del av H 2 O, betegnet som MeOH / H 2 O. Oppbevarren MeOH og MeOH / H2O ved -20° C for å minimere alkoholfordampning og øke prøvestabiliteten.
- Saltsyre (HCl): fortynnet 9 mol / L fra konsentrert HCl (12,0 mol / L eller 37%) samt 0,1 mol / L HCl. Den høyere konsentrerte (9 mol / L) løsningen brukes til proteinhydrolyse, mens den lavere konsentrerte (0,1 mol / L) brukes til fastfaseekstraksjon.
FORSIKTIG: Arbeid inne i avtrekkshetten. - Klargjør en erstatningsløsning for SPE som inneholder 10 % mettet ammoniakkløsning (lager: 30 % w/w ammoniakk), 50 % metanol og 40 % vann (v/v).
- NMR-buffer: Løs opp 5,56 g dinatriumhydrogenfosfat (Na 2 HPO 4, 0,08 mol / L), 0,4 g 3- (trimetylsilyl) propionsyre-2,2,3,3-d4 natriumsalt (TSP, 5 mmol / L), 0,04 % (w / v) natriumazid (NaN3) i 500 ml deuteriumdioksid (D2O) og juster til pH7,4 (ved bruk av HCl eller NaOH, henholdsvis) (se Materialfortegnelse). Kontroller renheten til hver ny bufferbatch ved NMR-spektroskopi.
MERK: Mengden av eventuelle forurensninger (f.eks. etanol) bør være så lav som mulig. - Fyll masserør med zirkoniumoksidperler (2 ml rør og 1,4 mm perler er egnet for de fleste applikasjoner, men forskjellige varianter er tilgjengelige) (se materialtabell). Fyll omtrent 10-20 perler for hånd eller kjøp ferdigfylte rør, som også er tilgjengelige.
- Hold pipetter og de respektive spissene klare i området 10-1000 μL.
MERK: Svært rent vann, betegnet som H 2 O, definert av en høy motstand på ≥18,2 MΩ · cm-1, ble brukt gjennom hele arbeidet. Det tilsvarer dobbelt destillert vann.
2. Prøveinnsamling og lagring
- Flash fryser væskeprøvene (serum / plasma, cellekultursupernatant, etc.) med flytende nitrogen og oppbevar dem ved -80 ° C til bruk.
- Forbered de faste materialene som nevnt nedenfor.
- Samle cellene fra cellekulturer (3-5 millioner celler) enten ved å samle adherente celler, etter vask med kaldt fosfatbufret saltvann, skraping og sentrifugering, eller direkte sentrifugering av celler dyrket i suspensjon.
- Fjern cellesupernatantene (som kan samles inn for videre analyse, enten ved påfølgende direkte måling, se trinn 6, eller etter utfelling av oppløselige proteiner, se trinn 3.1), og blitzfrys deretter pellets med flytende nitrogen og oppbevar ved -80 °C. For videre behandling, se trinn 3.2.
- Oppbevar og samle vevene i henhold til målet med studien. For svært homogene vev, som leveren eller muskelen, analyser hvilken som helst del av den. For eksempel, i tilfelle av en musehjerne, bestemme global argininmetylering av hele hjernen eller hjerneseksjonene.
MERK: Den ideelle vekten av vev som skal behandles er 30-60 mg. Det anbefales å fryse og pulverisere hele hjernen og bruke alikoter derav. Alternativt kan spesifikke hjernedeler (f.eks. frontal, cerebellum, oksipitale regioner eller en halvkule, som veier ~ 250 mg) brukes.
3. Foreløpig prøveklargjøring
MERK: Utfør arbeidet på is, og hold MeOH kaldt. Prøvene må også oppbevares på is for å unngå nedbrytning av protein.
- For væskeprøver, tilsett 400 μL iskald metanol til 200 μL av prøven. Fortsett med trinn 3.3.
MERK: Hvis mindre utvalg er tilgjengelig, juster volumene tilsvarende; NMR-følsomheten er vanligvis høy nok for mindre prøvemengder, men må testes individuelt. - Når det gjelder faste materialer, lag nok 1,5 ml rør til lysatene (bruk for sentrifugering etter homogenisering).
- Forsiktig, men grundig, resuspender cellepellets i 600 μL MeOH/ H 2O og overfør hele væskefasen til masserørene.
- Plasser vev i masserør (du kan veie dem direkte inn i rørene) og tilsett 600 μL MeOH/ H 2O (for 30-60 mg; juster hvis vekten varierer vesentlig).
- Sett rørene inn i vevshomogenisatoren (se materialtabell) og homogeniser enten en gang i 20 s med kraftig risting (for cellepellets, bløtvev) eller to ganger i 20 s hver (eller lenger om nødvendig) med et intervall på 5 minutter i mellom (for stivt vev).
- Etter homogenisering, legg straks prøver på isen igjen og overfør hele lysatene til nye 1,5 ml rør.
