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Neuroscience

झिल्ली के गुण मापना 3D-संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (3D-SIM) का उपयोग करके अक्षतंतु प्रारंभिक खंड का आवधिक कंकाल

Published: February 11, 2022 doi: 10.3791/63327

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल सुसंस्कृत चूहे हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स और 3 डी-संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (3 डी-सिम) का उपयोग करके अक्षतंतु प्रारंभिक खंड के झिल्ली आवधिक कंकाल के एक्टिन रिंग्स और झिल्ली आवधिक कंकाल के अन्य घटकों की कल्पना और मापने के लिए एक विधि का वर्णन करता है।

Abstract

अक्षतंतु प्रारंभिक खंड (एआईएस) वह साइट है जिस पर एक्शन पोटेंशियल शुरू होती है और एक परिवहन फिल्टर और प्रसार बाधा का गठन करती है जो सोमाटो-डेंड्रिटिक कार्गो को छंटाई करके न्यूरोनल ध्रुवीयता के रखरखाव में योगदान करती है। एक झिल्ली आवधिक कंकाल (एमपीएस) जिसमें आवधिक एक्टिन के छल्ले शामिल होते हैं, संरचनात्मक प्रोटीन और विभिन्न आयन चैनलों सहित विभिन्न एआईएस प्रोटीन को लंगर डालने के लिए एक पाड़ प्रदान करता है। हालांकि हाल ही में प्रोटिओमिक दृष्टिकोणों ने उपन्यास एआईएस घटकों की काफी संख्या की पहचान की है, एमपीएस की संरचना और इसके व्यक्तिगत घटकों की भूमिकाओं के विवरण की कमी है। एमपीएस (~ 190 एनएम) में व्यक्तिगत एक्टिन रिंगों के बीच की दूरी को एमपीएस के संरचनात्मक विवरणों को हल करने के लिए सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी तकनीकों के रोजगार की आवश्यकता होती है। यह प्रोटोकॉल 3 डी-संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (3 डी-सिम) का उपयोग करके उप-झिल्लीदार एक्टिन रिंग्स के सापेक्ष एमपीएस में एआईएस प्रोटीन के सटीक स्थानीयकरण की जांच करने के लिए सुसंस्कृत चूहे हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स का उपयोग करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। इसके अलावा, व्यक्तिगत घटकों की आवधिकता और एक्टिन के छल्ले के सापेक्ष उनकी स्थिति का मात्रात्मक रूप से आकलन करने के लिए एक विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण का भी वर्णन किया गया है।

Introduction

अक्षतंतु प्रारंभिक खंड (एआईएस) कशेरुक न्यूरॉन्स 1 के समीपस्थ अक्षतंतु का एक छोटा, विशिष्ट रूप से विशिष्ट क्षेत्र है। एआईएस में एक परिवहन फिल्टर और प्रसार बाधा शामिल है जो सोमाटो-डेंड्राइटिक कार्गो 2,3,4,5,6,7 को छँटाई करके न्यूरोनल ध्रुवीयता को बनाए रखने में आवश्यक है इसके अलावा, एआईएस की अद्वितीय संरचना इसे वोल्टेज-गेटेड आयन चैनलों के समूहों को समायोजित करने की अनुमति देती है जो कार्रवाई संभावित दीक्षा की साइट के रूप में इसके कार्य को सुविधाजनक बनाते हैं। एक अत्यधिक स्थिर संरचनात्मक परिसर एआईएस के अद्वितीय कार्यों को रेखांकित करता है। पिछले दशक के भीतर अनुसंधान ने एक झिल्ली आवधिक कंकाल (एमपीएस) की उपस्थिति का खुलासा किया है जिसमें स्पेक्ट्रिन द्वारा जुड़े एक्टिन के छल्ले होते हैं और विभिन्न एआईएस प्रोटीन 9,10 को लंगर डालने के लिए एक पाड़ प्रदान करते हैं

