Summary
El presente protocolo describe la preparación y medición cuantitativa de arginina y metilargininas libres y unidas a proteínas mediante espectroscopia de RMN-1H.
Abstract
La arginina unida a proteínas se metila comúnmente en muchas proteínas y regula su función alterando las propiedades fisicoquímicas, su interacción con otras moléculas, incluidas otras proteínas o ácidos nucleicos. Este trabajo presenta un protocolo fácilmente implementable para cuantificar la arginina y sus derivados, incluyendo dimetilarginina asimétrica y simétrica (ADMA y SDMA, respectivamente) y monometil arginina (MMA). Después del aislamiento de proteínas de fluidos biológicos corporales, tejidos o lisados celulares, se describe un método simple para la homogeneización, precipitación de proteínas e hidrólisis de proteínas. Dado que los hidrolizados contienen muchos otros componentes, como otros aminoácidos, lípidos y ácidos nucleicos, es esencial un paso de purificación mediante extracción en fase sólida (SPE). SPE se puede realizar manualmente utilizando centrífugas o un robot pipeteador. La sensibilidad para ADMA utilizando el protocolo actual es de aproximadamente 100 nmol / L. El límite superior de detección de arginina es de 3 mmol / L debido a la saturación de SPE. En resumen, este protocolo describe un método robusto, que abarca desde la preparación de muestras biológicas hasta la detección basada en RMN, proporcionando valiosos consejos y dificultades para un trabajo exitoso al estudiar el metiloma de arginina.
Introduction
Durante las últimas dos décadas, la metilación de los residuos de arginina ha sido reconocida como una modificación posttraduccional esencial de las proteínas. Afecta a procesos biológicos fundamentales como la regulación de la transcripción, la transducción de señales y muchos más1. Las principales proteínas implicadas en la regulación de la metilación de la arginina son las proteínas arginina metiltransferasas (PRMTs)2. Los principales derivados de la arginina son ω-(N G,N G)-dimetilarginina asimétrica (ADMA), ω-(N G,N'G)-dimetilarginina simétrica (SDMA), y ω-N G-monometilarginina (MMA)2.
Los PRMT utilizan S-adenosil-l-metionina para transferir grupos metilo al grupo guanidino terminal (con dos grupos amino equivalentes) de arginina1 unida a proteínas. Se pueden distinguir dos enzimas principales: tanto las enzimas de tipo I como las de tipo II catalizan el primer paso de metilación para formar MMA (que por lo tanto pierde su simetría). Después de este paso, las enzimas de tipo I (por ejemplo, PRMT1, 2, 3, 4, 6, 8) utilizan MMA como sustrato para formar ADMA, mientras que las enzimas de tipo II (principalmente PRMT5 y PRMT9) producen SDMA. PRMT1 fue la primera proteína arginina metiltransferasa aislada de células de mamíferos3. Aún así, los PRMT se han conservado evolutivamente4 en otros animales como vertebrados no mamíferos, cordados de invertebrados, equinodermos, artrópodos y nematodos cnidarios5, plantas6 y protozoos, incluidos hongos como la levadura7. En muchos casos, el knockout de uno de los PRMT conduce a la pérdida de viabilidad, revelando el papel esencial de las especies de arginina metilada involucradas en procesos celulares fundamentales como la transcripción, traducción, transducción de señales, apoptosis y separación de fase líquido-líquido (es decir, la formación de orgánulos sin membrana, por ejemplo, nucléolos), que regularmente involucra dominios ricos en arginina 8,9,10 . A su vez, esto influye en la fisiología y los estados de enfermedad, incluyendo cáncer 11,12,13, mieloma múltiple 14, enfermedades cardiovasculares15, patogénesis viral, atrofia muscular espinal 16, diabetes mellitus 17 y envejecimiento1. Se cree que el aumento de los niveles de ADMA en el torrente sanguíneo, por ejemplo, derivado del pulmón18 debido a la descomposición de proteínas, está relacionado con la disfunción endotelial, la enfermedad pulmonar crónica19 y otros síndromes de enfermedad cardiovascular20. Se ha encontrado que la sobreexpresión de PRMT acelera la tumorigénesis y se asocia con mal pronóstico21,22. Además, la ablación de PRMT6 y PRMT7 desencadena un fenotipo de senescencia celular23. Se ha encontrado una disminución significativa de ADMA y PRMT1 durante el envejecimiento de los fibroblastos WI-3824.
