Summary
본 프로토콜은 배양된 래트 해마 뉴런 및 3D 구조화된 조명 현미경(3D-SIM)을 사용하여 축색 초기 분절의 막주기적 골격의 액틴 고리 및 기타 성분을 시각화하고 측정하는 방법을 기술한다.
Abstract
축삭 초기 세그먼트 (AIS)는 작용 전위가 시작되고 소마토 수지상 화물을 분류하여 신경 극성의 유지에 기여하는 수송 필터 및 확산 장벽을 구성하는 부위입니다. 주기적 액틴 고리를 포함하는 막 주기적 골격 (MPS)은 구조 단백질 및 상이한 이온 채널을 포함하는 다양한 AIS 단백질을 앵커링하기 위한 스캐폴드를 제공한다. 최근의 프로테오믹 접근법이 상당한 수의 새로운 AIS 성분을 확인했지만, MPS의 구조와 개별 구성 요소의 역할에 대한 세부 사항은 부족합니다. MPS (~ 190nm)에서 개별 액틴 링 사이의 거리는 MPS의 구조적 세부 사항을 해결하기 위해 초분해능 현미경 검사 기술을 사용해야합니다. 이 프로토콜은 배양된 래트 해마 뉴런을 사용하여 3D 구조화된 조명 현미경(3D-SIM)을 사용하여 막하 액틴 고리에 비해 MPS 내의 AIS 단백질의 정확한 국소화를 조사하는 방법을 기술한다. 또한, 개별 성분의 주기성 및 액틴 고리에 대한 그들의 위치를 정량적으로 평가하기 위한 분석적 접근법이 또한 설명된다.
Introduction
축삭 초기 세그먼트(AIS)는 척추동물 뉴런의 근위 축삭의 짧고 독특하게 전문화된 영역이다1. AIS는 소마토-수지상 화물 2,3,4,5,6,7을 분류하여 뉴런 극성을 유지하는 데 필수적인 수송 필터 및 확산 장벽을 포함한다. 또한, AIS의 독특한 구조는 작용 전위 개시 부위로서의 기능을 용이하게 하는 전압 게이팅된 이온 채널의 클러스터를 수용할 수 있게 한다8. 매우 안정적인 구조 단지는 AIS의 고유 한 기능의 기초가됩니다. 지난 10년 동안의 연구는 스펙트린에 의해 연결된 액틴 고리를 함유하는 막 주기적 골격(MPS)의 존재를 밝혀냈으며, 다양한 AIS 단백질9,10을 앵커링하기 위한 스캐폴드를 제공한다.
MPS (∼190 nm)9,10에서 액틴 링 사이의 거리는 종래의 광 현미경의 해상도 한계 미만이다. MPS를 시각화하기 위해 전자 현미경을 사용하려는 초기 시도는 MPS의 구조를 보존하지 못했기 때문에 성공하지 못했습니다. 따라서, 초분해능 현미경 기술은 MPS11의 구조적 세부 사항 중 일부를 밝히는 데 매우 중요한 것으로 입증되었습니다. 그러나 AIS 구조 복합체에 대한 이해, 구성 요소의 정체성과 기능, 시공간 조절은 여전히 불완전합니다. 최근의 프로테오믹 연구는 AIS12,13의 구조적 성분에 가까운 AIS에 국한되는 단백질의 상당한 목록을 만드는 데 성공했다. 그럼에도 불구하고 AIS 단지의 기능과 정확한 위치에 대한 세부 사항은 부족합니다. 따라서 초분해능 현미경 검사 기술은 다른 MPS 구성 요소에 비해 이러한 단백질의 정확한 위치를 검사하고 기능을 조사하는 데 필수적인 도구 역할을합니다. 몇몇 광 현미경 기술은 빛의 회절 한계보다 높은 분해능을 달성할 수 있으며, 일부는 단일 분자를 국소화할 수도 있다. 그러나, 이러한 기술들 중 다수는 전형적으로 특수한 형광단 또는 이미징 버퍼를 필요로 하며, 이미지 획득은 종종 시간-집약적이다14.
