Summary
細菌によって産生されるdsRNAの経口投与は、 カエノラブディティス・エレガンス において日常的に使用されているRNA干渉(RNAi)の送達方法であり、ここで成虫の蚊に適用することに成功した。我々の方法は、注射を使用せずに堅牢な逆遺伝学研究および伝達遮断ベクター研究を可能にする。
Abstract
RNA干渉は、20年間、逆遺伝子解析に多用されてきました。成虫の蚊では、二本鎖RNA(dsRNA)投与は主に注射 によって 行われており、これはかなりの時間を必要とし、フィールド用途には適していない。これらの制限を克服するために、ここでは、成体の アノフェレス・ガンビア科へのdsRNAの経口送達によるRNAiの堅牢な活性化のためのより効率的な方法を提示する。 エシェリヒア・コリ HT115株(DE3)で長いdsRNAを産生し、熱死したdsRNA含有細菌を10%スクロースに濃縮懸濁し、綿球上で成虫の蚊に 自由 摂取させた。コットンボールは、治療期間中、2日ごとに交換した。 ダブルセックス (性分化に関与する遺伝子)または フォークヘッド (唾液腺転写因子をコードする)を標的とするこの方法の使用は、定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)または蛍光共焦点顕微鏡によってそれぞれ測定されるように、標的遺伝子発現および/またはタンパク質免疫蛍光シグナルの減少をもたらした。唾液腺形態の欠陥も観察された。この非常に柔軟で、ユーザーフレンドリーで、低コストで、時間効率の良いdsRNA送達方法は、昆虫ベクター生理学およびそれ以降にとって重要な標的遺伝子に広く適用できる可能性がある。
Introduction
多くの病気は蚊によって伝染し、蚊の生理学と遺伝学の研究を重要な仕事にしています。これらの生物におけるRNAiの使用は、過去20年間に顕著であり、多くの蚊遺伝子1、2、3、4、5の機能的特徴付けを可能にしてきた。dsRNA送達に最も一般的に使用される技術はマイクロインジェクションであり、これは蚊を傷つける可能性があり、かなりの時間と労力を必要とするという欠点を有する。RNAiの経口送達方法は試験されているが、主に蚊の幼虫期に6、7、8、9である。成虫の蚊におけるdsRNAの経口送達は完全には研究されておらず、ベクター生物学およびベクター制御の研究に有用なツールとなる可能性がある。
マラリアは、感染した雌の蚊が感染していない宿主から血液の食事を採取し、マラリア原虫10を含む唾液を注入すると、アノフェレス蚊によって伝染する。最終的に蚊の唾液中に伝染するためには、寄生虫は、蚊の免疫系の回避、中腸障壁の通過、および唾液腺11の侵入を含む多くのハードルを克服しなければならない。蚊の唾液腺(SG)アーキテクチャは寄生虫の侵入の鍵であり、そのアーキテクチャは重要な唾液腺発現転写因子と性的二型性の決定要因の両方によって制御される。いくつかの高度に保存された転写因子は、唾液腺の細胞仕様および恒常性維持、ならびに血液摂食において機能する唾液タンパク質の産生および分泌のために必要とされる12,13,14。フォークヘッド(Fkh)は、昆虫SGの構造および機能の主要な調節因子として機能する翼のあるらせん転写因子である(ショウジョウバエおよびカイコの蛾の研究に基づく)15,16,17,18,19,20。ショウジョウバエSGsにおいて、FkhはSG特異的な塩基性ヘリックスループヘリックス(bHLH)転写因子であるセージとともに機能し、SGの生存および唾液産生を促進する19。ショウジョウバエにおける唾液産生の重要かつ肯定的な共調節因子は、分泌経路遺伝子21、22、23の発現をアップレギュレートするよく研究されたロイシンジッパー転写因子であるCrebAである。また、雌の唾液腺には形態学的分化の強い程度があり、これは血液摂食だけでなく、寄生虫がこの組織に侵入する能力においても重要な役割を果たしている可能性が高い24。
唾液腺の生存、構造、生理学、および性的二型性の決定に関与する遺伝子の多くは、複雑な時空間発現プロファイル25、26、27を有し、RNAiを誘導するためのdsRNAの従来の送達方法は、この組織または他の組織においてこれらの種類の遺伝子を標的とするのに必ずしも効率的ではない。しかしながら、ヒトスジシマカおよびアンガンビア蚊の幼虫期におけるdsRNAの経口送達は、dsx遺伝子の雌特異的形態を沈黙させるために首尾よく使用されている9、28。蚊の唾液腺にdsRNAを用いたこれまでの研究では、大量のdsRNAが必要であるにもかかわらず、サイレンシング効果は比較的長期間(少なくとも13日間)持続することが分かりました29。ここで、dsx、fkh、またはCrebAに対する配列特異的dsRNAを発現する熱死滅した大腸菌株HT115(DE3)が、成体雌蚊においてこれらの遺伝子のRNAiサイレンシングを誘導する能力を試験した。dsRNAの経口投与は、ガンビア科において遺伝子ノックダウンを誘発し、mRNAレベルの明確な低下を伴い、これらの遺伝子の機能喪失と一致する表現型を有する。したがって、このアプローチは、様々な唾液腺遺伝子の機能をノックダウンするために働く可能性が高い。
Protocol
1. 大腸菌 発現ベクターへのdsRNAのクローニング