El desafío es comprender cómo actúa la metilación en los procesos (pato)fisiológicos identificando y cuantificando la metilación de la proteína arginina. La mayoría de los enfoques actuales utilizan anticuerpos para detectar argininas metiladas. Sin embargo, estos anticuerpos siguen siendo específicos del contexto y podrían no reconocer diferentes motivos de proteínas metiladas con arginina25,26. En el protocolo descrito, todos los derivados de arginina mencionados anteriormente pueden ser cuantificados de manera confiable por espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), es decir, solos, en combinación o, como en la mayoría de los casos, dentro de matrices biológicas complejas como células eucariotas (por ejemplo, de levadura, ratón u origen humano) y tejidos27, así como suero28. Para las proteínas y esas matrices complejas, la hidrólisisde proteínas 29 es un requisito previo para generar aminoácidos libres (modificados), como arginina, MMA, SDMA y ADMA. La extracción en fase sólida (SPE)30 permite el enriquecimiento de los compuestos de interés. Finalmente, la espectroscopia de 1H-RMN permite la detección paralela de arginina y todos los principales derivados metílicos de la arginina. La espectroscopia de RMN tiene la ventaja de que es genuinamente cuantitativa, altamente reproducible y una técnica robusta31,32. Las mediciones finales de RMN se pueden hacer después cuando se hayan recogido y preparado muchas muestras. Finalmente, este protocolo se centra principalmente en la preparación de muestras, ya que no requiere un espectrómetro de RMN propio. Se puede realizar en la mayoría de los laboratorios bioquímicos. Aún así, en este trabajo se proporcionan algunas pistas sobre qué mediciones de espectroscopia de RMN se deben realizar.
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Protocol
Se utilizaron hidrolizados de proteínas de levadura como muestras para los resultados representativos de este trabajo. Todo el protocolo se resume en la Figura 1.
1. Preparación de materiales y reactivos
- Metanol/agua: prepare una mezcla de dos partes de metanol al 99% (MeOH) y una parte de H2O, designada como MeOH/H2O. Almacene MeOH puro y MeOH/H2Oa -20 °C para minimizar la evaporación del alcohol y aumentar la estabilidad de la muestra.
- Ácido clorhídrico (HCl): diluir 9 mol/L de HCl concentrado (12,0 mol/L o 37%), así como 0,1 mol/L de HCl. La solución de mayor concentración (9 mol/L) se utiliza para la hidrólisis de proteínas, mientras que la de menor concentración (0,1 mol/L) se utiliza para la extracción en fase sólida.
PRECAUCIÓN: Trabaje dentro de la campana extractora. - Prepare una solución de reemplazo para SPE que contenga 10% de una solución de amoníaco saturada (madre: 30% p/p de amoníaco), 50% de metanol y 40% de agua (v/v).
- Tampón de RMN: Disolver 5,56 g de hidrogenofosfato disódico (Na2HPO 4, 0,08 mol/L), 0,4 g de sal sódica (TSP, 5 mmol/L) de ácido 3-(trimetilsilil) propiónico-2,2,3,3-d4 (TSP, 5 mmol/L), 0,04 % (p/v) de azida sódica (NaN3) en 500 ml de dióxido de deuterio (D2O) y ajustar a pH7,4 (usando HCl o NaOH, respectivamente) (véase el cuadro de materiales). Compruebe la pureza de cada nuevo lote de tampón mediante espectroscopia de RMN.
NOTA: La cantidad de cualquier contaminante (por ejemplo, etanol) debe ser lo más baja posible. - Llene los tubos de pulpa con perlas de óxido de circonio (los tubos de 2 ml y las perlas de 1,4 mm son adecuados para la mayoría de las aplicaciones, pero hay diferentes variantes disponibles) (consulte la Tabla de materiales). Llene aproximadamente 10-20 cuentas a mano o compre tubos precargados, que también están disponibles.
- Mantenga las pipetas y las puntas respectivas listas en el rango de 10-1,000 μL.
NOTA: Durante todo el trabajo se utilizó agua altamente pura, designada comoH2O, definida por una alta resistencia de ≥18.2 MΩ·cm-1. Corresponde al agua destilada doble.
2. Recogida y almacenamiento de muestras
- Congelar rápidamente las muestras líquidas (suero/plasma, sobrenadante de cultivo celular, etc.) con nitrógeno líquido y almacenarlas a -80 °C hasta su uso.
- Prepare los materiales sólidos como se menciona a continuación.
- Recolectar las células de cultivos celulares (3-5 millones de células) ya sea recolectando células adherentes, después del lavado con solución salina tamponada con fosfato frío, raspado y centrifugación, o centrifugación directa de células cultivadas en suspensión.
- Retirar los sobrenadantes celulares (que podrían recogerse para su posterior análisis, ya sea mediante medición directa consecutiva, ver paso 6, o después de la precipitación de proteínas solubles, ver paso 3.1), y luego congelar rápidamente los gránulos con nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C. Para un procesamiento posterior, consulte el paso 3.2.
