Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Extractie en zuivering van FAHD1-eiwit uit varkensnier en muizenlever

Published: February 18, 2022 doi: 10.3791/63333
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Research Institute for Biomedical Aging Research, University of Innsbruck

Summary

Dit protocol beschrijft hoe fumarylacetoacetaat hydrolase domeinbevattend eiwit 1 (FAHD1) uit varkensnier en muizenlever kan worden geëxtraheerd. De vermelde methoden kunnen worden aangepast aan andere eiwitten van belang en worden gewijzigd voor andere weefsels.

Abstract

Fumarylacetoacetaat hydrolase domeinbevattend eiwit 1 (FAHD1) is het eerste geïdentificeerde lid van de FAH-superfamilie in eukaryoten, handelend als oxaalacetaatdecarboxylase in mitochondriën. Dit artikel presenteert een reeks methoden voor de extractie en zuivering van FAHD1 uit varkensnier en muizenlever. Behandelde methoden zijn ionische uitwisselingschromatografie met snelle eiwitvloeistofchromatografie (FPLC), preparatieve en analytische gelfiltratie met FPLC en proteomische benaderingen. Na totale eiwitextractie werden ammoniumsulfaatprecipitatie en ionische uitwisselingschromatografie onderzocht en FAHD1 werd geëxtraheerd via een sequentiële strategie met behulp van ionische uitwisseling en grootte-uitsluitingschromatografie. Deze representatieve benadering kan worden aangepast aan andere eiwitten van belang (uitgedrukt in significante niveaus) en worden gewijzigd voor andere weefsels. Gezuiverd eiwit uit weefsel kan de ontwikkeling van hoogwaardige antilichamen en / of krachtige en specifieke farmacologische remmers ondersteunen.

Introduction

Het eukaryote FAH-domeinbevattende eiwit 1 (FAHD1) werkt als bifunctioneel oxaalacetaat (OAA) decarboxylase (ODx)1 en acylpyruvaathydrolase (ApH)2. Het is gelokaliseerd in mitochondriën2 en behoort tot de brede FAH-superfamilie van enzymen 1,2,3,4,5,6. Hoewel de ApH-activiteit slechts van ondergeschikt belang is, is de ODx-activiteit van FAHD1 betrokken bij de regulatie van de TCA-cyclusflux 1,7,8,9. OAA is niet alleen nodig voor de centrale citraatsynthasereactie in de tricarbonzuurcyclus, maar fungeert ook als een competitieve remmer van succinaatdehydrogenase als onderdeel van het elektronentransportsysteem en als een kataplerotische metaboliet. Downregulatie van FAHD1-genexpressie in menselijke navelstrengas endotheelcellen (HUVEC) resulteerde in een significante vermindering van de snelheid van celproliferatie10 en significante remming van mitochondriaal membraanpotentiaal, geassocieerd met een gelijktijdige omschakeling naar glycolyse. Het werkmodel verwijst naar mitochondriale disfunctie geassocieerde senescentie (MiDAS)11-achtige fenotype8, waarbij mitochondriale OAA-niveaus strak worden gereguleerd door FAHD1-activiteit 1,8,9.

Recombinant eiwit is gemakkelijker te verkrijgen via expressie en zuivering van bacteriën12 in plaats van uit weefsel. Een eiwit dat tot expressie komt in bacteriën kan echter bevooroordeeld zijn door mogelijk gebrek aan posttranslationele modificaties, of kan eenvoudigweg problematisch zijn (d.w.z. als gevolg van plasmideverlies, bacteriële stressreacties, vervormde / ongevormde disulfidebindingen, geen of slechte secretie, eiwitaggregatie, proteolytische splitsing, enz.). Voor bepaalde toepassingen moet eiwit worden verkregen uit cellysaat of weefsel, om dergelijke modificaties op te nemen en/of mogelijke artefacten uit te sluiten. Gezuiverd eiwit uit weefsel ondersteunt de ontwikkeling van hoogwaardige antilichamen en/of krachtige en specifieke farmacologische remmers voor geselecteerde enzymen, zoals voor FAHD113.

Dit manuscript presenteert een reeks methoden voor de extractie en zuivering van FAHD1 uit varkensnieren en muizenlever. De beschreven methoden vereisen snelle eiwitvloeistofchromatografie (FPLC), maar maken verder gebruik van gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur. Alternatieve methoden zijn elders te vinden 14,15,16,17. Na totale eiwitextractie omvat het voorgestelde protocol een testfase, waarin subprotocollen voor ammoniumsulfaatprecipitatie en ionische uitwisselingschromatografie worden besproken (figuur 1). Na het definiëren van deze subprotocollen wordt het eiwit van belang geëxtraheerd via een sequentiële strategie met behulp van ionische uitwisseling en grootte-uitsluitingschromatografie met FPLC. Op basis van deze richtlijnen kan het uiteindelijke protocol individueel worden aangepast voor andere eiwitten van belang.