- dsRNAの発現に適したベクターに挿入する標的遺伝子配列を選択する。次のメソッドを使用して、Vectorbase.org から式の値を取得します。
- ホームページ検索ボックスで目的の遺伝子(例えば 、表1)を検索する。
- 結果の遺伝子ページで、 8に移動します。トランスクリプトミクス セクション。
- リストされている関連するRNA-seqおよびマイクロアレイ遺伝子発現実験を探します。
- 関心のある値を表計算ソフトに書き起こし、データテーブルを作成します。
- 使用するT7プロモーターを少なくとも1つ有する市販のプラスミドを選択する。選択されたプラスミドがT7プロモーターを1つしか有さない場合(ほとんどの市販プラスミドがそうであるように)、目的の遺伝子に対するdsDNAの増幅に使用されるリバースプライマーに第2のT7プロモーターを含める。
注:標的遺伝子のdsRNA配列は、RNAi試薬30の設計のためのウェブアプリケーションE-RNAiを用いて選択することができる。長いdsRNA(約400bp)または短いヘアピン型のdsRNA(shRNA)のいずれかを、特定の遺伝子配列に基づいて設計することができる。これらの配列は、クローニング前に同一性確認のために増幅および配列決定する必要があります。この研究で使用した選択された遺伝子領域、プラスミド、およびプロモーターは、 補足ファイル1にリストされています。 - 前述の簡単なワンステップ手順に従ってクローニングを実行する 9,31.この目的のために、PCR産物を精製し、直鎖状プラスミドDNAに連結する。ライゲーションの産物をコンピテント大腸菌細胞32のヒートショック形質転換に使用する。青/白スクリーニングで形質転換細胞を選択します。T7プライマーPCRを用いてインサートの配向を確認し、M13プライマーを用いて配列を確認した。
注:ホワイト/ブルースクリーニングは、形質転換のために選択されたプラスミドがβ-ガラクトシダーゼをコードするlacZ遺伝子を有する場合に使用することができる。白色コロニーは、lacZ内に所望のインサートを含むべきであり、標的配列33の存在および配向をさらに確認するために選択することができる。 - 最初の形質転換からプラスミドを精製し、それを使用して、前述のようにコンピテント 大腸菌 HT115(DE3)を形質転換する34。インサート付きのプラスミドが有能な 大腸菌 HT115(DE3)に存在することを確認した後、単回使用のために細菌のグリセロールストックを作る。
注:適切な非関連対照dsRNAを、すべての実験で使用するために取得または準備する必要があります。この場合、シロイヌナズナ由来の外皮質(アリ)の無関係遺伝子に対する配列が用いられる。
2. dsRNAを発現する加熱死菌の作製
- 100 μg/mL のアンピシリンおよび 12.5 μg/mL のテトラサイクリンを含む 50 mL のルリアブロス (LB) 中の dsRNA 発現プラスミドを含む 115 株 HT115 (DE3) の 単一 細菌コロニーから、プラットフォームシェーカー (180 rpm) 上で 37 °C で 12 時間培養します。
- 細菌培養物(1:1000)を、100μg/mLのアンピシリンおよび12.5μg/mLのテトラサイクリンを含む2x酵母トリプトン(2x YT)培地に希釈する。
- 40μM(最終濃度)イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加することによりdsRNA産生を誘導する。
- 細胞がO.D.600=0.4に達したら、180rpm での撹拌を伴う37°Cで約2時間の誘導後、Taracenaら 9によって記載されるように加熱死菌の濃縮懸濁液を調製する。遠心分離(4000 x g、4°C、10分間)により細胞をペレット化し 、 1容量のリン酸ナトリウム緩衝液(PBS)で細胞を洗浄した。
- 同条件で再度スピンし、初期容量の1/100までPBSに再懸濁し、70°Cで1時間置いた。
- 熱死菌を400μLのアリコートにし、さらに使用するまで-20°Cで保存する(1週間以上保存しないでください)。この加熱死菌の懸濁液には、RNAi実験に特異的なdsRNAが含まれています。この手順は、標的遺伝子dsRNA-細菌と、各実験で使用する無関係なdsRNAコントロールの両方に対して実施します。
3. dsRNAを発現する熱死菌を蚊に給餌する
- dsRNAの1つのアリコート(HT115(DE3)細菌懸濁液)を解凍し、0.2%メチルパラベンを含む1.6mLの12%糖溶液と混合する。
- この溶液に小さな綿球を浸し、浸した綿球を生後5日の蚊を入れたケージに入れます。蚊がこの溶液を食べ、砂糖とdsRNA含有細菌の両方を同時に拾うようにしてください。
- dsRNA-糖液に浸した綿球を1日おきに8日間連続で交換する。
- 蚊かごを一定の条件、すなわち27°C、相対湿度80%、光周期12時間:暗黒光周期、30分の夜明けと30分の夕暮れの期間で区切って保管してください。
4. アッセイ対象遺伝子発現量
- 容器を氷の上に1分間置くか、蚊が動きを止めるまで、蚊を冷麻酔します。蚊が麻酔をかけられたら、冷たい表面に置いて解剖のために女性を隔離します。