- Almacenar y recoger los tejidos según el objetivo del estudio. Para tejidos muy homogéneos, como el hígado o el músculo, analiza cualquier parte del mismo. Por ejemplo, en el caso de un cerebro de ratón, determine la metilación global de arginina de todo el cerebro o secciones cerebrales.
NOTA: El peso ideal de los tejidos a procesar es de 30-60 mg. Es recomendable congelar y pulverizar todo el cerebro y utilizar alícuotas del mismo. Alternativamente, se pueden usar partes específicas del cerebro (por ejemplo, frontal, cerebelo, regiones occipitales o un hemisferio, que pesa ~ 250 mg).
3. Preparación preliminar de la muestra
NOTA: Realice el trabajo en hielo, manteniendo el MeOH frío. Las muestras también deben mantenerse en hielo para evitar la degradación de proteínas.
- Para muestras líquidas, añadir 400 μL de metanol helado a 200 μL de la muestra. Continúe con el paso 3.3.
NOTA: Si hay menos muestra disponible, ajuste los volúmenes en consecuencia; La sensibilidad a la RMN suele ser lo suficientemente alta para cantidades de muestra más pequeñas, pero debe probarse individualmente. - En el caso de materiales sólidos, preparar suficientes tubos de 1,5 ml para los lisados (uso para centrifugación después de la homogeneización).
- Con cuidado, pero a fondo, resuspender los gránulos celulares en 600 μL de MeOH/H2Oy transferir toda la fase líquida a los tubos de pulpa.
- Coloque los pañuelos en tubos de pulpa (puede pesarlos directamente en los tubos) y agregue 600 μL de MeOH / H2O (para 30-60 mg; ajuste si el peso difiere sustancialmente).
- Coloque los tubos en el homogeneizador de tejidos (consulte la Tabla de materiales) y homogeneice una vez durante 20 s con agitación intensa (para gránulos celulares, tejidos blandos) o dos veces durante 20 s cada uno (o más si es necesario) con un intervalo de 5 minutos entre ellos (para tejidos rígidos).
- Después de la homogeneización, vuelva inmediatamente a colocar las muestras en el hielo y transfiera todo el lisado a nuevos tubos de 1,5 ml.
- Almacenar las muestras durante al menos 30 minutos (hasta varios días) a -20 °C antes de procesarlas.
- Centrifugar a 10.000 x g durante 30 min a 4 °C. Mientras tanto, prepare suficientes tubos de 1,5 ml para recoger los sobrenadantes.
NOTA: Este sobrenadante (designado "(1)" en la Figura 1) puede descartarse, liofilizarse y procesarse directamente para RMN (paso 6) o analizarse de otra manera. - En este protocolo, el precipitado de MeOH (= pellet obtenido después del paso 3.1 o 3.2.2, respectivamente) se utiliza para análisis adicionales que contienen, entre otras cosas, componentes tales como ácidos nucleicos y lípidos, proteínas metiladas por arginina. Continuar con hidrólisis proteica o conservar los gránulos a -20 °C durante unos días.
4. Hidrólisis de proteínas
- Añadir 500 μL de 9 mol/L de HCl a cada muestra. Luego, trunque las tapas de cada tubo con tijeras y colóquelas en los tubos de cultivo de vidrio (Figura 2A). Con cuidado, pero con fuerza, cierre las tapas rojas (verificando así el sellado).
NOTA: Antes de usar, siempre revise cada sellado (lámina de PTFE gris dentro de los tapones de rosca rojos) para que esté aprietando adecuadamente y límpielos regularmente con agua. - Cuando termine, coloque los tubos en un vaso de precipitados parcialmente lleno de arena (para una mejor transferencia de calor) e hidrolice las muestras durante aproximadamente 16 h a 110 ° C en una cámara de secado.
- Después de la hidrólisis, enfriar las muestras (~1 h).
- Después de eso, liofilizar durante la noche usando una centrífuga con un alto vacío (por debajo de 100 Pa).
- Disuelva los pellets, si están completamente secos (si no, continúe la liofilización), en 1 ml de HCl de 0,1 mol/L y agregue 50 μL de cloroformo (CHCl3) a cada tubo; Disuelva completamente el pellet con una pipeta de 1.000 μL, mezclando así los líquidos, y luego transfiera el volumen completo a un nuevo tubo.
PRECAUCIÓN: Siempre trabaje con pequeñas cantidades para minimizar la evaporación extensa - Luego, centrifugar a 8,000 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
- Recoja cuidadosamente la fase superior del líquido bifásico que contiene la fracción soluble en agua (Figura 2B, la fracción con la densidad más baja) con una pipeta y llénela en tubos nuevos. Utilice tubos de 1,5 ml para SPE manual (sección 5.2) o viales de vidrio para SPE robótica (sección 5.3 y figura 2D). Evite derramar sobre CHCl3 y su contenido (Figura 2C).
