Summary
Typiska mikrotubulihämmare, som används i stor utsträckning i grundforskning och tillämpad forskning, har långtgående effekter på celler. Nyligen framkom fotostatiner som en klass av fotoväxlingsbara mikrotubulihämmare, som kan momentan, reversibel, spatiotemporalt exakt manipulation av mikrotubuli. Detta steg-för-steg-protokoll beskriver tillämpningen av fotostatiner i ett 3D-levande preimplantatorembryo.
Abstract
Mikrotubulicytoskelettet utgör ramen för en cell och är grundläggande för intracellulär transport, celldelning och signaltransduktion. Traditionell farmakologisk störning av det allestädes närvarande mikrotubulinätverket med användning av till exempel nokodazol kan få förödande konsekvenser för vilken cell som helst. Reversibelt fotoswitchbara mikrotubulihämmare har potential att övervinna begränsningarna genom att göra det möjligt att implementera läkemedelseffekter på ett spatiotemporalt kontrollerat sätt. En sådan familj av läkemedel är de azobensenbaserade fotostatinerna (PST). Dessa föreningar är inaktiva under mörka förhållanden, och vid belysning med UV-ljus binder de till kolchicinbindningsstället för β-tubulin och blockerar mikrotubulipolymerisation och dynamisk omsättning. Här är tillämpningen av PST i det 3-dimensionella (3D) levande preimplantatoribiorembryot inställt på att störa mikrotubulinätverket på en subcellulär nivå. Detta protokoll ger instruktioner för experimentell installation, samt ljusaktiverings- och avaktiveringsparametrar för PST med hjälp av konfokalmikroskopi med levande celler. Detta säkerställer reproducerbarhet och gör det möjligt för andra att tillämpa denna procedur på sina forskningsfrågor. Innovativa fotoswitchar som PST kan utvecklas som kraftfulla verktyg för att främja förståelsen av det dynamiska intracellulära mikrotubulinätverket och för att icke-invasivt manipulera cytoskelettet i realtid. Dessutom kan PST vara användbara i andra 3D-strukturer såsom organoider, blastoider eller embryon från andra arter.
Introduction
Mikrotubuliarkitekturen varierar kraftigt mellan olika celltyper för att stödja olika funktioner 1,2. Dess dynamiska karaktär av tillväxt och krympning möjliggör snabb anpassning till extra- och intracellulära signaler och att svara på en cells ständigt föränderliga behov. Därför kan det betraktas som det "morfologiska fingeravtrycket" som spelar en nyckelroll i cellulär identitet.
Farmakologisk inriktning av mikrotubulicytoskelettet med hjälp av småmolekylära hämmare har lett till en uppsjö av grundläggande upptäckter inom utvecklingsbiologi, stamcellsbiologi, cancerbiologi och neurobiologi 3,4,5,6,7. Detta tillvägagångssätt, även om det är oumbärligt, presenterar olika begränsningar såsom toxicitet och effekter utanför målet. Till exempel är ett av de mest använda mikrotubuli-inriktningsmedlen, nokodazol, ett kraftfullt mikrotubuli-depolymeriserande läkemedel8. Småmolekylära hämmare såsom nokodazol är emellertid aktiva från appliceringstillämpningen och med tanke på mikrotubulicytoskelettets väsentliga natur för många kritiska cellulära funktioner kan global depolymerisering av mikrotubuli ge off-target-effekter, vilket kan vara olämpligt för många applikationer. Dessutom är nokodazolbehandling irreversibel om inte prover tvättas fria från läkemedlet, vilket förhindrar kontinuerlig levande avbildning och därmed exakt spårning av enskilda mikrotubulifilament.
Utvecklingen av ljusaktiverade föreningar började med skapandet av fotouncaged molekyler och har förebådat en ny era i inriktning och övervakning av effekterna av mikrotubulär tillväxthämning på ett exakt och spatiotemporalt kontrollerat sätt. En familj av reversibelt fotobytbara läkemedel, fotostatiner (PST), utvecklades genom att ersätta stilbenekomponenten i combretastatin A-4 med azobensen9. PST är inaktiva tills de tänds med UV-ljus, varigenom den inaktiva transkonfigurationen omvandlas till den aktiva cis-konfigurationen genom reversibel isomerisering. Cis-PST hämmar mikrotubulipolymerisation genom att binda till kolchicinbindningsstället för β-tubulin, blockera dess gränssnitt med β-tubulin och förhindra dimerisering som krävs för mikrotubulitillväxt10. Bland en kohort av PST har PST-1P uppstått som en blyförening eftersom den har den högsta styrkan, är helt vattenlöslig och visar en snabb början av bioaktivitet efter belysning.
Den mest effektiva trans- till cis-isomeriseringen av PST sker vid våglängder mellan 360-420 nm, vilket möjliggör dubbla alternativ för PST-aktivering. En 405 nm laserlinje på ett typiskt konfokalmikroskop kan administreras för optimal rumslig inriktning av mikrotubuli tillväxthämning. Möjligheten att fastställa platsen och tidpunkten för PST-aktivering genom 405 nm laserbelysning underlättar exakt tidsmässig och rumslig kontroll, vilket möjliggör störning av mikrotubulidynamik på en subcellulär nivå, inom subsekutsvarstiderna9. Alternativt, ett prisvärt LED UV-ljus tillåter belysning av hela organismen för att inducera organismomfattande störningar i mikrotubuliarkitekturen. Detta kan vara ett kostnadseffektivt alternativ för forskare för vilka den exakt tidsenad uppkomsten av hämning, snarare än rumslig inriktning, är målet. En annan egenskap hos PST är deras inaktivering på begäran genom att applicera grönt ljus med en våglängd i intervallet 510-540 nm9. Detta möjliggör spårning av mikrotubulifilament före, under och efter PST-medierade tillväxthämningar.
