Xenopus laevis tadpole rygmarvstranssektion er en relevant skademetode til at studere rygmarvsskade og regenerering ved at lave et tværgående snit, der fuldstændigt skærer rygmarven på thoraxniveau.
Rygmarvsskade (SCI) er en permanent lidelse, som påvirker centralnervesystemet (CNS) motoriske og sensoriske nerver, hvilket resulterer i lammelse under skadestedet. Til dato er der ingen funktionel genopretningsterapi til SCI, og der mangler klarhed over de mange komplekser og dynamiske begivenheder, der opstår efter SCI. Mange organismer uden pattedyr kan regenerere efter svær SCI, såsom teleostfisk, urodele amfibier og larvestadier af anuran amfibier, herunder Xenopus laevis tadpoles. Disse er bona fide modelorganismer til at studere og forstå reaktionen på SCI og de mekanismer, der ligger til grund for vellykkede regenerative processer. Denne type forskning kan føre til identifikation af potentielle mål for SCI terapeutisk intervention. Denne artikel beskriver, hvordan man udfører Xenopus laevis tadpole rygmarvstranssektion, herunder husdyrhold, kirurgi, postkirurgisk pleje og funktionel testevaluering. Denne skadesmetode kan anvendes til at belyse de forskellige trin i rygmarvsregenerering ved at studere de cellulære, molekylære og genetiske mekanismer samt histologisk og funktionel udvikling efter SCI og under rygmarvsregenerering.
Rygmarvsskade (SCI) er en lidelse, der rammer ca. 250.000-500.000 mennesker verden over hvert år1. Ud over denne høje forekomst påvirker SCI sensoriske og motoriske nerver, hvilket genererer lammelse under skadestedet og afbrydelse af nogle indre organer fra kontrollen af CNS. Rygmarven, en del af CNS, kan ikke regenerere, og på grund af lidelsens kompleksitet og manglen på fuldstændig forståelse af alle de involverede processer er der stadig ingen effektive terapier, der muliggør funktionel genopretning.
Ikke-pattedyrsorganismer, såsom teleostfisk, urodele padder og larvestadier af anuran amfibier, som kan regenerere rygmarven efter svær SCI2,3,4, er fremragende modelorganismer til at studere de processer, der styrer en vellykket regenerativ begivenhed og forstå svigt i pattedyrs regenerering. Denne forståelse er af stor interesse, da den kan give original indsigt i at udvikle nye terapeutiske mål og mulige terapier til SCI.
Anuranfrøen, Xenopus laevis, er en fremragende modelorganisme til at studere SCI. Det har fremragende regenerative kapaciteter under haletudsestadierne, som gradvist går tabt under metamorfose, hvilket muliggør eksperimentering i de regenerative og ikke-regenerative stadier3,5. Den etablerede skadesmetode til undersøgelse af SCI i Xenopus laevis haletudser består af haleamputation, hvor hele halen fjernes, herunder væv som muskel, notochord og rygmarv6. Denne tilgang har været medvirkende til forståelsen af generelle mekanismer for regenerative processer4,7,8,9,10.
Da haleamputation involverer flere væv ud over rygmarven, hvilket er forskelligt fra, hvad der sker efter human SCI, er der behov for et mere relevant skadeparadigme til undersøgelsen af SCI. Vi har stolet på undersøgelser, der er brugt i fortiden11 til at generere omfattende beskrivelser af skadesparadigmer5,12,13,14 og forskellige metoder til undersøgelse af SCI12,13,14,15,16,17,18 . Efter rygmarvstranssektion kan den kaudale del af rygmarven isoleres for RNA- og proteinekspression og analyser med høj gennemstrømning14,19,20,21. Derudover tillader intracelomiske injektioner af lægemidler og små molekyler samt elektroporation af cDNA, RNA eller morpholinos før eller efter rygmarvstransektion undersøgelse af virkningerne af disse molekyler til forebyggelse eller behandling af SCI eller af specifikke hændelser, der forekommer efter SCI og rygmarvsregenerering13,14 . Endvidere kan skadesudvikling og de regenerative processer studeres på forskellige tidspunkter efter skade ved hjælp af biokemiske, molekylære, histologiske og funktionelle tilgange12,13,14,17,19,20,21,22,23.
Endelig kan alle ovennævnte teknikker anvendes i ikke-regenerative stadier, hvilket fremhæver en af de vigtigste fordele ved at anvende Xenopus laevis som en modelorganisme til at studere SCI, de komparative undersøgelser af regenerative og ikke-regenerative mekanismer i samme art13,19,20,21,22. Dette papir præsenterer en protokol for Xenopus laevis tadpole rygmarvstranssektion, begyndende med iscenesættelse og udvælgelse af regenerative Nieuwkoop og Faber (NF) fase 50 haletudser. Dette efterfølges af beskrivelsen af procedurerne for rygmarvskirurgi for at producere falske og transekterede dyr, postkirurgisk pleje og endelig analysen af funktionel genopretning ved måling af fri haletudse svømmeafstand.