- 蚊に70%エタノールをスプレーし、PBSでガラス表面に置く。一対の鉗子で、蚊の頭をしっかりと固定し、胸郭を非常にゆっくりと引っ張り、唾液腺をPBSに放出できるようにします。
- 10人が解剖されるまで、唾液腺を氷冷PBSに保管する。グアニジニウムチオシアネート - フェノール - クロロホルム法を用いたRNA抽出のためのプール10SGs。RNペレットを30 μLのRNase非含有水に懸濁する。
- 前のステップでSGから抽出したRNAの1μLアリコートを使用し、260および280nmにおける吸光度を読み取り、希釈係数を掛けることによって各サンプルのRNA濃度を計算する。~2.0の260/280比は良質のRNAを示す。
- 精製した RNA 1 μg を使用して、市販の逆転写キットを使用して相補的 DNA (cDNA) を合成します。
- cDNAを1:10希釈して、メーカーの推奨に従ってRT-PCR反応を調製します。各試料について、標的遺伝子に対する反応を準備し、並行して、ハウスキーピング(HK)遺伝子との反応を設定する。各遺伝子反応を技術的な3連で設定して、ランダム変動の影響を方法から排除します。
注:ここでは、 HK遺伝子としてアン・ガンビア科 リボソーム S7 遺伝子(GeneBank:L20837.1)および アクチン (VectorBase:AGAP000651)が用いられている。 - SYBR-greenメーカーの指示に従い、300nMの最終濃度ですべてのプライマーを使用してください。標準的なPCR条件で増幅する:95°Cで10分間、続いて95°Cで15秒、60°Cで60秒を40サイクル繰り返します。
注:遺伝子発現を定量するために、デルタデルタ-Ct法(ΔΔCt)が使用される。デルタCt(ΔCt)は、標的遺伝子のCtとハウスキーピング遺伝子のCtとの差である。ΔΔCtは、実験群のΔCtと対照群35のΔCtとの差である。
5.表現型評価:採血成功
- 血液供給能力を評価するために、標的および対照dsRNAで処理した15匹の雌の蚊のグループを小さなケージ(直径12cm)に設定し、4時間飢えさせた。
- 37°Cに設定した循環水浴を用いて、ガラス製の蚊送り装置(直径24mm)とパラフィルム膜を用いて、解繊した羊の血液を蚊に供する。
注:血液は、米国起源の健康なドナー動物から無菌的に採取し、抗凝固剤や添加剤なしで手動で解凍する商業ベンダーから入手することができます。 - 直接観察することにより、各グループで完全に充血するまでの最初の5人の女性から血液の食事を首尾よく獲得するためのプロービング試行の数を数えて記録します。
注:血液探索行動に影響を与えるエネルギー資源を妨げる可能性のある蚊の重大な代謝変化を避けるために、飢餓は最小限に抑えられました(4時間)。その結果、すべての蚊が熱心に血液ミールを求めるわけではなく、人間の匂いへの暴露、部屋と摂食面の間の温度変化などの時間変数の影響を減らすために、充血した雌の数を5人(各グループの合計の3分の1)に制限しました。
表現型評価:唾液腺の形態と関連タンパク質のダウンレギュレーション
- ステップ4.2で説明したように、新鮮な組織を1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で単離し、氷冷アセトン中で90秒間固定する。アセトンを除去した後、1x PBSで数回すすいでください。一次抗体と共に、1x PBSに希釈した抗血清( 材料表を参照)と共に4°Cで一晩インキュベートする。
注:唾液タンパク質に使用される一次抗体の同定については、 材料表 を参照してください(アノフェレス 抗血小板タンパク質、AAPP;ムチン2、MUC2)、SG転写因子(フォークヘッド、fkh;セージ、セージ;環状AMP応答エレメント結合タンパク質A、CrebA)、および分泌小胞(Rab11)のマーカーである。これらの抗体は、SGの形態および機能の読み出しとして使用される。しかしながら、免疫蛍光に適した任意の抗体は、このプロトコールに適しているべきである。 - 1x PBSで数回洗う。1x PBSで希釈した二次抗体(蛍光性)を加え、室温で暗所で2時間インキュベートする。任意の対比染色剤[4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI;DNA)、小麦胚芽アグルチニン(WGA;キチン用)、ファロイジン(F-アクチン用)、および/またはナイルレッド(脂質用)]2時間インキュベーション終了の30分前。
- 1x PBSで3回洗ってください。次いで、100%グリセロール中の組織を厚さ1mmのカバースリップを備えた標準的な顕微鏡スライド上にマウントし、蛍光共焦点顕微鏡を用いて撮像するまで-20°Cで保存した。
メモ: 定量データを取得するには、イメージング設定を一定に保つ必要があります。ここでは、組織の3D体積全体にわたる最大強度投影画像のみが含まれ、すべての画像定量化は、非SG組織残骸(脂肪体、キューティクル、または頭部)のDAPIシグナルに基づいて、治療間(実験内)に正規化されたスライド上にも存在する。
Representative Results
