Summary

מדידות רפלקס H טרמינלי בעכברים

Published: June 16, 2022
doi:

Summary

ההערכה הקלינית של ספסטיות המבוססת על רפלקס הופמן (H-reflex) ושימוש בגירוי חשמלי של עצבים היקפיים היא שיטה מבוססת. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לגירוי עצבי טרמינלי וישיר לכימות H-רפלקס בכף הקדמית של העכבר.

Abstract

רפלקס הופמן (H-reflex), כאנלוגיה חשמלית לרפלקס המתיחה, מאפשר אימות אלקטרופיזיולוגי של שלמות המעגלים העצביים לאחר פציעות כגון נזק לחוט השדרה או שבץ. עלייה בתגובת H-reflex, יחד עם תסמינים כמו התכווצויות שרירים לא רצוניות, רפלקס מתיחה מוגבר פתולוגית והיפרטוניה בשריר המתאים, היא אינדיקטור לספסטיות שלאחר שבץ (PSS).

בניגוד למדידות טרנסעוריות לא ספציפיות לעצבים, כאן אנו מציגים פרוטוקול לכימות רפלקס H ישירות בעצבים האולנרים והמדיאניים של הכף הקדמית, אשר ישים, בשינויים קלים, לעצב הטיביאלי והסכיאטי של הכף האחורית. בהתבסס על גירוי ישיר והסתגלות לעצבים שונים, השיטה מהווה כלי אמין ורב-תכליתי לאימות שינויים אלקטרופיזיולוגיים במודלים של מחלות הקשורות לספסטיות.

Introduction

רפלקס הופמן (H-reflex), הקרוי על שם הפיזיולוג פול הופמן, יכול להיות מעורר על ידי גירוי חשמלי של עצבים היקפיים, הנושאים אקסונים של נוירונים סנסוריים ומוטוריים הנובעים מאותם שרירים ומובילים אליהם. זהו האנלוגי המושרה חשמלית של רפלקס המתיחה המונוסינפטי, וחולק את אותו מסלול1. בניגוד למתיחה של שריר, רפלקס H נובע מגירוי חשמלי. כאשר עצבים היקפיים מגורים חשמלית בעוצמת זרם נמוכה, סיבי Ia afferent הם בדרך כלל depolarized הראשון בשל קוטר האקסון הגדול שלהם2. פוטנציאלי הפעולה שלהם מעוררים נוירוני אלפא מוטוריים (αMNs) בחוט השדרה, אשר בתורם מעוררים פוטנציאלי פעולה שנעים במורד אקסוני αMN לכיוון השריר (איור 1). מפל זה יוצר תגובה שרירית עם משרעת קטנה, המשתקפת במה שמכונה גל H. על ידי הגדלה הדרגתית של עוצמת הגירוי, המשרעת של גל H עולה עקב גיוס של יחידות מוטוריות נוספות. מעוצמת גירוי מסוימת, פוטנציאלי פעולה באקסונים הדקים יותר של αMN מופקים ישירות, אשר נרשם כגל M. גל M זה מופיע עם השהיה קצרה יותר מגל H (איור 2). אם עוצמת הגירוי מוגברת עוד יותר, המשרעת של גל M הופכת גדולה יותר עקב גיוס אקסונים נוספים של αMN, בעוד שגל H הופך בהדרגה קטן יותר. גל H יכול להיות מדוכא בעוצמות גירוי גבוהות עקב התפשטות לאחור אנטידרומית של פוטנציאלי פעולה באקסונים αMN. פוטנציאלי פעולה מופעלים אלה מתנגשים עם אלה של גירוי Ia ולכן יכולים לבטל זה את זה. בעוצמות גירוי על-מקסימליות, פוטנציאלי פעולה אורתודרומיים (לכיוון השריר) ואנטי-דרומיים (לכיוון חוט השדרה) מתרחשים בכל אקסוני MN; הראשון מוליד את המשרעת המקסימלית של גל M (Mmax), ואילו האחרון מביא לביטול מוחלט של רפלקס H3.