Protokollen beskrevet heri er en glimrende metode til at udføre SCI og evaluere funktionel opsving. For reproducerbarhed er det vigtigt at dyrke sunde haletudser og vælge dyr, der er ens i størrelse. Mangel på korrekt fodring skaber næringsstofstress, hvilket resulterer i dårlig regenerativ kapacitet26; derfor bør der lægges særlig vægt på tadpole fodring. Da haletudser når stadie 50 efter 3-4 uger, kan de opdrættes ved højere temperaturer for at fremskynde vækstprocessen, idet 18-25 °C er optimal27. Vandkvaliteten er vigtig, da dyr er følsomme over for vandforhold og kemiske produkter. De optimale vandforhold omfatter anvendelse af kulfiltreret, klorfrit vand med følgende parametre: pH (6,5-7,5), chlorid (<0,02 mg/l), vandets ledningsevne (1,0 mS/cm ± 0,1 enheder), kobber (<0,3 mg/l); karbobundethed (KH: 5-10 dKH); generel hårdhed (GH: 6-16 dGH); nitrat (NO3: <20 mg/l) og nitrit (NO2: <0,1 mg/l)14,27,28. For at undgå forurening skal plasttanke rengøres en gang om ugen til opdræt af dyr eller hver anden dag efter operationen ved at vaske grundigt med kloridfrit vand og en svamp; vaskemiddel skal undgås.
For en bedre overlevelsesrate efter operationen må haletudser ikke udsættes for anæstesi i lange perioder (højst 2 min). Desuden anbefales det at anæstesi en tadpole ad gangen. Da dyrene har brug for at forblive hydreret, skal du holde dyrene nedsænket i opløsning hele tiden før og efter operationen og hælde opløsningen med en ske oven på haletudsen, inden operationen påbegyndes. Sørg for, at skaden er omfattende nok til at dække hele rygmarven, men ikke for omfattende, da det kan fremkalde dårlig funktionel genopretning eller død. Hvis notochordet er beskadiget, vil dyret blive bøjet, og den funktionelle genopretning vil blive påvirket. Hvis skaden strækker sig ud over notokorden, øges sandsynligheden for død14. Under svømmeanalysen betragtes optagelsen som korrekt, hvis softwaren identificerer hvert dyr med en blå skygge; Ellers skal optagelsen gentages. Det er vigtigt at undgå bevægelses- og luft- eller lysændringer under optagelsesprocessen for at forhindre optagelsesfejl.
Der er stadig mange åbne spørgsmål om de cellulære og molekylære mekanismer, der ligger til grund for rygmarvsskader og regenerering. Protokollen beskrevet i dette arbejde kan bruges til at studere bidraget fra forskellige cellulære begivenheder, genekspression og behandlinger på funktionel genopretning, bestemt ved måling af svømmekapacitet. Derudover kan mange andre teknikker anvendes på de opererede dyr. Rygmarven kan isoleres for at udføre protein- og/eller mRNA-ekstraktion14 for at studere protein- og genekspressionsprofiler efter skade og behandling19,20. Denne operation har også været grundlaget for at studere rygmarvscellerespons22 og adfærden af neurale stamceller12,13,22 efter rygmarvsskade. Signalkaskader involveret i rygmarvsregenerering er også blevet undersøgt ved hjælp af rygmarvsskadeparadigmet beskrevet heri23. Sammenfattende er den protokol, der er beskrevet her, en fremragende model til at studere rygmarvsskade og regenerering og er blevet brugt til mange undersøgelser, der har bidraget til den eksisterende viden om emnet.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af forskningsbevillinger fra: PG Slater: FONDECYT N° 3190820; J. Larraín: FONDECYT N° 1180429, CARE Chile UC-Centro de Envejecimiento y Regeneración (PFB 12/2007).
Air pump | Regent CALM | RC-006 | For oxygen diffuser stones function |
ANY-maze software | Stoelting | Swimming behavior test | |
Ca(NO3)2·4H2O | Sigma-Aldrich | 237124 | |
CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | 223506 | |
Camera | Stoelting | 60528 | Swimming behavior test |
Computer | Swimming behavior test (minimum recommended specifications: PC, Windows 7, Intel Core i3, 2 GB RAM, 10-GB drive disk, 1 available USB port, 1,366 × 768 monitor) |
||
Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | Surgery / staging |
Glass Petri dishes | 100 x 20 mm | ||
HEPES | Gibco | 11344-041 | |
Human chorionic gonadotropin | It can be found in different formats in the pharmacy | ||
KCl | Merck Millipore | 104936 | |
LED light box | custom made | wood box: 55-cm length, 34-cm width, 9-cm height, LED lights, transparent polystyrene sheet) | |
MgSO4·7H2O | Merck Millipore | 105886 | |
Microdissection scissors for transection | Fine Science Tools | 15003-08 | Spring Scissors for surgery |
MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | Anesthetic; tricaine mesylate |
NaCl | Merck Millipore | 106404 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
Nasco Frog Brittle for Tadpole Xenopus | Nasco | SB09480(LM)MX | Food for Xenopus tadpoles stage 44 to 60 |
Oxygen diffuser stones | Pentair | AA1 | Mantainance of animals |
Pair of forceps | Fine Science Tools | Dumont n° 5 SF forceps | For surgery |
Penicillin | Sigma-Aldrich | P7794 | |
pH meter | |||
Plastic Pasteur pipette | Sigma-Aldrich | Z331740 | For collecting embryos after mating |
Plastic Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5981 | 150 x 15 mm |
Plastic tank/box with lid | 4.5 liter capacity; 20 cm × 17 cm × 15 cm or similar | ||
Sterilized gauze | |||
Streptomycin | Sigma-Aldrich | S1277 | |
Tablespoon | |||
Xenopus laevis specialized strains and lines |
National Xenopus Resource European Xenopus Resource Centre Xenopus laevis Research Resource Centre |
http://www.mbl.edu/xenopus https://xenopusresource.org/ https://www.urmc.rochester.edu/microbiology-immunology/xenopus-laevis.aspx |
|
Xenopus laevis wild type | Xenopus 1 Xenopus Express |
https://xenopus1.com http://www.xenopus.com |