Figure 1
Figuur 1: De algemene strategie van dit protocol. Van boven naar beneden: Eiwit wordt gewonnen uit weefsels. Weefselhomogenaat wordt bereid, gecentrifugeerd en gefiltreerd. Voor elk paar supernatant- en pelletmonsters moeten tests voor ammoniumsulfaatprecipitatie en ionische uitwisselingschromatografie (FPLC) worden uitgevoerd om optimale omstandigheden te onderzoeken. Na het vaststellen van deze subprotocollen kan het eiwit worden geëxtraheerd via een sequentiële procedure van ammoniumsulfaatprecipitatie, ionische uitwisselingschromatografie en repetitieve grootte-uitsluitingschromatografie (FPLC) bij verschillende pH- en zoutconcentraties. Alle stappen moeten worden gecontroleerd door western blot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen. Varkensnier werd vers uit de plaatselijke supermarkt gehaald. Leverweefsels werden geoogst van C57BL6 wild-type muizen onderhouden aan het Instituut voor Biomedisch Verouderingsonderzoek aan de Universiteit van Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Oostenrijk onder toezicht van Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr, gedekt door ethische toestemming als projectleider uitgegeven in 2013 (BMWF-66.008/0007-II/3b/2013). Onderhoud en gebruik van de muizen voor het project vallen onder ethische toestemming nr. 2020-0.242.978 vanaf 5 mei 2020, uitgegeven door het Oostenrijkse ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Onderzoek (BMBWF).

1. Voorbereidingen

OPMERKING: Voordat het protocol begint, moeten verschillende dingen worden voorbereid, d.w.z. de eiwitlysisbuffer, het ruwe weefselmonster en een specifiek antilichaam, naast algemene chemicaliën en materialen.

  1. Bereid 250 ml eiwitlysisbuffer per 100 g nettogewicht weefsel: 250 ml 1x PBS met 50 mM NaF, 1 mM PMSF, 2 μg/ml aprotinine en 1 mM geactiveerd orthovanadaat (zie tabel 1). Filtreer de oplossing met behulp van een spuitfiltereenheid van 0,22 μm.
    OPMERKING: Activering van orthovanadaat is vereist voor gebruik om het om te zetten in een krachtigere remmer van eiwit tyrosine fosfatasen18. Geactiveerd orthovanadaat kan worden verkregen bij commerciële leveranciers, maar ook als volgt worden bereid.
    1. Bereid een 200 mM stockoplossing van (natrium)orthovanadaat in ddH2O. Voeg voor de bereiding van 10 ml oplossing 368 mg Na3VO4 tot 9 ml water toe en los op door te roeren. Eenmaal opgelost, vul het volume aan tot 10 ml met ddH2O.
      OPMERKING: De start-pH van de natriumorthopvanaatoplossing kan variëren met de bron van het materiaal en de pH moet als volgt worden aangepast tot 10 in een repetitieve benadering.
    2. Afhankelijk van de initiële pH van de oplossing, stelt u de pH bij tot 10 met NaOH of HCl. Bij pH > 10 heeft de oplossing een gele kleur. Kook de oplossing totdat deze kleurloos wordt, koel af tot kamertemperatuur en controleer de pH. Als de pH >10 is, voegt u een klein volume HCl toe om de pH op 10 aan te passen. Op dit punt kan de oplossing weer geel worden.
    3. Herhaal het koken en afkoelen totdat de oplossing kleurloos blijft en de pH stabiliseert op 10 (ongeveer 5-7 keer). Op dit punt resulteert het toevoegen van HCl in een zwakke verschijning van gele kleur in de oplossing. Bewaar geactiveerd orthovanadaat in aliquots van 1 ml bij -20 °C.
  2. Bereid buisjes voor met 2 ml lysisbuffer per gram weefsel en leg ze op ijs.
    OPMERKING: Dit protocol gebruikte acht buizen van 50 ml, elk gevuld met 30 ml lysisbuffer in totaal voor één varkensnier (ongeveer 100-150 g), en twee buizen elk gevuld met 40 ml lysisbuffer voor 20 muizenlevers (elk 1-2 g) in totaal.
  3. Bereid het weefsel voor: ontleed het weefsel op een voorgezuiverde glasplaat op ijs in een doos met polystyreenschuim. Snijd weefselstukken van ongeveer 100 mg elk om gemakkelijk in de respectieve buizen te worden overgebracht voor daaropvolgende lysis. Breng de weefselstukken over in de voorbereide buizen (stap 1.2).
  4. Bereid een verzadigde ammoniumsulfaatoplossing: verwarm 500 ml ddH2O tot 70 °C en voeg onder het roeren geleidelijk ammoniumsulfaatpoeder (zie materiaaltabel) toe totdat er geen ammoniumsulfaat meer is opgelost. Koel deze (over)verzadigde oplossing af tot kamertemperatuur en bewaar deze een nacht bij 4 °C.

2. Totale eiwitextractie

OPMERKING Na het bereiden van het monster in koude eiwitlysisbuffer (zie stap 1.3), homogeniseert u het weefsel zo goed mogelijk via ultrasoonapparaat door een ultrasone sonde of met behulp van een elektrische homogenisator als volgt.