5. Extracción en fase sólida (SPE)
- Antes del primer uso, limpie los cartuchos SPE dos veces con 1 ml de la solución de reposición (paso 1.3) seguido de centrifugación a 800 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente (colocado en tubos de 15 ml). Se pueden usar 10-20 veces cada uno.
- Manual SPE
- Acondicione previamente los cartuchos (consulte la Tabla de materiales) en cada serie con 1 ml de metanol puro y 2 x 1 ml de PBS, cada vez seguido de centrifugación a 800 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente (colocado en tubos de 15 ml).
- Después, cargue las muestras (del paso 4.7) en los cartuchos SPE y centrifugarlas a 600 x g durante 2 min a temperatura ambiente.
- Luego, aplique un ciclo de lavado como se menciona a continuación.
- Añadir tres veces 1 ml deH2O(cada uno seguido de centrifugación durante 1 min a 800 x g a temperatura ambiente).
- Añadir cinco veces 1 ml de HCl de 0,1 mol/L (cada uno seguido de centrifugación durante 1 minuto a 800 x g a temperatura ambiente).
- Añadir dos veces 1 ml de MeOH (cada uno seguido de centrifugación durante 1 min a 800 x g a temperatura ambiente).
- Luego, eluir la arginina y sus derivados con 3 x 1 ml de solución de reemplazo (seguida de centrifugación 1 min a 800 x g a temperatura ambiente) en un solo tubo de 15 ml.
NOTA: La solución de reemplazo sirve como eluyente para arginina y derivados y también se usa para limpiar los cartuchos (todas las sustancias se lavan antes de la elución o al valor de pH básico de la solución de reemplazo). Aún así, para evitar la contaminación con el tiempo, la reutilización debe limitarse (ver paso 5.1).
- SPE robótico
NOTA: Aquí, un robot de pipeteo (la parte principal que consiste en una aguja de pipeteo, una estación de lavado para la aguja, un suministro de reactivo y posiciones para muestras y eluidos, consulte la Tabla de materiales) se suministra con un soporte de cartucho para las columnas SPE. Para otros instrumentos, asegúrese de estar completamente equipado con todas las cosas enumeradas.- Llene el sobrenadante (a partir del paso 4.7) directamente en viales de vidrio con sellado de PTFE (Figura 2D), prepare suficientes reactivos (100 ml de cada uno, es decir, solución de reemplazo, 99% de MeOH, PBS,H2Oy 0,1 de mol/L HCl), tubos de 5 ml para la elución y solución de lavado para la aguja del robot (generalmenteH2O).
- Utilice una aplicación o método en el software del robot basado precisamente en los pasos descritos para SPE manual (paso 5.2).
NOTA: Los detalles pueden variar mucho entre los proveedores de instrumentos, así que consulte el manual de software del robot respectivo para la programación. Un robot de pipeteo generalmente funciona aplicando presión de aire sobre los cartuchos en lugar de centrifugación, que es la principal diferencia. Si el protocolo se establece y se ejecuta por primera vez, incluya controles (por ejemplo, L-arginina de concentración conocida) para verificar un flujo de trabajo óptimo.
6. Preparación final para la RMN
- Liofilizar las muestras durante la noche para completar la sequedad para eliminar el amoníaco yH2O.
- Disolver cada muestra en 500 μL de tampón de RMN (paso 1.4) y transferir a tubos de RMN. Es importante destacar que el volumen debe ser el mismo en todos los tubos, y las muestras deben ser homogéneas (libres de residuos y lípidos, que tienden a agregarse).
NOTA: Los detalles de la espectroscopia de RMN van más allá de esta revisión del método y se describen con más detalle en otra parte27. Aquí, solo se explican los principales requisitos y pasos. La cuantificación de la arginina y sus metabolitos se realiza en un espectrómetro de RMN de 600 MHz (ver Tabla de materiales). En principio, se puede utilizar cualquier otro espectrómetro de RMN/intensidad de campo de RMN, siempre que las señales de RMN de arginina y argininas metiladas puedan detectarse con suficiente sensibilidad y sin superposición de señales. Se puede utilizar cualquier cabezal de sonda con gradientes de eje z capaz de registrar espectrosH de 1, siempre que las secuencias de pulsos se configuren en consecuencia. - Registre un espectro 1D utilizando la secuencia de pulsos CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill)33,34 (cpmgpr1d, 512 escaneos, tamaño de fid 73728, ancho espectral de 11904.76 Hz en una RMN de 600 MHz, retardo de reciclaje 4 s) con supresión de señal de agua mediante presaturación.
- En estos experimentos, elimine los acoplamientos escalares de 1H mediante el desacoplamiento virtual, reduciendo la superposición de señales. Registrar adicionales para preguntas específicas y/o muestras o matrices complejas, por ejemplo, 1espectro de coherencia cuántica simple (HSQC) H-13C-heteronuclear27.