まず、VectorBaseのマイクロアレイ発現データを使用して、発生段階36、37にわたって潜在的な標的をスキャンし、現在の研究に関連するすべての遺伝子の発現状態を決定しました(表1)。予想通り、我々が選択したすべての標的遺伝子は、成人SGにおいて発現を示した。 また、注目すべきは、成人女性SGs9におけるf-Agdsxの高レベルの発現であった。
各遺伝子からの特定のセグメントを、RNAi試薬30の設計のためのウェブアプリケーションE−RNAiを用いてdsRNAとしての使用について評価した。次いで、各標的遺伝子に固有の配列を含む〜400 bp領域をクローニングし(図1A)、適切な細菌株に形質転換し、熱死菌の懸濁液を調製するために使用され、これはdsRNAを産生するように誘導された。成虫の蚊は、f-Agdsx、fkh、またはアリ(無関係のネガティブコントロール)のdsRNAの細菌懸濁液を含むスクロース浸漬綿球に8日間給餌した。
雌の蚊のRNAi給餌の解析のために、まず、f-Agdsxまたはfkh dsRNA摂食が遺伝子サイレンシングを誘導したかどうかを決定した。fkh-dsRNAを投与した群では、fkh転写産物レベルの98.8%(±2.1)の低下が観察され(図1B)、dsRNAがSGにおけるfkh転写産物の存在量を非常に効果的に減少させたことが示された。驚くべきことに、f-AgdsxのdsRNAで処置された蚊では、fkh mRNAレベルが82.0%(±18.9)減少し、f-Agdsxの減少が89.86%(±4.48)であった。 fkhが唾液腺におけるF-Dsxの標的である可能性を示唆する。fkh発現レベルの有意な低下に伴い、fkhノックダウン蚊は、血液供給に必要な探査試行回数の有意な増加を示した。これらの蚊は、対照群またはf-Agdsx dsRNA給餌蚊よりも平均して5倍の摂食試行を示し、蚊は血液で完全に充血した(図1C)。これは、fkhノックダウンRNAi治療が、主要な転写調節因子(SG TFsセージおよびCrebA)(図2)、分泌タンパク質(AAPおよびムチン)(図3)、および分泌機構[ナイルレッド(脂質)およびRab11(分泌小胞)](図4)の局在化および/または分布の変化を引き起こしたかどうかを尋ねることにつながった。重要なことに、染色強度の実質的な差が、異なる葉領域、葉、および個々のSGにわたって観察された。
予測されたように、セージおよびCrebA染色のレベルは、アリ対照RNAi(図2A)と比較して、fkh RNAiに続くすべてのSG葉において顕著に減少した(図2A)。ラインスキャンプロファイルにおける最大強度の最高値(赤色の破線および数値ラベル)および最小の最大強度値(青色の破線および数値ラベル)の両方の減少は、組織内の高信号および低信号の両方の領域の減少を示唆した(図2A、B)。これらのデータは、An. gambiae fkh RNAiが有効であり、fkhがGambiaeにおけるSG TFsセージおよびCrebAの産生および/または安定性を調節することを示唆しており、ショウジョウバエSGsにおけるそれらの遺伝的関係に類似している19,38,39。
非常に豊富な唾液成分タンパク質を考慮すると、対照RNAi治療と比較して、アノフェレス抗血小板タンパク質(AAPP)40,41のレベルは、fkh RNAi後の3つのSG葉すべてにおいて減少した(図3A、B;緑)。一方、ムチンのレベルに変化は認められなかった(図3A、B;紫色)。これらのデータは、Fkhが異なる唾液タンパク質遺伝子の発現に異なる方法で寄与することを示唆している。
最後に、分泌の2つのマーカーが観察された(図4A、B):Rab11(頂端リサイクルエンドソームに関連する小胞)42およびナイルレッド(脂質)。減少したRab11蛍光は、fkh RNAi処置後の遠位側方(DL)葉において観察された(図4A v対4B v;緑色)。しかしながら、内側(M)および近位側方(PL)葉におけるRab11シグナルの増加(図4A vii、ix対4B vii、ix;緑)も起こった。対照RNAi処置と比較して、fkh RNAi後のナイルレッドシグナル(図4A、B;紫色)において識別可能な差は観察されなかった。これらのデータは、fkhの減少がSGローブ間で異なる複雑な方法でいくつかの分泌機構作用を変化させる可能性があることを示唆している。
| データセット： | ゴルツェフ | ネイラ・オビエド | ネイラ・オビエド | パン屋 | パン屋 | パン屋 | パン屋 | ||
| 遺伝子記号 | 機能 | アガップ ID | 胚(25時間) | L3幼虫 | L3 SG | 大人の女性 ボディ(3日間) |
成人男性 ボディ(3日間) |
大人の女性 SG(3日間) |
成人男性 SG(3日間) |
| アアプリ | 唾液タンパク質 | AGAP009974 | 3.92 | 4.38 | 4.33 | 3.81 | 2.46 | 11.92 | 2.69 |
| クレバ | txn 係数 | AGAP001464 | 6.28 | 5.22 | 5.92 | 2.99 | 2.96 | 3.27 | 3.13 |
| " | txn 係数 | AGAP011038 | 4.50 | 4.46 | 5.23 | 2.96 | 2.86 | 3.05 | 2.88 |
| ティッカー | txn 係数 | AGAP004050 | 4.91 | 5.39 | 5.55 | 3.72 | 4.00 | 4.57 | 4.01 |
