El presente protocolo describe la preparación y medición cuantitativa de arginina y metilargininas libres y unidas a proteínas mediante espectroscopia de RMN-1H.
La arginina unida a proteínas se metila comúnmente en muchas proteínas y regula su función alterando las propiedades fisicoquímicas, su interacción con otras moléculas, incluidas otras proteínas o ácidos nucleicos. Este trabajo presenta un protocolo fácilmente implementable para cuantificar la arginina y sus derivados, incluyendo dimetilarginina asimétrica y simétrica (ADMA y SDMA, respectivamente) y monometil arginina (MMA). Después del aislamiento de proteínas de fluidos biológicos corporales, tejidos o lisados celulares, se describe un método simple para la homogeneización, precipitación de proteínas e hidrólisis de proteínas. Dado que los hidrolizados contienen muchos otros componentes, como otros aminoácidos, lípidos y ácidos nucleicos, es esencial un paso de purificación mediante extracción en fase sólida (SPE). SPE se puede realizar manualmente utilizando centrífugas o un robot pipeteador. La sensibilidad para ADMA utilizando el protocolo actual es de aproximadamente 100 nmol / L. El límite superior de detección de arginina es de 3 mmol / L debido a la saturación de SPE. En resumen, este protocolo describe un método robusto, que abarca desde la preparación de muestras biológicas hasta la detección basada en RMN, proporcionando valiosos consejos y dificultades para un trabajo exitoso al estudiar el metiloma de arginina.
Durante las últimas dos décadas, la metilación de los residuos de arginina ha sido reconocida como una modificación posttraduccional esencial de las proteínas. Afecta a procesos biológicos fundamentales como la regulación de la transcripción, la transducción de señales y muchos más1. Las principales proteínas implicadas en la regulación de la metilación de la arginina son las proteínas arginina metiltransferasas (PRMTs)2. Los principales derivados de la arginina son ω-(N G,N G)-dimetilarginina asimétrica (ADMA), ω-(N G,N’G)-dimetilarginina simétrica (SDMA), y ω-N G-monometilarginina (MMA)2.
Los PRMT utilizan S-adenosil-l-metionina para transferir grupos metilo al grupo guanidino terminal (con dos grupos amino equivalentes) de arginina1 unida a proteínas. Se pueden distinguir dos enzimas principales: tanto las enzimas de tipo I como las de tipo II catalizan el primer paso de metilación para formar MMA (que por lo tanto pierde su simetría). Después de este paso, las enzimas de tipo I (por ejemplo, PRMT1, 2, 3, 4, 6, 8) utilizan MMA como sustrato para formar ADMA, mientras que las enzimas de tipo II (principalmente PRMT5 y PRMT9) producen SDMA. PRMT1 fue la primera proteína arginina metiltransferasa aislada de células de mamíferos3. Aún así, los PRMT se han conservado evolutivamente4 en otros animales como vertebrados no mamíferos, cordados de invertebrados, equinodermos, artrópodos y nematodos cnidarios5, plantas6 y protozoos, incluidos hongos como la levadura7. En muchos casos, el knockout de uno de los PRMT conduce a la pérdida de viabilidad, revelando el papel esencial de las especies de arginina metilada involucradas en procesos celulares fundamentales como la transcripción, traducción, transducción de señales, apoptosis y separación de fase líquido-líquido (es decir, la formación de orgánulos sin membrana, por ejemplo, nucléolos), que regularmente involucra dominios ricos en arginina 8,9,10 . A su vez, esto influye en la fisiología y los estados de enfermedad, incluyendo cáncer 11,12,13, mieloma múltiple 14, enfermedades cardiovasculares15, patogénesis viral, atrofia muscular espinal 16, diabetes mellitus 17 y envejecimiento1. Se cree que el aumento de los niveles de ADMA en el torrente sanguíneo, por ejemplo, derivado del pulmón18 debido a la descomposición de proteínas, está relacionado con la disfunción endotelial, la enfermedad pulmonar crónica19 y otros síndromes de enfermedad cardiovascular20. Se ha encontrado que la sobreexpresión de PRMT acelera la tumorigénesis y se asocia con mal pronóstico21,22. Además, la ablación de PRMT6 y PRMT7 desencadena un fenotipo de senescencia celular23. Se ha encontrado una disminución significativa de ADMA y PRMT1 durante el envejecimiento de los fibroblastos WI-3824.
El desafío es comprender cómo actúa la metilación en los procesos (pato)fisiológicos identificando y cuantificando la metilación de la proteína arginina. La mayoría de los enfoques actuales utilizan anticuerpos para detectar argininas metiladas. Sin embargo, estos anticuerpos siguen siendo específicos del contexto y podrían no reconocer diferentes motivos de proteínas metiladas con arginina25,26. En el protocolo descrito, todos los derivados de arginina mencionados anteriormente pueden ser cuantificados de manera confiable por espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), es decir, solos, en combinación o, como en la mayoría de los casos, dentro de matrices biológicas complejas como células eucariotas (por ejemplo, de levadura, ratón u origen humano) y tejidos27, así como suero28. Para las proteínas y esas matrices complejas, la hidrólisisde proteínas 29 es un requisito previo para generar aminoácidos libres (modificados), como arginina, MMA, SDMA y ADMA. La extracción en fase sólida (SPE)30 permite el enriquecimiento de los compuestos de interés. Finalmente, la espectroscopia de 1H-RMN permite la detección paralela de arginina y todos los principales derivados metílicos de la arginina. La espectroscopia de RMN tiene la ventaja de que es genuinamente cuantitativa, altamente reproducible y una técnica robusta31,32. Las mediciones finales de RMN se pueden hacer después cuando se hayan recogido y preparado muchas muestras. Finalmente, este protocolo se centra principalmente en la preparación de muestras, ya que no requiere un espectrómetro de RMN propio. Se puede realizar en la mayoría de los laboratorios bioquímicos. Aún así, en este trabajo se proporcionan algunas pistas sobre qué mediciones de espectroscopia de RMN se deben realizar.
