Dieser Artikel stellt eine einfache Methode zur schnellen Herstellung von riesigen unilamellären Vesikeln mit verkapselten zytoskelettalen Proteinen vor. Die Methode erweist sich als nützlich für die Bottom-up-Rekonstitution von Zytoskelettstrukturen in Enstrikt- und Zytoskelett-Membran-Interaktionen.
Riesige unilamellare Vesikel (GUVs) werden häufig als Modelle biologischer Membranen verwendet und sind daher ein großartiges Werkzeug, um membranbezogene zelluläre Prozesse in vitro zu untersuchen. In den letzten Jahren hat sich die Verkapselung in GUVs als hilfreicher Ansatz für Rekonstitutionsexperimente in der Zellbiologie und verwandten Bereichen erwiesen. Es ahmt die Einschlussbedingungen in lebenden Zellen besser nach, im Gegensatz zur herkömmlichen biochemischen Rekonstitution. Methoden zur Verkapselung in GUVs sind oft nicht einfach zu implementieren, und die Erfolgsraten können sich von Labor zu Labor erheblich unterscheiden. Eine Technik, die sich bei der Verkapselung komplexerer Proteinsysteme als erfolgreich erwiesen hat, wird als kontinuierliche Tröpfchengrenzflächenkreuzung (cDICE) bezeichnet. Hier wird eine cDICE-basierte Methode zur schnellen Verkapselung von Zytoskelettproteinen in GUVs mit hoher Verkapselungseffizienz vorgestellt. Bei dieser Methode werden zunächst Lipid-Monolayer-Tröpfchen erzeugt, indem eine Proteinlösung von Interesse in einem Lipid/Öl-Gemisch emulgiert wird. Nach der Zugabe in eine rotierende 3D-gedruckte Kammer passieren diese lipidmonolagigen Tröpfchen dann eine zweite Lipid-Monoschicht an einer Wasser/Öl-Grenzfläche innerhalb der Kammer, um GUVs zu bilden, die das Proteinsystem enthalten. Diese Methode vereinfacht das Gesamtverfahren der Verkapselung in GUVs und beschleunigt den Prozess und ermöglicht es uns somit, die dynamische Entwicklung der Netzwerkmontage in Lipiddoppelschichtvesikeln einzugrenzen und zu beobachten. Diese Plattform ist praktisch, um die Mechanik von Zytoskelett-Membran-Interaktionen im Gefangenenverkehr zu untersuchen.
Lipid-Doppelschichtkompartimente werden als synthetische Modellzellen zur Untersuchung geschlossener organischer Reaktionen und membranbasierter Prozesse oder als Trägermodule in Drug-Delivery-Anwendungenverwendet 1,2. Die Bottom-up-Biologie mit gereinigten Komponenten erfordert minimale experimentelle Systeme, um Eigenschaften und Wechselwirkungen zwischen Biomolekülen wie Proteinen und Lipiden zu untersuchen 3,4. Mit dem Fortschritt des Feldes besteht jedoch ein erhöhter Bedarf an komplexeren experimentellen Systemen, die die Bedingungen in biologischen Zellen besser imitieren. Die Verkapselung in GUVs ist ein praktischer Ansatz, der einige dieser zellähnlichen Eigenschaften bieten kann, indem er eine verformbare und selektiv durchlässige Lipiddoppelschicht und einen begrenzten Reaktionsraum bereitstellt. Insbesondere die In-vitro-Rekonstitution von Zytoskelettsystemen als Modelle synthetischer Zellen kann von der Verkapselung in Membrankompartimentenprofitieren 5. Viele Zytoskelettproteine binden und interagieren mit der Zellmembran. Da die meisten Zytoskelettbaugruppen Strukturen bilden, die sich über die gesamte Zelle erstrecken, wird ihre Form natürlich durch zellgroße Einschließungbestimmt 6.