3D 구조화된 조명 현미경(3D-SIM)은 사용 편의성과 간단한 샘플 준비 요구 사항으로 인해 이미징 또는 샘플 준비를 위한 특수 시약이 필요하지 않으며 다양한 형광단 및 샘플과 잘 작동하며 여러 색상으로 쉽게 구현할 수 있으며 라이브 셀 이미징이 가능합니다15. SIM이 제공하는 최상의 해상도(~120nm)는 다른 많은 초분해능 기술에 비해 낮지만, 많은 응용 분야(예: 뉴런에서 MPS의 구성 요소 해결)에 충분합니다. 따라서 SIM이 적합한 선택인지 또는 더 높은 해상도가 필요한지 여부를 결정하기 위해 특정 응용 프로그램에 대한 요구 사항을 고려하는 것이 중요합니다. 여기에서, Abouelezz et al.16에서 구현된 바와 같이, 배양된 해마 뉴런 및 3D 구조화된 조명 현미경(3D-SIM)을 사용하여 MPS 내의 액틴 고리에 대한 추정적 AIS 단백질의 위치 및 조직을 조사하기 위한 프로토콜이 기술되어 있다.16
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Protocol
이 실험에 사용된 일차 해마 뉴런은 헬싱키 대학과 핀란드 법의 윤리적 지침에 따라 17일째 위스타 래트 배아 중 어느 한 성별의 배아로부터 수확되었다.16 .
1. 시료 준비
- 고충실도 유리 커버슬립에서 쥐 해마 뉴런이 희소 한 배양 조건 (~ 5,000-10,000 세포 / cm2)에서 14 일 (시험관 내 14 일) 동안 자랄 수 있도록하십시오.
참고: 희소 배양을 사용하면 신경돌기가 겹칠 가능성이 줄어들어 MPS를 정량화하는 데 도움이 됩니다. - 실온에서 12 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드를 사용하여 뉴런을 고정시킵니다. 커버슬립을 PBS (BSA-PBS) 중의 0.2% BSA로 1회 세척하고, 실온에서 PBS 중의 트리톤-X의 1% 용액에서 10분 동안 인큐베이션한다. BSA-PBS에서 한 번 세척하십시오.
- 항-안키린 G 항체 (1:200)를 BSA-PBS에 희석한다. 항체 용액을 커버슬립에 첨가하고, 4°C에서 밤새 인큐베이션한다. 임의로, 치킨 항-MAP2 항체 ( 표 문헌 참조)를 항체 용액에 첨가하여 소마토-수지상 도메인을 구분한다.
- 세포를 BSA-PBS로 1회 세척하고, PBS에서 0.1% 트리톤-X로 세척한 다음, BSA-PBS로 최종 세척을 수행한다.
- 형광단-태깅된 항-마우스 이차 항체 (1:200) ( 물질 표 참조)를 BSA-PBS에 희석하고, 커버슬립에 첨가하고, 실온에서 1 h 동안 인큐베이션한다. 세포를 BSA-PBS로 1회, PBS 중의 0.1% 트리톤-X로 1회, PBS에서 1회 세척한다.
- PBS 중의 태그된 팔로이드인의 1 μM 용액을 준비하고( 물질의 표 참조) 이를 세포에 첨가한다. 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 세포를 PBS에서 1회, PBS에서 0.1% 트리톤-X로 1회, PBS에서 1회 세척한다.
참고 : AlexaFluor488 태그 phalloidin이 여기에 사용되었지만 다른 태그도 작동합니다. - 커버슬립을 유리 슬라이드에 장착하려면 유리 슬라이드에 장착 매체 한 방울을 바르고, 커버슬립을 탈이온수에 담근 다음, 부드러운 종이 타월을 사용하여 닦으십시오(과도한 물을 제거하기 위해).
- 커버 슬립을 유리 슬라이드에 놓습니다. 실온에서 24시간 동안 인큐베이션한다.
참고: 하드 세팅 마운팅 매체(경화 후 굴절률 1.47)를 사용하여 샘플에 대한 부작용은 관찰되지 않았습니다.
- 커버 슬립을 유리 슬라이드에 놓습니다. 실온에서 24시간 동안 인큐베이션한다.
2. 이미징
- 가능하다면 이미징하기 전에 현미경 검사 시설 직원과 상담하십시오. 침지 오일 계산기( 재료 표 참조)를 사용하여 샘플에 적합한 침지 오일을 선택합니다.