| ティッカー | txn 係数 | AGAP001671 | 5.18 | 4.67 | 5.25 | 2.99 | 3.09 | 3.21 | 3.05 |
| ムック2 | 唾液タンパク質 | AGAP012020 | 4.59 | 5.53 | 5.63 | 2.96 | 3.07 | 3.08 | 3.26 |
| ラブ11 | 小胞人身売買 | AGAP004559 | 10.21 | 7.47 | 8.60 | 4.90 | 3.79 | 3.38 | 2.96 |
| セージ | txn 係数 | AGAP013335 | 5.32 | 5.96 | 8.89 | 3.40 | 3.33 | 7.37 | 7.23 |
表1:Anの平均log2マイクロアレイ発現プロファイル 。 ガンビアエ 関心のある遺伝子。 遺伝子名、機能カテゴリ、ベクターベース(AGAP)識別子、およびベクターベースから収集された平均log2マイクロアレイ発現データが表示されます。これらのデータは、我々の関心のある遺伝子(唾液腺(SG)細胞生物学および分泌に関与する)が、全個体と比較して、幼虫期3(L3)および成体SGにおいて発現および富化されていることを示している。
図1:成体のAn. gambiaeにおけるf-Agdsxおよびfkhノックダウンは、SGsにおけるfkh mRNAレベルを低下させ、女性の血液供給能力に影響を及ぼす。 (a)この方法論におけるdsRNA産生に利用されるプラスミド設計の代表的な画像。第2のT7プロモーター配列は、pGEMTプラスミドにクローニングされるインサートを増幅するために使用される3'プライマーにそれを含めることによってプラスミドに付加される。次いで、プラスミドを大腸菌HT115(DE3)細菌に形質転換し、誘導された熱死菌を10%糖水に懸濁させた給餌溶液で作る。(B)f-AgdsxまたはfkhのいずれかのdsRNA供給溶液を給餌した動物は、fkh転写産物のレベルが有意に低いことを示した(多重比較による一元配置分散分析;n=15)。しかしながら、fkh dsRNA(C)を給餌した群のみが、血液ミールを獲得するために必要な噛み付き試行の数に有意差を示した。この群の蚊は、対照群またはdsx-dsRNA給餌群(多重比較による一元配置分散分析;n = 15)によって必要とされるよりも、平均して5倍のプロービング試行回数を必要とした。エラーバーは、平均の標準誤差(SEM)を示します。各実験は、3つの別々の生物学的複製で実施した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:成人のアン・ガンビアエ唾液腺におけるfkhノックダウンはSG転写因子レベルを低下させる。 示されているのは、(A)無関係のdsRNAコントロール(アリ)または(B)色素DAPI(DNA;赤色)で染色された10%スクロース中のSG TFフォークヘッド(fkh、AGAP001671)を標的とするdsRNA(WGA、キチン/ O-GlcNAcylation;青)のいずれかへの経口曝露の8日後(5〜13日目)の成人女性An. gambiae SGsの13日目からの代表的な画像であり、 SG TFsセージ(緑)とCrebA(紫)に対する抗血清。表示されているスケールバーの長さはミクロンです。SG (i) は白いダッシュで囲まれています。ズームされたローブ画像の黄色い線(黄色のボックスで囲まれ、「はめ込み」とラベル付けされた領域)は、信号強度のラインスキャンが行われた場所を示します。ズームされた各ローブのラインスキャンに対応する緑と紫のチャンネル強度は、画像の下のグラフに(SGでは常に左から右に)プロットされます。X 軸 = 距離 (ピクセル単位)、Y 軸 = グレー単位 (ピクセル強度)。ピクセル強度のダイナミックレンジは、赤(最大)と青(最小)の点線で区切られ、対応する値が各グラフに表示されます。MIP = SG 深度全体にわたる最大強度 3D 投影。DL:遠位側葉;M:内側葉;PL:近位側葉;SD:唾液管。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:成体のアン・ガンビア唾液腺におけるfkhノックダウンは、SG分泌タンパク質レベルを低下させる。 示されているのは、(A)無関係のdsRNAコントロール(アリ)、または(B)色素DAPI(DNA;赤)で染色された10%スクロース中のSG TFフォークヘッド(fkh、AGAP001671)を標的とするdsRNA(WGA、キチン/ O-GlcNAcylation;青)への経口曝露の8日後(5〜13日目)の成人女性An. gambiae SGsの13日目からの代表的な画像であり、 唾液タンパク質AAPP(緑色)およびムチン(MUC2、紫色)を含む。表示されているスケールバーの長さはミクロンです。SG (i) は白いダッシュで囲まれています。ズームされたローブ画像(黄色のボックスで囲まれた領域)の黄色い線は、信号強度のラインスキャンが行われた場所を示します。各ローブのラインスキャンに対応する緑と紫のチャンネル強度は、画像の下のグラフに(SGでは常に左から右に)プロットされます。