  1. Homogenisatie van weefsels
    1. In het geval van een varkensnier, soniceer de suspensie bij voorkeur door een ultrasone sonde terwijl het monster op ijs blijft (10 cycli van 15 s puls, met intervallen van 30 s tussen de pulsen om het monster op ijs af te koelen, bij gemiddelde amplitude met 50% duty cycle).
    2. In het geval van muisorganen homogeniseert u de suspensie met behulp van een elektrische homogenisator (beginnend met een lage kracht en langzaam versnellend tot gemiddelde kracht) terwijl het monster op ijs blijft. Was de elektrische homogenisator regelmatig in PBS om organisch materiaal te verwijderen dat het apparaat verstopt.
    3. Neem 20 μL uit de monsters en controleer onder de microscoop of de cellen van het gehomogeniseerde weefsel goed zijn vernietigd; herhaal anders de homogenisatie.
  2. Centrifugeer de buizen in een tafelcentrifuge bij 10.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
    OPMERKING: Centrifugeer het supernatant optioneel een tweede keer bij 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C om kleine fracties van de oorspronkelijke pellet die mogelijk zijn overgebracht, te elimineren. Dit zal de daaropvolgende filtratie in stap 2.3 vereenvoudigen.
  3. Verzamel het supernatant in een verse tube en leg het op ijs. Filter het supernatant sequentieel met behulp van 0,45 μm en 0,22 μm spuitfiltereenheden. Verdeel het supernatant in batches van 10 ml en vries ze in bij -20 °C voor opslag op korte termijn of bij -80 °C voor langere opslag.
    OPMERKING: Voorfiltering met 0,45 μm verwijdert de meerderheid van de deeltjes voordat een tweede filterstap met 0,22 μm de fijnere deeltjes verwijdert. Het direct gebruik van het filter van 0,22 μm kan het risico van verstopping van de filters veroorzaken.
  4. Bereid een monster van 50 μL voor SDS-PAGE/western blot-analyse door 10 μL 5x SDS-monsterbuffer (zie tabel 1) toe te voegen aan 40 μL van het supernatant en vervolgens gedurende 10 minuten te koken bij 95 °C.
    1. Resuspendatie optioneel ongeveer 100 μL pellet verkregen in stap 2.2 in 900 μL ddH2O, en bereid een monster voor SDS-PAGE/western blot-analyse zoals hierboven beschreven.
      OPMERKING: Opname van van pellets afgeleide monsters in de western blot-analyse, naast de positieve controle, zal aangeven of de expressie van het eiwit laag is of dat het antilichaam problematisch is.

3. SDS-PAGE en western blot analyse

OPMERKING: Western blot-analyse is vereist om te controleren op de oplosbaarheid van eiwitten. Hieronder wordt een protocol beschreven voor elektroblottering, met behulp van een nat/tank-blotsysteem (zie materiaaltabel). Een alternatief protocol voor SDS-PAGE is elders te vinden19.