- Oppbevar prøver i minst 30 min (opptil flere dager) ved -20 °C før videre behandling.
- Sentrifuge ved 10 000 x g i 30 minutter ved 4 °C. I mellomtiden forbereder du nok 1,5 ml rør til å samle supernatantene.
MERK: Denne supernatanten (betegnet "(1)" i figur 1) kan kasseres, være lyofilisert og direkte behandlet for NMR (trinn 6) eller analysert på annen måte. - I denne protokollen brukes MeOH-bunnfallet (= pellet oppnådd etter henholdsvis trinn 3.1 eller 3.2.2) for videre analyse som inneholder blant annet komponenter som nukleinsyrer og lipider, argininmetylerte proteiner. Fortsett med proteinhydrolyse eller oppbevar pellets ved -20 °C i noen dager.
4. Proteinhydrolyse
- Tilsett 500 μL 9 mol / L HCl til hver prøve. Deretter avkorter du hettene på hvert rør med saks og plasserer dem i glasskulturrørene (figur 2A). Forsiktig, men tett, lukk de røde hettene (kontroller dermed forseglingen).
NOTAT: Før bruk, kontroller alltid hver tetning (grå PTFE-folie inne i de røde skrukorkene) for riktig stramming og rengjør dem regelmessig med vann. - Når du er ferdig, plasser rørene i et beger delvis fylt med sand (for bedre varmeoverføring) og hydrolyser prøver i ca. 16 timer ved 110 °C i et tørkekammer.
- Etter hydrolyse, avkjøl prøvene (~ 1 h).
- Deretter fryser du over natten ved hjelp av en sentrifuge med høyt vakuum (under 100 Pa).
- Løs opp pellets - hvis helt tørr (hvis ikke, fortsett lyofilisering) - i 1 ml 0,1 mol / l HCl og tilsett 50 μL kloroform (CHCl3) til hvert rør; Løs opp pelleten grundig med en 1000 μL pipette, og bland deretter væskene, og overfør deretter hele volumet til et nytt rør.
FORSIKTIG: Arbeid alltid med små mengder for å minimere omfattende fordampning - Deretter sentrifuger ved 8000 x g i 10 min ved romtemperatur.
- Samle forsiktig den øvre fasen av den bifasiske væsken som inneholder den vannløselige fraksjonen (figur 2B, fraksjonen med lavere tetthet) med en pipette og fyll den i nye rør. Bruk 1,5 ml tuber til manuell SPE (pkt. 5.2) eller glassflasker til robotisert SPE (pkt. 5.3 og figur 2D). Unngå å søle over CHCl3 og innholdet i det (figur 2C).
5. Fastfase ekstraksjon (SPE)
- Før første gangs bruk, rengjør SPE-sylinderampullene to ganger med 1 ml av erstatningsoppløsningen (trinn 1,3) etterfulgt av sentrifugering ved 800 x g i 1 min ved romtemperatur (plassert i 15 ml rør). De kan brukes 10-20 ganger hver.
- Manuell SPE
- Forkondisjoner sylinderampullene (se materialfortegnelse) i hver kjøring med 1 ml ren metanol og 2 x 1 ml PBS, hver gang etterfulgt av sentrifugering ved 800 x g i 1 minutt ved romtemperatur (plassert i 15 ml rør).
- Deretter legger du prøvene (fra trinn 4.7) på SPE-kassettene og sentrifugerer dem ved 600 x g i 2 minutter ved romtemperatur.
- Bruk deretter en vaskesyklus som nevnt nedenfor.
- Tilsett tre ganger 1 ml H2O (hver etterfulgt av sentrifugering i 1 min ved 800 x g ved romtemperatur).
- Tilsett fem ganger 1 ml 0,1 mol/l HCl (hver etterfulgt av sentrifugering i 1 min ved 800 x g ved romtemperatur).
- Tilsett to ganger 1 ml MeOH (hver etterfulgt av sentrifugering i 1 min ved 800 x g ved romtemperatur).
- Deretter eluat arginin og dets derivater med 3 x 1 ml erstatningsløsning (etterfulgt av sentrifugering 1 min ved 800 x g ved romtemperatur) i et enkelt 15 ml rør.
MERK: Erstatningsoppløsningen fungerer som eluent for arginin og derivater og brukes også til rengjøring av sylinderampullene (alle stoffer vaskes enten ut før eluering eller ved erstatningsløsningens grunnleggende pH-verdi). For å unngå forurensning over tid, bør gjenbruken likevel begrenses (se trinn 5.1).
