Summary

Schnelle Verkapselung des rekonstituierten Zytoskeletts in riesigen unilamellären Vesikeln

Published: November 10, 2021
doi:

Summary

Dieser Artikel stellt eine einfache Methode zur schnellen Herstellung von riesigen unilamellären Vesikeln mit verkapselten zytoskelettalen Proteinen vor. Die Methode erweist sich als nützlich für die Bottom-up-Rekonstitution von Zytoskelettstrukturen in Enstrikt- und Zytoskelett-Membran-Interaktionen.

Abstract

Riesige unilamellare Vesikel (GUVs) werden häufig als Modelle biologischer Membranen verwendet und sind daher ein großartiges Werkzeug, um membranbezogene zelluläre Prozesse in vitro zu untersuchen. In den letzten Jahren hat sich die Verkapselung in GUVs als hilfreicher Ansatz für Rekonstitutionsexperimente in der Zellbiologie und verwandten Bereichen erwiesen. Es ahmt die Einschlussbedingungen in lebenden Zellen besser nach, im Gegensatz zur herkömmlichen biochemischen Rekonstitution. Methoden zur Verkapselung in GUVs sind oft nicht einfach zu implementieren, und die Erfolgsraten können sich von Labor zu Labor erheblich unterscheiden. Eine Technik, die sich bei der Verkapselung komplexerer Proteinsysteme als erfolgreich erwiesen hat, wird als kontinuierliche Tröpfchengrenzflächenkreuzung (cDICE) bezeichnet. Hier wird eine cDICE-basierte Methode zur schnellen Verkapselung von Zytoskelettproteinen in GUVs mit hoher Verkapselungseffizienz vorgestellt. Bei dieser Methode werden zunächst Lipid-Monolayer-Tröpfchen erzeugt, indem eine Proteinlösung von Interesse in einem Lipid/Öl-Gemisch emulgiert wird. Nach der Zugabe in eine rotierende 3D-gedruckte Kammer passieren diese lipidmonolagigen Tröpfchen dann eine zweite Lipid-Monoschicht an einer Wasser/Öl-Grenzfläche innerhalb der Kammer, um GUVs zu bilden, die das Proteinsystem enthalten. Diese Methode vereinfacht das Gesamtverfahren der Verkapselung in GUVs und beschleunigt den Prozess und ermöglicht es uns somit, die dynamische Entwicklung der Netzwerkmontage in Lipiddoppelschichtvesikeln einzugrenzen und zu beobachten. Diese Plattform ist praktisch, um die Mechanik von Zytoskelett-Membran-Interaktionen im Gefangenenverkehr zu untersuchen.

Introduction

Lipid-Doppelschichtkompartimente werden als synthetische Modellzellen zur Untersuchung geschlossener organischer Reaktionen und membranbasierter Prozesse oder als Trägermodule in Drug-Delivery-Anwendungenverwendet 1,2. Die Bottom-up-Biologie mit gereinigten Komponenten erfordert minimale experimentelle Systeme, um Eigenschaften und Wechselwirkungen zwischen Biomolekülen wie Proteinen und Lipiden zu untersuchen 3,4. Mit dem Fortschritt des Feldes besteht jedoch ein erhöhter Bedarf an komplexeren experimentellen Systemen, die die Bedingungen in biologischen Zellen besser imitieren. Die Verkapselung in GUVs ist ein praktischer Ansatz, der einige dieser zellähnlichen Eigenschaften bieten kann, indem er eine verformbare und selektiv durchlässige Lipiddoppelschicht und einen begrenzten Reaktionsraum bereitstellt. Insbesondere die In-vitro-Rekonstitution von Zytoskelettsystemen als Modelle synthetischer Zellen kann von der Verkapselung in Membrankompartimentenprofitieren 5. Viele Zytoskelettproteine binden und interagieren mit der Zellmembran. Da die meisten Zytoskelettbaugruppen Strukturen bilden, die sich über die gesamte Zelle erstrecken, wird ihre Form natürlich durch zellgroße Einschließungbestimmt 6.

