Summary
Le présent protocole décrit une méthode pour visualiser et mesurer les anneaux d’actine et d’autres composants du squelette périodique membranaire du segment initial de l’axone à l’aide de neurones hippocampiques de rat cultivés et d’une microscopie à illumination structurée en 3D (3D-SIM).
Abstract
Le segment initial axonal (AIS) est le site où les potentiels d’action s’initient et constitue un filtre de transport et une barrière de diffusion qui contribuent au maintien de la polarité neuronale en triant les cargaisons somato-dendritiques. Un squelette périodique membranaire (MPS) comprenant des anneaux d’actine périodiques fournit un échafaudage pour ancrer diverses protéines AIS, y compris des protéines structurelles et différents canaux ioniques. Bien que les approches protéomiques récentes aient permis d’identifier un nombre considérable de nouveaux composants de l’AIS, les détails de la structure du MPS et les rôles de ses composants individuels font défaut. La distance entre les anneaux d’actine individuels dans le MPS (~ 190 nm) nécessite l’utilisation de techniques de microscopie à super-résolution pour résoudre les détails structurels du MPS. Ce protocole décrit une méthode d’utilisation de neurones hippocampiques de rat cultivés pour examiner la localisation précise d’une protéine AIS dans le MPS par rapport aux anneaux d’actine sous-membraneux à l’aide de la microscopie à éclairage structuré en 3D (3D-SIM). En outre, une approche analytique pour évaluer quantitativement la périodicité des composants individuels et leur position par rapport aux anneaux d’actine est également décrite.
Introduction
Le segment initial de l’axone (AIS) est une région courte et spécialisée de l’axone proximal des neurones vertébrés1. L’AIS comprend un filtre de transport et une barrière de diffusion essentiels au maintien de la polarité neuronale par le tri des cargaisons somato-dendritiques2,3,4,5,6,7. De plus, la structure unique de l’AIS lui permet d’accueillir des grappes de canaux ioniques voltage-dépendants qui facilitent sa fonction de site d’initiation du potentiel d’action8. Un complexe structurel très stable sous-tend les fonctions uniques de l’AIS. La recherche au cours de la dernière décennie a révélé la présence d’un squelette périodique membranaire (MPS) contenant des anneaux d’actine reliés par la spectrine et fournissant un échafaudage pour ancrer diverses protéines AIS9,10.
La distance entre les anneaux d’actine dans le MPS (~190 nm)9,10 est inférieure à la limite de résolution de la microscopie optique conventionnelle. Les premières tentatives d’utilisation de la microscopie électronique pour visualiser le MPS n’ont pas abouti, car les procédures de préparation difficiles impliquées n’ont pas réussi à préserver la structure du MPS. Ainsi, les techniques de microscopie à super-résolution se sont avérées inestimables pour élucider certains des détails structurels du MPS11. Cependant, la compréhension du complexe structurel de l’AIS, l’identité et les fonctions de ses composants, ainsi que sa régulation spatio-temporelle sont encore incomplètes. Des études protéomiques récentes ont réussi à créer une liste importante de protéines qui se localisent dans l’AIS à proximité des composants structurels de l’AIS12,13. Pourtant, les détails de leur fonction et leur place précise dans le complexe AIS manquent. Ainsi, les techniques de microscopie à super-résolution servent d’outil essentiel pour examiner les positions précises de ces protéines par rapport aux autres composants MPS et étudier leurs fonctions. Plusieurs techniques de microscopie optique peuvent atteindre des résolutions supérieures à la limite de diffraction de la lumière, certaines pouvant même localiser des molécules uniques. Cependant, bon nombre de ces techniques nécessitent généralement des fluorophores spécialisés ou des tampons d’imagerie, et l’acquisition d’images prend souvent beaucoup de temps14.