PST, även om det fortfarande är en relativt ny design, har använts i många in vitro-applikationer inom olika forskningsområden11, inklusive undersökning av nya mekanismer för cellmigration i amoeboider12, i neuroner isolerade från hjärnan hos den nyfödda musen13 och vingeepitelutveckling i Drosophila melanogaster14 . Andra ljusreaktiva läkemedel har visat sig vara värdefulla verktyg för riktade störningar i cellulär funktion. Till exempel användes en analog av blebbistatin, azidoblebbistatin, för förbättrad myosinhämning under belysning15,16. Detta belyser potentialen för nya upptäckter på grund av förmågan till spatiotemporalt kontrollerad hämning av cellulär funktion.
Levande 3D-organismer presenterar fantastiska men mer känsliga system för att manipulera mikrotubulidynamik på en heldjurs-, encells- eller subcellulär nivå under fysiologiska förhållanden. I synnerhet erbjuder det preimplantatoritiska musembryot exceptionell inblick i cellens inre arbete såväl som intercellulära relationer inom en organism17. Temporärt och rumsligt riktade konsekutiva cykler av aktivering och deaktivering av PST bidrog till karakteriseringen av interfasbron, en postcytokinetisk struktur mellan celler, som ett icke-centrosomalt mikrotubuliorganiserande centrum i det preimplantatoriska musembryot16. En liknande experimentell inställning visade involveringen av växande mikrotubuli i tätningen av musembryot för att möjliggöra blastocystbildning18. Vidare användes PST också i hela zebrafiskembryon för att undersöka neuronal cellmigration genom att hämma mikrotubulitillväxt i en delmängd av celler i bakhjärnen19.
Detta protokoll beskriver den experimentella installationen och användningen av PST-1P i det preimplantatorinationella musembryot. Instruktionerna som presenteras här kan också vägleda tillämpningen av PST för ett brett spektrum av mål som att studera kromosomsegregering och celldelning, handel med intracellulär last och cellmorfogenes och migration. Dessutom kommer sådana studier att hjälpa till med implementeringen av PST i organoidsystem, blastoider och andra embryomodeller som Caenorhabditis elegans och Xenopus laevis, samt potentiellt utöka användningen av PST för in vitro-fertiliseringsteknik .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Försöken godkändes av Monash Animal Ethics Committee under djuretiskt nummer 19143. Djur hölls i specifika patogenfria djurhusförhållanden på djuranläggningen (Monash Animal Research Platform) i strikt överensstämmelse med etiska riktlinjer.
1. Preimplantatorisk musembryosamling
- Superäggula och para möss som beskrivits tidigare 16,18, i enlighet med de institutionella djuretiska riktlinjerna.
OBS: De vanligaste stammarna för insamling av levande embryon är C57BL/6 eller FVB/N-möss. Alla data som visas här genererades med FVB/N-möss. - På morgonen efter parning spola zygoter från äggledaren med M2-medium som beskrivs20, eller Human Tubal Fluid (HTF) medium. Använd en munpipettapparat enligt beskrivningen21,22, överför zygoter till färska kalium Simplex Optimised Medium (KSOM) droppar, förvärmda till 37 °C och jämviktade till 5 % CO 2, i en 35 mm odlingsskål överlagrad med en tillräcklig volym mineralolja för att säkerställa medietäckning.
- Mikroinjektera zygoter som beskrivits20 med cRNA-kodning för en röd fluorescerande märkt mikrotubuli plus ändmarkör. Här användes cRNA för det slutbindande proteinet 3 (EB3)-dTomato vid 30 ng/μL koncentration efter beredning och rening enligt beskrivningen16,18 och spädning i mikroinjektionsbuffert.
OBS: Det rekommenderas att förbereda cRNA i förväg och lagra det vid -20 ° C tills det behövs. - Odlingsembryon i mörker vid 37 °C och 5 % CO2 tills embryon har nått önskat utvecklingsstadium för PST-1P-behandling.
OBS: För en omfattande resurs av de odlingstider som krävs för olika embryonala stadier se23. För embryon i 16-cellstadiet som används här, odling till embryonal dag 3 (E3) efter befruktning.
2. Läkemedels- och bildberedning
OBS: För steg 2.1-2.10, arbeta uteslutande i mörker eller rött ljus för att undvika oavsiktlig PST-1P-aktivering. Aluminiumfolie eller mörka lock bör användas för alla rör och diskar som innehåller PST.
- Förbered en lagerkoncentration på 50 mM PST-1P i ultrarent vatten.
OBS: Molekylvikten för PST-1P är 440 g / mol. Stamlösningen är stabil vid -20 °C i upp till 1 år. PST-1P är lösligt i vatten eller vattenbuffert men löses inte lätt upp i DMSO. - Från steg 2.1 bereder du en mellanliggande arbetskoncentration på 800 μM PST-1P i ultrarent vatten.
- Späd PST-1P till en slutlig koncentration av 40 μM i färsk KSOM. Eftersom ett typiskt experiment kräver cirka 20 μL PST-1P-behandlad KSOM, späd 1 μL av 800 μM PST-1P i 19 μL KSOM för en slutlig volym på 20 μL för att säkerställa att tillräckligt medium förbereds i förväg, med endast rött ljus för synlighet.
OBS: Både koncentrationen och aktiveringsstatusen för en PST-1P-utspädning kan kontrolleras genom att ta ett UV-Vis-absorbansspektrum med hjälp av en spektrofotometer som bör göras under analysetableringen. Absorbansen vid 380 nm (A380) av en helt trans 40 μM utspädning i en 1 cm kyvett bör vara ungefär 0,8. Både cis- och transformer har samma absorbans vid 455 nm (A455). När förhållandet mellan A380 och A455 är ungefär 9:1 är utspädningen inaktiv (helt trans). När förhållandet A380:A455 är 1:2 är utspädningen fullt aktiverad (helt cis). Mellanliggande förhållanden återspeglar mellanliggande aktiveringstillstånd. - För att förbereda kammarbilden för levande avbildning, pipettera 10 μL PST-1P-behandlad KSOM i mitten av en brunn för att bilda en halvklotformad droppe (Figur 1A).