- Robotisk SPE
MERK: Her leveres en pipetteringsrobot (hoveddelen består av en pipetteringsnål, en vaskestasjon for nålen, en reagenstilførsel og posisjoner for prøver og eluater, se materialfortegnelse) med en patronholder for SPE-kolonnene. For andre instrumenter, sørg for å være fullt utstyrt med alle ting som er oppført.- Fyll supernatanten (fra trinn 4.7) direkte i hetteglass med PTFE-forsegling (figur 2D), klargjør nok reagenser (100 ml av hver, dvs. erstatningsløsning, 99 % MeOH, PBS,H2O og 0,1 mol/l HCl), 5 ml rør for eluering og vaskeoppløsning for nålen til roboten (vanligvis H2O).
- Bruk en applikasjon eller metode i programvaren til roboten basert nøyaktig på trinnene beskrevet for manuell SPE (trinn 5.2).
MERK: Detaljene kan variere mye mellom instrumentleverandører, så se programvarehåndboken til den respektive roboten for programmering. En pipetteringsrobot fungerer vanligvis ved å påføre lufttrykk på patronene i stedet for sentrifugering, som er hovedforskjellen. Hvis protokollen etableres og kjøres for første gang, inkluderer du kontroller (f.eks. L-arginin med kjent konsentrasjon) for å verifisere en optimal arbeidsflyt.
6. Siste forberedelse til NMR
- Lyofiliser prøver over natten for å fullføre tørrhet for å kvitte seg med ammoniakk og H2O.
- Løs opp hver prøve i 500 μL NMR-buffer (trinn 1,4) og overfør til NMR-rør. Det er viktig at volumet må være det samme i alle rør, og prøvene må være homogene (fri for rester og lipider, som har en tendens til å aggregere).
MERK: Detaljene i NMR-spektroskopi går utover denne metodegjennomgangen og er beskrevet mer detaljert andre steder27. Her forklares bare hovedkravene og trinnene. Kvantifiseringen av arginin og dets metabolitter utføres på et 600 MHz NMR-spektrometer (se materialtabell). I prinsippet kan alle andre NMR-spektrometer/NMR-feltstyrker brukes, forutsatt at NMR-signalene til arginin og metylerte argininer kan detekteres med tilstrekkelig følsomhet og uten signaloverlapping. Ethvert sondehode med z-aksegradienter som kan registrere 1H-spektra kan brukes, forutsatt at pulssekvensene er satt opp tilsvarende. - Ta opp et 1D-spektrum ved hjelp av CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill) pulssekvens33,34 (cpmgpr1d, 512 skanninger, størrelse på fid 73728, 11904.76 Hz spektralbredde på en 600 MHz NMR, resirkuleringsforsinkelse 4 s) med vannsignalundertrykkelse ved bruk av premetning.
- I disse eksperimentene fjerner du 1H-skalarkoblingene ved virtuell frakobling, noe som reduserer signaloverlappingen. Ta opp ytterligere for spesifikke spørsmål og / eller komplekse prøver eller matriser, for eksempel 1 H-13C-heteronukleær enkelt kvantekoherens (HSQC) spektra27.
MERK: For mer komplekse matriser der 1 H NMR-signaler av metylerte argininer delvis kan overlappes med 1 H NMR-signaler fra andre metabolitter (f.eks. lysin), kreves 1H homonukleære J-oppløste spektra (JRES)35. - Utføre absolutt kvantifisering ved å integrere de respektive toppintensitetene til standarder for en kjent konsentrasjon, f.eks. 100 μmol / arginin.
MERK: Rutinemessig rapporteres ADMA, SDMA og MMA (se materialfortegnelse) som et forhold i forhold til arginin. Dette har en betydelig fordel at ingen separat normalisering (f.eks. cellenummer, vevsmasse, proteinkonsentrasjoner) må utføres. I så fall fungerer arginin som en intern standard, og relativ kvantifisering er tilstrekkelig til å få biologisk relevant informasjon. - For differensiering av SDMA og MMA vil lyofilisere prøvene igjen være å kvitte seg med D2O (hvis de har blitt resuspendert i NMR-buffer før), som deretter erstattes av deuterert dimetylsulfoksid (d6-DMSO), noe som muliggjør oppløsning av metylresonanser27. Aspirer derfor prøvene fra NMR-rørene med Pasteur-pipetter, lyofiliser og oppløs dem i 500 μL d6-DMSO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rutinemessig brukes 1H 1D-projeksjoner av 2D J-løst (JRES), praktisk talt frakoblede NMR-spektra for toppoppgaver og kvantifiseringer i vårt laboratorium36. Figur 3 viser representative JRES-spektra av gjærproteinhydrolysater renset ved hjelp av gjeldende SPE-protokoll. Selv om de er i svært forskjellige konsentrasjoner, kan begge stoffene separeres og kvantifiseres i en cellulær matrise. Basert på antall protoner av den spesifikke metylgruppen (-CH3) eller metylen (-CH2-) ved det respektive kjemiske skiftet, tillater 1H-NMR-spektroskopi presis kvantifisering. Som påpekt i protokollen (trinn 0), er den relative kvantifiseringen av et metyl-argininderivat sammenlignet med arginin hovedsakelig tilstrekkelig til å observere biologiske prosesser, for eksempel endringer av argininmetylering som respons på modulasjoner, for eksempel knock-down / overekspresjon av gener, endringer i næringsstoffer eller behandling med inhibitorer.