  1. Bereid een discontinue 12,5% polyacrylamide SDS-PAGE gel volgens de instructies van de fabrikant (d.w.z. een stapelgel bovenop een oplossende gel; zie tabel 1). Voer de monsters uit die eerder zijn voorbereid tijdens stap 2 (vergelijkbaar met stap 4, 5 en 6; zie hieronder).
    1. Plaats een eiwitmarkerladder in de eerste put (zie Tabel met materialen). Belasting 5 ng hFAHD1 recombinant eiwit (verkregen uit bacteriën12; zie tabel 1) als positieve controle in de tweede put.
    2. Laad vervolgens 20 μL van het te analyseren monster en vul alle resterende putten met 20 μL bereide SDS-PAGE 1x monsterbuffer (d.w.z. 5x monsterbuffer verdund met ddH2O). Voer de SDS-PAGE-gels uit op 125 V met behulp van de SDS-buffer (zie tabel 1).
  2. Nadat SDS-PAGE is voltooid, voert u een western blot-analyse uit en onderzoekt u de membranen met behulp van het beschikbare antilichaam tegen FAHD1 (zie tabel 1).
    OPMERKING: Aangezien de monsters worden genomen van ruw weefselhomogenaat, wordt meestal de kwaliteit van de SDS-PAGE en de western blot-analyse op dit punt aangetast; het is echter belangrijk om te controleren of het te extraheren eiwit oplosbaar is in het supernatant. Het volgende protocol werd getest op varkensnieren en verschillende muizenorganen, waaronder lever, hart, hersenen en nieren.
    1. Bereid de 10x western blot transfer buffer voor (zie tabel 1). Bereid de 1x western blot transfer buffer (zie tabel 1) en laat deze afkoelen tot 4 °C.
    2. Activeer een PVDF-membraan gedurende 2 minuten in methanol. Was het membraan gedurende2min in ddH 2 O. Breng het membraan gedurende 15 minuten in evenwicht in 1x western blot transfer buffer.
    3. Was de SDS-gel met 1x PBS gedurende 10 minuten tijdens het schudden om de SDS-lopende buffer te verwijderen en incubeer de gel vervolgens gedurende 10 minuten in 1x western blot transfer buffer voor evenwicht. Monteer de elektroblottingcassette (d.w.z. combineer het geactiveerde PVDF-membraan en de gels) volgens de instructies van de fabrikant.
    4. Laat de vlek via elektroblotting bij 300 mA gedurende 1 uur in een met ijs gevulde piepschuimdoos of in de koude ruimte (4 °C) lopen. Breng het PVDF-membraan over in een buis van 50 ml met de blootgestelde kant naar de binnenkant van de buis. Incubeer het membraan in 20 ml western blot-blokkerende buffer (zie tabel 1) gedurende de nacht bij 4 °C tijdens het rollen op een buisrol (zie Materiaaltabel).
    5. Was het membraan de volgende dag gedurende 5 minuten met 20 ml western blot wasbuffer (PBS met 0,1% (v/v) Tween 20) in dezelfde buis tijdens het rollen. Incubeer het membraan in dezelfde buis met het primaire antilichaam2 (gericht op FAHD1; zie tabel 1) verdund 1:500 in western blot blokkerende buffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur tijdens het rollen.
    6. Was het membraan in dezelfde buis drie keer gedurende 10 minuten elk met 20 ml western blot wasbuffer tijdens het rollen. Incubeer het membraan gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met HRP-geconjugeerd secundair antilichaam (zie Tabel met materialen) verdund 1:3000 in 5 ml western blot blokkerende buffer.
    7. Was het membraan in dezelfde buis drie keer gedurende 10 minuten elk met 20 ml western blot wasbuffer en twee keer gedurende 5 minuten elk met 1x PBS. Droog het membraan door het voorzichtig met een pincet aan één rand vast te houden en door een stuk cellulose of een stuk Whatman-papier met de tegenovergestelde (onder)rand van het membraan aan te raken. Leg het membraan (blootgestelde zijde naar boven) op een gereinigde glasplaat.
    8. Bedek het hele membraan zorgvuldig met 1 ml bereid ECL western blot-substraat met behulp van een pipet, waarbij u ervoor zorgt dat er geen luchtbellen ontstaan. Laat de ECL-oplossing gedurende 3 minuten incuberen en ontwikkel het membraan onmiddellijk met behulp van röntgenfilm of met behulp van een beeldvormingssysteem.
      OPMERKING: Als het eiwit in geen van de monsters maar alleen in de positieve controle is gedetecteerd, kan dit erop wijzen dat het eiwit onoplosbaar is of niet in voldoende hoeveelheden aanwezig is om door het antilichaam te worden gedetecteerd. Als alleen nanogrammen van de positieve controle werden geladen, is het eerste scenario waarschijnlijker. Als er helemaal geen eiwit is gedetecteerd, controleer dan de kwaliteit van het antilichaam en schakel misschien over op een polyklonaal antilichaam in plaats van een monoklonaal antilichaam. In zeldzame gevallen, d.w.z. voor sommige hydrofobe eiwitten, kan het eiwit detecteerbaar zijn na centrifugeren, maar niet na filtratie. In een dergelijk geval wordt aanbevolen om speciale filtereenheden voor hydrofobe eiwitten te gebruiken.
  3. Optioneel kleurt u de PVDF-membranen na western blot om de succesvolle overdracht van het eiwit van de SDS-PAGE-gel naar het PVDF-membraan te regelen.
    OPMERKING: Coomassie-kleuring wordt aanbevolen voor probleemoplossing, methodeontwikkeling en documentatie, maar houd er rekening mee dat na het toepassen van dit protocol membranen verloren gaan bij verdere western blot-analyse. Ponceau S-kleuring geeft zwakkere kleuring, maar kan worden gebruikt als de membranen opnieuw moeten worden onderzocht.
    1. Bereid kleine bakjes met de kleuring (Coomassie of Ponceau S) en ontkleuringsoplossingen.
    2. Gebruik een pincet, plaats het membraan in de kleuringsoplossing en schud voorzichtig totdat het membraan goed gekleurd is (5-10 min).
    3. Breng het membraan over in de vasthoudende oplossing en schud totdat de oplossing verzadigd is (5-10 min). Herhaal de destainingstap totdat de eiwitbanden op het membraan kunnen worden waargenomen; als er helemaal geen banden worden waargenomen, herhaalt u de kleuring met een langere incubatietijd. Droog het membraan door het met een pincet op een glasplaat te plaatsen.

4. Testen: Ammoniumsulfaat precipitatie

OPMERKING: Ammoniumsulfaatprecipitatie is een methode voor eiwitzuivering door de oplosbaarheid van het eiwit te veranderen. In een voorlopig experiment wordt de ammoniumsulfaatconcentratie sequentieel verhoogd tot een waarde die een maximale hoeveelheid eiwitverontreinigingen neerslaat, terwijl FAHD1 in oplossing blijft. De oplosbaarheid van het eiwit wordt opnieuw onderzocht via western blot-analyse.

