Summary

Explorando el metiloma de arginina mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear

Published: December 16, 2021
doi:

Summary

El presente protocolo describe la preparación y medición cuantitativa de arginina y metilargininas libres y unidas a proteínas mediante espectroscopia de RMN-1H.

Abstract

La arginina unida a proteínas se metila comúnmente en muchas proteínas y regula su función alterando las propiedades fisicoquímicas, su interacción con otras moléculas, incluidas otras proteínas o ácidos nucleicos. Este trabajo presenta un protocolo fácilmente implementable para cuantificar la arginina y sus derivados, incluyendo dimetilarginina asimétrica y simétrica (ADMA y SDMA, respectivamente) y monometil arginina (MMA). Después del aislamiento de proteínas de fluidos biológicos corporales, tejidos o lisados celulares, se describe un método simple para la homogeneización, precipitación de proteínas e hidrólisis de proteínas. Dado que los hidrolizados contienen muchos otros componentes, como otros aminoácidos, lípidos y ácidos nucleicos, es esencial un paso de purificación mediante extracción en fase sólida (SPE). SPE se puede realizar manualmente utilizando centrífugas o un robot pipeteador. La sensibilidad para ADMA utilizando el protocolo actual es de aproximadamente 100 nmol / L. El límite superior de detección de arginina es de 3 mmol / L debido a la saturación de SPE. En resumen, este protocolo describe un método robusto, que abarca desde la preparación de muestras biológicas hasta la detección basada en RMN, proporcionando valiosos consejos y dificultades para un trabajo exitoso al estudiar el metiloma de arginina.

Introduction

Durante las últimas dos décadas, la metilación de los residuos de arginina ha sido reconocida como una modificación posttraduccional esencial de las proteínas. Afecta a procesos biológicos fundamentales como la regulación de la transcripción, la transducción de señales y muchos más1. Las principales proteínas implicadas en la regulación de la metilación de la arginina son las proteínas arginina metiltransferasas (PRMTs)2. Los principales derivados de la arginina son ω-(N G,N G)-dimetilarginina asimétrica (ADMA), ω-(N G,N’G)-dimetilarginina simétrica (SDMA), y ω-N G-monometilarginina (MMA)2.

Los PRMT utilizan S-adenosil-l-metionina para transferir grupos metilo al grupo guanidino terminal (con dos grupos amino equivalentes) de arginina1 unida a proteínas. Se pueden distinguir dos enzimas principales: tanto las enzimas de tipo I como las de tipo II catalizan el primer paso de metilación para formar MMA (que por lo tanto pierde su simetría). Después de este paso, las enzimas de tipo I (por ejemplo, PRMT1, 2, 3, 4, 6, 8) utilizan MMA como sustrato para formar ADMA, mientras que las enzimas de tipo II (principalmente PRMT5 y PRMT9) producen SDMA. PRMT1 fue la primera proteína arginina metiltransferasa aislada de células de mamíferos3. Aún así, los PRMT se han conservado evolutivamente4 en otros animales como vertebrados no mamíferos, cordados de invertebrados, equinodermos, artrópodos y nematodos cnidarios5, plantas6 y protozoos, incluidos hongos como la levadura7. En muchos casos, el knockout de uno de los PRMT conduce a la pérdida de viabilidad, revelando el papel esencial de las especies de arginina metilada involucradas en procesos celulares fundamentales como la transcripción, traducción, transducción de señales, apoptosis y separación de fase líquido-líquido (es decir, la formación de orgánulos sin membrana, por ejemplo, nucléolos), que regularmente involucra dominios ricos en arginina 8,9,10 . A su vez, esto influye en la fisiología y los estados de enfermedad, incluyendo cáncer 11,12,13, mieloma múltiple 14, enfermedades cardiovasculares15, patogénesis viral, atrofia muscular espinal 16, diabetes mellitus 17 y envejecimiento1. Se cree que el aumento de los niveles de ADMA en el torrente sanguíneo, por ejemplo, derivado del pulmón18 debido a la descomposición de proteínas, está relacionado con la disfunción endotelial, la enfermedad pulmonar crónica19 y otros síndromes de enfermedad cardiovascular20. Se ha encontrado que la sobreexpresión de PRMT acelera la tumorigénesis y se asocia con mal pronóstico21,22. Además, la ablación de PRMT6 y PRMT7 desencadena un fenotipo de senescencia celular23. Se ha encontrado una disminución significativa de ADMA y PRMT1 durante el envejecimiento de los fibroblastos WI-3824.