Som vist tidligere27, kan L-arginin og ADMA godt diskrimineres av deres forskjellige karakteristiske kjemiske skift ved henholdsvis 3,25 og 3,02 ppm. SDMA og MMA metylprotoner avslører overlappende topper i D 2 O(NMR-bufferen beskrevet i trinn 1.4) ved et kjemisk skifte på 2.85 ppm. Hvis en topp er tilstede i den respektive posisjonen, kan man skille SDMA og MMA ved å oppløse prøvene i d 6-DMSO som beskrevet i trinn6.6 i protokollen. Ved hjelp av denne tilnærmingen kan 1H NMR kjemiske skift av SDMA og MMA separeres og kvantifiseres med karakteristiske kjemiske skift ved 2,76 ppm (SDMA) og 2,74 ppm (MMA) 27. Figur 3B viser representative data for SDMA og MMA (begge 100 μmol/L) i henholdsvis D2O og d 6-DMSO. Tilsvarende data om SMDA og MMA påvist i forskjellige celler og vev har blitt rapportert nylig27. Som beskrevet i trinn 6.4-6.5 i protokollen, kan referansestandarder for kjente konsentrasjoner brukes til kvantifisering. Alle referansestandarder nevnt i teksten er kommersielt tilgjengelige.
Figur 1: Oversikt over prøvepreparering. Ordning som avslører de betydelige trinnene fra prøveinnsamling til NMR-måling. De svarte boksene refererer til nummereringen i protokollseksjonene. I tillegg vises omtrentlig antall dager (varierende i henhold til antall prøver). Inhomogene væskeprøver kan sentrifugeres før tilsetning av MeOH (trinn 3.1) for å fjerne restene (ikke vist). Supernatanten etter innledende sentrifugering (1) som inneholder f.eks. intracellulære metabolitter eller ikke-proteinbundne argininmetabolitter, kan lagres ved -20 °C for videre analyse. Rutinemessig analyseres MeOH-pellets (2) videre. Forkortelser: CHCl3, kloroform; HCl, saltsyre; MeOH, metanol; NMR, kjernemagnetisk resonans; o/n, over natten; SN, supernatant; SPE, fastfase ekstraksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Håndtering av proteinhydrolysater og tilberedning for fastfaseekstraksjon. (A) Beger fylt med sand, glassrør, skrukork med grå polytetrafluoretylen (PTFE) tetningsfolie og prøver i 1,5 ml rør etter kutting av lokkene. (B) Tube etter sentrifugering (trinn 4.6) og (C) etter fjerning av den vandige supernatanten (trinn 4.7): noe restvann (~50 μL) kan forbli. Den svarte resten inneholder uoppløselige, forkullede organiske rester. Likevel kan noen prøver inneholde fargede stoffer (D), som ikke forstyrrer L-argininmåling. Dette skyldes delvis fastfaseekstraksjon (SPE) etterpå, enten ved bruk av påfølgende sentrifugeringstrinn (E) eller en pipetteringsrobot (F). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Typiske NMR-spektra av L-arginin og dets metylderivater. 1 H 1D-projiserte J-oppløste NMR-spektra kunne lett skille δ-(CH2)-protonene til L-arginin (3,25 ppm) og ω-N-CH-3-protonene til asymmetrisk dimetylarginin (ADMA, ved3,02 ppm). Prøver fra gjærpellets (A) som avslører varierende mengder ADMA, kan kvantifiseres ved å integrere signalintensiteter selv i nærvær av høye mengder arginin (merk at full arginintopp ikke er vist). (B) Siden ω-(N G,N'G)-symmetrisk dimetylarginin (SDMA) og ω-N G-monometylarginin (MMA) vanskelig kan diskrimineres i deuteriumoksidbuffer (D 2 O), må prøver oppløses i deuterert dimetylsulfoksid (d6-DMSO), hvor toppene (i dette tilfellet 100 μmol / l av hvert stoff) lett kan skilles fra hverandre (topper ved 2,75 og2,76ppm, henholdsvis) og kvantifiseres. Alle spektrogrammer ble eksportert direkte fra kontrollprogramvaren til NMR-spektrometeret. Programvaren avslører de primære resultatene, som må kontrolleres før en mer detaljert analyse, inkludert statistikk over mange prøver, gjøres. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I det følgende avsnittet ligger hovedfokuset på selve metoden; de biologiske implikasjonene av argininmetylering er beskrevet i introduksjonsdelen.
