Summary

顆粒細胞前駆体における原発性シリウム依存シグナル伝達経路を研究するための効率的で費用対効果の高いエレクトロポレーション法

Published: November 30, 2021
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Summary

ここでは、費用対効果が高く、効率的で実行可能な一次小脳顆粒細胞前駆体(GCP)の遺伝子操作のための再現性のある インビトロ エレクトロポレーションプロトコルを提示する。さらに、このプロトコルはまた、一次GCP細胞における一次シリウム依存性ヘッジホッグシグナル伝達経路の分子的研究のための簡単な方法を示す。

Abstract

一次シリウムは、ヘッジホッグ(Hh)シグナル伝達刺激を細胞表面から伝達するほぼすべての細胞に見られる重要なシグナル伝達オルガネラである。顆粒細胞前駆体(GCP)において、一次シリウムはHhシグナル伝達経路を調節することによって前駆細胞増殖を調整する極めて重要なシグナル伝達センターとして機能する。一次シリウム依存性Hhシグナル伝達機械の調査は、経路成分の インビトロ 遺伝子操作によって促進され、一次シリウムへの動的局在化を可視化する。しかし、現在知られているエレクトロポレーション法を用いたGCPの一次培養におけるトランスフェインのトランスフェクションは、一般にコストがかかり、しばしば低い細胞生存率および望ましくないトランスフェクション効率をもたらす。この論文では、高いトランスフェクション効率が80~90%、最適な細胞生存率を実証する、効率的で費用対効果の高いシンプルなエレクトロポレーションプロトコルを紹介します。これは、一次GCP培養における主要なシリウム依存性ヘッジホッグシグナル伝達経路の研究に適用可能な、単純で再現性のある効率的な遺伝子改変方法である。

Introduction

小脳GCPは、生体内のHhシグナル伝達経路に対する高い存在量と高感度性のために、ニューロン前駆細胞型におけるHhシグナル伝達経路の機械を研究するために広く使用されています。GCPにおいて、一次シリウムは、前駆細胞6,7,8の増殖を調整する極めて重要なHhシグナル伝達ハブ5として機能する。一次シリウム上のHhシグナル伝達成分のインビジュアライゼーションは、内因性の基底レベルが低いため、しばしば困難です。したがって、目的の遺伝子のタンパク質発現レベルおよびフルオロフォアタグ付けの遺伝子導入修飾は、分子分解能で経路を研究するのに有用なアプローチである。しかし、リポソームベースのトランスフェクションアプローチを用いたGCP一次培養の遺伝子操作は、トランスフェクション効率が低いことが多く、さらなる分子調査を妨げる9。エレクトロポレーションは効率を高めるが、一般的には法外なベンダー固有および細胞型制限型エレクトロポレーション試薬10を必要とする。

本論文では、GCP一次培養におけるHhシグナル伝達経路成分を操作するための高効率かつ費用対効果の高いエレクトロポレーション法を紹介する。この改変エレクトロポレーションプロトコルを用いて、緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付きスムージングトランスジーン(pEGFP-Smo)をGCPに効率よく送達し、高い細胞生存率とトランスフェクション率(80~90%)を達成しました。さらに、免疫細胞化学的染色によって証明されるように、トランスフェクトGCPは、EGFP-Smoをプライマリ繊毛に密売することによってHhシグナル伝達経路のSmoothedアゴニスト誘発活性化に対して高い感受性を示した。このプロトコルは、ヒトおよびげっ歯類の一次細胞培養、ならびにヒト人工多能性幹細胞など、トランスフェクトが困難な細胞型の インビトロ 遺伝子改変を伴う実験に対して直接的に適用され、有益である。

Protocol

すべての動物関連の手順は、動物の取り扱いガイドラインと香港保健省によって承認されたプロトコルに従って行われました。動物実験免許(実験管理)条例(キャップ340)は、香港保健省から取得した。動物の仕事はHKBUの調査事務所および実験室安全委員会によって承認された動物の安全倫理に従って行われた。このプロトコルで使用されるすべての材料の詳細については、 資料表</strong…

Representative Results

この提案されたエレクトロポレーション方法論は、オプティ-MEM( 材料表参照)を汎用試薬として用い、一貫して80~90%で高いエレクトロポレーション効率を達成できる(図1)。Smo-EGFPベクターのエレクトロポレーション効率は、全てのペアドボックスタンパク質-6(Pax6)発現GCP細胞における緑色蛍光陽性細胞の割合を定量することにより、DIV2ポストエレクトロポレ?…

Discussion

エレクトロポレーション法による原発GCP培養におけるトランスフェインのトランスフェクションは、典型的には低い細胞生存率と低いトランスフェクション効率9,10と関連している。この論文では、高効率と生存率を実証した、費用対効果が高く、再現性の高いエレクトロポレーションプロトコルを紹介する。また、一次GCP細胞における一次シリウ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、HKBUシードファンドとティア2スタートアップグラント(RG-SGT2/18-19/SCI/009)、研究助成金協議会共同研究基金(CRF-C2103-20GF)からC.H.H.Horに支援されました。

Materials

GCP Culture
B27 supplement Life Technologies LTD 17504044
Cell strainer, 70 µm Corning 352350
DNase I from bovine pancreas Roche 11284932001
Earle’s Balanced Salt Solution Gibco, Life Technologies 14155063
FBS, qualified Thermo Scientific SH30028.02
GlutamMAXTM-I ,100x Gibco, Life Technologies 35050061 L-glutamine substitute
L-cysteine Sigma Aldrich C7352
Matrigel BD Biosciences 354277 Basement membrane matrix
Neurobasal Gibco, Life Technologies 21103049
Papain,suspension Worthington Biochemical Corporation LS003126
Poly-D-lysine Hydrobromide Sigma Aldrich P6407
SAG Cayman Chemical 11914-1 Smoothened agonist
IF staining
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A7906
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Primary antibody mix
Anti-GFP-goat ab Rockland 600-101-215 Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Arl13b mouse monoclonal ab NeuroMab 75-287 Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab Covance PRB-278P Dilution Factor: 1 : 1000
Secondary antibody mix
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG Invitrogen A-11055 Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG Invitrogen A-31570 Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG Invitrogen A-31573 Dilution Factor: 1 : 1000
DAPI Thermo Scientific 62247 Dilution Factor: 1 : 1000
Electroporation
CU 500 cuvette chamber Nepagene CU500
EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) Nepagene EC-002
Opti-MEM Life Technologies LTD 31985070 reduced-serum medium for transfection
pEGFP-mSmo Addgene 25395
Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation Nepagene NEPA21 electroporator

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Cite This Article
Lo, J. C. W., Wong, W. L., Hor, C. H. H. Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor. J. Vis. Exp. (177), e63283, doi:10.3791/63283 (2021).

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