एमपीएस (~ 190 एनएम) 9,10 में एक्टिन के छल्ले के बीच की दूरी पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी की संकल्प सीमा के तहत है। एमपीएस की कल्पना करने के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के शुरुआती प्रयास सफल नहीं थे, क्योंकि इसमें शामिल कठोर तैयारी प्रक्रियाएं एमपीएस की संरचना को संरक्षित करने में विफल रही थीं। इस प्रकार, सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी तकनीकों ने एमपीएस 11 के कुछ संरचनात्मक विवरणों को स्पष्ट करने में अमूल्य साबित किया है। हालांकि, एआईएस संरचनात्मक परिसर की समझ, इसके घटकों की पहचान और कार्य, और इसके स्पैटिओटेम्पोरल विनियमन अभी भी अधूरे हैं। हाल के प्रोटिओमिक अध्ययन प्रोटीन की एक बड़ी सूची बनाने में सफल रहे जो एआईएस 12,13 के संरचनात्मक घटकों के करीब एआईएस के लिए स्थानीयकृत होते हैं। फिर भी, एआईएस परिसर में उनके कार्य और सटीक स्थान के विवरण की कमी है। इस प्रकार, सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी तकनीकें अन्य एमपीएस घटकों के सापेक्ष इन प्रोटीनों की सटीक स्थिति की जांच करने और उनके कार्यों की जांच करने के लिए एक आवश्यक उपकरण के रूप में कार्य करती हैं। कई प्रकाश माइक्रोस्कोपी तकनीकें प्रकाश की विवर्तन सीमा से अधिक रिज़ॉल्यूशन प्राप्त कर सकती हैं, कुछ एकल अणुओं को स्थानीयकृत करने में भी सक्षम हैं। हालांकि, इनमें से कई तकनीकों को आमतौर पर विशेष फ्लोरोफोरस या इमेजिंग बफर की आवश्यकता होती है, और छवि अधिग्रहण अक्सर समय-गहन होता है।

3 डी संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (3 डी-सिम), उपयोग में आसानी और सरल नमूना तैयारी आवश्यकताओं के कारण, इमेजिंग या नमूना तैयारी के लिए कोई विशेष अभिकर्मकों की आवश्यकता नहीं होती है, फ्लोरोफोरस और नमूनों की एक विस्तृत सरणी के साथ अच्छी तरह से काम करता है, कई रंगों में आसानी से लागू किया जा सकता है, और लाइव-सेल इमेजिंग 15 में सक्षम है। जबकि सबसे अच्छा संभव रिज़ॉल्यूशन सिम प्रदान करता है (~ 120 एनएम) कई अन्य सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीकों की तुलना में कम है, यह कई अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त है (उदाहरण के लिए, न्यूरॉन्स में एमपीएस के घटकों को हल करने के लिए)। इस प्रकार, यह निर्धारित करने के लिए विशिष्ट अनुप्रयोगों की आवश्यकता पर विचार करना महत्वपूर्ण है कि क्या सिम एक उपयुक्त विकल्प है या यदि एक उच्च रिज़ॉल्यूशन आवश्यक है। यहां, सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स और 3 डी-संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (3 डी-सिम) का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है ताकि एमपीएस में एक्टिन के छल्ले के सापेक्ष एआईएस प्रोटीन की स्थिति और संगठन की जांच की जा सके, जैसा कि Abouelezz et al.16 में लागू किया गया है।

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Protocol

इन प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले प्राथमिक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स को हेलसिंकी विश्वविद्यालय और फिनिश कानून के नैतिक दिशानिर्देशों के तहत भ्रूण दिवस 17 विस्टार चूहा भ्रूण से काटा गया था।