- 샘플이 준비되면 커버슬립이 깨끗하고 잔여물이나 과도한 장착 매체가 없는지 확인하십시오. 필요한 경우 물이나 에탄올에 담근 면봉을 사용하여 청소하십시오. 샘플을 3D SIM 가능 현미경( 재료 표 참조)에 넣고 이미지화할 셀을 찾습니다.
- 관련 레이저 라인의 파워와 노출 시간을 조정하여 시료를 크게 표백하지 않고도 신호 대 잡음비를 최대화하십시오.
참고: 신호 대 잡음비가 좋으면 샘플에 초점을 맞춘 선명한 그리드 모양의 외관을 보여주고 정확한 고해상도 재구성으로 이어집니다. 488nm 및 640nm 레이저 라인을 사용하여 각각 F-actin 및 ankyrin G를 시각화했습니다. - 샘플의 상한과 하한을 z-차원에서 설정하고 스택 획득을 진행합니다.
참고: 125 nm의 z-스텝 사이즈가 여기에 사용되었다. - SIM 재구성을 성공적으로 하려면 현미경 소프트웨어( 자료 표 참조)에 사용된 염료에 적합한 광 전송 파일(OTF)이 있는지 확인하십시오.
참고: 일반적으로 전문 인력이 만들고 유지 관리합니다. 기능적 OTF가 없는 경우, 추정치에 따라 재구성을 수행할 수 있는 오픈 소스 도구도 사용할 수 있습니다17. 이 작업에서는 전문 인력이 제어하는 최신 OTF 파일이 사용되었습니다. - 스택에서 재구성 알고리즘을 실행하여 수퍼 분해능 재구성을 가져옵니다. 알려진 아티팩트에 대한 재구성을 확인하고 필요한 경우 매개변수를 조정하여 수정하십시오.
참고: 기본 알고리즘 매개 변수는 일반적으로 정확한 결과를 제공합니다. 이러한 아티팩트 중 상당수는 하나의 z-평면에서 여러 방향과 함께 줄무늬 선, '고스팅'(다양한 z-평면에 나타나는 반복 된 기능) 또는 일부 영역에서 나타나는 육각형 '벌집'패턴과 같은 반복되는 패턴을 포함합니다. 이러한 아티팩트는 종종 더 나은 샘플 준비, 더 나은 신호 대 잡음비, 재구성 알고리즘의 매개 변수 조정 또는 선택한 침지 오일의 굴절률이 장착 매체 및 샘플에 적합하도록 보장하여 고정 할 수 있습니다. SIM 아티팩트에 대한 자세한 설명과 아티팩트의 존재를 확인하는 데 자유롭게 사용할 수 있는 도구는 Ball et al.을 참조하십시오. 18 - SIM 재구성을 광역 이미지와 비교하여 해상도 향상을 관찰합니다.
- 다중 색상 SIM을 수행할 때는 만족스러운 재구성이 준비되면 정렬 알고리즘을 사용하여 서로 다른 채널을 올바르게 정렬합니다.
참고: 정렬 알고리즘은 현미경 제조업체의 지시에 따라 마이크로스피어 비드 준비를 사용하여 생성된 정렬 참조 파일을 사용합니다.
3. 이미지 분석
- MPS의 액틴 고리는 독특한 주기적 외관을 가지고 있습니다. 이미지 분석 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 액틴 링이 보이는 모든 초점 평면을 사용하여 최대 강도 프로젝션 이미지를 생성합니다.
- 최대 강도 프로젝션 이미지에서 눈에 보이는 인접한 링에 수직 선을 그리고 소프트웨어의 라인 '플롯 프로파일'기능과 함께 형광 강도를 기록합니다.
- 평균 피크 간 거리를 계산하려면 라인 프로파일에서 로컬 최대값을 기록하고 인접한 개별 형광 강도 피크 사이의 거리를 측정합니다.
참고: 예를 들어 MATLAB의 'findpeaks' 함수 또는 (오픈 소스) GNU Octave 플랫폼을 사용하여 쉽게 계산할 수 있습니다. - MPS에서 액틴 고리와 상이한 단백질의 공동국재화를 평가하기 위해, 액틴 및 후보 단백질의 SIM 재구성에 대한 공동국소화 분석 절차19,20,21을 실행한다. 수동으로 선택 항목을 그려 AIS를 소프트웨어 플랫폼19의 EzColocalization 플러그인에 대한 관심 영역으로 정의하고 분석을 실행하여 피어슨의 공동 현지화19,20,21의 PCC(상관 계수)를 계산합니다. PCC 값이 1에 가까우면 강력한 공동 지역화를 나타냅니다.