- Tillsätt försiktigt tillräckligt med mineralolja för att täcka droppen och se till att den inte sprider mediet. Detta säkerställer att droppen inte avdunstar.
- Förvärm och CO2-jämvikt kammarens glidskål i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO2 i minst 3 timmar eller högst över natten.
- I slutet av jämviktsperioden i steg 2.6 förbereder du en 35 mm odlingsskål med en 10 μL droppe PST-1P-behandlad, förvärmd och jämviktad KSOM som ett tvättsteg. Överlägg inte med olja.
- Överför embryon genom munpipettering till den PST-1P-behandlade KSOM-droppen från steg 2.7.
OBS: Steg 2.7 och 2.8 rekommenderas för munpipettering av embryon men är valfria. - Överför omedelbart embryon genom munpipettering till mitten av den PST-1P-behandlade KSOM-droppen i bildkammarbilden som förberetts i steg 2.4-2.6 (Figur 1A).
- Inkubera embryon vid 37 °C och 5 % CO2 i PST-1P-behandlad KSOM i bildkammarens diabild i minst 1 timme före avbildning. Montera om möjligt kammarglidningen på mikroskopet inuti en miljökammare vid 37 °C och 5 % CO2 och i fullständigt mörker för att säkerställa att alla PST-1P är i den inaktiva transkonfigurationen och att embryon kan sjunka till botten av skålen.
3. Live imaging och PST-1P fotoaktivering
OBS: Steg 3.1-3.13 utförs på ett laserskanningskonfokalmikroskop utrustat med lavinfotodioddetektorer (APD) och en mörk miljökammare. Dessa instruktioner hänvisar specifikt till bildinställningen med hjälp av förvärvsprogramvaran som beskrivs i materialförteckningen; De kan emellertid också tillämpas på andra konfokalmikroskopisystem.
- Förbered ett nedsänkningsmål på 63x/1,2 NA för vattenolja med det föreskrivna nedsänkningsmediet.
- Använd en ficklampa med rött ljus för att styra positioneringen och flytta fram målet att komma i kontakt med nedsänkningsmediet. Undvik i detta skede att använda vitt eller starkt fältljus för att hitta embryon eftersom detta kan aktivera PST-1P.
- Använd okularet och under rött ljus, leta reda på kanten på droppen av medium och placera målet direkt över denna plats. Detta kan hjälpa användaren att upprätta orientering och hitta fokalplanet.
- Därefter, genom okularet eller på mjukvaruaktiverad live-mode-skanning, använd ett rött våglängdsfilter eller 561 nm laser för att lokalisera embryon i droppen.
- Använd scenkontroller och live-scanning-läge för att ställa in start- och slutpunkter för att förvärva en z-stack av hela embryot.
- Justera lasereffektinställningarna (vanligtvis med mycket känsliga detektorer som APD: erna är en 561 nm lasereffekt på mindre än 5% tillräcklig), digital förskjutning (vanligtvis vid -0.900) för att optimera utseendet på EB3-dTomato-kometer och minimera bakgrundsbrus, pinhole vid 2 μm, pixelupplösning på 512 x 512 och pixeluppehållstid på 3.15 μs.
- Skaffa en z-stack av hela embryot med 1 μm sektionsintervall för att bedöma områden med mikrotubuli tillväxt i hela organismen (Figur 1B).
- Använd 3D z-stack-avbildningen från steg 3.7 för att identifiera intressanta regioner (ROI) för EB3-dTomato-spårningsexperiment. Öka zoomen till 3x och rita en rektangulär ROI runt det specifika subcellulära intresseområdet.
- Skaffa en time-lapse-film av ett enda z-plan med hjälp av de typiska värdena för bildparametrar: 561 nm lasereffekt vid 5%, digital förskjutning på -0,900, pixelupplösning på 512 x 512, pinhole vid 3 μm, pixel uppehållstid på 3,15 μs, zoom på 3x, tidsintervall på 500 ms.
OBS: 120 tidsramar ger en spårningsfilm på 1 min och bör vara tillräcklig för dataanalys. Förvärvet kan fortsätta längre, förutsatt att blekningen av fluoroforen är minimal (figur 1C). - För att aktivera PST-1P, byt till en 405 nm-laser och skaffa en annan time-lapse-film med 405 nm-lasern inställd på 10% effekt, pixelupplösning på 512 x 512, pinhole öppnad maximalt, pixel uppehållstid på 3,15 μs, zoom på 3x, tidsintervall på 500 ms och totalt 20 bilder (Figur 1D).
- Byt tillbaka till 561 nm laser och upprepa förvärvet som i steg 3.9 för att bekräfta förlusten av EB3-dTomato-kometer efter aktivering av PST-1P (Figur 1E). Se till att detta förvärv sker så snart som möjligt efter aktivering.
OBS: Steg 3.10 kan utföras repetitivt för längre hämning av EB3-dTomato-kometer. Embryon måste dock övervakas noggrant för att undvika skador orsakade av UV-ljus. - För att vända PST-1P tillbaka till sitt inaktiva transtillstånd, koppla in en 514 nm laser med 10% effekt. Skaffa en time-lapse-film med 514 nm-lasern inställd på 10 % effekt, pixelupplösning på 512 x 512, nålhål öppnat maximalt, pixelfördröjningstid på 3,15 μs, zoom på 3x, tidsintervall på 500 ms och totalt 20 tidsramar (figur 1F).
