Энтомопатогенные грибы приобрели значение в качестве агентов биологического контроля сельскохозяйственных насекомых-вредителей. В данном исследовании было успешно проведено массовое производство достаточного количества устойчивых инфекционных пропагул южноафриканских изолятов как Metarhizium robertsii , так и M. pinghaense для коммерческого применения против насекомых-вредителей с использованием сельскохозяйственных зерновых продуктов.
Энтомопатогенные грибы видового комплекса Metarhizium anisopliae приобрели значение в качестве агентов биологического контроля сельскохозяйственных насекомых-вредителей. Повышение устойчивости вредителей к химическим инсектицидам, растущая обеспокоенность по поводу негативного воздействия инсектицидов на здоровье человека и загрязнение окружающей среды пестицидами привели к глобальному стремлению найти новые устойчивые стратегии защиты растений и борьбы с вредителями. Ранее предпринимались попытки массовой культивации таких энтомопатогенных видов грибов (EPF), как Beauveria bassiana . Однако были предприняты лишь ограниченные попытки массового культивирования Metarhizium robertsii и M. pinghaense для использования против насекомых-вредителей. Это исследование было направлено на массовое получение достаточного количества устойчивых инфекционных пропагул южноафриканских изолятов M. robertsii и M. pinghaense для коммерческого применения. Три сельскохозяйственных зерновых продукта, слоеный овес, шелушащийся ячмень и рис, были использованы в качестве твердых ферментационных субстратов EPF. Для инокуляции твердых субстратов использовали два метода инокуляции, конидиальные суспензии и жидкую грибковую культуру бластоспор. Было отмечено, что инокуляция с использованием конидиальных суспензий была относительно менее эффективной, поскольку на твердых субстратах наблюдались повышенные уровни загрязнения по сравнению с использованием метода инокуляции бластоспор. Было обнаружено, что шелушащийся овес не является подходящим субстратом для роста как для M. robertsii , так и для M. pinghaense, поскольку с субстрата не собирали сухих конидий. Было обнаружено, что шелушеный ячмень благоприятствует производству M. robertsii conidia по сравнению с M. pinghaense, и в среднем из субстрата было собрано 1,83 г ± 1,47 г сухой M. robertsii conidia и ноль граммов M. pinghaense conidia. Было обнаружено, что рисовые зерна благоприятствуют конидиальному массовому производству изолятов M. pinghaense и M. robertsii , в среднем 8,2 г ± 4,38 г и 6 г ± 2 г, собранных из субстрата, соответственно.
Энтомопатогенные грибы (EPF) приобрели важное значение в качестве средств защиты растений в биологической борьбе с важными сельскохозяйственными насекомыми-вредителями 1,2. Энтомопатогены, встречающиеся естественным образом в почве, вызывают эпизоотии в популяциях различных видов вредителей3. Виды EPF специфичны для хозяина и представляют относительно небольшой риск с точки зрения нападения на нецелевые виды, и они нетоксичны для окружающей среды4. EPF имеют уникальный механизм для вторжения в своего хозяина, а также для распространения и сохранения в их ближайшем окружении1. Они атакуют хозяина в основном через бесполые споры, которые прикрепляются и проникают в кутикулу хозяина, чтобы вторгнуться и размножаться в гемокоэле хозяина. Хозяин в конечном итоге умирает из-за истощения питательных веществ гемолимфы или в результате токсикоза, вызванного токсичными метаболитами, выделяемыми грибком. После смерти, в идеальных условиях окружающей среды, грибок появляется на внешней поверхности (явный микоз) трупа хозяина 5,6.
Растущая обеспокоенность по поводу негативного воздействия химических остатков на здоровье человека, загрязнения окружающей среды и развития устойчивости к вредителям привела к глобальному стремлению сократить потребление инсектицидов на химической основе и найти альтернативные, новые и устойчивые стратегии защиты растений и борьбы с вредителями 6,7,8 . Это предоставило возможности для разработки инсектицидов на основе микробов для использования в программах комплексной борьбы с вредителями (IPM), которые являются более экологически благоприятными стратегиями, чем обычный химический контроль 3,8.