For det første kan vev med forskjellig stivhet trenge justering av prøvelysis: celler fra cellekultur (inkludert bakterier, gjær, etc.) og vev som hjerne, ung lever, glatt muskulatur, etc., kan raskt homogeniseres. For vev med høy stivhet (inkludert lever fra eldre personer, arterier, bein, etc.), må homogeniseringen gjøres to ganger (se trinn 3.2.3). Likevel bør denne prosessen ikke fortsette oftere, selv om noen uoppløselige rester er igjen. I stedet bør prøvene sentrifugeres i 10 minutter ved 10 000 x g og supernatantene samles inn for videre analyse (for å minimere nedbrytning av prøven).
Ved hvert trinn der prøvene fryses (først etter tilsetning av MeOH, henholdsvis trinn 3.3, 3.4 eller 3.5) eller etter lyofilisering (trinn 4.4 og 6.1), kan prøver lagres i noen dager før videre behandling. I tillegg kan supernatanten fra trinn 3.4 (etter homogenisering; betegnet som "(1)" i figur 1) også lagres for videre analyse, f.eks. for måling av andre metabolitter enn metyl-argininer36,37,38.
På den ene siden involverer kritiske trinn prøvelagring, da nedbrytning av proteiner kan endre utfallet. Hvis proteinnedbrytning skjer før MeOH-utfelling, kan arginin og dets metylderivater underestimeres. Derfor er det viktig å oppbevare prøver, f.eks. før og etter celle- eller vevslyse ved -20 °C eller, når det er mulig, ved -80 °C. Før eller etter homogenisering (trinn 3.2) skal prøvene holdes på is.
På den annen side endrer metanolforbehandling av prøver for å utfelle proteiner ikke metyleringsmønsteret av arginin. Dette ble testet med lysozym og Escherichia coli-proteinekstrakter (som ikke inneholder metylert arginin)27. Tidligere rapporter har imidlertid vist at MeOH kan metylere de terminale karboksylgruppene av glutamat og aspartat39.
For proteinhydrolyse, sørg for at forseglingene på skruehettene er intakte (trinn 4.1). Hvis ikke, kan fordamping av HCl påvirke tørkekammeret. Konsentrasjonen av analyttene kan imidlertid ikke endres kritisk, fordi de ikke fordamper, og gjenværende HCl fordampes senere ved lyofilisering. Lavere konsentrasjoner av HCl, f.eks. 6 mol / L, kan brukes, men kan kreve lengre hydrolysetid. Etter hydrolyse kan prøvene behandles ved romtemperatur. Riktig fjerning av lipider er viktig, skjønt. Lipider kan danne bifasiske blandinger i vann (eller D2O, henholdsvis) senere under NMR-måling. Disse inhomogenitetene fører til NMR-topputvidelse og påvirker potensielt kvaliteten og følsomheten til NMR-eksperimenter.
Hvis ingen pipetteringsrobot er tilgjengelig for SPE, er det verdt investeringen (den kan også brukes til andre formål). Prøvene på SPE-pipetteringsroboten behandles sekvensielt, og i det nåværende oppsettet tar en prøve ~40 minutter for en fullstendig kjøring. På grunn av begrensninger i reagenskapasiteten (dvs. 100 ml), kan bare 19 prøver behandles på en gang (tar ~ 13 timer totalt). Likevel er den praktiske tiden mye mindre enn for den manuelle SPE-prosedyren og krever mindre materiale. I løpet av denne perioden kan prøver lagres i roboten ved romtemperatur til lyofilisering. Tilsvarende produkter kan erstatte de brukte SPE-matrisene og kassettene. Likevel anbefales det å evaluere SPE-protokollen og justere den om nødvendig.
Deteksjonsgrensen for ADMA er ~100 nmol/l som evaluert tidligere ved seriefortynninger og ved bruk av rapporterte NMR-måletider. På den annen side kan høye argininkonsentrasjoner også overvurdere forholdet mellom ADMA og arginin (som vanligvis ligger i området 5% -15%). Dette skyldes at over 3 mmol / l arginin; SPE-kolonnebindingskapasiteten kan nå metning27. For å kontrollere sensitiviteten og spesifisiteten til hele arbeidsflyten i tilfelle uventede resultater (f.eks. ingen topper eller overlappende topper i 1H-NMR-spektra ved de rapporterte kjemiske skiftene), er standarder for ADMA, SDMA og MMA tilgjengelig fra kommersielle leverandører (se materialfortegnelse). Hvis et laboratorium ikke har NMR-spektrometer, kan alle trinn, inkludert endelig lyofilisering (trinn 6.1), utføres i det respektive laboratoriet, og prøver kan sendes til et NMR-anlegg for analyse.