참고: 이 프로토콜은 그림 1에 요약되어 있습니다.
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Representative Results
배양된 래트 해마 뉴런 및 3D-SIM을 사용하여, AIS에서 액틴 고리 및 MPS의 다른 성분을 시각화하고 측정하기 위한 프로토콜이 기술된다. 이미지 스택의 재구성은 액틴 링의 명확한 주기성을 보여주었습니다 (그림 2A). 우리의 손에서, 알렉사 488 태깅 팔로이드인을 사용하여 시각화 된 MPS에서 액틴 고리의 평균 피크 간 거리는 190.36 ± 1.7 nm (평균 ± SEM)이었다. 이는 MPS에서 액틴 고리 사이의 ∼190 nm의 이전에 보고된 평균 거리와 일치한다. 유사하게, 항-안키린 G 항체가 안키린 G를 가시화하기 위해 사용되었다 (도 2B). 안키린 G와 F-액틴의 공국소화는 공동국재화19,20,21의 PCC를 계산하기 위해 공동국소화 분석 절차를 사용하여 AIS에서 시험되었다. 안키린 G 및 F-액틴 형광의 공국소화의 PCC는 0.36 ± 0.03이었다 (평균 ± SEM, 도 2B). 안키린 G 및 액틴 고리는 상이한 도메인에서 βIV-스펙트린에 결합함에 따라, 이들은 유의한 공동국소화를 나타내지 않는다. 이러한 데이터는 Abouelezz et al.16에서 채택되었습니다.
그림 1: 3D-SIM 이미징을 위한 샘플 준비를 위한 프로토콜의 개략적인 표현. 해마 뉴런은 쥐 배아에서 수확되고, 해리되고, 14 일 동안 배양물에서 유리 덮개 슬립에서 자랄 수 있습니다. 그런 다음 세포를 고정하고 태그된 팔로이딘 및 적절한 항체를 사용하여 염색한 다음, 3D-SIM 이미징을 위해 유리 슬라이드에 장착합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 축삭 초기 세그먼트(AIS)에서 막 주기적 골격(MPS)의 3D-SIM 재구성. (A) F-액틴(녹색) 및 안키린 G(마젠타)는 3D-SIM으로 시각화된 AIS에서의 규칙적인 분포를 보여준다. 스케일 바 = 1 μm. (B) AIS에서 MPS에서 안키린 G와 F-액틴의 공국재화에 대한 피어슨의 상관 계수(PCC). 안키린 G의 평균 PCC는 0.36 (검은 원)이었다. 회색 다이아몬드는 개별 셀(n=16)을 나타내고, 중간선은 중앙값을 나타내고, 오차 막대는 25번째 및 75번째 백분위수를 나타냅니다. 데이터는 Abouelezz et al.16이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명된 프로토콜은 초분해능 기술을 사용하여 MPS 단백질을 시각화하고 측정하는 방법을 제공한다. 액틴 링 및 기타 MPS 성분은 ~190 nm9,10의 주기성을 나타내므로, 기존의 회절 제한 이미징 접근법은 MPS의 세부사항을 밝힐 수 없다. 여러 현미경 검사 설정을 통해 회절 제한 구조를 초분해능으로 해결할 수 있으며 SIM은 강력하고 복잡하지 않은 옵션을 나타냅니다. 중요한 것은 SIM이 가장 널리 사용되는 형광단과 호환되므로 상당한 유연성을 제공한다는 것입니다. 또한, SIM은 라트룬쿨린 처리 뉴런22 및 살아있는 뉴런15의 액틴 고리와 같은 MPS에서 잠재적으로 희미한 구조를 시각화하는데 효과적이다.