Чтобы разработать успешный микробный агент борьбы с сельскохозяйственным вредителем, подходящий организм должен быть сначала выделен, охарактеризован, идентифицирован и подтверждена его патогенность для целевого вредителя. Однако для получения жизнеспособного продукта для использования в программах биологического контроля 9,10,11,12,13 требуется простой и экономически эффективный метод крупномасштабного производства микробного агента. Массовое производство значительных количеств высококачественных энтомопатогенов зависит от микробного штамма, окружающей среды, целевого вредителя, состава, рынка, стратегии применения и желаемого конечного продукта 14,15,16. EPF может быть массово произведен с использованием ферментации жидкого субстрата для получения бластоспор или процесса ферментации твердого субстрата для получения воздушных конидий 6,17,18. Однако процесс массового производства и рецептуры энтомопатогенов напрямую влияет на вирулентность, стоимость, срок годности и полевую эффективность конечного продукта. Для успешного использования в IPM процесс производства энтомопатогенов должен быть простым в эксплуатации, требовать минимальной рабочей силы, производить высокую концентрацию вирулентных, жизнеспособных и стойких пропагул и быть недорогим 4,13,14,16.
Понимание потребностей в питании энтомопатогенов важно для массового выращивания всеми методами культивирования 4,12. Питательные компоненты производственной среды оказывают значительное влияние на характеристики полученных пропагул, включая эффективность биоконтроля, выход, устойчивость к высыханию и стойкость 8,19,20,21. Оптимизация производственных процедур предназначена для устранения таких факторов22. Для EPF основными требованиями для хорошего роста, споруляции и массового производства грибковых конидий являются достаточная влажность, оптимальная температура роста, рН, газообмен CO2 и O2 и питание, включая хорошие источники фосфора, углеводов, углерода и азота18.
Jaronski и Jackson18 описывают метод ферментации твердого субстрата как наиболее эффективный и наиболее близкий метод приближения к естественному процессу производства EPF по сравнению с методом ферментации жидкого субстрата, поскольку в естественных условиях грибковый конидиум переносится на твердые прямостоячие структуры, такие как поверхность трупов насекомых. Сельскохозяйственные продукты и побочные продукты, содержащие крахмал, в основном используются для массового производства гипокреальных грибов, поскольку грибы легко разлагают крахмал путем секреции высококонцентрированных гидролитических ферментов из своих гифальных кончиков, проникают в твердое вещество и получают доступ к питательным веществам, присутствующим в веществе 11,17,18,23 . Зерновые продукты также обеспечивают требования для здорового производства биомассы, потому что, когда они гидратируются и стерилизуются, субстраты могут поглощать дополнительные питательные вещества из любой жидкой среды 16,18,24.
Ранее в нескольких исследованиях предпринимались попытки массового культивирования видов EPF, таких как Beauveria bassiana (Bals.) Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Виегас и некоторые из Metarhizium anisopliae (Metschn.) Сорокинский видовой комплекс изолирует на различных субстратах 16,23,24. К таким массово производимым и коммерчески разработанным изолятам относятся Green Muscle® (штамм IMI 330189), разработанный из M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner) J.F. Bisch, Rehner & Humber, Metarhizium 69 (Meta 69 штамм ICIPE69), и Real Metarhizium 69 (L9281), разработанный из M. anisopliae, и Broadband® (штамм PPRI 5339) и Eco-Bb®, разработанный из B. bassiana25,26 . Однако были предприняты ограниченные попытки массовой культуры Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner & Humber и Metarhizium pinghaense Chen & Guo. Эти два изолята были выбраны в предыдущем исследовании как наиболее эффективные для борьбы с мучнистым червецом, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)27. Поэтому настоящее исследование направлено на формулирование и массовое производство достаточного количества устойчивых инфекционных пропагул местных изолятов M. robertsii и M. pinghaense для коммерческого применения против насекомых-вредителей. Метод ферментации твердого субстрата был использован для массового получения грибковых конидий для обоих изолятов EPF. Два метода инокуляции EPF, с использованием конидиальных суспензий и жидкой грибковой культуры бластоспор, были использованы для инокуляции твердых субстратов.