Sammenlignet med andre metoder, som massespektrometri, er det ikke nødvendig med merking av analytter, og det kan utføres uten interne standarder for kvantifisering. På den annen side er følsomheten til NMR litt lavere, som i de fleste biologiske tilfeller ikke spiller noen rolle, som arginin og dets metylderivater, kan lett detekteres i alle slags eukaryote celler eller vev. Som nevnt tidligere er 3 millioner celler nok til å kvantifisere proteinbundet ADMA - flere celler som lett kan oppnås med de fleste cellelinjer. Når det gjelder langsomt voksende, umodifiserte primærceller fra menneskelig opprinnelse som voksne stamceller40, kan celler dyrkes i en lengre periode eller samles fra separate eksperimenter. Det samme gjelder for vevsprøver. ~30 mg vev, tilsvarende mange organer, f.eks. av mus (delvis eller alle, f.eks. små muskler) eller biopsiprøve, er tilstrekkelig til å forberede nok lysat og proteinhydrolysat til NMR-måling27. Andre metoder for måling av protein argininmetylering inkluderer bruk av enzymkoblede luminescensanalyser41 eller 3H-merket S-adenosyl-metionin (SAM) 42. Følsomheten er høy og kan økes ved å bruke 14C-merket SAM, men på bekostning av økte kostnader. I tillegg forårsaker bruk av radioaktive stoffer (inkludert væskene for scintillasjonstelling) spesiell avfallshåndtering, noe som ikke er nødvendig ved bruk av gjeldende protokoll.
En komplementær metode til den nåværende protokollen, ved bruk av 2D heteronukleær NMR-spektroskopi, kan avsløre stedsspesifikke metyleringsmønstre i isolerte proteiner. Det har nylig blitt publisert, inkludert en detaljert beskrivelse av påvisning av metyl-argininer ved NMR-spektroskopi generelt43. Den nåværende protokollen gir ikke informasjon om stedsspesifikk argininmetylering i proteiner. Likevel endres global metylering på cellulært og fysiologisk nivå, inkludert cellevekst og differensiering, aldring, kreft 1,2,12, kardiovaskulær20 og nevrodegenerative sykdommer 8,44. Detaljene om de eksakte mekanismene som er involvert er fortsatt ikke fullt ut forstått, og mulige legemiddelkandidater som forstyrrer protein-argininmetylering11 både in vitro og in vivo trenger videre utforskning1. Å studere kinetikken til metylering (som vår gruppe nylig har vist)27 er viktig for å få innsikt i argininmodifikasjon og proteinnedbrytningsmekanismer. Globale argininmetyleringsmålinger og kinetiske eksperimenter (prøver kan fryses når som helst) som spenner fra enkeltproteiner til prøver fra hele organismer, kan oppnås enkelt ved hjelp av denne protokollen. Det gir derfor en robust metode, som enkelt kan tilpasses fremtidig forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Arbeidet ble støttet av Austrian Science Fund (FWF) tilskudd P28854, I3792, doc.funds BioMolStruct DOC 130, DK-MCD W1226 BioTechMed-Graz (flaggskipprosjekt DYNIMO), Austrian Research Promotion Agency (FFG) tilskudd 864690 og 870454, Integrative Metabolism Research Center Graz; Østerriksk infrastrukturprogram 2016/2017, Steiermarksregjeringen (Zukunftsfonds) og oppstartsfondet for talenter på høyt nivå ved Fujian Medical University (XRCZX2021020). Vi takker Center of Medical Research for tilgang til cellekulturfasiliteter. FZ ble trent innenfor rammen av PhD-programmet Molecular Medicine, Medical University of Graz. Q.Z. ble trent innenfor rammen av PhD-programmet Metabolske og kardiovaskulære sykdommer, Medical University of Graz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | Greiner Bio One | 188271 | |
| 3-(trimethylsilyl) propionic acid-2,2,3,3-d4 sodium salt (TSP) | Alfa Aesar | A1448 | |
| 5 mL tubes, round bottom | Greiner Bio One | 115101 | |
| Ammonia Solution 32% | Roth | A990.1 | |
| Bruker 600 MHz NMR spectrometer, equipped with a TXI probe head | Bruker | - | |
| Centrifuge, refrigerated, e.g. 5430 R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chloroform ≥99% p.a. | Roth | 3313.1 | |
| Cryocool | Thermo Scientific | SCC1 | heat transfer fluid for SpeedVac System |
| Deuterium Oxide (D2O) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-10-PK | |
| Dimethyl sulfoxide-d6 (d6-DMSO) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-6-1000 | |
| Drying Chamber | Binder | 9090-0018 | |
| DURAN culture tubes, 13 x 100mm, GL 14, 9 mL | VWR International | 212-0375 | |
| Edwards Deep vacuum oil pump RV5 | Thermo Scientific | 16234611 | part of the SpeedVac System |
| Eppendorf 1.5 mL tubes | Greiner Bio One | 616201 | |
| Gilson pipetting robot GX-241 Aspec | Gilson Inc. | 26150008 | |
| L-arginine | AppliChem | A3675 | |
| Methanol ≥99% | Roth | 8388.4 | |
| Milli-Q water aparatus | Millipore | ZIQ7000T0 | |