NOTA: Para matrices más complejas en las que las señales de RMN 1H de argininas metiladas podrían superponerse parcialmente con señales de RMN 1 H de otros metabolitos (por ejemplo, lisina), se requieren espectros homonucleares J (JRES)35 de 1H. - Realizar la cuantificación absoluta integrando las respectivas intensidades máximas de los patrones de una concentración conocida, por ejemplo, 100 μmol/arginina.
NOTA: Rutinariamente, ADMA, SDMA y MMA (ver Tabla de materiales) se informan como una proporción relativa a la arginina. Esto tiene la ventaja significativa de que no es necesario realizar una normalización separada (por ejemplo, número de células, masa tisular, concentraciones de proteínas). En ese caso, la arginina sirve como un estándar interno, y la cuantificación relativa es suficiente para obtener información biológicamente relevante. - Para la diferenciación de SDMA y MMA, liofilizar las muestras nuevamente para deshacerse deD2O(si han sido resuspendidas en tampón de RMN anteriormente), que luego es reemplazado por dimetilsulfóxido deuterado (d6-DMSO), permitiendo la resolución de resonancias metílicos27. Por lo tanto, aspirar las muestras de los tubos de RMN con pipetas Pasteur, liofilizar y disolverlas en 500 μL de d6-DMSO.
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Representative Results
Rutinariamente , lasproyecciones 1 H 1D de espectros de RMN 2D resueltos en J (JRES) virtualmente desacoplados se utilizan para asignaciones de picos y cuantificaciones en nuestro laboratorio36. La Figura 3 muestra espectros representativos de JRES de hidrolizados de proteínas de levadura purificados utilizando el presente protocolo SPE. Aunque en concentraciones muy diferentes, ambas sustancias pueden separarse y cuantificarse en una matriz celular. Basado en el número de protones del grupo metilo específico (-CH3) o metileno (-CH2-) en el cambio químico respectivo , laespectroscopia 1 H-RMN permite una cuantificación precisa. Como se señala en el protocolo (paso 0), la cuantificación relativa de un derivado de metil-arginina en comparación con la arginina es principalmente adecuada para observar procesos biológicos, por ejemplo, cambios en la metilación de arginina como respuesta a modulaciones, como la eliminación / sobreexpresión de genes, cambios en los nutrientes o el tratamiento con inhibidores.
Como se mostró anteriormente 27, la L-arginina y el ADMA pueden ser bien discriminados por sus diferentes cambios químicos característicos a3.25 y 3.02 ppm, respectivamente. Los protones metilo SDMA y MMA revelan picos superpuestos enD2O(el tampón de RMN descrito en el paso 1.4) a un cambio químico de 2,85 ppm. Si hay un pico en la posición respectiva, se puede separar SDMA y MMA disolviendo las muestras en d 6-DMSO como se describe en el paso6.6 del protocolo. Usando este enfoque, los cambios químicos de RMN 1H de SDMA y MMA se pueden separar y cuantificar con cambios químicos característicos a 2,76 ppm (SDMA) y 2,74 ppm (MMA)27. La Figura 3B muestra datos representativos de SDMA y MMA (ambos 100 μmol/L) en D2O y d6-DMSO, respectivamente. Los datos correspondientes de SMDA y MMA detectados en varias células y tejidos han sido reportados recientemente27. Como se describe en los pasos 6.4-6.5 del protocolo, para la cuantificación pueden utilizarse patrones de referencia de concentraciones conocidas. Todas las normas de referencia mencionadas en el texto están disponibles comercialmente.