  1. Ga verder met stap 2.3: ontdooi een aliquot van het monster of ga direct na eiwitextractie verder (d.w.z. zonder het monster in te vriezen). Filtreer het monster met een filtereenheid van 0,22 μm om mogelijke neerslag na het ontdooien uit te sluiten. Bereid zes buizen van 1,5 ml op ijs en breng 250 μL monster over in elke buis.
  2. Bereid een verdunningsreeks van 5%, 10%, 15%, 20%, 25% en 30% ammoniumsulfaat in de hierboven bereide buizen en maak het uiteindelijke volume aan tot 1000 μL met eiwitlysisbuffer. Incubeer de monsters bij 4 °C 's nachts op een buisrotator (zie Materiaaltabel).
  3. Centrifugeer met behulp van een tafelcentrifuge bij 10.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C en breng alle supernatanten voorzichtig over in afzonderlijke buizen. Droog de resulterende pellets aan de lucht en resuspend ze elk in 1000 μL ddH2O.
  4. Meng voor elk paar geresuspendeerde pellets en supernatant uit de vorige stap 40 μL met 10 μL 5x SDS-monsterbuffer en kook bij 95 °C met open deksels totdat het grootste deel van de vloeistof is verdampt. Breng de pellet vervolgens opnieuw op in een mengsel van 50% DMSO in ddH2O.
  5. Voer SDS-PAGE uit (stap 3) maar laat de gels 3 uur op 80 V draaien. Laad voor elke concentratie ammoniumsulfaat de monsters van de geresuspendeerde pellet en het supernatant (stap 4.3) in paren. Voer een western blot-analyse uit (stap 3).
  6. Controleer op de hoogste concentratie ammoniumsulfaat, waarbij het te zuiveren eiwit (d.w.z. FAHD1) achterblijft in het monster dat is afgeleid van het supernatant. Definieer op basis van de resultaten een ammoniumsulfaatprecipitatieprotocol voor het eiwit van belang, dat in toekomstige experimenten kan worden gebruikt.
    OPMERKING: Van ammoniumsulfaat is bekend dat het SDS-PAGE en western blot vervormt. Naarmate de concentratie ammoniumsulfaat toeneemt, zal de kwaliteit van de western blot-analyse in het gedrang komen. Net als bij stap 3 eerder wordt deze analyse echter gebruikt om te controleren op de oplosbaarheid van het eiwit van belang bij bepaalde concentraties ammoniumsulfaat. Dit protocol heeft tot doel andere eiwitten neer te slaan, terwijl het te zuiveren eiwit oplosbaar moet blijven.

5. Testen: ionische uitwisseling chromatografie met FPLC

OPMERKING: Moleculen met geladen functionele groepen zijn gebonden aan een silicadeeltjeskolom voor FPLC, waardoor de differentiatie van eiwitten mogelijk is op basis van hun oppervlaktelading. Voer deze stap twee keer uit met behulp van de kationische uitwisselingskolom en de anionische uitwisselingskolom (zie Tabel met materialen). De protocolstappen zijn hetzelfde voor kationische of anionische uitwisselingschromatografie, maar de te gebruiken buffers zijn verschillend (zie tabel 1); beide met "laag zout" 15 mM NaCl en "hoog zout" 1 M NaCl condities. Voor de gebruikte kolommen wordt een debiet van 1 ml/min aanbevolen.