이 프로토콜의 성공을 위한 필수적인 측면은 처음부터 MPS의 무결성을 보존하는 것입니다. 성공적인 SIM 이미징을 위한 가장 중요한 단계는 샘플 준비 중에 발생합니다. 예를 들어, 적당한 고정(실온에서 12분 동안 4% PFA) 및 강한 투과화(10분 동안 1% Triton-X)가 최상의 결과를 제공한다. 특정 준비에 필요할 수있는 가혹한 치료가 MPS의 구조적 무결성에 부정적인 영향을 미칠 수 있음을 명심하는 것이 중요합니다. 따라서 MPS의 보존을 극대화하기 위해 이러한 치료법을 수정하는 것이 가장 좋습니다.
이미징을 위해 샘플을 준비할 때 고려해야 할 또 다른 중요한 요소는 라벨링 밀도를 최대화하는 것입니다. 이상적으로는 모든 분자에 태그가 지정되고 검출됩니다. 예를 들어, 본 실험에 사용된 항-안키린 G 항체는 AIS를 표지하기 위해 일반적으로 사용된다. 이는 1:1000의 희석액에서 사용하고 실온에서 단지 1시간 동안 인큐베이션하는 경우에도 종래의 형광 현미경에서 뛰어난 성능을 제공한다. 그러나, 초분해능 현미경을 위한 양호한 표지 밀도를 얻기 위해, 5배 그 농도(1:200)를 사용하고 항체를 4°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션하는 것이 매우 효과적이다. 각 항체 또는 표지 기술에 대한 특정 요구 사항은 다양하며 실험적으로 결정해야하지만이를 명심하는 것이 도움이 될 수 있습니다.
또한 높은 신호 대 잡음비를 달성하면 정확하고 성공적인 SIM 재구성에 도움이된다는 점에 유의해야합니다. 엄지 손가락의 좋은 규칙은 SIM 양식이 결합되면 그리드 패턴이 개별 이미지에서 표시되어야한다는 것입니다. 그러나 이것이 항상 가능한 것은 아닙니다.
마지막으로, SIM은 power14를 해결하는 데 있어 가장 약한 초해상도 기술 중 하나라는 점에 유의해야 합니다. 따라서, MPS 단백질의 주기성 및 전체 조직을 드러내는 것으로 일반적으로 충분하지만, 확률적 광학 재구성 현미경(STORM)10보다 이들의 상호작용에 대한 세부사항을 제공할 수 있는 능력이 현저히 적다. 또한, 여기에 기술된 기술의 유용성은 특이적이고 잘 수행된 항체가 이용가능한 단백질의 연구로 제한된다. 그러나, 이것은 부분적으로 태그된 단백질15의 외인성 발현을 통해 회피될 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
Pirta Hotulainen 박사는이 원고를 준비하는 데 매우 귀중한 비판적 의견으로 인정 받고 있습니다. Rimante Minkeviciene 박사는 원래 실험에 사용 된 신경 배양을 준비하는 데 도움을 준 것으로 인정 받고 있습니다. 모든 이미징은 Biomedicum Imaging Unit에서 수행되었다. 이 작품은 핀란드 아카데미 (D.M., SA 266351)와 박사 과정 Brain & Mind (A.A.)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Corning | 3524 | |
| 4% Paraformaldehyde | |||
| Alexa-488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
| Alexa-647 anti-mouse | ThermoFisher | A31571 | |
| Anti-Ankyrin G antibody | UC Davis/NIH NeuroMab Facility, Clone 106/36 | 75-146 | |
| Anti-MAP2 antibody | Merck Millipore | AB5543 | |
| B-27 | Invitrogen | 17504044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BioWest | P6154 | |
| Deltavision OMX SR | GE Healthcare Life Sciences | N/A | |
| Fiji software package | ImageJ | ||
| GNU Octave | GNU | ||
| High performance coverslips | Marienfeld | 117530 | |
| Immersion Oil Calculator | Cytiva Life Sciences | https://tinyurl.com/ImmersionOilCalculator | |
| L-Glutamine | VWR | ICNA1680149 | |
| MATLAB R2020a | Mathworks | ||
| Neurobasal media | Invitrogen | 21103049 | |
| OMX SR | Delta Vision OMX | ||
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| ProLong Gold mounting media | Invitrogen | P10144 | |
| softWoRx Deconvolution | Cytiva Life Sciences | ||
| Superfrost Slides | Epredia | ISO 8037/1 | |
| TetraSpeck microspheres 0.1 µm | ThermoFisher | T7279 | |
| Triton-X | Sigma | X100 |
References
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