El desafío es comprender cómo actúa la metilación en los procesos (pato)fisiológicos identificando y cuantificando la metilación de la proteína arginina. La mayoría de los enfoques actuales utilizan anticuerpos para detectar argininas metiladas. Sin embargo, estos anticuerpos siguen siendo específicos del contexto y podrían no reconocer diferentes motivos de proteínas metiladas con arginina25,26. En el protocolo descrito, todos los derivados de arginina mencionados anteriormente pueden ser cuantificados de manera confiable por espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), es decir, solos, en combinación o, como en la mayoría de los casos, dentro de matrices biológicas complejas como células eucariotas (por ejemplo, de levadura, ratón u origen humano) y tejidos27, así como suero28. Para las proteínas y esas matrices complejas, la hidrólisisde proteínas 29 es un requisito previo para generar aminoácidos libres (modificados), como arginina, MMA, SDMA y ADMA. La extracción en fase sólida (SPE)30 permite el enriquecimiento de los compuestos de interés. Finalmente, la espectroscopia de 1H-RMN permite la detección paralela de arginina y todos los principales derivados metílicos de la arginina. La espectroscopia de RMN tiene la ventaja de que es genuinamente cuantitativa, altamente reproducible y una técnica robusta31,32. Las mediciones finales de RMN se pueden hacer después cuando se hayan recogido y preparado muchas muestras. Finalmente, este protocolo se centra principalmente en la preparación de muestras, ya que no requiere un espectrómetro de RMN propio. Se puede realizar en la mayoría de los laboratorios bioquímicos. Aún así, en este trabajo se proporcionan algunas pistas sobre qué mediciones de espectroscopia de RMN se deben realizar.

Protocol

Se utilizaron hidrolizados de proteínas de levadura como muestras para los resultados representativos de este trabajo. Todo el protocolo se resume en la Figura 1. 1. Preparación de materiales y reactivos Metanol/agua: prepare una mezcla de dos partes de metanol al 99% (MeOH) y una parte de H2O, designada como MeOH/H2O. Almacene MeOH puro y MeOH/H2Oa -20 °C para minimizar la evaporación del alcohol y aumentar la …

Representative Results

Rutinariamente , lasproyecciones 1 H 1D de espectros de RMN 2D resueltos en J (JRES) virtualmente desacoplados se utilizan para asignaciones de picos y cuantificaciones en nuestro laboratorio36. La Figura 3 muestra espectros representativos de JRES de hidrolizados de proteínas de levadura purificados utilizando el presente protocolo SPE. Aunque en concentraciones muy diferentes, ambas sustancias pueden separarse y cuantificarse en una matriz celular. Basad…

Discussion

En la siguiente sección, el enfoque principal radica en el método en sí; las implicaciones biológicas de la metilación de la arginina se describen en la sección Introducción.

En primer lugar, los tejidos de diferente rigidez pueden necesitar un ajuste de la lisis de la muestra: las células del cultivo celular (incluidas bacterias, levaduras, etc.) y tejidos como el cerebro, el hígado joven, el músculo liso, etc., pueden homogeneizarse rápidamente. Para tejidos de alta rigidez (inclu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El trabajo fue apoyado por las subvenciones del Fondo Austríaco para la Ciencia (FWF) P28854, I3792, doc.funds BioMolStruct DOC 130, DK-MCD W1226 BioTechMed-Graz (proyecto emblemático DYNIMO), la Agencia Austriaca de Promoción de la Investigación (FFG) otorga 864690 y 870454, el Centro de Investigación del Metabolismo Integrativo de Graz; Programa de Infraestructura Austriaca 2016/2017, el Gobierno de Estiria (Zukunftsfonds) y el Fondo de Inicio para Talentos de Alto Nivel de la Universidad Médica de Fujian (XRCZX2021020). Agradecemos al Centro de Investigación Médica por el acceso a las instalaciones de cultivo celular. F.Z. se formó en el marco del programa de doctorado Medicina Molecular de la Universidad Médica de Graz. Q.Z. se formó en el marco del programa de doctorado Enfermedades metabólicas y cardiovasculares de la Universidad Médica de Graz.