- Upprepa steg 3.11 för att visualisera återhämtningen av EB3-dTomato-kometer (figur 1G).
4. Analys av bilddata
- För att analysera och kvantifiera hämningen av mikrotubuli polymerisation av PST, använd program som är tillgängliga för forskare för att passa deras specifika behov. De som rekommenderas för användning kommer att ha ett spårningsverktyg som manuellt eller automatiskt kan spåra rörelsen, riktningen och hastigheten hos EB3-dTomato-kometer 16,18.
Figur 1: Schematisk representation av PST-1P-fotoaktivering och deaktivering i det levande 3D-preimplantatoriska musembryot. Alla experiment utförs i fullständigt mörker (svart bakgrund) eller endast med rött ljusbelysning. (A) Levande preimplantatoriska musembryon som uttrycker EB3-dTomato odlas till 16-cellsstadiet och överförs sedan till en droppe KSOM innehållande 40 μM PST-1P i en bildkammarglidning. (B) En 3D-bild av hela embryot möjliggör bedömning av mikrotubulitillväxt genom att visualisera fördelningen av EB3-dTomato-kometer. (C) För att starta experimentet spåras EB3-dTomato-kometer i en subcellulär region med hjälp av time-lapse-avbildning. (D) Efterföljande PST-1P-fotoaktivering i samma subcellulära region med användning av en 405 nm laser resulterar i förlust av EB3-dTomato-kometer (E). Intensifierad PST-1P-aktivering kan vid behov implementeras genom sekventiell 405 nm ljusbelysning. (F-G) För att vända PST-1P tillbaka till sitt inaktiva tillstånd och återställa EB3-dTomato-kometer appliceras en 514 nm laser på samma subcellulära region. Vid behov kan flera omgångar av fotoaktivering och avaktivering utföras. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I enlighet med protokollet mikroinjicerades preimplantationsmusembryon med cRNA för EB3, märkta med röd fluorescerande dTomato (EB3-dTomato). Detta möjliggör visualisering av växande mikrotubuli eftersom EB3 binder till polymeriserande mikrotubuli plus slutar24.
Experimenten utfördes 3 dagar efter befruktningen (E3) då musembryot består av 16 celler. Alla andra preimplantatorisk utvecklingsstadium kan användas, beroende på vilken vetenskaplig fråga som ska undersökas. För att demonstrera minimal fotoblekning med hjälp av 405 nm laserljusaktiveringsprotokoll visas ett kontrollexperiment med ett obehandlat embryo (figur 2A i). En ROI med slående EB3-dTomato densitet väljs utifrån den förvärvade 3D-bilden av embryot. I det här exemplet används ett enda z-plan av en hel cell för EB3-dTomato högupplöst avbildning. Olika regioner i embryot kan emellertid väljas efter behov (till exempel kortikal region, perinukleär region, en mitotisk cell, en inre eller yttre cell). En bild av EB3-dTomato-uttryck före 405 nm laserljusbelysning visar en mycket tät EB3-dTomato-signal inom hela cellens cytoplasma, utom kärnområdet (Figur 2A ii). Ingen förändring i EB3-dTomatodensiteten observerades efter 405 nm laserljusbelysning (figur 2A iii och iv). Således orsakar 405 nm laserljuset i sig ingen fotoskada på embryot eller mikrotubulidynamiken.
Därefter behandlades embryon i 16-cellstadiet med 40 μM PST-1P 3 h före levande avbildning och hölls i mörkret. För att framgångsrikt utföra PST-experiment på levande 3D-organismer är det viktigt att hitta den optimala jämvikten för PST-koncentration, inkubationstid och nödvändig laserkraft för att undvika skadliga effekter11. Under strikta mörka förhållanden kan starka EB3-dTomato-uttryck detekteras i 3D-bilden (figur 2B i), liknande kontrollembryon (figur 2A i). Således framkallar PST-1P inte hämning av mikrotubulipolymerisation under mörka förhållanden. Time-lapse-avbildning av ett enda z-plan bekräftade starkt EB3-dTomato-uttryck och mikrotubuli polymerisation före 405 nm laserljusbelysning (figur 2B ii). Inom några sekunder observerades en reduktion av EB3-dTomato-signalen efter 405 nm laserljusaktivering av PST-1P (figur 2B iii). Denna förlust rapporteras pågå cirka 2 till 20 minuter innan den gradvis återgår på grund av termisk avslappning eller diffusion i omgivande områden11. Således kan en repetitiv 405 nm laserljusaktivering förlänga varaktigheten av EB3-dTomato-förlust (figur 1E-D). Viktigt är att embryon mikroinjekerade med EB3-dTomato och inkuberade med PST-1P visar normal embryonal potential, utvecklas till blastocyststadiet (figur 3 och kompletterande figur 1) och normal mikrotubulidynamik, till exempel under mitos (kompletterande figur 2). Därför visar inaktiv PST-1P ingen toxicitet för embryot.
Kontrollerad PST-1P-avaktivering kan uppnås genom 514 nm laserljusbelysning (figur 2B iv). Medan detta tillvägagångssätt kan vara användbart för att bestämma ursprunget till mikrotubuli tillväxt efter PST-1P-inducerad tillväxthämning, utesluter det användningen av gröna fluorescerande proteiner för levande avbildning. Även om det rekommenderas starkt att arbeta under mörka förhållanden, om PST: er oavsiktligt aktiveras, möjliggör grön ljusbelysning PST-återgång till ett inaktivt transtillstånd. Under denna omständighet krävs en tillräcklig återhämtningsperiod för cellerna som en försiktighetsåtgärd för att säkerställa att cellerna kan återgå till sitt föraktiveringstillstånd. Om tiden tillåter skulle det helst vara minst några timmar.