Verschiedene Methoden werden verwendet, um GUVs zu erzeugen, wie z.B. die Quellung 7,8, die kleine Vesikelfusion9,10, der Emulsionstransfer 11,12, das gepulste Jetting 13 und andere mikrofluidische Ansätze14,15. Obwohl diese Methoden immer noch verwendet werden, hat jede ihre Grenzen. Daher ist ein robuster und unkomplizierter Ansatz mit einer hohen Ausbeute an GUV-Verkapselung sehr wünschenswert. Obwohl Techniken wie spontane Quellung und Elektroschwellung für die Bildung von GUVs weit verbreitet sind, sind diese Methoden in erster Linie mit spezifischen Lipidzusammensetzungen 16, niedrigen Salzkonzentrationspuffern17, kleineren Verkapselungsmolekülgrößen18 kompatibel und erfordern ein hohes Volumen des Verkapselungsmittels. Die Verschmelzung mehrerer kleiner Vesikel zu einem GUV ist von Natur aus energetisch ungünstig und erfordert daher Spezifität in geladenen Lipidzusammensetzungen9 und / oder externen fusionsinduzierenden Mitteln wie Peptiden19 oder anderen Chemikalien. Emulsionstransfer- und mikrofluidische Verfahren hingegen können eine Tröpfchenstabilisierung durch Tensid- und Lösungsmittelentfernung nach Doppelschichtbildungbzw. 18,20 erfordern. Die Komplexität des Versuchsaufbaus und der Vorrichtung in mikrofluidischen Techniken wie dem gepulsten Jetting stellt eine zusätzliche Herausforderungdar 21. cDICE ist eine emulsionsbasierte Methode, die von ähnlichen Prinzipien für den Emulsionstransfer abgeleitet ist22,23. Eine wässrige Lösung (äußere Lösung) und ein Lipid-Öl-Gemisch werden durch Zentrifugalkräfte in einer rotierenden zylindrischen Kammer (cDICE-Kammer) geschichtet, die eine lipidgesättigte Grenzfläche bildet. Das Einschichten von einschichtigen wässrigen Lipidtröpfchen in die rotierende cDICE-Kammer führt zu einem Reißverschluss einer Doppelschicht, wenn Tröpfchen die lipidgesättigte Grenzfläche in die äußere wässrige Lösung22,24 überqueren. Der cDICE-Ansatz ist eine robuste Technik zur GUV-Verkapselung. Mit der vorgestellten modifizierten Methode wird nicht nur die für cDICE typische hohe Vesikelausbeute mit einer deutlich kürzeren Verkapselungszeit (wenige Sekunden) erreicht, sondern auch die GUV-Erzeugungszeit, die die Beobachtung zeitabhängiger Prozesse (z.B. Aktin-Zytoskelett-Netzwerkbildung) ermöglicht, signifikant reduziert. Das Protokoll dauert ca. 15-20 Minuten vom Start bis zur GUV-Sammlung und Bildgebung. Hier wird die GUV-Erzeugung mit der modifizierten cDICE-Methode zur Verkapselung von Aktin- und Aktin-bindenden Proteinen (ABPs) beschrieben. Die vorgestellte Technik ist jedoch anwendbar für die Verkapselung einer Vielzahl von biologischen Reaktionen und Membranwechselwirkungen, von der Montage von Biopolymeren über die zellfreie Proteinexpression bis hin zum auf Membranfusion basierenden Frachttransfer.
Verschiedene Methoden zur Erzeugung von GUVs wurden für die Erzeugung synthetischer Zellen erforscht Die Komplexität der Verfahren, die verlängerte Zeit bis zur Verkapselung, die Einschränkung der Lipidtypen und die molekulare Zusammensetzung des Verkapselungsmittels, der Bedarf an nichtphysiologischen Chemikalien zur Erleichterung der Verkapselung, die geringe GUV-Ausbeute und die Inkonsistenzen bei der Verkapselungseffizienz haben die Forscher auf diesem Gebiet weiterhin herausgefordert. In Anbetracht der breiten P…
The authors have nothing to disclose.
APL würdigt die Unterstützung durch ein Humboldt-Forschungsstipendium für erfahrene Forscher sowie durch die National Science Foundation (1939310 und 1817909) und National Institutes of Health (R01 EB030031).
18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 810150C | |
96 Well Optical Btm Pit PolymerBase | ThermoFisher Scientific | 165305 | |
Actin from rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99-A | |
ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle | Hypermol | 8153-01 | |
Axygen microtubes (200 µL) | Fisher Scientific | 14-222-262 | for handling ABPs |
Black resin | Formlabs | RS-F2-GPBK-04 | |
Cholesterol (powder) | Avanti Polar Lipids | 700100P | |
Choloroform | Sigma Aldrich | 67-66-3 | |
Clear resin | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
CSU-X1 Confocal Scanner Unit | YOKOGAWA | CSU-X1 | |
Density gradient medium (Optiprep) | Sigma-Aldrich | D1556 | |
DOPC lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
Fascin | homemade | N/A | |
F-buffer | homemade | N/A | |
Fisherbrand microtubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
FS02 Sonicator | Fischer Scientific | FS20 | |
G-buffer | homemade | N/A | |
Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
iXon X3 camera | Andor | DU-897E-CS0 | |
Mineral oil | Acros Organics | 8042-47-5 | |
Olympus IX81 Inverted Microscope | Olympus | IX21 | |
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective | Olumpus | 1-U2B933 | |
Silicone oil | Sigma-Aldrich | 317667 |