X 軸 = 距離 (ピクセル単位)、Y 軸 = グレー単位 (ピクセル強度)。ピクセル強度のダイナミックレンジは、赤(最大)と青(最小)の破線で区切られ、対応する値が各グラフに表示されます。MIP = SG 深度全体にわたる最大強度 3D 投影。DL:遠位側葉;M:内側葉;PL:近位側葉;SD:唾液管。斜体の「DL」ラベル(Bi)は、同じDLローブの2つの可視領域を示す。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:成人のアン・ガンビア唾液腺におけるfkhノックダウンはSG分泌マーカーを減少させる。 示されているのは、(A)非関連dsRNAコントロール(アリ)、または(B)色素DAPI(DNA;赤色)で染色された10%スクロース中のSG TFフォークヘッド(fkh、AGAP001671)を標的とするdsRNA(WGA、キチン/ O-GlcNAcylation;青)への経口曝露の8日後(5〜13日目)の成人女性An. gambiae SGsの13日目からの代表的な画像であり、 ナイルレッド(脂質;紫)、及び抗血清はリサイクルエンドソーム小胞マーカーRab11(緑)に対して。表示されているスケールバーの長さはミクロンです。SG (i) は白いダッシュで囲まれています。ズームされたローブ画像(黄色のボックスで囲まれた領域)の黄色い線は、信号強度のラインスキャンが行われた場所を示します。各ローブのラインスキャンに対応する緑と紫のチャンネル強度は、画像の下のグラフにプロットされます(SGでは常に左から右)。X 軸 = 距離 (ピクセル単位)、Y 軸 = グレー単位 (ピクセル強度)。ピクセル強度のダイナミックレンジは、赤(最大)と青(最小)の破線で区切られ、対応する値が各グラフに表示されます。MIP = SG 深度全体にわたる最大強度 3D 投影。DL:遠位側葉;M:内側葉;PL:近位側葉;SD:唾液管。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル 1.このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
経口給餌によって ガンビア科 の蚊にdsRNAを効果的に送達する能力は、実験室および野外の両方でベクター生物学の研究に幅広い意味を持つ。マイクロインジェクションは、蚊における化学物質、抗体、RNAi、および遺伝子改変戦略の好ましい送達様式として長い間受け入れられてきた43、44。実質的な物理的操作、細胞損傷、およびストレスの結果は、経口送達の使用によって回避することができ、これはまた、大規模または野外適用に潜在的に適している可能性がある。これまでの研究は、RNAiが個々の成虫の蚊29内で遍在的に作用し、唾液腺を含むすべての組織において効果を可能にすることを示唆している。長期間にわたって非同期に消化される多数のdsRNA発現 大腸菌 を蚊に給餌することにより、ケージ内のすべての個体にわたってRNAiへの一貫した均一な曝露を達成できる可能性がある。この方法は、多数の蚊に餌を与え、標的遺伝子に応じて生じる表現型の潜在的な変動性を分析することを可能にする。しかし、1つの重要な考慮事項は、綿繊維中の細菌、したがってdsRNAの不均一な分布の可能性である。蚊の糖補給に毎日使用される400 μLの細菌には、以前に記載および計算されたように、約≤4.6 μgのdsRNAが含まれていますが、各蚊が 摂取するdsRNAの量は個別に決定されませんでした。dsRNA構築物の構築が日常的になる場合、この単純な治療プロトコルは、任意の蚊研究者によるこの技術の迅速な同化を可能にする。 先験的に、治療中の時間消費(1日あたり30分)は、同様のサンプルサイズにマイクロインジェクションを学び、適用するのにかかる時間と比較して些細なことです。
dsRNAの摂食は、モデル生物Caenorhabditis elegans45における逆遺伝学研究のために日常的に使用されている。この多用レベルは、経口送達アプローチの価値を強調しています。形質転換大腸菌におけるアン・ガンビアエゲノムワイドライブラリーの構築は、C. elegans46,47に存在するものと同様に、蚊における迅速な逆遺伝学的スクリーニングをより大きな規模で可能にするであろう。しかしながら、この方法の効率は、転写産物の内因性レベルに大きく依存し、発現が標的組織に限定されず、より広く発現されるかどうかに大きく依存することに注意することが重要である4、8、44。さらに、いくつかの殺虫剤が蚊からの行動回避を誘発する可能性があるという証拠48があり、それらの中に有害作用を誘発する可能性のある細菌を餌にすることは、同様の回避パターンを引き起こす可能性がある。蚊が代替食物源を持っていなかった実験室の制御された環境では、彼らは大腸菌で砂糖水を避ける選択肢を持たず、栄養価の高い供給源の必要性はおそらく細菌を避ける本能を上書きするでしょう。ただし、戦略があまり制御されていない設定で使用することを意図している場合は、これを考慮する必要があります。