Figura 1: Descripción general de la preparación de la muestra. Esquema que revela los pasos significativos desde la recolección de muestras hasta la medición de RMN. Las casillas negras se refieren a la numeración en las secciones de protocolo. Además, se muestra la cantidad aproximada de días (que varían según el número de muestras). Las muestras líquidas no homogéneas pueden centrifugarse antes de añadir MeOH (paso 3.1) para eliminar los residuos (no se muestra). El sobrenadante después de la centrifugación inicial (1) que contenga, por ejemplo, metabolitos intracelulares o metabolitos de arginina no unidos a proteínas puede almacenarse a -20 °C para su posterior análisis. Rutinariamente, los pellets de MeOH (2) se analizan más a fondo. Abreviaturas: CHCl3, cloroformo; HCl: ácido clorhídrico; MeOH: metanol; RMN: resonancia magnética nuclear; o/n, durante la noche; SN: sobrenadante; SPE: extracción en fase sólida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Manipulación de hidrolizados proteicos y preparación para extracción en fase sólida. (A) Vaso de precipitados lleno de arena, tubos de vidrio, tapones de rosca con lámina de sellado de politetrafluoroetileno gris (PTFE) y muestras en tubos de 1,5 ml después de cortar las tapas. (B) Tubo después de la centrifugación (paso 4.6) y (C) después de la eliminación del sobrenadante acuoso (paso 4.7): puede quedar algo de agua residual (~50 μL). El residuo negro contiene restos orgánicos insolubles y carbonizados. Aún así, algunas muestras pueden contener sustancias coloreadas (D), que no interfieren con la medición de L-arginina. Esto se debe en parte a la extracción en fase sólida (SPE) posterior, ya sea utilizando pasos de centrifugación consecutivos (E) o un robot de pipeteo (F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Espectros típicos de RMN de L-arginina y sus metilderivados. 1 Los espectros de RMN resuelta J proyectados por H 1D podrían distinguir fácilmente los protones δ-(CH2)-de L-arginina (3,25 ppm) y los protones ω-N-CH3-de dimetilarginina asimétrica (ADMA, a 3,02 ppm). Las muestras de pellets de levadura (A) que revelan cantidades variables de ADMA se pueden cuantificar integrando intensidades de señal incluso en presencia de altas cantidades de arginina (tenga en cuenta que no se muestra el pico completo de arginina). (B) Dado que la ω-(N G,N'G)-dimetilarginina simétrica (SDMA) y la ω-N G-monometilarginina (MMA) difícilmente pueden discriminarse en el tampón de óxido de deuterio (D 2 O), las muestras deben disolverse en dimetilsulfóxido deuterado (d6-DMSO), donde los picos (en este caso 100 μmol/L de cada sustancia) pueden distinguirse fácilmente entre sí (picos a 2,75 y2,76ppm). respectivamente) y cuantificarse. Todos los espectrogramas se exportaron directamente desde el software de control del espectrómetro de RMN. El software revela los resultados primarios, que deben verificarse antes de realizar un análisis más detallado, incluidas las estadísticas de muchas muestras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En la siguiente sección, el enfoque principal radica en el método en sí; las implicaciones biológicas de la metilación de la arginina se describen en la sección Introducción.
En primer lugar, los tejidos de diferente rigidez pueden necesitar un ajuste de la lisis de la muestra: las células del cultivo celular (incluidas bacterias, levaduras, etc.) y tejidos como el cerebro, el hígado joven, el músculo liso, etc., pueden homogeneizarse rápidamente. Para tejidos de alta rigidez (incluyendo hígado de sujetos de edad avanzada, arterias, huesos, etc.), la homogeneización debe realizarse dos veces (ver paso 3.2.3). Sin embargo, este proceso no debe continuarse más a menudo, incluso si quedan algunos restos insolubles. En su lugar, las muestras deben centrifugarse durante 10 minutos a 10.000 x g y los sobrenadantes deben recogerse para su posterior análisis (para minimizar la degradación de la muestra).
En cada paso donde se congelan las muestras (inicialmente, después de agregar MeOH, pasos 3.3, 3.4 o 3.5, respectivamente) o después de la liofilización (pasos 4.4 y 6.1), las muestras se pueden almacenar durante unos días antes de su posterior procesamiento. Además, el sobrenadante de la etapa 3.4 (después de la homogeneización; designado como "(1)" en la Figura 1) también puede almacenarse para su posterior análisis, por ejemplo, para la medición de metabolitos distintos de las metilargininas36,37,38.
Por un lado, los pasos críticos implican el almacenamiento de muestras, ya que la degradación de las proteínas puede alterar el resultado. Si la degradación de proteínas ocurre antes de la precipitación de MeOH, la arginina y sus derivados metílicos pueden subestimarse. Por lo tanto, el almacenamiento de muestras es esencial, por ejemplo, antes y después de la lisis celular o tisular a -20 °C, o, siempre que sea posible, a -80 °C. Antes o después de la homogeneización (paso 3.2), las muestras deben conservarse en hielo.
Por otro lado, el pretratamiento con metanol de muestras para precipitar proteínas no altera el patrón de metilación de la arginina. Esto fue probado con extractos de lisozima y proteína de Escherichia coli (que no contienen arginina metilada)27. Sin embargo, informes anteriores han demostrado que MeOH puede metilar los grupos carboxilo terminales de glutamato y aspartato39.
Para la hidrólisis de proteínas, asegúrese de que los sellados de los tapones de rosca estén intactos (paso 4.1). De lo contrario, la evaporación del HCl podría afectar a la cámara de secado. Sin embargo, la concentración de los analitos podría no cambiar críticamente, porque no se evaporan, y el HCl residual se evapora más tarde por liofilización. Se pueden usar concentraciones más bajas de HCl, por ejemplo, 6 mol / L, pero pueden requerir un tiempo de hidrólisis más largo. Después de la hidrólisis, las muestras pueden tratarse a temperatura ambiente. Sin embargo, la eliminación adecuada de lípidos es esencial. Los lípidos pueden formar mezclas bifásicas en agua (o D2O, respectivamente) más tarde durante la medición de RMN. Esas inhomogeneidades conducen a la ampliación del pico de RMN y potencialmente afectan la calidad y sensibilidad de los experimentos de RMN.