La microscopie à éclairage structuré 3D (3D-SIM), en raison de sa facilité d’utilisation et de ses exigences simples en matière de préparation des échantillons, ne nécessite aucun réactif spécial pour l’imagerie ou la préparation des échantillons, fonctionne bien avec un large éventail de fluorophores et d’échantillons, peut être facilement mise en œuvre en plusieurs couleurs et est capable d’imagerie sur cellules vivantes15. Bien que la meilleure résolution possible offerte par la carte SIM (~ 120 nm) soit faible par rapport à de nombreuses autres techniques de super-résolution, elle est suffisante pour de nombreuses applications (par exemple, pour résoudre les composants du MPS dans les neurones). Ainsi, il est crucial de considérer l’exigence d’applications spécifiques pour déterminer si la carte SIM est un choix approprié ou si une résolution encore plus élevée est nécessaire. Ici, un protocole est décrit pour l’utilisation de neurones hippocampiques cultivés et de microscopie à illumination structurée en 3D (3D-SIM) pour examiner la position et l’organisation des protéines AIS putatives par rapport aux anneaux d’actine dans le MPS, comme mis en œuvre dans Abouelezz et al.16
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Protocol
Les neurones primaires de l’hippocampe utilisés dans ces expériences ont été prélevés16 à partir d’embryons embryonnaires de 17 embryons de rats Wistar de l’un ou l’autre sexe selon les directives éthiques de l’Université d’Helsinki et la loi finlandaise.
1. Préparation de l’échantillon
- Sur les couvercles en verre haute fidélité, permettre aux neurones de l’hippocampe du rat de se développer dans des conditions de culture clairsemées (~5 000 à 10 000 cellules / cm2) pendant 14 jours (14 jours in vitro).
REMARQUE: L’utilisation de cultures clairsemées réduit les risques de chevauchement des neurites, ce qui aide à quantifier le MPS. - Fixez les neurones à l’aide de 4% de paraformaldéhyde pendant 12 minutes à température ambiante. Laver le couvercle une fois dans 0,2% BSA dans PBS (BSA-PBS), puis incuber pendant 10 min dans une solution à 1% de Triton-X dans PBS à température ambiante. Laver une fois dans BSA-PBS.
- Diluer les anticorps anti-ankyrine G (1:200) dans BSA-PBS. Ajouter la solution d’anticorps au couvercle et incuber pendant la nuit à 4 °C. Éventuellement, ajoutez des anticorps anti-MAP2 de poulet (voir tableau des matériaux) à la solution d’anticorps pour délimiter le domaine somato-dendritique.
- Lavez les cellules une fois dans BSA-PBS, suivie de 0,1% triton-X dans PBS, puis faites un lavage final dans BSA-PBS.
- Diluer les anticorps secondaires anti-souris marqués au fluorophore (1:200) (voir tableau des matériaux) dans le BSA-PBS, ajouter au couvercle et incuber pendant 1 h à température ambiante. Lavez les cellules une fois dans BSA-PBS, une fois dans 0,1% Triton-X dans PBS, puis une fois dans PBS.
- Préparer une solution de 1 μM de phalloïdine marquée dans le PBS (voir Tableau des matériaux) et l’ajouter aux cellules. Incuber pendant 2 h à température ambiante. Lavez les cellules une fois dans PBS, une fois dans 0,1% Triton-X dans PBS, puis une fois dans PBS.
REMARQUE: La phalloïdine marquée AlexaFluor488 a été utilisée ici, mais d’autres étiquettes fonctionneront également. - Pour monter le couvercle sur une glissière en verre, appliquez une goutte de support de montage sur une glissière en verre, trempez la lèvre de couverture dans de l’eau désionisée et tamponnez à l’aide d’une serviette en papier souple (pour éliminer l’excès d’eau).
- Placez le couvercle sur la glissière en verre. Incuber à température ambiante pendant 24 h.
REMARQUE: Aucun effet indésirable sur l’échantillon n’a été observé à l’aide de supports de montage rigides (indice de réfraction de 1,47 après durcissement).
- Placez le couvercle sur la glissière en verre. Incuber à température ambiante pendant 24 h.
2. Imagerie
- Si possible, consultez le personnel de l’installation de microscopie avant l’imagerie. Utilisez un calculateur d’huile d’immersion (voir Tableau des matériaux) pour sélectionner l’huile d’immersion adaptée à l’échantillon.