1. नमूना तैयारी

  1. उच्च-निष्ठा ग्लास कवरलिप्स पर, चूहे हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स को 14 दिनों (14 दिनों-इन-विट्रो) के लिए विरल संस्कृति स्थितियों (~ 5,000-10,000 कोशिकाओं / सेमी 2) में बढ़ने की अनुमति दें।
    नोट: विरल संस्कृतियों का उपयोग करने से ओवरलैपिंग न्यूराइट्स की संभावना कम हो जाती है, जो एमपीएस को मापने में मदद करती है।
  2. कमरे के तापमान पर 12 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड का उपयोग करके न्यूरॉन्स को ठीक करें। पीबीएस (बीएसए-पीबीएस) में 0.2% बीएसए में एक बार कवरस्लिप को धोएं, फिर कमरे के तापमान पर पीबीएस में ट्राइटन-एक्स के 1% समाधान में 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। बीएसए-पीबीएस में एक बार धो लें।
  3. बीएसए-पीबीएस में एंटी-एंकिरिन जी एंटीबॉडी (1: 200) को पतला करें। कवरस्लिप में एंटीबॉडी समाधान जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। वैकल्पिक रूप से, somato-dendritic डोमेन सीमांकन करने के लिए एंटीबॉडी समाधान के लिए चिकन विरोधी MAP2 एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें।
  4. बीएसए-पीबीएस में एक बार कोशिकाओं को धोएं, इसके बाद पीबीएस में 0.1% ट्राइटन-एक्स, फिर बीएसए-पीबीएस में अंतिम धोएं।
  5. बीएसए-पीबीएस में फ्लोरोफोर-टैग किए गए एंटी-माउस माध्यमिक एंटीबॉडी (1: 200) ( सामग्री की तालिका देखें) को पतला करें, कवरस्लिप में जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। बीएसए-पीबीएस में एक बार कोशिकाओं को धोएं, पीबीएस में 0.1% ट्राइटन-एक्स में एक बार, फिर पीबीएस में एक बार।
  6. पीबीएस में टैग किए गए फालोइडिन का 1 μM समाधान तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें) और इसे कोशिकाओं में जोड़ें। कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। पीबीएस में एक बार कोशिकाओं को धोएं, पीबीएस में 0.1% ट्राइटन-एक्स में एक बार, फिर पीबीएस में एक बार।
    नोट: AlexaFluor488-टैग किए गए phalloidin यहाँ इस्तेमाल किया गया था, लेकिन अन्य टैग भी काम करेंगे.
  7. एक ग्लास स्लाइड पर कवरस्लिप को माउंट करने के लिए, ग्लास स्लाइड पर बढ़ते मीडिया की एक बूंद लागू करें, कवरस्लिप को विआयनीकृत पानी में डुबोएं, और एक नरम पेपर तौलिया (अतिरिक्त पानी को हटाने के लिए) का उपयोग करके थपकी दें।
    1. कवरस्लिप को ग्लास स्लाइड पर रखें। कमरे के तापमान पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: हार्ड-सेटिंग बढ़ते मीडिया (इलाज के बाद अपवर्तक सूचकांक 1.47) का उपयोग करके नमूने पर कोई प्रतिकूल प्रभाव नहीं देखा गया था।