  1. Stel het FPLC-systeem in met de anionische of kationische uitwisselingskolom. Was de kolom met 5 kolomvolumes (cv's) van 20% EtOH (in H2O), gevolgd door 5 cv's van ddH2O. Was de kolom afwisselend met 1 CV met een lage zoutbuffer, een hoge zoutbuffer en opnieuw een lage zoutbuffer in de volgorde totdat er geen pieken meer worden waargenomen in het chromatogram, maar was minstens één keer.
  2. Na het bepalen van het optimale protocol voor ammoniumsulfaatprecipitatie op kleine schaal (stap 4), past u het precipitatieprotocol toe op 10 ml oorspronkelijk weefselhomogenaat (stap 2). Optioneel dialyseer het monster tegen de lage zoutbuffer.
    1. Breng het monster aan op de kolom (bijvoorbeeld door injectie of met behulp van een monsterpomp) en vang de doorstroming op. Was de kolom met 1 CV van de lage zoutbuffer.
  3. Stel een lineaire gradiënte-elutie in van 100% lage zoutbuffer / 0% hoge zoutbuffer naar 0% lage zoutbuffer / 100% hoge zoutbuffer binnen 3 cv's. Verzamel continu 1 ml fracties. Nadat de gradiënt is voltooid, blijft u met de hoge zoutbuffer lopen totdat er geen eiwitgerelateerde pieken (UV-absorptie bij 280/255 nm) meer worden gedetecteerd in het chromatogram over het bereik van 1 CV.
  4. Breng 1 ml 25% SDS opgelost in 0,5 M NaOH (in ddH2O) aan om de kolom schoon te maken. Was achtereenvolgens de kolom met 3 cv's van ddH2O en 3 cv's van 20% EtOH (in ddH2O).
  5. Verzamel SDS-PAGE-monsters van alle piekfracties en de doorstroming en onderzoek ze via western blot op de aanwezigheid van het eiwit van belang (stap 3). Vries de verzamelde fracties in vloeibare stikstof in en bewaar ze bij -80 °C.
  6. Nadat de western blot-analyse is voltooid, ontdooit en poolt u de fracties die het eiwit van belang bevatten en gooit u de andere weg. Herhaal stap 5.1-5.5 met de alternatieve kolom (d.w.z. kationische of anionische uitwisselingskolom).
  7. Nadat beide kolommen zijn onderzocht, definieert u een FPLC-protocol voor het eiwit van belang, dat in toekomstige experimenten kan worden gebruikt. Verminder het volume van de eiwitoplossing met behulp van ultracentrifugatiefiltereenheden (10 kDa, zie Tabel met materialen) tot 2 ml.
    OPMERKING: Er zijn twee verwachte uitkomsten van deze reeks experimenten. Of het eiwit van belang heeft zich aan een van de kolommen gehecht en de eiwitoplossing is al vrij zuiver na elutie, of het eiwit bleef in beide gevallen in de doorstroom. In het laatste scenario, hoewel het eiwit zich in de doorstroom bevindt, kan het reinigende effect van deze stap nog steeds aanzienlijk zijn. In een dergelijk geval, zoals voor FAHD1 in varkensnieren en muizenlever, zal deze stap van ionische uitwisseling nog steeds worden uitgevoerd. Als noch de kationische noch de anionische uitwisselingskolom een goed reinigend effect kan hebben, kan men proberen de pH van het lysaat en de buffer te wijzigen en het monster tegen de lopende buffer te dialyseren voordat het op FPLC wordt aangebracht.

6. Eiwitextractie met behulp van gedefinieerde subprotocollen voor ammoniumsulfaatprecipitatie en FPLC

OPMERKING: Poreuze deeltjes in een silicagelkolom voor FPLC (zie tabel met materialen) maken de differentiatie van eiwitten mogelijk op basis van hun hydrodynamische straal. De beschreven stappen moeten worden uitgevoerd met een FPLC-systeem, met behulp van maatuitsluitingschromatografie (SEC). Voor de gebruikte SEC-kolom (zie Tabel met materialen) wordt een debiet van 0,3 ml/min aanbevolen.

  1. Bereid alle benodigde materialen voor (zie stap 1) en extraheer het totale eiwit uit het weefsel (zie stap 2). Voer een ammoniumsulfaatprecipitatie uit met al het weefselhomogenaat dat niet voor de test is gebruikt (zie stap 4). Voor grotere volumes concentreert u het lysaat met behulp van ultracentrifugatiefiltereenheden (10 kDa; zie Tabel met materialen) tot een kleiner volume van 50 ml of minder.
  2. Voer een eerste zuiveringsstap uit met behulp van ionische uitwisselingschromatografie (zie stap 5).
    1. Bereid monsters voor western blot, zoals beschreven in de vorige stappen. Voer western blot-analyse uit en bundel alle FAHD1-bevattende fracties van ionische uitwisselingschromatografie.
    2. Reduceer het volume van de eiwitoplossing tot 2 ml met behulp van ultracentrifugatiefiltereenheden (10 kDa). Filter de oplossing sequentieel met 0,45 μm en 0,22 μm spuitfiltereenheden om eventuele microprecipitatie te verwijderen.
  3. Breng de SEC-kolom in evenwicht met 1 CV van de SEC-lopende buffer (zie tabel 1), die 1 mM DTT bevat. Laad het monster op de kolom en voer de chromatografie uit totdat alle eiwitten zijn geëlueerd (1-2 CV).
    1. Verzamel fracties van 1 ml van de doorstroom die overeenkomen met significante pieken in het chromatogram (UV-absorptie bij 280/255 nm) en bereid 50 μL monsters van elke verzamelde fractie voor SDS-PAGE en western blot-analyse, zoals beschreven in de vorige stappen. Vries alle fracties in met vloeibare stikstof en bewaar ze bij -80 °C.
  4. Was achtereenvolgens de SEC-kolom met 1 CV van ddH2O en 1 CV van 20% EtOH (in ddH2O). Voer western-Blot-analyse uit en bundel alle FAHD1-bevattende fracties. Reduceer het volume van de eiwitoplossing tot 2 ml met behulp van ultracentrifugatiefiltereenheden (10 kDa, zie Materiaaltabel).
  5. Beoordeel de eiwitconcentratie met behulp van een commerciële BCA-testkit (zie Tabel met materialen).
    OPMERKING: De pH en het zoutgehalte van de mobiele fase kunnen het elutieprofiel van bolvormige eiwittenbeïnvloeden 20. Zure of basische omstandigheden kunnen ertoe leiden dat pieken minder gedefinieerd zijn en dat de eiwit-matrixinteracties toenemen, wat leidt tot gedeeltelijke retentie van eiwit op de kolom20. Dit effect kan worden benut voor verdere eiwitzuivering. Een herhaling van stap 6 met verschillende stroomsnelheden, pH en zoutconcentraties kan de zuiverheid van het eiwitverbeteren 20.

