Denna artikel rapporterar en in vivo-hämning av CENP-E genom bukkirurgi och testikelinjektion av GSK923295, en värdefull modell för manlig meiotisk delning. Med hjälp av immunofluorescens-, flödescytometri- och transmissionselektronmikroskopianalyser visar vi att CENP-E-hämning resulterar i kromosomfelinriktning och genominstabilitet i musspermatocyter.
I eukaryoter är meios avgörande för genomstabilitet och genetisk mångfald vid sexuell reproduktion. Experimentella analyser av spermatocyter i testiklar är kritiska för undersökningar av spindelsammansättning och kromosomsegregering vid manlig meiotisk delning. Musspermatocyten är en idealisk modell för mekanistiska studier av meios, men effektiva metoder för analys av spermatocyter saknas. I denna artikel rapporteras en praktisk och effektiv metod för in vivo-hämning av kinesin-7 CENP-E i musspermatocyter. Ett detaljerat förfarande för testikelinjektion av en specifik hämmare GSK923295 genom bukkirurgi hos 3 veckor gamla möss presenteras. Vidare beskrivs här en serie protokoll för vävnadsinsamling och fixering, hematoxylin-eosinfärgning, immunofluorescens, flödescytometri och transmissionselektronmikroskopi. Här presenterar vi en in vivo-hämningsmodell via bukkirurgi och testikelinjektion, som kan vara en kraftfull teknik för att studera manlig meios. Vi visar också att CENP-E-hämning resulterar i kromosomfelinriktning och metafasstopp i primära spermatocyter under meios I. Vår in vivo-hämningsmetod kommer att underlätta meiosstudier, fungera som en användbar metod för genetiska modifieringar av manliga könslinjer och belysa framtida kliniska tillämpningar.
Meios är en av de viktigaste, mycket styva, evolutionärt bevarade händelserna i eukaryota organismer och är avgörande för gametogenes, sexuell reproduktion, genomintegritet och genetisk mångfald 1,2,3. Hos däggdjur genomgår könscellerna två på varandra följande celldelningar, meios I och II, efter en enda omgång DNA-replikation. Till skillnad från systerkromatider vid mitos kopplas duplicerade homologa kromosomer ihop och separeras i två dotterceller under meios I 4,5. I meios II drar systerkromatider isär och separerar för att bilda haploida gameter utan DNA-replikation6. Fel i någon av de två meiotiska divisionerna, inklusive spindelmonteringsdefekter och kromosommissegregering, kan leda till förlust av könsceller, sterilitet eller aneuploidisyndrom 7,8,9.
Ackumulerande studier har visat att kinesinfamiljemotorer spelar en avgörande roll i regleringen av kromosomjustering och segregering, spindelmontering, cytokinese och cellcykelprogression i både mitotiska och meiotiska celler10,11,12. Kinesin-7 CENP-E (centromerprotein E) är en plus-end-riktad kinetokormotor som krävs för kromosomkongress, kromosomtransport och inriktning och reglering av spindelmonteringskontrollpunkt i mitos 13,14,15,16,17,18. Under meios leder CENP-E-hämning av den specifika hämmaren GSK923295 till cellcykelstopp, kromosomfelinriktning, spindeldisorganisation och genominstabilitet i spermatogena celler19. Lokaliseringsmönstren och dynamiken hos CENP-E vid centromererna för delande spermatocyter indikerar att CENP-E interagerar med kinetokorproteiner för sekventiell sammansättning av centromerer under meios I20,21. I oocyter krävs CENP-E för kromosomjustering och slutförande av meios I13,22,23. Antikroppar eller morfolinoinjektion av CENP-E resulterar i feljusterade kromosomer, onormal kinetokororientering och meios I arresterar i både mus- och Drosophila-oocyter 23. Jämfört med de väsentliga rollerna för CENP-E i mitos är funktionerna och mekanismerna för CENP-E i meios fortfarande i stort sett okända. Detaljerade mekanismer för CENP-E i kromosomkongress och genomstabilitet i manliga meiotiska celler återstår att klargöra.
Spermatogenes är en komplex och långvarig fysiologisk process, som involverar sekventiell spermatogoniaproliferation, meios och spermiogenes. Därför är hela processen utomordentligt svår att reproducera in vitro hos däggdjur och andra arter24,25. Det är omöjligt att inducera spermatocytdifferentiering efter pachytenstadiet in vitro. Studier av manliga meiotiska delningar har i allmänhet begränsats till experimentella analyser av tidig meiotisk profas25,26. Trots många tekniska ansträngningar, inklusive kortvarig odling av spermatocyter27,28 och organodlingsmetoder25, finns det få effektiva metoder för att studera manlig meiotisk delning. Dessutom resulterar genetisk deletion av essentiella gener vanligtvis i utvecklingsstopp och embryonal dödlighet. Till exempel misslyckas musembryon som saknar CENP-E att implantera och kan inte utvecklas efter implantation29, vilket är ett hinder i mekanistiska studier av CENP-E vid meios. Sammantaget kan upprättandet av ett praktiskt och genomförbart system för att studera manlig meiotisk uppdelning i hög grad främja forskningsområdet meios.