2. इमेजिंग

  1. यदि संभव हो, तो इमेजिंग से पहले माइक्रोस्कोपी सुविधा के कर्मियों से परामर्श करें। नमूने के लिए उपयुक्त विसर्जन तेल का चयन करने के लिए एक विसर्जन तेल कैलकुलेटर का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. एक बार जब नमूने तैयार हो जाते हैं, तो सुनिश्चित करें कि कवरलिप्स किसी भी अवशेष या अतिरिक्त बढ़ते मीडिया से साफ और स्पष्ट हैं। यदि आवश्यक हो, तो साफ करने के लिए पानी या इथेनॉल में डूबी हुई कपास की नोक का उपयोग करें। नमूने को 3 डी सिम-सक्षम माइक्रोस्कोप में रखें ( सामग्री की तालिका देखें) और छवि के लिए एक सेल ढूंढें।
  3. प्रासंगिक लेजर लाइनों की शक्ति और जोखिम समय को समायोजित करने के लिए काफी नमूना bleaching के बिना संकेत-से-शोर अनुपात को अधिकतम करने के लिए.
    नोट: एक अच्छा संकेत-से-शोर अनुपात नमूने पर केंद्रित एक स्पष्ट ग्रिड जैसी उपस्थिति दिखाएगा और सटीक उच्च-रिज़ॉल्यूशन पुनर्निर्माण का नेतृत्व करेगा। 488 एनएम और 640 एनएम लेजर लाइनों का उपयोग क्रमशः एफ-एक्टिन और एंकिरिन जी की कल्पना करने के लिए किया गया था।
  4. z-आयाम में नमूने की ऊपरी और निचली सीमासेट करें और एक स्टैक प्राप्त करने के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: 125 एनएम के z-चरण आकार का उपयोग यहां किया गया था।
  5. सफल सिम पुनर्निर्माण के लिए, सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोपी सॉफ़्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) में उपयोग किए गए रंगों के लिए उपयुक्त ऑप्टिकल ट्रांसफर फ़ाइल (OTF) है।
    नोट: ये आमतौर पर बनाए जाते हैं और विशेष कर्मियों द्वारा बनाए रखा जाता है। एक कार्यात्मक ओटीएफ की अनुपस्थिति में, अनुमान 17 के आधार पर पुनर्निर्माण करने के लिए ओपन-सोर्स टूल भी उपलब्ध हैं। इस काम में, अप-टू-डेट ओटीएफ फ़ाइलों का उपयोग विशेष कर्मियों द्वारा नियंत्रित किया गया था।
  6. एक सुपर-हल पुनर्निर्माण प्राप्त करने के लिए स्टैक पर पुनर्निर्माण एल्गोरिथ्म चलाएँ। ज्ञात कलाकृतियों के लिए पुनर्निर्माण की जांच करें और, यदि आवश्यक हो, तो उन्हें सही करने के लिए मापदंडों को समायोजित करें।
    नोट:: डिफ़ॉल्ट एल्गोरिथ्म पैरामीटर आमतौर पर सटीक परिणाम देते हैं। इन कलाकृतियों में से कई में कुछ दोहराए जाने वाले पैटर्न शामिल हैं: एक जेड-प्लेन पर कई दिशाओं के साथ धारीदार रेखाएं, 'घोस्टिंग' (विभिन्न जेड-विमानों में दिखाई देने वाली बार-बार विशेषताएं), या कुछ क्षेत्रों में उभरने वाला एक हेक्सागोनल 'हनीकॉम्ब' पैटर्न। इन कलाकृतियों को अक्सर बेहतर नमूना तैयारी, एक बेहतर सिग्नल-टू-शोर अनुपात, पुनर्निर्माण एल्गोरिथ्म के मापदंडों को समायोजित करने, या चुने गए विसर्जन तेल के अपवर्तक सूचकांक को सुनिश्चित करने के साथ तय किया जा सकता है, बढ़ते माध्यम और नमूने के लिए उपयुक्त है। SIM कलाकृतियों की अधिक विस्तृत चर्चा और कलाकृतियों की उपस्थिति की जांच करने के लिए एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध उपकरण के लिए, बॉल एट अल देखें 18
  7. रिज़ॉल्यूशन में सुधार देखने के लिए सिम पुनर्निर्माण की तुलना एक विस्तृत-फ़ील्ड छवि से करें.
  8. बहु-रंग सिम करते समय, एक संतोषजनक पुनर्निर्माण तैयार होने के बाद विभिन्न चैनलों को सही ढंग से संरेखित करने के लिए संरेखण एल्गोरिथ्म का उपयोग करें।
    नोट:: संरेखण एल्गोरिथ्म माइक्रोस्कोप निर्माता के निर्देश के अनुसार एक माइक्रोस्फीयर मनका तैयारी का उपयोग कर उत्पन्न एक संरेखण संदर्भ फ़ाइल का उपयोग करता है।