Verschiedene Methoden werden verwendet, um GUVs zu erzeugen, wie z.B. die Quellung 7,8, die kleine Vesikelfusion9,10, der Emulsionstransfer 11,12, das gepulste Jetting 13 und andere mikrofluidische Ansätze14,15. Obwohl diese Methoden immer noch verwendet werden, hat jede ihre Grenzen. Daher ist ein robuster und unkomplizierter Ansatz mit einer hohen Ausbeute an GUV-Verkapselung sehr wünschenswert. Obwohl Techniken wie spontane Quellung und Elektroschwellung für die Bildung von GUVs weit verbreitet sind, sind diese Methoden in erster Linie mit spezifischen Lipidzusammensetzungen 16, niedrigen Salzkonzentrationspuffern17, kleineren Verkapselungsmolekülgrößen18 kompatibel und erfordern ein hohes Volumen des Verkapselungsmittels. Die Verschmelzung mehrerer kleiner Vesikel zu einem GUV ist von Natur aus energetisch ungünstig und erfordert daher Spezifität in geladenen Lipidzusammensetzungen9 und / oder externen fusionsinduzierenden Mitteln wie Peptiden19 oder anderen Chemikalien. Emulsionstransfer- und mikrofluidische Verfahren hingegen können eine Tröpfchenstabilisierung durch Tensid- und Lösungsmittelentfernung nach Doppelschichtbildungbzw. 18,20 erfordern. Die Komplexität des Versuchsaufbaus und der Vorrichtung in mikrofluidischen Techniken wie dem gepulsten Jetting stellt eine zusätzliche Herausforderungdar 21. cDICE ist eine emulsionsbasierte Methode, die von ähnlichen Prinzipien für den Emulsionstransfer abgeleitet ist22,23. Eine wässrige Lösung (äußere Lösung) und ein Lipid-Öl-Gemisch werden durch Zentrifugalkräfte in einer rotierenden zylindrischen Kammer (cDICE-Kammer) geschichtet, die eine lipidgesättigte Grenzfläche bildet. Das Einschichten von einschichtigen wässrigen Lipidtröpfchen in die rotierende cDICE-Kammer führt zu einem Reißverschluss einer Doppelschicht, wenn Tröpfchen die lipidgesättigte Grenzfläche in die äußere wässrige Lösung22,24 überqueren. Der cDICE-Ansatz ist eine robuste Technik zur GUV-Verkapselung. Mit der vorgestellten modifizierten Methode wird nicht nur die für cDICE typische hohe Vesikelausbeute mit einer deutlich kürzeren Verkapselungszeit (wenige Sekunden) erreicht, sondern auch die GUV-Erzeugungszeit, die die Beobachtung zeitabhängiger Prozesse (z.B. Aktin-Zytoskelett-Netzwerkbildung) ermöglicht, signifikant reduziert. Das Protokoll dauert ca. 15-20 Minuten vom Start bis zur GUV-Sammlung und Bildgebung. Hier wird die GUV-Erzeugung mit der modifizierten cDICE-Methode zur Verkapselung von Aktin- und Aktin-bindenden Proteinen (ABPs) beschrieben. Die vorgestellte Technik ist jedoch anwendbar für die Verkapselung einer Vielzahl von biologischen Reaktionen und Membranwechselwirkungen, von der Montage von Biopolymeren über die zellfreie Proteinexpression bis hin zum auf Membranfusion basierenden Frachttransfer.

Protocol

1. Herstellung eines Öl-Lipid-Gemisches HINWEIS: Der Schritt muss in einem Abzug unter Einhaltung aller Sicherheitsrichtlinien für den Umgang mit Chloroform durchgeführt werden. Nehmen Sie 0,5 ml Chloroform in eine 15 ml Durchstechflasche aus Glas. 88 μL 25 mg/ml Dioleoyl-Phosphocholin (DOPC), 9,3 μL 50 mg/ml Cholesterin und 5 μL 1 mg/ml Dioleoyl-phosphoethanolamin-Lissamin-Rhodamin B (Rhodamin PE) (siehe Materialtabelle) in die 15-ml-Durchstec…

Representative Results

Um die erfolgreiche Erzeugung von zytoskelettalen GUVs unter Verwendung des aktuellen Protokolls zu demonstrieren, wurden Fascin-Aktin-Bündelstrukturen in GUVs rekonstituiert. Fascin ist ein kurzer Vernetzer von Aktinfilamenten, der steife parallel ausgerichtete Aktinbündel bildet und als Glutathion-S-Transferase (GST) Fusionsprotein26 aus E. coli gereinigt wird. Zunächst wurden 5 μM Aktin rekonstituiert, darunter 0,53 μM ATTO488-Aktin im Aktinpolymerisationspuffer und 7,5 % des Dich…

Discussion

Verschiedene Methoden zur Erzeugung von GUVs wurden für die Erzeugung synthetischer Zellen erforscht Die Komplexität der Verfahren, die verlängerte Zeit bis zur Verkapselung, die Einschränkung der Lipidtypen und die molekulare Zusammensetzung des Verkapselungsmittels, der Bedarf an nichtphysiologischen Chemikalien zur Erleichterung der Verkapselung, die geringe GUV-Ausbeute und die Inkonsistenzen bei der Verkapselungseffizienz haben die Forscher auf diesem Gebiet weiterhin herausgefordert. In Anbetracht der breiten P…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

APL würdigt die Unterstützung durch ein Humboldt-Forschungsstipendium für erfahrene Forscher sowie durch die National Science Foundation (1939310 und 1817909) und National Institutes of Health (R01 EB030031).