Si no hay un robot de pipeteo disponible para SPE, vale la pena la inversión (también se puede utilizar para otros fines). Las muestras en el robot de pipeteo SPE se procesan secuencialmente, y en la configuración actual, una muestra tarda ~ 40 minutos para una ejecución completa. Debido a las limitaciones de las capacidades de reactivo (es decir, 100 ml), solo se pueden procesar 19 muestras de una sola vez (tomando ~ 13 h en total). Aún así, el tiempo de práctica es mucho menor que para el procedimiento manual de SPE y requiere menos material. Durante este período, las muestras se pueden almacenar dentro del robot a temperatura ambiente hasta la liofilización. Los productos equivalentes pueden reemplazar las matrices y cartuchos SPE usados. Sin embargo, se recomienda evaluar el protocolo SPE y ajustarlo si es necesario.
El límite de detección para ADMA es ~ 100 nmol / L según lo evaluado previamente por diluciones en serie y utilizando los tiempos de medición de RMN informados. Por otro lado, las altas concentraciones de arginina también pueden sobreestimar la proporción de ADMA a arginina (que generalmente está en el rango de 5% -15%). Esto se debe a que por encima de 3 mmol / L de arginina; la capacidad de encuadernación de la columna SPE puede alcanzar la saturación27. Para verificar la sensibilidad y la especificidad de todo el flujo de trabajo en caso de resultados inesperados (por ejemplo, sin picos o picos superpuestos en los espectros de 1H-RMN en los cambios químicos informados), los estándares de ADMA, SDMA y MMA están disponibles de proveedores comerciales (consulte la Tabla de materiales). Si algún laboratorio no tiene espectrómetro de RMN, todos los pasos, incluida la liofilización final (paso 6.1), podrían realizarse en el laboratorio respectivo, y las muestras podrían enviarse a una instalación de RMN para su análisis.
En comparación con otros métodos, como la espectrometría de masas, no se necesita el etiquetado de los analitos, y se puede realizar sin estándares internos para la cuantificación. Por otro lado, la sensibilidad de la RMN es ligeramente menor, lo que en la mayoría de los casos biológicos, aunque no juega ningún papel, como la arginina y sus derivados metílicos se pueden detectar fácilmente en todo tipo de células o tejidos eucariotas. Como se mencionó anteriormente, 3 millones de células son suficientes para cuantificar ADMA unido a proteínas, varias células que se pueden lograr fácilmente con la mayoría de las líneas celulares. En el caso de células primarias de crecimiento lento y no modificadas de origen humano, como las células madre adultas40, las células pueden cultivarse durante un período más prolongado o agruparse a partir de experimentos separados. Lo mismo es cierto para las muestras de tejido. ~ 30 mg de tejido, correspondiente a muchos órganos, por ejemplo, de ratones (en parte o en todo, por ejemplo, músculos pequeños) o muestra de biopsia, es suficiente para preparar suficiente lisado e hidrolizado de proteínas para la medición de RMN27. Otros métodos para medir la metilación de la proteína arginina incluyen el uso de ensayos de luminiscencia acoplada a enzimas41 o 3S-adenosil-metionina (SAM) marcados con H42. La sensibilidad es alta y podría aumentarse mediante el uso de SAM con etiqueta C 14, pero a expensas de mayores costos. Además, el uso de sustancias radiactivas (incluidos los fluidos para el conteo de centelleo) provoca una gestión especial de los residuos, que no es necesaria utilizando el protocolo actual.
Un método complementario al presente protocolo, utilizando espectroscopia de RMN heteronuclear 2D, puede revelar patrones de metilación específicos del sitio dentro de proteínas aisladas. Recientemente ha sido publicado, incluyendo una descripción detallada de la detección de metil-argininas por espectroscopia de RMN en general43. El protocolo actual no proporciona información sobre la metilación de arginina específica del sitio dentro de las proteínas. Aún así, la metilación global cambia a nivel celular y fisiológico, incluyendo el crecimiento y la diferenciación celular, el envejecimiento, el cáncer 1,2,12, cardiovascular20 y las enfermedades neurodegenerativas 8,44. Los detalles sobre los mecanismos exactos involucrados aún no se comprenden completamente, y los posibles candidatos a fármacos que interfieren con la metilación proteína-arginina11 tanto in vitro como in vivo necesitan una mayor exploración1. El estudio de la cinética de la metilación (que nuestro grupo ha demostrado recientemente)27 es esencial para obtener información sobre la modificación de la arginina y los mecanismos de descomposición de proteínas. Las mediciones globales de metilación de arginina y los experimentos cinéticos (las muestras se pueden congelar en cualquier momento) que van desde proteínas individuales hasta muestras de organismos completos se pueden lograr directamente utilizando este protocolo. Por lo tanto, proporciona un método robusto, que puede adaptarse fácilmente para futuras investigaciones.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.