7. Zilverkleuring

OPMERKING: Zilverkleuringsanalyse van SDS-PAGE-gels is vereist om te controleren op eiwitverontreinigingen die mogelijk niet worden gezien met Coomassie-kleuring. Het volgende protocol is een van de vele versies die te vinden zijn in de literatuur21. Voer alle incubatiestappen uit door te schudden in een schone glazen lade. Verzamel alle zilver- en formaldehyde-bevattende vloeistoffen in een speciale afvalcontainer en gooi ze op de juiste manier weg.

  1. Incubeer de SDS-PAGE gels in zilverkleuringsoplossing (zie tabel 1) 's nachts in de koelcel. Incubeer de gels in zilverkleuringsincubatieoplossing (zie tabel 1) gedurende 3 uur bij kamertemperatuur. Voeg eventueel glutaaraldehyde toe (zie tabel 1) om de detectie van zwakke banden te verbeteren. Was de gels vier keer in ddH2O gedurende 10 minuten elk.
  2. Incubeer de gels in zilverkleuring zilveroplossing (zie tabel 1) gedurende 1 uur.
    OPMERKING: Let op dat vanaf nu alle vloeistoffen en de gel zelf zilver en formaldehyde bevatten die giftig zijn.
  3. Incubeer de gels in een oplossing voor het plaatsen van zilverkleuring (zie tabel 1) met krachtig schudden totdat de banden duidelijk zichtbaar zijn. Om de reactie te stoppen, gooit u de ontwikkelaarsoplossing weg en incubeert u de gels onmiddellijk in de zilverkleuringsstopoplossing (zie tabel 1) gedurende minimaal 10 minuten.
    OPMERKING: Banden die in stap 7.2 en 7.3 zijn gekleurd, zullen voortdurend meer ontwikkeld worden. Het toevoegen van meer formaldehyde aan de oplossing dan vermeld kan nodig zijn als de kleuring zwak is.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

FAHD1-eiwit werd geëxtraheerd uit varkensnieren en muizenlever met behulp van het gepresenteerde protocol. Voor muizenweefsel zijn meerdere organen nodig om meerdere μg te verkrijgen na de laatste zuiveringsstap. Om deze reden richt dit artikel zich op de extractie van FAHD1 uit varkensnieren, wat een veel voorbeeldiger experiment is. De extractie van FAHD1 uit de muizenlever wordt uitgevoerd om de moeilijkheden en mogelijke valkuilen van dit protocol te presenteren. Het wordt over het algemeen aanbevolen om organen te gebruiken die een hoog expressieniveau vertonen van het eiwit dat men wil zuiveren. De Human Protein Atlas22 kan helpen om de expressie in het modelsysteem te schatten, of men kan voorlopige western blot-experimenten uitvoeren met verschillende ruwe weefsellysaten om deze niveaus te beoordelen. De positieve controle die in alle western blot-analyses werd gebruikt, was een gelabeld recombinant eiwit, met een iets hoger molecuulgewicht.

Als eerste experiment wordt de extractie van FAHD1 uit de varkensnier gepresenteerd. Het proces van weefselhomogenisatie (stap 1) en totale eiwitextractie (stap 2) wordt weergegeven in aanvullende figuur 1 (zie de legenda voor een beschrijving van de afzonderlijke stappen). Een aliquoted tiende van het totale lysaat werd gebruikt voor de volgende experimenten.

Ammoniumsulfaatprecipitatie is eenmaal getest op dit lysaat, door ammoniumsulfaat in verschillende concentraties aan het lysaat toe te voegen (stap 4) (figuur 2). Na centrifugatie werden pellets en supernatanten bemonsterd en geanalyseerd met western blot met behulp van een gedefinieerd polyklonaal antilichaam2 tegen humaan FAHD1. 200 ng recombinant His/S tagged human FAHD1 verkregen uit E. coli12 werd geladen als de positieve controle. De FAHD1-eiwitband is te zien bij 25 kDa, terwijl de gelabelde positieve controle op 34 kDa draait. Op basis van deze gegevens werd een protocol gedefinieerd waarbij het lysaat wordt behandeld met 25% ammoniumsulfaat, d.w.z. omstandigheden waarbij FAHD1 zich nog steeds in het supernatant bevindt, terwijl de meerderheid van de andere eiwitten wordt neergeslagen. Dit is een belangrijke stap in de zuiveringsstrategie. Ammoniumsulfaatprecipitatie is een effectieve reinigingsstap voordat u doorgaat met andere methoden. Van belang is dat hoeveelheden ammoniumsulfaat hoger dan 30% niet zullen worden gebruikt, omdat ammoniumsulfaat geleidelijk de kwaliteit van SDS-PAGE en western blot verstoort.