Materials

15 mL tubes Greiner Bio One 188271
3-(trimethylsilyl) propionic acid-2,2,3,3-d4 sodium salt (TSP) Alfa Aesar A1448
5 mL tubes, round bottom Greiner Bio One 115101
Ammonia Solution 32% Roth A990.1
Bruker 600 MHz NMR spectrometer, equipped with a TXI probe head Bruker
Centrifuge, refrigerated, e.g. 5430 R Eppendorf 5428000010
Chloroform ≥99% p.a. Roth 3313.1
Cryocool Thermo Scientific SCC1 heat transfer fluid for SpeedVac System
Deuterium Oxide (D2O) Cambridge Isotope Laboratories DLM-10-PK
Dimethyl sulfoxide-d6 (d6-DMSO) Cambridge Isotope Laboratories DLM-6-1000
Drying Chamber Binder 9090-0018
DURAN culture tubes, 13 x 100mm, GL 14, 9 mL VWR International 212-0375
Edwards Deep vacuum oil pump RV5 Thermo Scientific 16234611 part of the SpeedVac System
Eppendorf 1.5 mL tubes Greiner Bio One 616201
Gilson pipetting robot GX-241 Aspec Gilson Inc. 26150008
L-arginine AppliChem A3675
Methanol ≥99% Roth 8388.4
Milli-Q water aparatus Millipore ZIQ7000T0
Oasis MCX 1cc/30 mg, 1 mL cartridges Waters 186000252 https://www.waters.com/waters/en_US/Waters-Oasis-Sample-Extraction-SPE-Products/
Phosphate Buffered Saline (PBS) Lonza LONBE17-512F
Precellys 24 tissue homogenizer Bertin Instruments P000669-PR240-A https://www.bertin-instruments.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys24-tissue-homogenizer/
Precellys tubes (pulping tubes) VWR International 432-0351
Precellyse 1.4 mm zirconium oxide beads VWR International 432-0356
Reacti-Therm/ReactiVap Heating, Stirring, and Evaporation Modules Thermo Scientific TS-18820 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/TS-18820
Rotor for 1.5 mL tubes, FA-45-30-11 Eppendorf 5427753001
Savant Refrigerated Cooling Trap Thermo Scientific 15996161 part of the SpeedVac System
Savant SpeedVac vacuum concentrator SPD210 Thermo Scientific 15906181 part of the SpeedVac System; equipped with rotor for 1.5 ml tubes
Screw caps for glas vials with PTFE sealing, DN9 Dr. R. Forche Chromatographie CT11B3011
Seasand Roth 8441.3
Short thread glas vials 1.5 mL, ND9 Dr. R. Forche Chromatographie VT1100309
Sodium azide (NaN3) Roth K305.1
Sodium hydroxide (NaOH) VWR BDH7363-4
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) VWR 80731-078
TopSpin 4.0 (Software) Bruker https://www.bruker.com
ω-NG-asymmetric dimethylarginine (ADMA) Santa Cruz Biotechnology sc-208093
ω-NG-monomethylarginine (MMA) Santa Cruz Biotechnology sc-200739A
ω-NG-NG'-symmetric dimethylarginine (SDMA) Santa Cruz Biotechnology sc-202235A

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Cite This Article
Habisch, H., Zhang, F., Zhou, Q., Madl, T. Exploring the Arginine Methylome by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. J. Vis. Exp. (178), e63245, doi:10.3791/63245 (2021).

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