Acknowledgments
El trabajo fue apoyado por las subvenciones del Fondo Austríaco para la Ciencia (FWF) P28854, I3792, doc.funds BioMolStruct DOC 130, DK-MCD W1226 BioTechMed-Graz (proyecto emblemático DYNIMO), la Agencia Austriaca de Promoción de la Investigación (FFG) otorga 864690 y 870454, el Centro de Investigación del Metabolismo Integrativo de Graz; Programa de Infraestructura Austriaca 2016/2017, el Gobierno de Estiria (Zukunftsfonds) y el Fondo de Inicio para Talentos de Alto Nivel de la Universidad Médica de Fujian (XRCZX2021020). Agradecemos al Centro de Investigación Médica por el acceso a las instalaciones de cultivo celular. F.Z. se formó en el marco del programa de doctorado Medicina Molecular de la Universidad Médica de Graz. Q.Z. se formó en el marco del programa de doctorado Enfermedades metabólicas y cardiovasculares de la Universidad Médica de Graz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | Greiner Bio One | 188271 | |
| 3-(trimethylsilyl) propionic acid-2,2,3,3-d4 sodium salt (TSP) | Alfa Aesar | A1448 | |
| 5 mL tubes, round bottom | Greiner Bio One | 115101 | |
| Ammonia Solution 32% | Roth | A990.1 | |
| Bruker 600 MHz NMR spectrometer, equipped with a TXI probe head | Bruker | - | |
| Centrifuge, refrigerated, e.g. 5430 R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chloroform ≥99% p.a. | Roth | 3313.1 | |
| Cryocool | Thermo Scientific | SCC1 | heat transfer fluid for SpeedVac System |
| Deuterium Oxide (D2O) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-10-PK | |
| Dimethyl sulfoxide-d6 (d6-DMSO) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-6-1000 | |
| Drying Chamber | Binder | 9090-0018 | |
| DURAN culture tubes, 13 x 100mm, GL 14, 9 mL | VWR International | 212-0375 | |
| Edwards Deep vacuum oil pump RV5 | Thermo Scientific | 16234611 | part of the SpeedVac System |
| Eppendorf 1.5 mL tubes | Greiner Bio One | 616201 | |
| Gilson pipetting robot GX-241 Aspec | Gilson Inc. | 26150008 | |
| L-arginine | AppliChem | A3675 | |
| Methanol ≥99% | Roth | 8388.4 | |
| Milli-Q water aparatus | Millipore | ZIQ7000T0 | |
| Oasis MCX 1cc/30 mg, 1 mL cartridges | Waters | 186000252 | https://www.waters.com/waters/en_US/Waters-Oasis-Sample-Extraction-SPE-Products/ |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | LONBE17-512F | |
| Precellys 24 tissue homogenizer | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | https://www.bertin-instruments.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys24-tissue-homogenizer/ |
| Precellys tubes (pulping tubes) | VWR International | 432-0351 | |
| Precellyse 1.4 mm zirconium oxide beads | VWR International | 432-0356 | |
| Reacti-Therm/ReactiVap Heating, Stirring, and Evaporation Modules | Thermo Scientific | TS-18820 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/TS-18820 |
| Rotor for 1.5 mL tubes, FA-45-30-11 | Eppendorf | 5427753001 | |
| Savant Refrigerated Cooling Trap | Thermo Scientific | 15996161 | part of the SpeedVac System |
| Savant SpeedVac vacuum concentrator SPD210 | Thermo Scientific | 15906181 | part of the SpeedVac System; equipped with rotor for 1.5 ml tubes |
| Screw caps for glas vials with PTFE sealing, DN9 | Dr. R. Forche Chromatographie | CT11B3011 | |
| Seasand | Roth | 8441.3 | |
| Short thread glas vials 1.5 mL, ND9 | Dr. R. Forche Chromatographie | VT1100309 | |
| Sodium azide (NaN3) | Roth | K305.1 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | VWR | BDH7363-4 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | VWR | 80731-078 | |
| TopSpin 4.0 (Software) | Bruker | - | https://www.bruker.com |
| ω-NG-asymmetric dimethylarginine (ADMA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-208093 | |
| ω-NG-monomethylarginine (MMA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-200739A | |
| ω-NG-NG'-symmetric dimethylarginine (SDMA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-202235A |
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