- Une fois les échantillons prêts, assurez-vous que les couvercles sont propres et exempts de tout résidu ou support de montage en excès. Si nécessaire, utilisez une pointe en coton trempée dans de l’eau ou de l’éthanol pour nettoyer. Placez l’échantillon dans un microscope 3D compatible SIM (voir Tableau des matériaux) et trouvez une cellule à imager.
- Ajustez la puissance des lignes laser concernées et les temps d’exposition pour maximiser le rapport signal/bruit sans blanchir considérablement l’échantillon.
REMARQUE: Un bon rapport signal/bruit montrera une apparence claire de grille axée sur l’échantillon et conduira à des reconstructions précises à haute résolution. Des lignes laser de 488 nm et 640 nm ont été utilisées pour visualiser respectivement la F-actine et l’ankyrine G. - Définissez les limites supérieure et inférieure de l’échantillon dans la dimension z et procédez à l’acquisition d’une pile.
REMARQUE: la taille z-step de 125 nm a été utilisée ici. - Pour une reconstruction SIM réussie, assurez-vous que le logiciel de microscopie (voir Tableau des matériaux) dispose d’un fichier de transfert optique (OTF) adapté aux colorants utilisés.
REMARQUE: Ceux-ci sont généralement créés et maintenus par du personnel spécialisé. En l’absence d’un OTF fonctionnel, des outils open source sont également disponibles pour effectuer des reconstructions basées sur des estimations17. Dans ce travail, des dossiers à jour de la FTO ont été utilisés et contrôlés par du personnel spécialisé. - Exécutez l’algorithme de reconstruction sur la pile pour obtenir une reconstruction super-résolue. Vérifiez les reconstructions pour les artefacts connus et, si nécessaire, ajustez les paramètres pour les corriger.
REMARQUE : Les paramètres d’algorithme par défaut donnent généralement des résultats précis. Beaucoup de ces artefacts impliquent des motifs répétitifs: des lignes rayées avec plusieurs directions sur un plan z, des « fantômes » (caractéristiques répétées apparaissant dans divers plans z) ou un motif hexagonal « nid d’abeille » émergeant dans certaines zones. Ces artefacts peuvent souvent être corrigés avec une meilleure préparation de l’échantillon, un meilleur rapport signal/bruit, en ajustant les paramètres de l’algorithme de reconstruction ou en s’assurant que l’indice de réfraction de l’huile d’immersion choisie est adapté au milieu de montage et à l’échantillon. Pour une discussion plus détaillée des artefacts SIM et un outil disponible gratuitement pour vérifier la présence d’artefacts, voir Ball et al. 18 ans - Comparez la reconstruction de la carte SIM à une image grand champ pour observer des améliorations de résolution.
- Lorsque vous effectuez une carte SIM multicolore, utilisez l’algorithme d’alignement pour aligner correctement les différents canaux une fois qu’une reconstruction satisfaisante est prête.
REMARQUE: L’algorithme d’alignement utilise un fichier de référence d’alignement généré à l’aide d’une préparation de billes de microsphère conformément aux instructions du fabricant du microscope.
3. Analyse d’images
- Les anneaux d’actine dans le MPS ont un aspect périodique distinctif. À l’aide d’un logiciel d’analyse d’images (voir Tableau des matériaux), créez une image de projection d’intensité maximale en utilisant tous les plans focaux où les anneaux d’actin sont visibles.
- Sur l’image de projection d’intensité maximale, tracez une ligne perpendiculaire à travers les anneaux adjacents visibles et enregistrez l’intensité de fluorescence avec la fonction de ligne « Tracer le profil » du logiciel.
- Pour calculer la distance moyenne entre les pics, notez les maxima locaux dans le profil de ligne et mesurez la distance entre les pics d’intensité fluorescente adjacents individuels.
