توصيف الخلايا البطانية لنمو الدم (BOEC) من الدم المحيطي للخنزير
Abstract
البطانة هي بنية ديناميكية متكاملة تلعب دورا مهما في العديد من الوظائف الفسيولوجية مثل تكوين الأوعية الدموية والإرقاء والالتهاب والاتزان الداخلي. تلعب البطانة أيضا دورا مهما في الفيزيولوجيا المرضية مثل تصلب الشرايين وارتفاع ضغط الدم والسكري. تشكل الخلايا البطانية البطانة الداخلية للدم والأوعية اللمفاوية وتظهر عدم تجانس في التركيب والوظيفة. قامت مجموعات مختلفة بتقييم وظائف الخلايا البطانية المشتقة من الدم المحيطي البشري مع التركيز على الخلايا السلفية البطانية المشتقة من الخلايا الجذعية المكونة للدم أو الخلايا البطانية الناضجة (أو الخلايا المكونة للمستعمرة البطانية). توفر هذه الخلايا موردا ذاتيا للعلاجات ونمذجة الأمراض. قد توفر الخلايا الغريبة مصدرا بديلا للعلاجات بسبب توافرها وتجانسها باستخدام متشابهة وراثيا تربى في ظروف مماثلة. ومن ثم ، تم تقديم بروتوكول قوي لعزل وتوسيع الخلايا البطانية المتكاثرة للغاية من الدم المحيطي للخنازير. يمكن استخدام هذه الخلايا في العديد من التطبيقات مثل هندسة أنسجة القلب والأوعية الدموية ، والعلاج بالخلايا ، ونمذجة الأمراض ، وفحص الأدوية ، ودراسة بيولوجيا الخلايا البطانية ، والثقافات المشتركة في المختبر للتحقيق في استجابات الالتهاب والتخثر في زراعة الأعضاء.
Introduction
البطانة هي بنية ديناميكية معقدة للغاية ومكون حيوي لجدار الأوعية الدموية. يبطن السطح الداخلي للأوعية الدموية لتوفير واجهة مادية بين الدورة الدموية والأنسجة المحيطة. من المعروف أن هذا الهيكل غير المتجانس يؤدي وظائف مختلفة مثل تكوين الأوعية ، والالتهاب ، وتنظيم الأوعية ، والإرقاء1،2،3،4. الخلايا البطانية للوريد السري البشري هي نوع من الخلايا يدرس على نطاق واسع لتقييم وظائف الخلايا البطانية. ومع ذلك ، فإن تباين الدفعة الخاصة بالمريض ، والنمط الظاهري غير المتسق ، والحد الأدنى من كفاءة الانقسام تشير إلى الحاجة إلى تحديد مصدر الخلية الذي يمكن أن يحسن كل هذه الميزات5.
يمكن أن يكون الحصول على مجموعة متجانسة من الخلايا البطانية الأولية أمرا صعبا من الناحية الفنية ، ولا تمتلك الخلايا البطانية الأولية قدرة تكاثرية عالية6. ومن ثم ، لدراسة تجديد الأوعية الدموية وتقييم العمليات الفيزيولوجية المرضية ، حاولت مجموعات مختلفة الحصول على أنواع مختلفة من الخلايا البطانية المشتقة من الدم المحيطي وتقييمها ، على سبيل المثال ، الخلايا السلفية البطانية البطانية (EPCs) أو الخلايا البطانية لنمو الدم (BOECs)6،7،8،9. تنشأ EPCs المبكرة على شكل مغزل من الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) ولها قوة نمو محدودة وقدرة وعائية محدودة على إنتاج خلايا بطانية ناضجة. علاوة على ذلك ، فهي تشبه إلى حد كبير الخلايا الوحيدة الالتهابية. بالإضافة إلى ذلك ، لا تزال قدرتها على التمايز إلى خلايا بطانية وظيفية ومتكاثرة وناضجة قابلة للنقاش6،7،9،10. يمكن أن تؤدي الثقافة المستمرة لخلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) إلى ظهور مجموعة ثانوية من الخلايا تعرف باسم EPCs متأخرة النمو أو BOECs أو الخلايا المكونة للمستعمرة البطانية (ECFCs)6،7،9،10. في عام 2018 ، اعترف Medina et al. بقيود EPCs ، وغموض تسميتها ، إلى جانب الافتقار العام للتوافق مع العديد من أنواع الخلايا المتميزة التي يتم تجميعها باستمرار تحت EPCs11. في المقابل ، أصبحت BOECs معترف بها لدورها في إصلاح الأوعية الدموية ، والصحة والمرض ، والعلاج الخلوي. ستعتمد الدراسة الإضافية والاستخدام العلاجي لهذه الخلايا على بروتوكولات لاشتقاق هذه الأنواع من الخلايا باستمرار من الخلايا السلفية المنتشرة.