3. छवि विश्लेषण

  1. एमपीएस में एक्टिन के छल्ले में एक विशिष्ट आवधिक उपस्थिति होती है। छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करना ( सामग्री की तालिका देखें), सभी फोकल विमानों का उपयोग करके एक अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण छवि बनाएं जहां एक्टिन के छल्ले दिखाई देते हैं।
  2. अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण छवि पर, दृश्यमान आसन्न छल्ले भर में एक लंबवत रेखा खींचें और सॉफ़्टवेयर की रेखा 'प्लॉट प्रोफ़ाइल' फ़ंक्शन के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता रिकॉर्ड करें।
  3. माध्य अंतर-शिखर दूरी की गणना करने के लिए, लाइन प्रोफ़ाइल में स्थानीय मैक्सिमा को नोट करें और व्यक्तिगत आसन्न फ्लोरोसेंट तीव्रता चोटियों के बीच की दूरी को मापें।
    नोट:: यह आसानी से परिकलित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, MATLAB या (खुला स्रोत) GNU Octave प्लेटफ़ॉर्म में 'findpeaks' फ़ंक्शन का उपयोग कर।
  4. एमपीएस में एक्टिन रिंग्स के साथ विभिन्न प्रोटीनों के सह-स्थानीयकरण का मूल्यांकन करने के लिए, एक्टिन और उम्मीदवार प्रोटीन के सिम पुनर्निर्माण पर एक सहस्थानीयकरण विश्लेषण प्रक्रिया 19,20,21 चलाएं। मैन्युअल रूप से सॉफ्टवेयर platform19 में EzColocalization प्लगइन के लिए ब्याज के एक क्षेत्र के रूप में एआईएस को परिभाषित करने के लिए एक चयन आकर्षित और सह स्थानीयकरण 19,20,21 के पियर्सन के सहसंबंध के गुणांक (पीसीसी) की गणना करने के लिए विश्लेषण चलाने के लिए। 1 के करीब एक पीसीसी मान मजबूत colocalization इंगित करता है।
    नोट:: इस प्रोटोकॉल चित्र 1 में सारांशित किया गया है।

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Representative Results

सुसंस्कृत चूहे हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स और 3 डी-सिम का उपयोग करते हुए, एआईएस में एक्टिन रिंग्स और एमपीएस के अन्य घटकों की कल्पना करने और मापने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। छवि स्टैक के पुनर्निर्माण ने एक्टिन के छल्ले की स्पष्ट आवधिकता दिखाई (चित्रा 2 ए)। हमारे हाथों में, एमपीएस में एक्टिन के छल्ले की औसत अंतर-चोटी की दूरी, एलेक्सा 488-टैग किए गए फेलोइडिन का उपयोग करके कल्पना की गई, 190.36 ± 1.7 एनएम (मतलब ± एसईएम) थी। यह एमपीएस में एक्टिन के छल्ले के बीच ~ 190 एनएम की पहले से रिपोर्ट की गई औसत दूरी के अनुरूप है। इसी तरह, एक एंटी-एंकिरिन जी एंटीबॉडी का उपयोग एंकिरिन जी (चित्रा 2 बी) की कल्पना करने के लिए किया गया था। एंकिरिन जी और एफ-एक्टिन के सह-स्थानीयकरण का परीक्षण एआईएस में सह-स्थानीयकरण 19,20,21 के पीसीसी की गणना करने के लिए एक सह-स्थानीयकरण विश्लेषण प्रक्रिया का उपयोग करके किया गया था। एंकिरिन जी और एफ-एक्टिन प्रतिदीप्ति के सह-स्थानीयकरण का पीसीसी 0.36 ± 0.03 था (मतलब ± एसईएम, चित्रा 2 बी)। चूंकि एंकिरिन जी और एक्टिन के छल्ले विभिन्न डोमेन पर πIV-स्पेक्ट्रिन को बांधते हैं, वे महत्वपूर्ण सह-स्थानीयकरण नहीं दिखाते हैं। इन आंकड़ों को Abouelezz et al.16 से अनुकूलित किया गया था