| Oasis MCX 1cc/30 mg, 1 mL cartridges | Waters | 186000252 | https://www.waters.com/waters/en_US/Waters-Oasis-Sample-Extraction-SPE-Products/ |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | LONBE17-512F | |
| Precellys 24 tissue homogenizer | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | https://www.bertin-instruments.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys24-tissue-homogenizer/ |
| Precellys tubes (pulping tubes) | VWR International | 432-0351 | |
| Precellyse 1.4 mm zirconium oxide beads | VWR International | 432-0356 | |
| Reacti-Therm/ReactiVap Heating, Stirring, and Evaporation Modules | Thermo Scientific | TS-18820 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/TS-18820 |
| Rotor for 1.5 mL tubes, FA-45-30-11 | Eppendorf | 5427753001 | |
| Savant Refrigerated Cooling Trap | Thermo Scientific | 15996161 | part of the SpeedVac System |
| Savant SpeedVac vacuum concentrator SPD210 | Thermo Scientific | 15906181 | part of the SpeedVac System; equipped with rotor for 1.5 ml tubes |
| Screw caps for glas vials with PTFE sealing, DN9 | Dr. R. Forche Chromatographie | CT11B3011 | |
| Seasand | Roth | 8441.3 | |
| Short thread glas vials 1.5 mL, ND9 | Dr. R. Forche Chromatographie | VT1100309 | |
| Sodium azide (NaN3) | Roth | K305.1 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | VWR | BDH7363-4 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | VWR | 80731-078 | |
| TopSpin 4.0 (Software) | Bruker | - | https://www.bruker.com |
| ω-NG-asymmetric dimethylarginine (ADMA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-208093 | |
| ω-NG-monomethylarginine (MMA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-200739A | |
| ω-NG-NG'-symmetric dimethylarginine (SDMA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-202235A |
References
- Guccione, E., Richard, S. The regulation, functions and clinical relevance of arginine methylation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).
- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
- Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase. Journal of Biological Chemistry. 271 (25), 15034-15044 (1996).
- Bachand, F. Protein arginine methyltransferases: from unicellular eukaryotes to humans. Eukaryotic Cell. 6 (6), 889-898 (2007).
- Wang, Y. C., Li, C. Evolutionarily conserved protein arginine methyltransferases in non-mammalian animal systems. FEBS Journal. 279 (6), 932-945 (2012).
- Ahmad, A., Cao, X. Plant PRMTs broaden the scope of arginine methylation. Journal of Genetics and Genomics. 39 (5), 195-208 (2012).
- Fisk, J. C., Read, L. K. Protein arginine methylation in parasitic protozoa. Eukaryotic Cell. 10 (8), 1013-1022 (2011).
- Hofweber, M., et al. Phase Separation of FUS Is Suppressed by Its Nuclear Import Receptor and Arginine Methylation. Cell. 173 (3), 706-719 (2018).
- Chong, P. A., Vernon, R. M., Forman-Kay, J. D. RGG/RG Motif Regions in RNA Binding and Phase Separation. Journal of Molecular Biology. 430 (23), 4650-4665 (2018).
- Nott, T. J., et al. Phase transition of a disordered nuage protein generates environmentally responsive membraneless organelles. Molecular Cell. 57 (5), 936-947 (2015).
- Fong, J. Y., et al. Therapeutic targeting of RNA splicing catalysis through inhibition of protein arginine methylation. Cancer Cell. 36 (2), 194-209 (2019).
- Yang, Y., Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).
- Wang, S. M., Dowhan, D. H., Muscat, G. E. O. Epigenetic arginine methylation in breast cancer: emerging therapeutic strategies. Journal of Molecular Endocrinology. 62 (3), 223-237 (2019).
- Gulla, A., et al. Protein arginine methyltransferase 5 has prognostic relevance and is a druggable target in multiple myeloma. Leukemia. 32 (4), 996-1002 (2018).
- Wang, Z., Tang, W. H., Cho, L., Brennan, D. M., Hazen, S. L. Targeted metabolomic evaluation of arginine methylation and cardiovascular risks: potential mechanisms beyond nitric oxide synthase inhibition. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (9), 1383-1391 (2009).
- Friesen, W. J., Massenet, S., Paushkin, S., Wyce, A., Dreyfuss, G. SMN, the product of the spinal muscular atrophy gene, binds preferentially to dimethylarginine-containing protein targets. Molecular Cell. 7 (5), 1111-1117 (2001).
- Lee, J. H., Park, G. H., Lee, Y. K., Park, J. H. Changes in the arginine methylation of organ proteins during the development of diabetes mellitus. Diabetes Research and Clinical Practice. 94 (1), 111-118 (2011).
- Bulau, P., et al. Analysis of methylarginine metabolism in the cardiovascular system identifies the lung as a major source of ADMA. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 292 (1), 18-24 (2007).