يمكن استخدام الخلايا الأولية مثل BOECs كبديل للحصول على خلايا بطانية ناضجة تكاثريةللغاية 6. BOECs متميزة ظاهريا عن EPCs المبكرة وتظهر ميزات بطانية نموذجية مثل مورفولوجيا الحصى والتعبير عن تقاطعات adherens و caveolae12. وجد التنميط الجيني بواسطة Hebbel et al.13،14،15 أن BOECs أو ECFCs هي الخلايا البطانية الحقيقية لأنها تعزز تكوين الأوعية الدموية الدقيقة والأوعية الكبيرة. وبالتالي ، يمكن استخدام BOECs كأداة لتقييم العمليات الفيزيولوجية المرضية والتنوع الجيني16. كما أنها تعتبر مصدرا ممتازا للخلايا للعلاج الخلوي لتجديد الأوعية الدموية17. ومن ثم ، فإن وجود بروتوكول موحد لاشتقاق هذه الخلايا شديدة التكاثر باستمرار أمر ضروري.
بينما توفر BOECs أداة قوية لدراسة التباين الفيزيولوجي المرضي والجيني البشري ، فإن مصدرا أكثر تجانسا ل BOECs قد يوفر نتائج تجريبية وعلاجية أكثر قوة وموثوقية. يمكن تحقيق التجانس الفائق باستخدام مصادر الخلايا الغريبة المستمدة من الحيوانات المتشابهة وراثيا التي تربى في ظروف مماثلة18. في حين أن مصادر الخلايا الغريبة المنشأ عرضة لإثارة استجابة مناعية للمضيف ، يتم تطوير استراتيجيات التعديل المناعي بهدف توليد ومنتجات حيوانية متوافقة مع المناعة ، بما في ذلك الخلايا. الخنازير ، على وجه الخصوص ، هي مصدر وفير للدم المحيطي وتستخدم عادة لدراسة الأجهزة الطبية والعلاجات الأخرى بسبب أوجه التشابه التشريحية والفسيولوجية مع البشر. ومن ثم ، فإن هذه الدراسة تعمل على تحسين بروتوكول عزل وتوسيع BOECs شديدة التكاثر من الدم المحيطي الخنازير. البروتوكول المفصل أدناه هو طريقة مباشرة وموثوقة للحصول على عدد كبير من BOECs من كمية صغيرة نسبيا من الدم. يمكن توسيع الثقافات من خلال عدة ممرات لتوليد ملايين الخلايا من عينة دم واحدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
BOECs هي أداة قوية يمكن استخدامها في مختلف الأساليب العلمية والعلاجية7،8،16. تم استخدام BOECs لتحليل التعبير الجيني EC لتوضيح العوامل الرئيسية المسؤولة عن تطور أمراض الأوعية الدموية والسرطان5،19،20<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يرغب المؤلفون في الاعتراف بالتمويل المقدم من NIH / NHLBI R00 HL129068.
Materials
| 19 G needle | Covidien | 1188818112 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
| 6 well plate | BD Falcon | 353046 | |
| 60 mL syringes | Covidien | 8881560125 | |
| Ammonium chloride solution (0.8%) | Stemcell Technologies | 07850 | |
| Antibiotic/antimycotic solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75-253-839 | |
| EGM-2 culture medium | Lonza Walkersville | CC-3162 | |
| Extension tube | Hanna Pharmaceutical Supply Co. | 03382C6227 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Ficoll-Paque 1077 | Cytiva | 17144003 | Density gradient solution |
| Heparin sodium injection (1,000 units/mL) | Pfizer | 00069-0058-01 | |
| Human plasma fibronectin | Gibco | 33016-015 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Pipette set | Eppendorf | 2231300004 | |
| Sterile water | Gibco | 15230-162 | |
| Thin pipette | Celltreat Scientific | 229280 |
References
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms. Circulation Research. 100 (2), 158-173 (2007).
- Pober, J. S., Tellides, G. Participation of blood vessel cells in human adaptive immune responses. Trends in Immunology. 33 (1), 49-57 (2012).
- Navarro, S., et al. The endothelial cell protein C receptor: its role in thrombosis. Thrombosis Research. 128 (5), 410-416 (2011).
- Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood. 114 (14), 3084-3091 (2009).
- Ormiston, M. L., et al. Generation and culture of blood outgrowth endothelial cells from human peripheral blood. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53384 (2015).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. Journal of Clinical Investigation. 105 (1), 71-77 (2000).