Figur 2: Levande avbildning av EB3-dTomato före och efter UV-ljusaktivering och deaktivering av PST-1P i det levande musembryot. (A i) Maximal projektion 3D z-stack av ett obehandlat kontroll 16-cells stadium musembryo märkt för EB3-dTomato. En cytokinetisk mikrotubulibro är närvarande (betecknad med grå pilspets) tillsammans med flera interfasbroar (betecknad med gula pilspetsar). (A ii) Ett enda z-plan av en cell avbildad före 405 nm laserexponering. (A iii-iv) Ett enda z-plan av en cell avbildad omedelbart (A iii) och 4 min (A iv) efter 405 nm laserljusexponering (indikerad av en violett blixt), vilket inte visar någon förändring i EB3-dTomato-signalen. (B i) Maximal projektion 3D z-stack av ett embryo i 16-cellstadiet märkt för EB3-dTomato, som behandlas med 40 μM PST-1P och hålls i mörkret. Interfasbroar indikeras av gula pilspetsar. (B ii) Enstaka z-plan av en cell avbildad föraktivering. (B iii) Ett enda z-plan av en cell avbildad omedelbart efter 405 nm laserljusexponering (indikerad av en violett blixt), vilket visar en markant minskning av EB3-dTomato-signalen. (B iv) Ett enda z-plan av en cell avbildad omedelbart efter 514 nm laserljusexponering (indikerad med en grön blixt), vilket visar återhämtning av EB3-dTomato-signalen. Kärnor indikeras av den streckade blå linjen. Skalstänger: 15 μm för hela 3D-embryon; 5 μm i insatser. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Inaktiva PST-1P-odlingsförhållanden möjliggör normal embryonal utveckling till blastocyststadiet. (A) Single differential interference contrast (DIC) z-plan för ett embryo vid blastocyststadiet (E4.5) efter odling i 40 μM PST-1P i mörkret. B) Maximal projektion 3D z-stack av embryot som visas i (A), som visar EB3-dTomato-uttryck. Skalstänger: 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
I de förvärvade time-lapse-filmerna visas EB3-dTomato-märkning som "kometliknande" strukturer och möjliggör spårning av växande mikrotubulifilament (Figur 4). I PST-1P-behandlade embryon som hålls under mörka förhållanden (figur 4A) kan enskilda EB3-dTomato-kometer (betecknade med vita och gula pilspetsar i figur 4B) ses som härrör från interfasbron, som fungerar som ett icke-centrosomalt mikrotubuli-organiserande centrum i det tidiga musembryot16 (Figur 4B). En projektion av tidpunkter (t-stack) visar det totala antalet och avståndet som EB3-dTomato-kometer reste (figur 4B), vilket visar den högsta densiteten av EB3-dTomato i området för interfasbron. Efter aktivering av PST-1P med ett laserljus på 405 nm kan EB3-dTomato-kometer inte längre ses vid basen av interfasbron och saknas också i t-stacken (figur 4C).
Figur 4: Spårning av EB3-dTomato-kometer före och efter subcellulär UV-ljusaktivering av PST-1P i det levande musembryot. (A) Maximal projektion 3D z-stack av ett 16-cells stadium musembryo märkt för EB3-dTomato, behandlat med 40 μM PST-1P och förvarat i mörkret. (B) Fyra utvalda enkla z-plan och motsvarande t-stack av en ROI vid interfasbron (indikerad med *) före 405 nm laserbelysning, som visar EB3-dTomato-kometer över tiden. Rörelsen hos enskilda kometer indikeras av de gula och vita pilspetsarna medan de färgmatchade streckade pilspetsarna visar kometpositioner vid tidigare tidpunkter. Tiderna som visas är i sekunder (er). (C) Fyra utvalda enkla z-plan och motsvarande t-stack av interfasbron avbildad omedelbart efter 405 nm laserljusexponering (indikerad av en violett blixt) visar en förlust av EB3-dTomato-kometer. Skalstänger: 10 μm för hela 3D-embryon; 2 μm för enkla z-plan; 1,5 μm för t-stack. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Sammantaget visar dessa resultat appliceringen av PST-1P i det levande preimplantatorinjon musembryot. PST-1P hämmar effektivt mikrotubulipolymerisation efter aktivering med en 405 nm laser och denna hämning är reversibel vid 514 nm laserljusbelysning på cellulär och subcellulär nivå.
Kompletterande figur 1: Preimplantationsembryon odlade i inaktiv PST-1P visar normal utvecklingspotential till blastocyststadiet. A) Obehandlade kontroller och (B) PST-1P-behandlade embryon som visar utvecklingshastighet till blastocyststadiet. Alla embryon hölls i mörka förhållanden under hela utvecklingen för att säkerställa inaktivitet av PST-1P. Utvecklingshastigheten till blastocyststadiet var jämförbar mellan kontroller (100%, n = 13) och PST-1P-behandlade embryon (91,3%, n = 23). Skalstänger är 20 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Preimplantatorembryon odlade i inaktiv PST-1P visar normal spindeldynamik under mitos. (A) Obehandlade kontroller och (B) PST-1P-behandlade embryon som delar sig från 8-cells till 16-cellstadiet, injicerade med EB3-dTomato och Histone 2B (H2B)-GFP. Alla embryon hölls i mörka förhållanden under hela utvecklingen för att säkerställa inaktivitet av PST-1P. Anpassning av kromosomer kan ses (A i och B i), följt av tidig anafas (A ii och B ii), sen anafas (A iii och B iii) och cytokinesi (A iv och B iv) utan defekter. Skalstänger är 10 μm i 3D-bilder och 5 μm i insatser. (C) Anafas varade i medelvärdet 8 min 53 s i kontroller och 8 min 40 s i PST-1P-behandlade embryon (p-värde = 0,8241) och (D) kromosomer dekondenserade under telofas i medelvärdet 19 min 38 s i kontroller och 18 min 51 s efter anafasinitiering i PST-1P-behandlade embryon (p-värde = 0,2743). För analys är n = 10 i kontroller och n = 12 vid PST-1P-behandling. Dessutom är alla celler uppdelade i en synkron våg, som förväntat. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikrotubulinätverket är integrerat i en cells grundläggande inre arbete. Följaktligen presenterar detta utmaningar för att manipulera mikrotubulidynamiken i levande organismer, eftersom varje störning i nätverket tenderar att få omfattande konsekvenser för alla aspekter av cellulär funktion. Framväxten av fotoswitchbara mikrotubuli-riktade föreningar presenterar ett sätt att exakt manipulera cytoskelettet på en subcellulär nivå, med överlägsen kontroll för induktion och reversering av mikrotubulär tillväxthämning9. Detta protokoll visar hur mikrotubulipolymerisation kan hämmas i det preimplantatorande musembryot genom ljusaktiverad PST-1P i subcellulär skala och på ett tidsmässigt exakt sätt. Dessutom kan denna hämning vändas för att möjliggöra undersökning av kortvarig störning av mikrotubulinätverket.