Успешная интеграция микробных агентов для биологической борьбы с важными сельскохозяйственными насекомыми-вредителями в агроэкосистему зависит как от успеха, так и от простоты массового производства энтомопатогенов в качестве первого шага в лабораторных условиях. Массовое произво?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Хорта Поме, Хорта Стоуна и Программу технологий и человеческих ресурсов для промышленности (THRIP: TP14062571871) за финансирование проекта.
ORCID:
Летоди Л. Матулве http://orcid.org/0000-0002-5118-3578
Антуанетта. Малан http://orcid.org/0000-0002-9257-0312
Номахолва Ф. Стокве http://orcid.org/0000-0003-2869-5652
0.05% Tween 20 | Lasec | Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water | |
20 mL McCartney bottles | Lasec | Used to make conidial suspensions | |
Aluminium foil | Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask | ||
Autoclave | Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process | ||
Autoclave bags | Lasec | Fermentation bags or solid substrate containers | |
Autoclave tape | Lasec | To secure PVC pipes on the fermentation bags | |
Brown Kraft paper bags | Used to dry conidia cultures on agricultural grains | ||
Bunsen burnner | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks) | |
Clear edge test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
Corn steep liquor | SIGMA | 66071-94-1 | Ingredient of the blastospore liquid medium |
Cotton Wool | Lasec | Used as plug of the neck for fermentation bags | |
Duran laboratory bottles | Neolab | Used to autoclave SDA medium and distilled water | |
Electrical tape | Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust | ||
ENDECOTTS test sieve | Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates | ||
Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask | Lasec | Carrier of the blastospore liquid medium | |
Ethanol (99%) | Lasec | Used to sterilize surgical blades and inoculating loops | |
Flaked barley | Health Connection Wholefoods | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
Flaked oats | Tiger brands | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
Glucose | Merck | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
Growth Chamber/ incubators | For growing fungal conidia culture | ||
Haemocytometer | Used to determine conidial concentrations | ||
Inoculating loops | Lasec | For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth | |
Kitchen rolling pin | Used to manipulate the solid grain substrate bed | ||
Laminar flow Cabinet | ESCO Laminar Flow Cabinet | Provide as sterile environment during substrate inoculation | |
Metarhizium pinghaense conidia | Stellenbosch University | 5HEID | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense |
Metarhizium robertsii conidia | Stellenbosch University | 6EIKEN | Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii |
Microscope | ZEIZZ (Scope. A1) | Used to determine conidial concentrations and conidial viability | |
Orbital shaker | IncoShake- LABOTEC | Used for the blastospore production process | |
Parboiled rice | Spekko | Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii | |
Penicillin-Streptomycin | SIGMA | Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination | |
Petri-dishes | Lasec | Containers for the SDA medium | |
Pipettes and pipette tips | Labnet (BioPette PLUS) | Used to measure liquids ingredients | |
Polyvinylchloride Marley waste pipe | Used to create a neck for the fermentation bag | ||
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | Ingredient of the blastospore liquid medium | |
Rubber band | Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks | ||
Sabaroud dextrose agar (SDA) | NEOGEN Culture Media | Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii | |
Sterile distilled water | To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions | ||
Sticky pad | Used to secure the seives on the vibratory shaker | ||
Surgical blade | Lasec | Used to scrape off spores from fungal cultures | |
Surgical paper | Lasec | Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag | |
Vibratory shaker | Used to shake conidia off the agricultural grain substrates | ||
Vortex mixer | Labnet (Labnet International, Inc.) | Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles | |
Yeast extract | Biolab | Added to the SDA medium to improve spore germination and growth | |
Zipper-lock bags | GLAD | Used to to store harvested fungal conidia |