Den lilla cellgenomsläppliga hämmaren är ett kraftfullt verktyg för att studera kinesinmotorer i celldelning och utvecklingsprocesser. Den allosteriska hämmaren, GSK923295, binder specifikt till CENP-E-motordomänen, blockerar frisättningen av ADP (adenosindifosfat) och stabiliserar slutligen interaktionerna mellan CENP-E och mikrotubuli30. I denna studie presenteras en in vivo inhibitionsmusmodell genom bukkirurgi och testikelinjektion av GSK923295. CENP-E-hämning resulterar i feljustering av kromosomer i metafas I av primära spermatocyter. Vidare leder CENP-E-hämning till meiotisk arrestering av spermatocyter och störning av spermatogenesen. En serie protokoll beskrivs för analys av spermatocyter och kan tillämpas för att observera meiotiska spindelmikrotubuli, homologa kromosomer och subcellulära organeller i spermatocyter. Vår in vivo-hämningsmetod är en effektiv metod för studier av meiotisk delning och spermatogenes.
I denna studie har vi etablerat en in vivo CENP-E-hämningsmodell av mustestiklar med hjälp av bukkirurgi och mikroinjektion av GSK923295. Bukkirurgi och testikelinjektionsmetod som används i denna studie har följande fördelar. För det första är det inte begränsat till mössens ålder. Experimenter kan utföra testikelinjektion i ett tidigt skede, till exempel vid 3 veckor gamla eller yngre möss. För det andra har GSK923295 en specifik och utmärkt hämmande effekt på CENP-E. För det tredje är denna…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar alla medlemmar i Cytoskeleton Laboratory vid Fujian Medical University för hjälpsamma diskussioner. Vi tackar Jun-Jin Lin på Public Technology Service Center, Fujian Medical University för teknisk hjälp inom flödescytometri. Vi tackar Ming-Xia Wu och Lin-Ying Zhou vid Electron Microscopy Lab of Public Technology Service Center, Fujian Medical University för teknisk hjälp inom elektronmikroskopi. Vi tackar Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke och Jun Song på Experimental Teaching Center of Basic Medical Sciences vid Fujian Medical University för deras stöd. Denna studie stöddes av följande bidrag: National Natural Science Foundation of China (bidragsnummer 82001608), Natural Science Foundation of Fujian-provinsen, Kina (bidragsnummer 2019J05071), Fujian Provincial Health Technology Project (bidragsnummer 2018-1-69), Startup Fund for Scientific Research, Fujian Medical University (bidragsnummer 2017XQ1001), Fujian Medical University high level talents scientific research start-up funding project (bidragsnummer XRCZX2017025) och forskningsprojekt av online-utbildning och undervisning av doktorander i kinesisk medicin (bidragsnummer B-YXC20200202-06).
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
1 ml Syringe | Several commercial brands available | Sterile. | |
1.5 mL Centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430828 | |
6 cm Petri dish | Corning | 430166 | |
95% Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009164 | |
tubulin rabbit polyclonal antibody | Beyotime | AF0001 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibody | Abcam | ab267372 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibody | Sangon Biotech | D110022 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab175191 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
Adhesion microscope slides | CITOTEST | 188105 | |
Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibody | Beyotime | A0423 | Sencodary antibody. Use at 1:500. |
Aluminium potassium sulphate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10001060 | |
Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 100092690 | |
Anti-fade mounting medium | Beyotime | P0131 | Prevent photobleching of flourescent signals. |
BD FACS Canto II | BD Biosciences | FACS Canto II | |
Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69003435 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5424BK745380 | |
Chloral hydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80037516 | |
Citric acid | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 122670 | |
Collagenase | Sangon Biotech | A004194-0100 | |
Coverslips | CITOTEST | 10212020C | 20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm. |
DAPI | Beyotime | C1006 | |
Dye vat | Several commercial brands available | 91347802 | |
Eosin Y, alcohol soluble | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71014460 | |
Ether | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009318 | |
Formaldehyde – aqueous solution | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10010018 | |
GSK923295 | MedChemExpress | HY-10299 | |
Hematoxylin, anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71020784 | |
ICR mouse | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd | ||
Image J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | Fluorescent image analysis. |
Leica ultramicrotome | Leica | ||
Leica EM UC-7 ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
Modfit MFLT32 | Verity Software House | For analysis of flow cytometry results. | |
Nail polish | Several commercial brands available | ||
Neutral gum | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10004160 | |
Nikon Ti-S2 microscope | Nikon | Ti-S2 | |
Picric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | J60807 | |
Rheodyne | Sangon Biotech | F519160-0001 | 10 μl rheodyne |
Sliced paraffin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69019461 | |
Sodium iodate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80117214 | |
Surgical instruments | Several commercial brands available | For abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min. | |
Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 | |
Trisodium citrate dihydrate | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 173970 | |
Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30188928 | Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution. |
Tween 20 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30189328 | Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution. |
Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80096618 | |
Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10023418 |