Materials

18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform Avanti Polar Lipids 810150C
96 Well Optical Btm Pit PolymerBase ThermoFisher Scientific 165305
Actin from rabbit skeletal muscle Cytoskeleton AKL99-A
ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle Hypermol 8153-01
Axygen microtubes (200 µL) Fisher Scientific 14-222-262 for handling ABPs
Black resin Formlabs RS-F2-GPBK-04
Cholesterol (powder) Avanti Polar Lipids 700100P
Choloroform Sigma Aldrich 67-66-3
Clear resin Formlabs RS-F2-GPCL-04
CSU-X1 Confocal Scanner Unit YOKOGAWA CSU-X1
Density gradient medium (Optiprep) Sigma-Aldrich D1556
DOPC lipid in chloroform Avanti Polar Lipids 850375C
Fascin homemade N/A
F-buffer homemade N/A
Fisherbrand microtubes (1.5 mL) Fisher Scientific 05-408-129
FS02 Sonicator Fischer Scientific FS20
G-buffer homemade N/A
Glucose Sigma-Aldrich 158968
iXon X3 camera Andor DU-897E-CS0
Mineral oil Acros Organics 8042-47-5
Olympus IX81 Inverted Microscope Olympus IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective Olumpus 1-U2B933
Silicone oil Sigma-Aldrich 317667

References

  1. Groaz, A., et al. Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (3), 1685 (2021).
  2. Diltemiz, S. E., et al. Use of artificial cells as drug carriers. Materials Chemistry Frontiers. 5, 6672-6692 (2021).
  3. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
  4. Ganzinger, K. A., Schwille, P. More from less – bottom-up reconstitution of cell biology. Journal of Cell Science. 132 (4), 227488 (2019).
  5. Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: Towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
  6. Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol reviews. 94 (1), 235-263 (2014).
  7. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
  8. Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68 (1), 98-105 (2009).
  9. Bailey, A. L., Cullis, P. R. Membrane fusion with cationic liposomes: Effects of target membrane lipid composition. Biochemistry. 36 (7), 1628-1634 (1997).
  10. Haluska, C. K., Riske, K. A., Marchi-Artzner, V., Lehn, J. M., Lipowsky, R., Dimova, R. Time scales of membrane fusion revealed by direct imaging of vesicle fusion with high temporal resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (43), 15841-15846 (2006).
  11. Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. Journal of Colloid and Interface Science. 376 (1), 119-125 (2012).
  12. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  13. Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Liu, A. P., Parekh, S. H., Fletcher, D. A. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  14. Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 51-77 (2020).
  15. Ho, K. K. Y., Murray, V. L., Liu, A. P. Engineering artificial cells by combining HeLa-based cell-free expression and ultrathin double emulsion template. Methods in Cell Biology. , 303-318 (2015).
  16. Akashi, K., Miyata, H., Itoh, H., Kinosita, K. Preparation of giant liposomes in physiological conditions and their characterization under an optical microscope. Biophysical Journal. 71 (6), 3242-3250 (1996).
  17. Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation: From lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).
  18. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  19. Pécheur, E. I., Martin, I., Ruysschaert, J. M., Bienvenüe, A., Hoekstra, D. Membrane fusion induced by 11-mer anionic and cationic peptides: A structure− function study. Biochemistry. 37 (8), 2361-2371 (1998).
  20. Morigaki, K., Walde, P. Giant vesicle formation from oleic acid/sodium oleate on glass surfaces induced by adsorbed hydrocarbon molecules. Langmuir. 18 (26), 10509-10511 (2002).
  21. Majumder, S., Wubshet, N., Liu, A. P. Encapsulation of complex solutions using droplet microfluidics towards the synthesis of artificial cells. Journal of Micromechanics and Microengineering. 29 (8), 83001 (2019).
  22. Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
  23. Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1690-1702 (2021).
  24. Claudet, C., In, M., Massiera, G. Method to disperse lipids as aggregates in oil for bilayers production. The European Physical Journal E. 39 (1), 1-6 (2016).
  25. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N. H., Liu, A. P. Confinement Geometry tunes fascin-actin bundle structures and consequently the shape of a lipid bilayer vesicle. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 610277 (2020).
  26. Bashirzadeh, Y., et al. Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture. Communications Biology. 4, 1136 (2021).
  27. Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. bioRxiv. , (2021).
  28. Litschel, T., et al. Reconstitution of contractile actomyosin rings in vesicles. Nature Communications. 12 (1), 1-10 (2021).
  29. Vitale, S. A., Katz, J. L. Liquid droplet dispersions formed by homogeneous liquid− liquid nucleation:"The Ouzo effect.&#34. Langmuir. 19 (10), 4105-4110 (2003).
  30. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Engineering asymmetric vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (19), 10718-10721 (2003).
  31. Deshpande, S., Dekker, C. On-chip microfluidic production of cell-sized liposomes. Nature Protocols. 13 (5), 856-874 (2018).
  32. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E. C., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
  33. Wubshet, N. H., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Fascin-induced actin protrusions are suppressed by dendritic networks in GUVs. Molecular Biology of the Cell. 32 (18), 1634-1640 (2021).

Play Video

Cite This Article
Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid Encapsulation of Reconstituted Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (177), e63332, doi:10.3791/63332 (2021).

View Video