- Zakrzewicz, D., Eickelberg, O. From arginine methylation to ADMA: a novel mechanism with therapeutic potential in chronic lung diseases. BMC Pulmonary Medicine. 9, 5 (2009).
- Fulton, M. D., Brown, T., Zheng, Y. G. The biological axis of protein arginine methylation and asymmetric dimethylarginine. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), (2019).
- Aliferis, K. A., Chrysayi-Tokousbalides, M. Metabolomics in pesticide research and development: review and future perspectives. Metabolomics. 7 (1), 35-53 (2011).
- Chiang, K., et al. PRMT5 Is a Critical Regulator of Breast Cancer Stem Cell Function via Histone Methylation and FOXP1 Expression. Cell Reports. 21 (12), 3498-3513 (2017).
- Blanc, R. S., Vogel, G., Chen, T., Crist, C., Richard, S. PRMT7 preserves satellite cell regenerative capacity. Cell Reports. 14 (6), 1528-1539 (2016).
- Lim, Y., Lee, E., Lee, J., Oh, S., Kim, S. Down-regulation of asymmetric arginine methylation during replicative and H2O2-induced premature senescence in WI-38 human diploid fibroblasts. Journal of Biochemistry. 144 (4), 523-529 (2008).
- Bhatter, N., et al. Arginine methylation augments Sbp1 function in translation repression and decapping. FEBS Journal. 286 (23), 4693-4708 (2019).
- Lee, Y. H., Stallcup, M. R. Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation. Molecular Endocrinology. 23 (4), 425-433 (2009).
- Zhang, F., et al. Global analysis of protein arginine methylation. Cell Reports Methods. 1 (2), (2021).
- Zinellu, A., Sotgia, S., Scanu, B., Deiana, L., Carru, C. Determination of protein-incorporated methylated arginine reference values in healthy subjects whole blood and evaluation of factors affecting protein methylation. Clinical Biochemistry. 41 (14-15), 1218-1223 (2008).
- Weiss, M., Manneberg, M., Juranville, J. F., Lahm, H. W., Fountoulakis, M. Effect of the hydrolysis method on the determination of the amino acid composition of proteins. Journal of Chromatography A. 795 (2), 263-275 (1998).
- Davids, M., et al. Simultaneous determination of asymmetric and symmetric dimethylarginine, L-monomethylarginine, L-arginine, and L-homoarginine in biological samples using stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 900, 38-47 (2012).
- Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation. Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).
- Vignoli, A., et al. High-throughput metabolomics by 1D NMR. Angewandte Chemie International Edition. 58 (4), 968-994 (2019).
- Carr, H. Y., Purcell, E. M. Effects of diffusion on free precession in nuclear magnetic resonance experiments. Physical Review. 94 (3), 630-638 (1954).
- Meiboom, S., Gill, D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation times. Review of Scientific Instruments. 29 (8), 688-691 (1958).
- Nagayama, K., Wuthrich, K., Bachmann, P., Ernst, R. R. Two-dimensional J-resolved 1H n.m.r. spectroscopy for studies of biological macromolecules. Biochemical and Biophysical Research Communications. 78 (1), 99-105 (1977).
- Stryeck, S., et al. Serum concentrations of Citrate, Tyrosine, 2- and 3- Hydroxybutyrate are associated with increased 3-month mortality in acute heart failure patients. Scientific Reports. 9 (1), 6743 (2019).
- Zhang, F., et al. Tissue-specific landscape of metabolic dysregulation during ageing. Biomolecules. 11 (2), (2021).
- Zhang, F., et al. Growing human hepatocellular tumors undergo a global metabolic reprogramming. Cancers. 13 (8), (2021).
- Pahlich, S., Zakaryan, R. P., Gehring, H. Protein arginine methylation: Cellular functions and methods of analysis. Biochimica et Biophysica Acta. 1764 (12), 1890-1903 (2006).
- Habisch, H. J., et al. Neuroectodermally converted human mesenchymal stromal cells provide cytoprotective effects on neural stem cells and inhibit their glial differentiation. Cytotherapy. 12 (4), 491-504 (2010).
- Ibanez, G., McBean, J. L., Astudillo, Y. M., Luo, M. An enzyme-coupled ultrasensitive luminescence assay for protein methyltransferases. Analytical Biochemistry. 401 (2), 203-210 (2010).
- Hevel, J. M., Price, O. M. Rapid and direct measurement of methyltransferase activity in about 30min. Methods. 175, 3-9 (2020).
- Altincekic, N., et al. Site-specific detection of arginine methylation in highly repetitive protein motifs of low sequence complexity by NMR. Journal of the American Chemical Society. 142 (16), 7647-7654 (2020).
- Kaneb, H. M., Dion, P. A., Rouleau, G. A. The FUS about arginine methylation in ALS and FTLD. The EMBO Journal. 31 (22), 4249-4251 (2012).