Figure 1
चित्रा 1: 3 डी-सिम इमेजिंग के लिए नमूना तैयारी के लिए प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स को चूहे के भ्रूण से काटा जाता है, अलग किया जाता है, और 14 दिनों के लिए संस्कृति में ग्लास कवरलिप्स पर बढ़ने की अनुमति दी जाती है। कोशिकाओं को तब टैग किए गए फालोइडिन और उचित एंटीबॉडी का उपयोग करके तय और दाग दिया जाता है, फिर 3 डी-सिम इमेजिंग के लिए ग्लास स्लाइड पर घुड़सवार किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: अक्षतंतु प्रारंभिक खंड (एआईएस) में झिल्ली आवधिक कंकाल (एमपीएस) का 3 डी-सिम पुनर्निर्माण। () एफ-एक्टिन (हरा) और एंकिरिन जी (मैजेंटा) एआईएस में एक नियमित वितरण दिखाते हैं, जिसे 3 डी-सिम द्वारा विज़ुअलाइज़ किया गया है। स्केल बार = 1 μm. (B) एआईएस में एमपीएस में एफ-एक्टिन के साथ एंकिरिन जी के सह-स्थानीयकरण के सहसंबंध (पीसीसी) के पियर्सन के गुणांक। एंकिरिन जी का औसत पीसीसी 0.36 (काला चक्र) था। ग्रे हीरे अलग-अलग कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं (एन = 16), मध्य-रेखा माध्यिका का प्रतिनिधित्व करती है, त्रुटि सलाखों 25 वें और 75 वें प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करती है। डेटा Abouelezz et al.16 से अनुकूलित हैकृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीक का उपयोग करके एमपीएस प्रोटीन को विज़ुअलाइज़ करने और मापने के लिए एक विधि प्रदान करता है। चूंकि एक्टिन रिंग्स और अन्य एमपीएस घटक ~ 190 nm9,10 की आवधिकता प्रदर्शित करते हैं, पारंपरिक विवर्तन-सीमित इमेजिंग दृष्टिकोण एमपीएस के विवरण को प्रकट नहीं कर सकते हैं। कई माइक्रोस्कोपी सेटअप सुपर-रिज़ॉल्यूशन में विवर्तन-सीमित संरचनाओं को हल कर सकते हैं, और सिम एक मजबूत और सरल विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है। महत्वपूर्ण रूप से, सिम सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोफोरस के साथ संगत है, जो महत्वपूर्ण लचीलापन प्रदान करता है। इसके अलावा, सिम एमपीएस में संभावित रूप से मंद संरचनाओं को देखने में प्रभावी है, जैसे कि लैट्रुनकुलिन-उपचारित न्यूरॉन्स 22 में एक्टिन रिंग्स, साथ ही साथ लाइव न्यूरॉन्स 15

इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए एक आवश्यक पहलू पहली जगह में एमपीएस की अखंडता को संरक्षित करना है। सफल सिम इमेजिंग के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम नमूना तैयारी के दौरान होते हैं। उदाहरण के लिए, मध्यम निर्धारण (कमरे के तापमान पर 12 मिनट के लिए 4% पीएफए) और मजबूत permeabilization (10 मिनट के लिए 1% Triton-X) सबसे अच्छा परिणाम प्रदान करते हैं। यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि विशिष्ट तैयारियों के लिए आवश्यक कठोर उपचार एमपीएस की संरचनात्मक अखंडता पर नकारात्मक प्रभाव डाल सकते हैं। इसलिए, एमपीएस के संरक्षण को अधिकतम करने के लिए इस तरह के उपचारों को संशोधित करने पर विचार करना शायद सबसे अच्छा है।

इमेजिंग के लिए नमूने तैयार करते समय विचार करने के लिए अन्य महत्वपूर्ण कारक लेबलिंग घनत्व को अधिकतम करना है। आदर्श रूप से, प्रत्येक अणु को टैग किया जाएगा और पता लगाया जाएगा। उदाहरण के लिए, इस प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले एंटी-एंकिरिन जी एंटीबॉडी का उपयोग आमतौर पर एआईएस को लेबल करने के लिए किया जाता है। यह पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में उत्कृष्ट प्रदर्शन प्रदान करता है, यहां तक कि जब 1: 1000 के कमजोर पड़ने पर उपयोग किया जाता है और कमरे के तापमान पर केवल 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया जाता है। हालांकि, सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी के लिए अच्छा लेबलिंग घनत्व प्राप्त करने के लिए, 5-गुना उस एकाग्रता (1: 200) का उपयोग करना और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातभर एंटीबॉडी को इनक्यूबेट करना अत्यधिक प्रभावी है। जबकि प्रत्येक एंटीबॉडी या लेबलिंग तकनीक के लिए विशिष्ट आवश्यकताएं अलग-अलग होंगी और प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित करने की आवश्यकता होगी, यह शायद इसे ध्यान में रखने में सहायक है।