Protokollet som presenteras är optimerat för tillämpning av PST på levande preimplantatoriska musembryon och kan användas som grund för att utöka deras användning till olika andra odlingssystem. Nya användare av PST kan stöta på några punkter i sina applikationer som kräver felsökning, för vilka flera problemlösningssteg presenteras.
Cytotoxiciteten hos PST bör bedömas och en arbetskoncentration som framkallar stark hämning av mikrotubulitillväxt med minimal toxicitet för celler bör väljas. Ett omfattande protokoll för att optimera arbetskoncentrationerna av PST och andra fotoswitchar beskrivs i en nyligen pre-print11. Kort sagt, nya användare av PST kan bedöma cytotoxicitet under mörka förhållanden med seriella utspädningar av läkemedlet. I denna miljö bör det inte finnas någon mätbar effekt på EB3-dTomato-kometer och ingen toxicitet för cellerna. Detta ger en utgångspunkt för att testa en icke-cytotoxisk koncentration under upplysta förhållanden. För ytterligare experiment rekommenderas den lägsta koncentrationen som framkallar en minskning av EB3-dTomato-kometer.
Som med all läkemedelsbehandling kan PST metaboliseras av cellen; Ur ett praktiskt perspektiv är detta dock sannolikt försumbart, vilket framgår av inkubation av C. elegans-embryon i PST-1P i 150 minuter och efterföljande effektiv isomerisering9. För mycket metaboliskt aktiva system kan en ökad koncentration av PST-1P krävas. PST kan också diffundera genom odlingsmediet, vilket minskar belastningen på aktiva PST inom avkastningen. För att mildra detta kan upprepad fotoaktivering vara nödvändig, vars cytotoxicitet skulle behöva bedömas på individuell celltypsbasis eftersom vissa system kan vara mottagliga för fototoxicitet. På samma sätt kan aktiverade PST diffundera ut ur den ljusaktiverade avkastningen och påverka omgivande mikrotubuli. På grund av deras inneboende tendens att slappna av tillbaka till det inaktiva transtillståndet bör effekten på omgivande områden vara försumbar.
Ett annat potentiellt hinder för användningen av PST hänför sig till deras tillämpning i organoider eller större organismer på grund av arten av begränsad ljuspenetrerbarhet hos dessa vävnader. Större vävnader kanske inte är tillgängliga för fotoaktivering av djupare celler. Det preimplantatoriska musembryot utgör en unik utmaning genom att det är omgivet av en yttre beläggning, zona pellucida, som kan hindra permeabiliteten hos läkemedel som läggs till media. För att mildra detta förinkuberas embryon i minst 1 timme i PST-1P före avbildning. Liknande optimeringsmetoder kan vara tillämpliga för att förbättra penetrationen av läkemedlet vid användning av PST i helorganism- eller organoidsystem, såsom tillsats av acetonitril för att underlätta cellulärt upptag av PST9.
På grund av PST: s reversibilitet för grönt ljus är dessa föreningar inte kompatibla med avbildning av fluoroforer som kräver excitation under 530 nm (såsom GFP). Användare kan dock implementera fluoroforspårning med vilken fluorofor som helst som kräver en excitation över 530 nm, till exempel RFP, mCherry eller mPlum. Om dubbelmärkning av subcellulära strukturer krävs kan användare använda röda och långröda baserade fluoroforer. Om GFP-kompatibilitet är viktigt kan en ny klass av fotoswitches, SBTubs, vara av intresse25. Dessa föreningar aktiveras också av UV-ljus; De svarar emellertid inte på grönt ljus, vilket gör dem funktionellt reversibla endast genom diffusion, men också kompatibla med alla fluoroforer med en excitationsvåglängd på 488 nm eller högre. Tillsammans med PST, som erbjuder reversibilitet men inte är kompatibla med avbildning av GFP, erbjuder dessa föreningar användaren ökad flexibilitet att ta ett anpassat tillvägagångssätt och anpassa de tillgängliga fotowitcharna till deras forskningsfråga.