REMARQUE: Cela peut être facilement calculé, par exemple, en utilisant la fonction 'findpeaks' dans MATLAB ou la plate-forme GNU Octave (open-source). - Pour évaluer la colocalisation de différentes protéines avec des anneaux d’actine dans le MPS, exécutez une procédure d’analyse de colocalisation19,20,21 sur les reconstructions SIM de l’actine et de la protéine candidate. Dessinez manuellement une sélection pour définir l’AIS comme une région d’intérêt pour le plugin EzColocalization dans la plate-forme logicielle19 et exécutez l’analyse pour calculer le coefficient de corrélation (PCC) de colocalisation de Pearson19,20,21. Une valeur PCC proche de 1 indique une forte colocalisation.
REMARQUE : Ce protocole est résumé à la figure 1.
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Representative Results
En utilisant des neurones hippocampiques de rat cultivés et 3D-SIM, un protocole est décrit pour visualiser et mesurer les anneaux d’actine et d’autres composants du MPS dans l’AIS. Les reconstructions des piles d’images ont montré une périodicité claire des anneaux d’actine (Figure 2A). Dans nos mains, la distance moyenne entre les pics des anneaux d’actine dans le MPS, visualisée à l’aide de la phalloïdine marquée Alexa 488, était de 190,36 ± 1,7 nm (moyenne ± SEM). Ceci est conforme à la distance moyenne précédemment rapportée d’environ 190 nm entre les anneaux d’actine dans le MPS. De même, un anticorps anti-ankyrine G a été utilisé pour visualiser l’ankyrine G (Figure 2B). La colocalisation de l’ankyrine G et de la F-actine a été testée dans l’AIS à l’aide d’une procédure d’analyse de colocalisation pour calculer le PCC de colocalisation19,20,21. Le PCC de colocalisation de la fluorescence de l’ankyrine G et de la F-actine était de 0,36 ± 0,03 (moyenne ± SEM, Figure 2B). Comme l’ankyrine G et les anneaux d’actine se lient à la βIV-spectrine à différents domaines, ils ne montrent pas de colocalisation significative. Ces données ont été adaptées d’Abouelezz et al.16
Figure 1 : Représentation schématique du protocole de préparation des échantillons pour l’imagerie 3D-SIM. Les neurones de l’hippocampe sont prélevés sur des embryons de rats, dissociés et autorisés à se développer sur des couvertures en verre en culture pendant 14 jours. Les cellules sont ensuite fixées et colorées à l’aide de phalloïdine marquée et d’anticorps appropriés, puis montées sur des lames de verre pour l’imagerie 3D-SIM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Reconstruction 3D-SIM du squelette périodique membranaire (MPS) dans le segment initial de l’axone (AIS). (A) F-actine (vert) et ankyrine G (magenta) montrent une distribution régulière dans l’AIS, visualisée par 3D-SIM. Barre d’échelle = 1 μm. (B) Coefficients de corrélation (PCC) de Pearson de la colocalisation de l’ankyrine G avec la F-actine dans le MPS dans l’AIS. Le PCC moyen de l’ankyrine G était de 0,36 (cercle noir). Les diamants gris représentent des cellules individuelles (n = 16), la ligne médiane représente la médiane, les barres d’erreur représentent les 25e et 75e percentiles. Les données sont adaptées d’Abouelezz et al.16Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Le protocole décrit ici fournit une méthode pour visualiser et mesurer les protéines MPS en utilisant la technique de super-résolution. Comme les anneaux d’actine et d’autres composants MPS affichent une périodicité d’environ 190 nm9,10, les approches d’imagerie conventionnelles à diffraction limitée ne peuvent pas révéler les détails du MPS. Plusieurs configurations de microscopie peuvent résoudre des structures limitées par diffraction en super-résolution, et SIM représente une option robuste et simple. Il est important de noter que la carte SIM est compatible avec les fluorophores les plus utilisés, offrant une flexibilité significative. En outre, la CARTE SIM est efficace pour visualiser les structures potentiellement sombres dans le MPS, telles que les anneaux d’actine dans les neurones traités à la latrunculine22, ainsi que les neurones vivants15.
