Caratterizzazione delle cellule endoteliali di escrescenza del sangue (BOEC) dal sangue periferico suino
Abstract
L’endotelio è una struttura integrata dinamica che svolge un ruolo importante in molte funzioni fisiologiche come l’angiogenesi, l’emostasi, l’infiammazione e l’omeostasi. L’endotelio svolge anche un ruolo importante nelle fisiopatologie come l’aterosclerosi, l’ipertensione e il diabete. Le cellule endoteliali formano il rivestimento interno dei vasi sanguigni e linfatici e mostrano eterogeneità nella struttura e nella funzione. Vari gruppi hanno valutato la funzionalità delle cellule endoteliali derivate dal sangue periferico umano con particolare attenzione alle cellule progenitrici endoteliali derivate da cellule staminali ematopoietiche o cellule endoteliali mature di crescita del sangue (o cellule endoteliali formanti colonie). Queste cellule forniscono una risorsa autologa per la terapia e la modellizzazione delle malattie. Le cellule xenogeniche possono fornire una fonte alternativa di terapie grazie alla loro disponibilità e omogeneità ottenuta utilizzando animali geneticamente simili allevati in condizioni simili. Pertanto, è stato presentato un robusto protocollo per l’isolamento e l’espansione di cellule endoteliali di crescita del sangue altamente proliferativo dal sangue periferico suino. Queste cellule possono essere utilizzate per numerose applicazioni come l’ingegneria tissutale cardiovascolare, la terapia cellulare, la modellazione delle malattie, lo screening farmacologico, lo studio della biologia cellulare endoteliale e le co-colture in vitro per studiare le risposte infiammatorie e coagulanti nello xenotrapianto.
Introduction
L’endotelio è una struttura altamente complessa e dinamica e una componente vitale della parete vascolare. Allinea la superficie interna dei vasi sanguigni per fornire un’interfaccia fisica tra il sangue circolante e i tessuti circostanti. Questa struttura eterogenea è nota per svolgere varie funzioni come l’angiogenesi, l’infiammazione, la vasoregolazione e l’emostasi 1,2,3,4. Le cellule endoteliali della vena ombelicale umana sono un tipo di cellula ampiamente studiato per valutare la funzionalità delle cellule endoteliali. Tuttavia, la variabilità del lotto specifico del paziente, il fenotipo incoerente e l’efficienza minima di scissione suggeriscono la necessità di determinare una fonte cellulare che potrebbe migliorare tutte queste caratteristiche5.
Ottenere una popolazione omogenea di cellule endoteliali primarie può essere tecnicamente impegnativo e le cellule endoteliali primarie non possiedono un’elevata capacità proliferativa6. Quindi, per studiare la rigenerazione vascolare e valutare i processi fisiopatologici, vari gruppi hanno cercato di ottenere e valutare diversi tipi di cellule endoteliali derivate dal sangue periferico, ad esempio cellule progenitrici endoteliali (EPC) o cellule endoteliali di estratzione del sangue (BOEC)6,7,8,9 . Le EPCs precoci a forma di fuso provengono da cellule staminali ematopoietiche (HSC) e hanno una potenza di crescita limitata e una limitata capacità angiogenica di produrre cellule endoteliali mature. Inoltre, assomigliano molto ai monociti infiammatori. Inoltre, la loro capacità di differenziarsi ulteriormente in cellule endoteliali funzionali, proliferanti e mature è ancora discutibile 6,7,9,10. La coltura continua di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) può dare origine a una popolazione secondaria di cellule note come EPC a crescita tardiva, BOEC o cellule formanti colonie endoteliali (ECFC)6,7,9,10. Medina et al. nel 2018, hanno riconosciuto i limiti delle EPC, l’ambiguità della loro nomenclatura, insieme a una generale mancanza di concordanza con molti tipi di cellule distinti continuamente raggruppati sotto EPC11. Al contrario, i BOEC sono stati riconosciuti per il loro ruolo nella riparazione vascolare, nella salute e nella malattia e nella terapia cellulare. Ulteriori studi e l’uso terapeutico di queste cellule si baseranno su protocolli per derivare coerentemente questi tipi di cellule da cellule progenitrici circolanti.
Le cellule primarie come le BOEC possono essere utilizzate come surrogato per ottenere cellule endoteliali mature altamente proliferative6. Le BOEC sono fenotipicamente distinte dalle EPC precoci e presentano caratteristiche endoteliali tipiche come la morfologia del ciottolo e l’espressione delle giunzioni aderenti e delle caveole12. Il profilo genico di Hebbel et al.13,14,15 ha scoperto che le BOEC o ECFC sono le vere cellule endoteliali in quanto promuovono la formazione di microvasi e grandi vasi. Pertanto, i BOEC possono essere utilizzati come strumento per valutare i processi fisiopatologici e la variazione genetica16. Sono anche considerati un’eccellente fonte cellulare per la terapia cellulare per la rigenerazione vascolare17. Quindi, un protocollo standardizzato per derivare costantemente queste cellule altamente proliferative è essenziale.
Mentre le BOEC forniscono un potente strumento per studiare la variazione fisiopatologica e genetica umana, una fonte più omogenea di BOEC può fornire risultati sperimentali e terapeutici più robusti e affidabili. Una maggiore omogeneità può essere ottenuta utilizzando fonti cellulari xenogeniche derivate da animali geneticamente simili allevati in condizioni simili18. Mentre le fonti cellulari xenogeniche sono inclini a suscitare una risposta immunitaria dell’ospite, si stanno sviluppando strategie di immunomodulazione con l’obiettivo di generare animali e prodotti animali immunocompatibili, comprese le cellule. I maiali, in particolare, sono una fonte abbondante di sangue periferico e sono comunemente usati per studiare dispositivi medici e altre terapie a causa delle somiglianze anatomiche e fisiologiche con gli esseri umani. Quindi, questo studio perfeziona il protocollo per l’isolamento e l’espansione di BOEC altamente proliferativi dal sangue periferico suino. Il protocollo descritto di seguito è un metodo semplice e affidabile per ottenere un gran numero di BOEC da un volume relativamente piccolo di sangue. Le colture possono essere espanse attraverso diversi passaggi per generare milioni di cellule da un singolo campione di sangue.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le BOEC sono uno strumento potente che può essere utilizzato in vari approcci scientifici e terapeutici 7,8,16. I BOEC sono stati utilizzati per analizzare l’espressione genica della CE per chiarire i fattori chiave responsabili dello sviluppo delle malattie vascolari e del cancro 5,19,20,21. I BOEC s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano riconoscere il finanziamento da NIH / NHLBI R00 HL129068.
Materials
| 19 G needle | Covidien | 1188818112 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
| 6 well plate | BD Falcon | 353046 | |
| 60 mL syringes | Covidien | 8881560125 | |
| Ammonium chloride solution (0.8%) | Stemcell Technologies | 07850 | |
| Antibiotic/antimycotic solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75-253-839 | |
| EGM-2 culture medium | Lonza Walkersville | CC-3162 | |
| Extension tube | Hanna Pharmaceutical Supply Co. | 03382C6227 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Ficoll-Paque 1077 | Cytiva | 17144003 | Density gradient solution |
| Heparin sodium injection (1,000 units/mL) | Pfizer | 00069-0058-01 | |
| Human plasma fibronectin | Gibco | 33016-015 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Pipette set | Eppendorf | 2231300004 | |
| Sterile water | Gibco | 15230-162 | |
| Thin pipette | Celltreat Scientific | 229280 |
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