לצורך הערכה של ספסטיות לאחר שבץ מוחי (PSS) או פגיעה בחוט השדרה (SCI), נעשה שימוש ברפלקס H כדי להעריך את הבסיס העצבי של תנועה וספסטיות בבני אדם1. כימות משופר של השינוי ברפלקס H בין מדידות ובין נבדקים מושג על ידי שימוש ביחס בין גל H וגל M (יחס H/M). לחלופין, דיכאון תלוי קצב (RDD) נמדד, באמצעות קבוצה של תדרים עולים (למשל, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 ו 5.0 הרץ). RDD משקף את שלמותם של מעגלים מעכבים שעלולים להיות מופרעים על ידי שבץ או SCI. כאשר כל המעגלים העצביים שלמים, קיים דיכוי אחיד ובלתי תלוי בתדר של רפלקס H. עם זאת, אם יש עיכוב עצבי מופחת כתוצאה משבץ או SCI, דיכוי רפלקס H פוחת עם הגדלת תדירות הגירוי4.

ההקלטה האלקטרופיזיולוגית הנכונה באמצעות אלקטרודות פני השטח יכולה להיות מאתגרת ועשויה להיות מושפעת ממשימות מוטוריות, מנגנוני עיכוב ורגישות αMN5. ברישום הטרנסעורי במכרסמים, אלקטרודת גירוי ממוקמת ליד העצב הטיביאלי, ואלקטרודת הקלטה ממוקמת ליד השרירים הקשורים בכפה הקדמית. אולם לפי הניסיון שלנו, המיקום הנכון של האלקטרודות הטרנסעוריות (איור 1A) הוא אפילו מורכב ומשתנה יותר במכרסמים מאשר מיקום אלקטרודות פני השטח בבני אדם. זה יכול להוביל להבדלים באורך, בתדירות ובעוצמת הגירוי הדרושים כדי לעורר את רפלקס H. אתגרים מתודולוגיים אלה יכולים להסביר מדוע יש רק מספר מוגבל מאוד של מחקרי מדידת רפלקס H (למשל, במודלים ניסיונייםשל שבץ 3,4, ומודלים אחרים של ספסטיות6. גירוי והקלטה מדויקים (ארוכי טווח) של רפלקס H על עצבים בודדים יכולים, באופן עקרוני, להיות מושגת באמצעות אלקטרודות מושתלות המקיפות את עצב המטרה 7,8. בשל הניתוח המאתגר עם תופעות לוואי אפשריות עבור בעל החיים וחוסר יציבות פוטנציאלי של הבדיקה, גישה זו לא הפכה לסטנדרט בתחום. השיטה המוצגת כאן דורשת גם מומחיות כירורגית מסוימת. עם זאת, הוא מאפשר גירוי והקלטה חדשניים ומדויקים של עצבים מבודדים in vivo באמצעות עוצמות גירוי נמוכות, הנמנעות מגירוי סימולטני של עצבים שכנים.

Protocol

כל הניסויים נערכו בהתאם לחוקי הטיפול בבעלי חיים האירופיים והלאומיים ולהנחיות המוסדיות, ואושרו על ידי Landesamt für Natur-, Umwelt-, und Verbraucherschutz נורדריין-וסטפליה (Az: 81-02.04.2019.A309). הפרוטוקול מותאם לעכברים בוגרים (עכברי C57Bl/6J בני 8-16 שבועות בקירוב) ולרישום הגפיים הקדמיות. ניתן להתאים אותו בקלות על-ידי גירוי ?…

Representative Results

מתוך n = 15 ניסויי גירוי לכל תדירות גירוי וכפה, בחר לפחות n = 10 הקלטות מוצלחות לניתוח. ניסויים עם שגיאות מדידה (למשל, גל M חסר) אינם נכללים בניתוח. נתח כל ניסוי בנפרד וצור ממוצע להשוואות קבוצתיות/זמן מאוחר יותר. ההשהיה בין הגירוי להופעה של גל M וגל H נרשמת עבור כל ניסוי. מניסיוננו, גל M מתרחש בערך 2 מ?…

Discussion

בניגוד למדידות H-רפלקס טרנסעוריות שתוארו קודם לכן בעכבר6, אנו מספקים מדידה ישירה יותר וספציפית לעצב. גישה חדשה זו יכולה להיות מיושמת על העצבים של הגפה הקדמית והאחורית (למשל, העצבים המדיאניים, האולנרים והרדיאליים, והעצבים הטיביאליים והסכיאטיים, בהתאמה), מה שהופך שיטה זו לניתנת ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים בהכרת תודה על תמיכתו של T. Akay, אוניברסיטת דלהאוזי, במהלך ביקור של MG במעבדה שלו. עבודה זו נתמכה על ידי מימון מקרן Friebe (T0498/28960/16) ומ- Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית) – Project-ID 431549029 – SFB 1451.