इसके अलावा, यह ध्यान रखना आवश्यक है कि उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्राप्त करना सटीक और सफल सिम पुनर्निर्माण के लिए खुद को अच्छी तरह से उधार देता है। अंगूठे का एक अच्छा नियम यह है कि सिम मोडलिटी लगे होने के बाद ग्रिड पैटर्न को व्यक्तिगत छवियों में दिखाई देना चाहिए। हालांकि, यह हमेशा संभव नहीं होता है।

अंत में, यह ध्यान रखना आवश्यक है कि सिम power14 को हल करने में सबसे कमजोर सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीकों में से एक है। इस प्रकार, जबकि यह आम तौर पर एमपीएस प्रोटीन की आवधिकता और समग्र संगठन को प्रकट करने के लिए पर्याप्त है, यह स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (स्टॉर्म) 10 की तुलना में उनकी बातचीत के बारे में विवरण प्रदान करने में काफी कम सक्षम है। इसके अलावा, यहां वर्णित तकनीक की उपयोगिता प्रोटीन के अध्ययन तक सीमित है जिसके लिए एक विशिष्ट, अच्छी तरह से प्रदर्शन करने वाला एंटीबॉडी उपलब्ध है। हालांकि, यह आंशिक रूप से टैग किए गए प्रोटीन 15 की बहिर्जात अभिव्यक्ति के माध्यम से दरकिनार किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

डॉ Pirta Hotulainen उसकी महत्वपूर्ण टिप्पणियों के लिए स्वीकार किया जाता है, इस पांडुलिपि को तैयार करने के लिए अमूल्य. डॉ Rimante Minkeviciene मूल प्रयोगों के लिए इस्तेमाल न्यूरोनल संस्कृतियों को तैयार करने में उसकी मदद के लिए स्वीकार किया जाता है। सभी इमेजिंग बायोमेडिकम इमेजिंग यूनिट में किया गया था। इस काम को फिनलैंड की अकादमी (डी.M, एसए 266351) और डॉक्टरेट प्रोग्राम ब्रेन एंड माइंड (ए.ए.) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well plates Corning 3524
4% Paraformaldehyde
Alexa-488 Phalloidin ThermoFisher A12379
Alexa-647 anti-mouse ThermoFisher A31571
Anti-Ankyrin G antibody UC Davis/NIH NeuroMab Facility, Clone 106/36 75-146
Anti-MAP2 antibody Merck Millipore AB5543
B-27 Invitrogen 17504044
Bovine Serum Albumin (BSA) BioWest P6154
Deltavision OMX SR GE Healthcare Life Sciences N/A
Fiji software package ImageJ
GNU Octave GNU
High performance coverslips Marienfeld 117530
Immersion Oil Calculator Cytiva Life Sciences https://tinyurl.com/ImmersionOilCalculator
L-Glutamine VWR ICNA1680149
MATLAB R2020a Mathworks
Neurobasal media Invitrogen 21103049
OMX SR Delta Vision OMX
Primocin InvivoGen ant-pm-1
ProLong Gold mounting media Invitrogen P10144
softWoRx Deconvolution Cytiva Life Sciences
Superfrost Slides Epredia ISO 8037/1
TetraSpeck microspheres 0.1 µm ThermoFisher T7279
Triton-X Sigma X100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 180
झिल्ली के गुण मापना 3D-संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (3D-SIM) का उपयोग करके अक्षतंतु प्रारंभिक खंड का आवधिक कंकाल
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Micinski, D., Lahti, L., Abouelezz,More

Micinski, D., Lahti, L., Abouelezz, A. Measuring Properties of the Membrane Periodic Skeleton of the Axon Initial Segment using 3D-Structured Illumination Microscopy (3D-SIM). J. Vis. Exp. (180), e63327, doi:10.3791/63327 (2022).

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