Un aspect essentiel pour le succès de ce protocole est de préserver l’intégrité du MPS en premier lieu. Les étapes les plus critiques pour une imagerie SIM réussie se produisent lors de la préparation de l’échantillon. Par exemple, une fixation modérée (4 % de PFA pendant 12 min à température ambiante) et une forte perméabilisation (1 % de Triton-X pendant 10 min) donnent les meilleurs résultats. Il est crucial de garder à l’esprit que les traitements sévères qui peuvent être nécessaires pour des préparations spécifiques peuvent avoir un effet négatif sur l’intégrité structurelle du MPS. Par conséquent, il est peut-être préférable d’envisager de modifier ces traitements pour maximiser la préservation du MPS.
L’autre facteur crucial à prendre en compte lors de la préparation des échantillons pour l’imagerie est de maximiser la densité d’étiquetage. Idéalement, chaque molécule serait étiquetée et détectée. Par exemple, l’anticorps anti-ankyrine G utilisé dans cette expérience est couramment utilisé pour marquer l’AIS. Il offre des performances exceptionnelles en microscopie à fluorescence conventionnelle, même lorsqu’il est utilisé à une dilution de 1:1000 et incubé pendant seulement 1 h à température ambiante. Cependant, pour obtenir une bonne densité de marquage pour la microscopie à super-résolution, il est très efficace d’utiliser 5 fois cette concentration (1:200) et d’incuber l’anticorps pendant la nuit à 4 °C. Bien que les exigences spécifiques pour chaque anticorps ou technique de marquage varient et doivent être déterminées expérimentalement, il est peut-être utile de garder cela à l’esprit.
En outre, il est essentiel de noter que l’obtention d’un rapport signal/bruit élevé se prête bien à des reconstructions SIM précises et réussies. Une bonne règle de base est que le motif de grille doit être visible dans les images individuelles une fois que la modalité SIM est engagée. Cependant, ce n’est pas toujours possible.
Enfin, il est essentiel de noter que la carte SIM est l’une des techniques de super-résolution les plus faibles en matière de puissance de résolution14. Ainsi, bien qu’elle soit généralement suffisante pour révéler la périodicité et l’organisation globale des protéines MPS, elle est nettement moins capable de fournir des détails sur leurs interactions que la microscopie à reconstruction optique stochastique (STORM)10. De plus, l’utilité de la technique décrite ici se limite à l’étude des protéines pour lesquelles un anticorps spécifique et performant est disponible. Cependant, cela peut être partiellement contourné par l’expression exogène de protéines marquées15.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
La Dre Pirta Hotulainen est reconnue pour ses commentaires critiques, d’une valeur inestimable pour la préparation de ce manuscrit. La Dre Rimante Minkeviciene est reconnue pour son aide dans la préparation des cultures neuronales utilisées pour les expériences originales. Toute l’imagerie a été réalisée dans l’unité d’imagerie Biomedicum. Ce travail a été soutenu par l’Académie de Finlande (D.M., SA 266351) et le programme doctoral Brain & Mind (A.A.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Corning | 3524 | |
| 4% Paraformaldehyde | |||
| Alexa-488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
| Alexa-647 anti-mouse | ThermoFisher | A31571 | |
| Anti-Ankyrin G antibody | UC Davis/NIH NeuroMab Facility, Clone 106/36 | 75-146 | |
| Anti-MAP2 antibody | Merck Millipore | AB5543 | |
| B-27 | Invitrogen | 17504044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BioWest | P6154 | |
| Deltavision OMX SR | GE Healthcare Life Sciences | N/A | |
| Fiji software package | ImageJ | ||
| GNU Octave | GNU | ||
| High performance coverslips | Marienfeld | 117530 | |
| Immersion Oil Calculator | Cytiva Life Sciences | https://tinyurl.com/ImmersionOilCalculator | |
| L-Glutamine | VWR | ICNA1680149 | |
| MATLAB R2020a | Mathworks | ||
| Neurobasal media | Invitrogen | 21103049 | |
| OMX SR | Delta Vision OMX | ||
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| ProLong Gold mounting media | Invitrogen | P10144 | |
| softWoRx Deconvolution | Cytiva Life Sciences | ||
| Superfrost Slides | Epredia | ISO 8037/1 | |
| TetraSpeck microspheres 0.1 µm | ThermoFisher | T7279 | |
| Triton-X | Sigma | X100 |
References
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