複数の遺伝子を同時に標的にすることも可能かもしれないが(1つの構築物、複数の構築物、または形質転換細菌分離株の混合物を使用)、有効性を評価するためにはさらなる研究が必要である。この点に関するもう1つの重要な考慮事項は、単一または複数のターゲットを使用する場合に起こり得るオフターゲットまたは相乗効果の評価です。適切な対照遺伝子およびグループの確立は、実験計画の重要な部分である。さらに、このアプローチが他の病原体またはウイルスを標的とするために使用できると推測したくなる49。これまでの蚊へのRNAi誘導に向けた研究は、試薬を直接注入した条件下で行われていたため、 大腸菌 は存在しなかった。 大腸菌 は、時間の経過とともにdsRNAのより遅い放出を可能にする保護コンパートメントを提供し、曝露がはるかに長い期間にわたって多かれ少なかれ連続的であることを保証する29。
最後に、これらの結果は、曝露の時間枠(長さおよび開始日)および使用される 大腸菌 の量を調整することによって、この技術の効果が調整可能であることを示している。この特徴により、試行錯誤により最適なノックダウン条件を同定することで、必須遺伝子(dsx 、 fkh)の機能を調べることができました。これにより、目的の標的遺伝子がこの技術を使用して調査できる可能性が大幅に高まります。
要約すると、成虫の蚊へのRNAiの経口送達は、単純で汎用性が高く、蚊の遺伝子機能を研究し、蚊媒介性疾患のベクター制御のための新規で可鍛性のあるツールを作成するための強力なアプローチであり得ることが判明した。
Disclosures
著者らは、開示すべき利益相反はないと報告している。
Acknowledgments
著者らは、CDCの昆虫学部門と寄生虫病・マラリア部門のスタッフと科学者、JHUでの細菌調製の支援および/またはこの研究の有益な議論について、Brian TriggとMichelle Chiuに感謝したい。私たちは、JHMRI昆虫館とマネージャーのクリス・キジトに、 アン・ガンビア科 の蚊へのアクセスと飼育に感謝します。我々は、この研究で使用するプラスミドPJet GFPおよびpPB47 GFPの入手に協力してくれたWei Huang(JHSPH)に感謝する。この研究のための資金は、ジョンズホプキンスマラリア研究所ポスドクフェローシップ(MWに)であるNIH R21AI153588(DJAに)によって提供されました。また、Good Ventures FoundationとOpen Philanthropy ProjectからCDC財団への助成金により、マラリアの研究を支援するために蚊の凍結保存と女性の発達抑制を支援する、Open Philanthropy Project、2017。JHU顕微鏡施設のスタッフからの支援と、使用する顕微鏡に対するNIH助成金の支援に深く感謝しています(NIHグラント#:S10OD016374)。この原稿の所見と結論は著者のものであり、必ずしもCDCの見解を表すものではありません。商号の使用は識別のみを目的としており、疾病管理予防センター、公衆衛生局、または米国保健福祉省による承認を意味するものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 | |
| 2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) Medium | BD Difco | DF0440-17 | |
| AAPP | n/a | n/a | Antisera. 1:50 dilution (rabbit); gift from Fabrizio Lombardo |
| AccuStart II PCR Supermix | Quantabio | 95137-100 | |
| Agarose | Millipore Sigma | A9539 | |
| Ampicillin | Millipore Sigma | A5354 | |
| Anopheles gambiae G3 | BioDefense and Emerging Infections (BEI) Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4) | MRA-112 | |
| BugDorm | BioQuip | 1452 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | P022628181 | |
| CrebA | DSHB | CrebA Rbt-PC | Antisera. 1:50 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab |
| Damiens diet | BioServ | ||
| DAPI | Life Technologies | n/a | 4′,6-diamidino-2-phenylindole; 1:200 dilution. |
| Defibrinated sheep blood | HemoStat | DSB050 | |
| Escherichia coli HT115 (DE3) | |||
| Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Millipore Sigma | I5502 | |