- Martin-Ramirez, J., Hofman, M., Biggelaar, M. V. D., Hebbel, R. P., Voorberg, J. Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood. Nature Protocols. 7 (9), 1709-1715 (2012).
- Gulati, R., et al. Diverse origin and function of cells with endothelial phenotype obtained from adult human blood. Circulation Research. 93 (11), 1023-1025 (2003).
- Hebbel, R. P. Blood endothelial cells: utility from ambiguity. The Journal of Clinical Investigation. 127 (5), 1613-1615 (2017).
- Medina, R. J., et al. Endothelial progenitors: A consensus statement on nomenclature. Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1316-1320 (2018).
- Medina, R. J., et al. Molecular analysis of endothelial progenitor cell (EPC) subtypes reveals two distinct cell populations with different identities. BMC Medical Genomics. 3, 18 (2010).
- Jiang, A., Pan, W., Milbauer, L. C., Shyr, Y., Hebbel, R. P. A practical question based on cross-platform microarray data normalization: are BOEC more like large vessel or microvascular endothelial cells or neither of them. Journal of Bioinformatics and Computational Biology. 5 (4), 875-893 (2007).
- Pan, W., Shen, X., Jiang, A., Hebbel, R. P. Semi-supervised learning via penalized mixture model with application to microarray sample classification. Bioinformatics. 22 (19), 2388-2395 (2006).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Fernandez, L. A., et al. Blood outgrowth endothelial cells from hereditary haemorrhagic telangiectasia patients reveal abnormalities compatible with vascular lesions. Cardiovascular Research. 68 (2), 235-248 (2005).
- Critser, P. J., Yoder, M. C. Endothelial colony-forming cell role in neoangiogenesis and tissue repair. Current Opinion in Organ Transplantation. 15 (1), 68-72 (2010).
- Zhao, Y., et al. Isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59673 (2019).
- Chang Milbauer, L., et al. Genetic endothelial systems biology of sickle stroke risk. Blood. 111 (7), 3872-3879 (2008).
- Wei, P., et al. Differential endothelial cell gene expression by African Americans versusCaucasian Americans: a possible contribution to health disparity in vascular disease and cancer. BMC Medicine. 9 (1), 2 (2011).
- Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 114 (14), 3084-3091 (2009).
- Milbauer, L. C., et al. Blood outgrowth endothelial cell migration and trapping in vivo: a window into gene therapy. Translational Research. 153 (4), 179-189 (2009).
- Matsui, H., et al. Ex vivo gene therapy for hemophilia A that enhances safe delivery and sustained in vivo factor VIII expression from lentivirally engineered endothelial progenitors. Stem Cells. 25 (10), 2660-2669 (2007).
- De Meyer, S. F., et al. Phenotypic correction of von Willebrand disease type 3 blood-derived endothelial cells with lentiviral vectors expressing von Willebrand factor. Blood. 107 (12), 4728-4736 (2006).
- Bodempudi, V., et al. Blood outgrowth endothelial cell-based systemic delivery of antiangiogenic gene therapy for solid tumors. Cancer Gene Therapy. 17 (12), 855-863 (2010).
- Dudek, A. Z., et al. Systemic inhibition of tumour angiogenesis by endothelial cell-based gene therapy. British Journal of Cancer. 97 (4), 513-522 (2007).
- Moubarik, C., et al. Transplanted late outgrowth endothelial progenitor cells as cell therapy product for stroke. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (1), 208-220 (2011).
- Pislaru Sorin, V., et al. Magnetic forces enable rapid endothelialization of synthetic vascular grafts. Circulation. 114 (1), 314 (2006).
- Satyananda, V., et al. New concepts of immune modulation in xenotransplantation. Transplantation. 96 (11), 937-945 (2013).
- Klymiuk, N., Aigner, B., Brem, G., Wolf, E. Genetic modification of pigs as organ donors for xenotransplantation. Molecular Reproduction and Development. 77 (3), 209-221 (2010).
- Ryczek, N., Hryhorowicz, M., Zeyland, J., Lipiński, D., Słomski, R. CRISPR/Cas technology in pig-to-human xenotransplantation research. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 3196 (2021).
- Cooper, D. K., Koren, E., Oriol, R. Genetically engineered pigs. Lancet. 342 (8872), 682-683 (1993).
- Cozzi, E., White, D. J. G. The generation of transgenic pigs as potential organ donors for humans. Nature Medicine. 1 (9), 964-966 (1995).
- Phelps, C. J., et al. Production of alpha 1,3-galactosyltransferase-deficient pigs. Science. 299 (5605), 411-414 (2003).