Konventionella småmolekylära hämnings-, knockout- och knockdown-metoder kan implementeras på helcells- eller helorganismskalor för att karakterisera mikrotubuliverkan. Dessa tillvägagångssätt ger potenta, men ändå breda och destruktiva effekter på mikrotubuli som inte är lätt reversibla och ofta är svåra att rikta in sig på ett subcellulärt eller temporärt kontrollerat sätt. En strategi för att kringgå dessa begränsningar är genom genteknik av ett ljusinducerbart optogenetiskt system. Tillämpningarna av dessa system varierar mycket och inkluderar ljusinducerad heterodimerisering, homodimerisering och dissociation av proteiner eller proteindomäner26. Nyligen designades en optogenetiskt kontrollerad ändbindande protein 1 (EB1) konstruktion, där en ljusinducerbar omkopplare möjliggjorde disassociation av amino- och karboxylterminalerna i mikrotubuli plus End Binding partner EB1. Detta gjorde proteinet funktionellt inaktivt med sub-sekund svarstider, vilket blockerade tillväxten av mikrotubuli i en human lungkarcinom cellinje27. På samma sätt användes en optogenetisk omkopplare för att tvärbinda mikrotubuli och aktinfilament i D. melanogaster för att förstå påverkan av cytoskeletttvärbindning på morfologiska förändringar i cellen28. Användningen av optogenetiska verktyg för att manipulera det tidiga embryot är ett högaktuellt forskningsområde och har sett några nya framsteg1. Ett optogenetiskt modifierat kärnexportsystem utvecklades för att inducera fellokalisering av kärnproteiner. Detta kan efterlikna genetiska modeller för förlust av funktion, med den extra flexibiliteten att utföras vid exakta utvecklingstidpunkter i D. melanogaster-embryon 29. Optogenetiska tillvägagångssätt är ett kraftfullt verktyg för spatiotemporal kontroll av mikrotubulidynamik; De kan dock vara svåra att konstruera, tidskrävande och kostsamma. Däremot erbjuder PST ett kemiskt alternativ till komplex genetisk manipulation som har liknande svarstider, specificitet och reversibilitet med den extra fördelen med enkel användning och tillgänglighet.
Ett annat riktat tillvägagångssätt för att mekaniskt störa mikrotubulifilament är laserablation med hjälp av en tvåfotonlaser. Detta tillämpades framgångsrikt för att ablatera interfasbron i preimplantatorembryon16. När det implementeras väl kan användarna uppnå en hög utdelning. Att utföra denna teknik är dock utmanande och kräver en hög grad av precision för att undvika förstörelse eller lys av omgivande strukturer eller cellerna själva. Dessutom kan användare behöva upprepade gånger ablatera sina prover för att uppnå den avsedda effekten, eftersom mikrotubuli kan växa snabbtigen 30. Däremot hämmar PST direkt mikrotubulipolymerisation31 och undviker oönskade effekter som kan uppstå med laserablation på grund av deras specificitet för bindning till β-tubulin. Dessutom kan PST appliceras på hela organismen, medan laserablation av naturen endast kan riktas mot en viss region.
Med hjälp av detta protokoll är möjligheterna att tillämpa PST omfattande och övertygande. PST kan möjliggöra exakt, subcellulär hämning av mikrotubuli tillväxt inom sub-sekund svarstider för att studera aspekter av kromosomsegregering under mitotisk eller meiotisk celldelning. Handel med intracellulär last skulle kunna störas genom att hämma de transportvägar som tillhandahålls av mikrotubulinätverket för att studera endosomal handel, förflyttning av mitokondrier eller nukleär positionering. PST användes också för att framgångsrikt hämma mikrotubulitillväxt i 3D-multicellulära sfäroider odlade från humana melanomcellinjer 32,33. Att koppla flexibiliteten hos PST-aktivering med deras fantastiska svarstider ger forskare ett dynamiskt verktyg för att undersöka mikrotubulidynamik och manipulera cellulär funktion. Dessutom gör REVERSIbiliteten hos PST deras tillämpning idealisk för studier av både kortsiktiga och långsiktiga konsekvenser av mikrotubulihämning på en enda cell eller utvalda celler i en vävnad eller organism.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inget konkurrerande eller ekonomiskt intresse.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr. Oliver Thorn-Seshold och Li Gao för att ha gett oss fotostatiner och råd om manuskriptberedning, Monash Production för filmstöd och Monash Micro Imaging för mikroskopistöd.
Detta arbete stöddes av National Health and Medical Research Council (NHMRC) projektbidrag APP2002507 till J.Z. och Canadian Institute for Advanced Research (CIFAR) Azrieli Scholarship till J.Z. Australian Regenerative Medicine Institute stöds av bidrag från delstatsregeringen i Victoria och den australiensiska regeringen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | For mouth aspiration apparatus |
| Chamber slides - LabTek | Thermo Fisher Scientific | NUN155411 | |
| cRNA encoding for EB3-dTomato | N/A | N/A | Prepared according to manufacturers instructions using mMessage in vitro Transcription kit |
| Culture dishes - 35mm | Thermo Fisher Scientific | 150560 | |
| Human chorionic growth hormone | Sigma-Aldrich | C8554 | |
| Human Tubal Fluid (HTF) medium | Cosmo-Bio | CSR-R-B071 | |
| Imaris Image Analysis Software | Bitplane | ||
| Immersion Oil W 2010 | Carl Zeiss | 444969-0000-000 | For use with microscope immersion objective |
| LED torch - Red light | Celestron | 93588 | |
| M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Mice - wild-type FVB/N, males and females | N/A | N/A | Females 8-9 weeks old. Males 2-6 months old. |
| Microcapillary Pipettes - Kimble | Sigma-Aldrich | Z543306 | For mouth aspiration apparatus |
| Microinjection buffer | N/A | N/A | 5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4 |
| Mineral oil | Origio | ART-4008-5P | |
| mMessage In vitro Transcription kit | Thermo Fisher Scientific | AM1340 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM) medium | Cosmo-Bio | CSR-R-B074 | |
| Pregnant mare serum gonadotrophin | Prospec Bio | HOR-272 | |
| PST-1P | N/A | N/A | Borowiak, M. et al., Photoswitchable Inhibitors of Microtubule Dynamics Optically Control Mitosis and Cell Death. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015). |
| RNA purification kit | Sangon | B511361-0100 | |
| Ultrapure water | Sigma-Aldrich | W1503 | |
| ZEN Black Software | Carl Zeiss |
References
- Hawdon, A., Aberkane, A., Zenker, J. Microtubule-dependent subcellular organisation of pluripotent cells. Development. 148 (20), (2021).