En la siguiente sección, el enfoque principal radica en el método en sí; las implicaciones biológicas de la metilación de la arginina se describen en la sección Introducción.
En primer lugar, los tejidos de diferente rigidez pueden necesitar un ajuste de la lisis de la muestra: las células del cultivo celular (incluidas bacterias, levaduras, etc.) y tejidos como el cerebro, el hígado joven, el músculo liso, etc., pueden homogeneizarse rápidamente. Para tejidos de alta rigidez (inclu…
The authors have nothing to disclose.
El trabajo fue apoyado por las subvenciones del Fondo Austríaco para la Ciencia (FWF) P28854, I3792, doc.funds BioMolStruct DOC 130, DK-MCD W1226 BioTechMed-Graz (proyecto emblemático DYNIMO), la Agencia Austriaca de Promoción de la Investigación (FFG) otorga 864690 y 870454, el Centro de Investigación del Metabolismo Integrativo de Graz; Programa de Infraestructura Austriaca 2016/2017, el Gobierno de Estiria (Zukunftsfonds) y el Fondo de Inicio para Talentos de Alto Nivel de la Universidad Médica de Fujian (XRCZX2021020). Agradecemos al Centro de Investigación Médica por el acceso a las instalaciones de cultivo celular. F.Z. se formó en el marco del programa de doctorado Medicina Molecular de la Universidad Médica de Graz. Q.Z. se formó en el marco del programa de doctorado Enfermedades metabólicas y cardiovasculares de la Universidad Médica de Graz.
15 mL tubes | Greiner Bio One | 188271 | |
3-(trimethylsilyl) propionic acid-2,2,3,3-d4 sodium salt (TSP) | Alfa Aesar | A1448 | |
5 mL tubes, round bottom | Greiner Bio One | 115101 | |
Ammonia Solution 32% | Roth | A990.1 | |
Bruker 600 MHz NMR spectrometer, equipped with a TXI probe head | Bruker | – | |
Centrifuge, refrigerated, e.g. 5430 R | Eppendorf | 5428000010 | |
Chloroform ≥99% p.a. | Roth | 3313.1 | |
Cryocool | Thermo Scientific | SCC1 | heat transfer fluid for SpeedVac System |
Deuterium Oxide (D2O) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-10-PK | |
Dimethyl sulfoxide-d6 (d6-DMSO) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-6-1000 | |
Drying Chamber | Binder | 9090-0018 | |
DURAN culture tubes, 13 x 100mm, GL 14, 9 mL | VWR International | 212-0375 | |
Edwards Deep vacuum oil pump RV5 | Thermo Scientific | 16234611 | part of the SpeedVac System |
Eppendorf 1.5 mL tubes | Greiner Bio One | 616201 | |
Gilson pipetting robot GX-241 Aspec | Gilson Inc. | 26150008 | |
L-arginine | AppliChem | A3675 | |
Methanol ≥99% | Roth | 8388.4 | |
Milli-Q water aparatus | Millipore | ZIQ7000T0 | |
Oasis MCX 1cc/30 mg, 1 mL cartridges | Waters | 186000252 | https://www.waters.com/waters/en_US/Waters-Oasis-Sample-Extraction-SPE-Products/ |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | LONBE17-512F | |
Precellys 24 tissue homogenizer | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | https://www.bertin-instruments.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys24-tissue-homogenizer/ |
Precellys tubes (pulping tubes) | VWR International | 432-0351 | |
Precellyse 1.4 mm zirconium oxide beads | VWR International | 432-0356 | |
Reacti-Therm/ReactiVap Heating, Stirring, and Evaporation Modules | Thermo Scientific | TS-18820 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/TS-18820 |
Rotor for 1.5 mL tubes, FA-45-30-11 | Eppendorf | 5427753001 | |
Savant Refrigerated Cooling Trap | Thermo Scientific | 15996161 | part of the SpeedVac System |
Savant SpeedVac vacuum concentrator SPD210 | Thermo Scientific | 15906181 | part of the SpeedVac System; equipped with rotor for 1.5 ml tubes |
Screw caps for glas vials with PTFE sealing, DN9 | Dr. R. Forche Chromatographie | CT11B3011 | |
Seasand | Roth | 8441.3 | |
Short thread glas vials 1.5 mL, ND9 | Dr. R. Forche Chromatographie | VT1100309 | |
Sodium azide (NaN3) | Roth | K305.1 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | VWR | BDH7363-4 | |
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | VWR | 80731-078 | |
TopSpin 4.0 (Software) | Bruker | – | https://www.bruker.com |
ω-NG-asymmetric dimethylarginine (ADMA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-208093 | |
ω-NG-monomethylarginine (MMA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-200739A | |
ω-NG-NG'-symmetric dimethylarginine (SDMA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-202235A |