Materials

Absorbent underpad VWR 115-0684
AD converter Cambridge Electronic Design, UK CED 1401micro
Amplifier Workshop Zoological Institute, UoC
Digital stimulator Workshop Zoological Institute, UoC MS 501
EMG electrodes Workshop Zoological Institute, UoC Two twisted, insulated copper wires (50 µm outer diameter) were soldered to a male plug and connected to a differential amplifier.
Eye ointment Bayer Bepanthen
Glass pipette Workshop Zoological Institute, UoC Prepare a glass pipette bent into a simple glass hook in the flame of a Bunsen burner.
Heating box MediHeat MediHeat V1200
Heating pad WPI 61840 Heating pad
Hook electrodes Workshop Zoological Institute, UoC To produce the electrodes, bend stainless steel miniature pins into hooks at one end and insert into blunt cannulas to create direct mechanical contact. Solder the end of the cannula to copper wires (length approx. 50 cm), which are connected to either stimulation or recording device.
Ketamine Pfizer Ketavet
Rectal probe WPI RET-3
Stimulator isolation unit Workshop Zoological Institute, UoC MI 401
Sterilizer CellPoint Scientific Germinator 500 Routine pre- and post-operative disinfection of the surgical equipment should be done by heat sterilization. Decontaminate instruments for 15 s in the heated glass bead bath (260°C).
Temperature controller WPI ATC200
Vaseline Bayer
Xylazine Bayer Rompun

References

  1. Palmieri, R. M., Ingersoll, C. D., Hoffman, M. A. The Hoffmann reflex: methodologic considerations and applications for use in sports medicine and athletic training research. Journal of Athletic Training. 39 (3), 268-277 (2004).
  2. Henneman, E., Somjen, G., Carpenter, D. O. Excitability and inhibitibility of motoneurons of different sizes. Journal of Neurophysiology. 28 (3), 599-620 (1965).
  3. Toda, T., Ishida, K., Kiyama, H., Yamashita, T., Lee, S. Down-regulation of KCC2 expression and phosphorylation in motoneurons, and increases the number of in primary afferent projections to motoneurons in mice with post-stroke spasticity. PLoS ONE. 9 (12), 114328 (2014).
  4. Lee, S., Toda, T., Kiyama, H., Yamashita, T. Weakened rate-dependent depression of Hoffmann’s reflex and increased motoneuron hyperactivity after motor cortical infarction in mice. Cell Death & Disease. 5 (1), 1007 (2014).
  5. Knikou, M. The H-reflex as a probe: Pathways and pitfalls. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 1-12 (2008).
  6. Wieters, F., et al. Introduction to spasticity and related mouse models. Experimental Neurology. 335, 113491 (2020).
  7. Pearson, K. G., Acharya, H., Fouad, K. A new electrode configuration for recording electromyographic activity in behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 36-42 (2005).
  8. Akay, T. Long-term measurement of muscle denervation and locomotor behavior in individual wild-type and ALS model mice. Journal of Neurophysiology. 111 (3), 694-703 (2014).
  9. Haghighi, S. S., Green, D. K., Oro, J. J., Drake, R. K., Kracke, G. R. Depressive effect of isoflurane anesthesia on motor evoked potentials. Neurosurgery. 26 (6), 993 (1990).
  10. Chang, H. -. Y., Havton, L. A. Differential effects of urethane and isoflurane on external urethral sphincter electromyography and cystometry in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 295 (4), 1248-1253 (2008).
  11. Nolan, J. P. Section 4: Nervous system (Br. J. Pharmacol). Clinical pharmacology. , 295-310 (2012).
  12. Struck, M. B., Andrutis, K. A., Ramirez, H. E., Battles, A. H. Effect of a short-term fast on ketamine-xylazine anesthesia in rats. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 50 (3), 344-348 (2011).
  13. Zandieh, S., Hopf, R., Redl, H., Schlag, M. G. The effect of ketamine/xylazine anesthesia on sensory and motor evoked potentials in the rat. Spinal Cord. 41 (1), 16-22 (2003).

Play Video

Cite This Article
Wieters, F., Gruhn, M., Büschges, A., Fink, G. R., Aswendt, M. Terminal H-reflex Measurements in Mice. J. Vis. Exp. (184), e63304, doi:10.3791/63304 (2022).

View Video