| JM109 Competent cells | Promega | L2005 | |
| Luria Broth Media | Thermo Fisher Scientific | 10855001 | |
| Mucin 2 | Proteintech | Muc2; 27 675-1-AP | Antisera. 1:100 dilution (mouse). |
| Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Nile Red | Sigma | n/a | Lipid dye; 1:50 dilution. |
| Owl EasyCast B2 Mini Gel Horizontal Electrophoresis | Thermo Fisher Scientific | Model B2 | |
| pGEMT easy | Promega | A3600 | |
| Power SYBR-green PCR master MIX | Applied Biosystems | 4367659 | |
| PureLink PCR purification kit | Thermo Fisher Scientific | K31001 | |
| QuantaStudio 6 | Applied Biosystems | ||
| QuantStudio6 Real Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| Rab11 | n/a | n/a | Antisera. 1:100 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab |
| Rh-WGA | Vector Labs | n/a | Rhodamine-conjugated wheat germ agglutinin (chitin, O-GlcNAcylation dye); 1:40 dilution |
| Sage | n/a | n/a | Antisera. 1:50 dilution (rat); generated by the Andrew Lab |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| Tetracycline | Millipore Sigma | 87128 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Zeiss LSM700 fluorescence confocal microscope | Zeiss | ||
| ANTIBODIES | |||
| Chicken anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A21472 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A28181 | |
| IgG (H+L) Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A27034 | |
| Rabbit anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A27012 | |
| PRIMERS | |||
| ACT-2f: TACAACTCGATCATGAAGTGCGA | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
| ACT-3r: CCCGGGTACATGGTGGTACCGC CGGA |
CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
| FKH_RNAi_F: GCCGACTTATGCTTAGCCCA | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
| FKH_RNAi_R: TAGCCGTCAATTCCTCCTGC | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
| newDSX-f: AGAGGGCGGGGAAATTCTAGT | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
| newDSX-r: GGGCTTGTGGCAGTACGAATA | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
| S7qf1: AGAACCAGCAGACCACCATC | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
| S7qr1: GCTGCAAACTTCGGCTATTC | CDC Biotechnology Core Facility Branch | n/a | qRT-PCR primer |
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