- Sanchez, A. D., Feldman, J. L. Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites. Current Opinion in Cell Biology. 44, 93-101 (2017).
- Galli, M., Morgan, D. O. Cell size determines the strength of the spindle assembly checkpoint during embryonic development. Developmental Cell. 36 (3), 344-352 (2016).
- Vazquez-Diez, C., Paim, L. M. G., FitzHarris, G. Cell-size-independent spindle checkpoint failure underlies chromosome segregation error in mouse embryos. Current Biology. 29 (5), 865-873 (2019).
- Baudoin, J. P., Alvarez, C., Gaspar, P., Metin, C. Nocodazole-induced changes in microtubule dynamics impair the morphology and directionality of migrating medial ganglionic eminence cells. Developmental Neuroscience. 30 (1-3), 132-143 (2008).
- Munz, F., et al. Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment. Scientific Reports. 8 (1), 312 (2018).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
- Borowiak, M., et al. Photoswitchable inhibitors of microtubule dynamics optically control mitosis and cell death. Cell. 162 (2), 403-411 (2015).
- Gaspari, R., Prota, A. E., Bargsten, K., Cavalli, A., Steinmetz, M. O. Structural basis of cis- and trans-Combretastatin binding to tubulin. Chem. 2 (1), 102-113 (2017).
- Thorn-Seshold, O., Meiring, J. Photocontrolling microtubule dynamics with photoswitchable chemical reagents. ChemRxiv. , (2021).
- Kopf, A., et al. Microtubules control cellular shape and coherence in amoeboid migrating cells. Journal of Cell Biology. 219 (6), 201907154 (2020).
- Sawada, M., et al. PlexinD1 signaling controls morphological changes and migration termination in newborn neurons. The EMBO Journal. 37 (4), 97404 (2018).
- Singh, A., et al. Polarized microtubule dynamics directs cell mechanics and coordinates forces during epithelial morphogenesis. Nature Cell Biology. 20 (10), 1126-1133 (2018).
- Kepiro, M., et al. Azidoblebbistatin, a photoreactive myosin inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (24), 9402-9407 (2012).
- Zenker, J., et al. A microtubule-organizing center directing intracellular transport in the early mouse embryo. Science. 357 (6354), 925-928 (2017).
- White, M. D., Zenker, J., Bissiere, S., Plachta, N. Instructions for assembling the early mammalian embryo. Developmental Cell. 45 (6), 667-679 (2018).
- Zenker, J., et al. Expanding actin rings zipper the mouse embryo for blastocyst formation. Cell. 173 (3), 776-791 (2018).
- Theisen, U., et al. Microtubules and motor proteins support zebrafish neuronal migration by directing cargo. Journal of Cell Biology. 219 (10), 201908040 (2020).
- Rulicke, T. Pronuclear microinjection of mouse zygotes. Methods in Molecular Biology. 254, 165-194 (2004).
- Greaney, J., Subramanian, G. N., Ye, Y., Homer, H. Isolation and in vitro culture of mouse oocytes. Bio-protocol. 11 (15), 4104 (2021).
- Subramanian, G. N., et al. Oocytes mount a noncanonical DNA damage response involving APC-Cdh1-mediated proteolysis. Journal of Cell Biology. 219 (4), 201907213 (2020).
- Mihajlovic, A. I., Bruce, A. W. The first cell-fate decision of mouse preimplantation embryo development: integrating cell position and polarity. Open Biology. 7 (11), 170210 (2017).
- Roostalu, J., et al. The speed of GTP hydrolysis determines GTP cap size and controls microtubule stability. Elife. 9, 51992 (2020).
- Gao, L., et al. In vivo photocontrol of microtubule dynamics and integrity, migration and mitosis, by the potent GFP-imaging-compatible photoswitchable reagents SBTubA4P and SBTub2M. BioRxiv. bioRxiv. , (2021).
- Tichy, A. M., Gerrard, E. J., Legrand, J. M. D., Hobbs, R. M., Janovjak, H. Engineering strategy and vector library for the rapid generation of modular light-controlled protein-protein interactions. Journal of Molecular Biology. 431 (17), 3046-3055 (2019).
- van Haren, J., Adachi, L. S., Wittmann, T. Optogenetic control of microtubule dynamics. Methods in Molecular Biology. 2101, 211-234 (2020).
- Adikes, R. C., Hallett, R. A., Saway, B. F., Kuhlman, B., Slep, K. C. Control of microtubule dynamics using an optogenetic microtubule plus end-F-actin cross-linker. Journal of Cell Biology. 217 (2), 779-793 (2018).
- Kogler, A. C., et al. Extremely rapid and reversible optogenetic perturbation of nuclear proteins in living embryos. Developmental Cell. 56 (16), 2348-2363 (2021).
- Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: setting up and working with an ablation system. Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).
- Bukhari, S. N. A., Kumar, G. B., Revankar, H. M., Qin, H. L. Development of combretastatins as potent tubulin polymerization inhibitors. Bioorganic Chemistry. 72, 130-147 (2017).
- Gilazieva, Z., Ponomarev, A., Rutland, C., Rizvanov, A., Solovyeva, V. Promising applications of tumor spheroids and organoids for personalized medicine. Cancers (Basel). 12 (10), 2727 (2020).
- Scherer, K. M., et al. Three-dimensional imaging and uptake of the anticancer drug combretastatin in cell spheroids and photoisomerization in gels with multiphoton excitation. Journal of Biomedical Optics. 20 (7), 78003 (2015).