Figure 2
Figuur 2: Ammoniumsulfaatprecipitatie en western blotscreening voor varkens FAHD1. (A) Ammoniumsulfaat werd in verschillende concentraties (maximaal 5% tot 25%) aan het lysaat toegevoegd om eiwitten uit de oplossing neer te slaan. (B) De aanwezigheid van varkens FAHD1 (25 kDa) werd bepaald in de afzonderlijke paren pellets en supernatant die overeenkomen met variërende ammoniumsulfaatconcentraties via western blot met behulp van een polyklonaal antilichaam tegen humaan FAHD1. Het supernatant dat overeenkomt met 25% ammoniumsulfaatprecipitatie vertoont nog steeds de aanwezigheid van varkens FAHD1 in het supernatant, terwijl tegelijkertijd een goede hoeveelheid andere eiwitten neerslaat. 200 ng van His/S-tagged recombinant eiwit werd geladen als een positieve controle (34 kDa). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Na het testen van ionische uitwisselingskolommen met FPLC werd een strategie gedefinieerd waarbij varkens FAHD1 in de doorstroom van een anionische uitwisselingschromatografie bij pH 9 (stap 5) blijven. Beginnend met lysaat verkregen door ammoniumsulfaatprecipitatie bij 25% (zoals gedefinieerd door eerdere testexperimenten), werd anionische uitwisselingschromatografie gebruikt om verdere eiwitten uit de oplossing te verwijderen (figuur 3A). Bindende eiwitten werden door elutie uit de kolom verwijderd, terwijl de doorstroming verder werd gezuiverd via SEC bij pH 7,4 (figuur 3B). Na beide stappen identificeerde western blot-analyse alle fracties die varkens FAHD1 bevatten, die werden samengevoegd en geconcentreerd tot 2 ml.

Figure 3
Figuur 3: Zuivering van varkens FAHD1 met FPLC - deel 1. Rode pijlen in het chromatogram en vlekken geven de aanwezigheid van FAHD1 aan. In het chromatogram duidt "UV" op de UV-absorptie bij 280 nm, "Cond" op de geleidbaarheid (gerelateerd aan de zoutconcentratie in de buffer) en "Conc B" op het percentage hoge zoutbuffer in de buffergradiënt (0% zuivere lage zoutbuffer; 100% zuivere hoge zoutbuffer). (A) Zuivering van varkens FAHD1 van lysaat verkregen door ammoniumsulfaatprecipitatie van 25 % met een anionische uitwisselingskolom (FPLC). Terwijl veel eiwitten zich binden aan de kolom, wordt varkens FAHD1 gevonden in de doorstroming. Vuil en niet-eiwitverontreinigingen worden door elutie uit de kolom verwijderd, terwijl de doorstroming verder wordt verwerkt. (B) De doorstroming van de vorige anionische uitwisselingschromatografie in (A) wordt verder gezuiverd via grootte-uitsluitingschromatografie (FPLC) bij pH 7,4. (A,B) Western blot-analyse (cropped blots aan de onderkant) identificeerde fracties die varkens FAHD1 bevatten, die gepoold en geconcentreerd zijn. De volledige vlekken tonen het met Coomassie bevlekte membraan na western blot-analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het gefilterde monster werd opnieuw aangebracht op SEC, maar onder buffercondities bij pH 9 (zie tabel 1) (figuur 4). De redenering achter deze benadering is dat de pH en het zoutgehalte van de mobiele fase het elutieprofiel van bolvormige eiwitten20 kunnen beïnvloeden, en onder deze bufferomstandigheden werd een verbeterd elutieprofiel voor FAHD1 gevonden. Eén fractie bevatte eiwit met voldoende zuiverheidsniveaus voor basisenzymactiviteitstests12 om uiteindelijk de identiteit van het eiwit te bevestigen.

Figure 4
Figuur 4: Zuivering van varkens FAHD1 met FPLC - deel 2. Rode pijlen in het chromatogram en vlekken geven de aanwezigheid van FAHD1 aan. Eiwitmonsters die eerder zijn gezuiverd met anionische uitwisseling en grootte-uitsluitingschromatografie worden verder gezuiverd via grootte-uitsluitingschromatografie (FPLC) bij pH 9 (bovenpaneel). Western blot-analyse rechtsonder identificeert fracties die varkens FAHD1 bevatten, die gepoold en geconcentreerd zijn (bodempanelen). De vlek linksonder toont de Coomassie-kleuring van het membraan na de western blot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Een alternatieve strategie (d.w.z. SEC gevolgd door ionische uitwisselingschromatografie) werd getest met 2 ml van het lysaat verkregen na ammoniumsulfaatprecipitatie (stap 4) (aanvullende figuur 2). De reden voor dit experiment is dat door eerst SEC te gebruiken, de FAHD1-bevattende fracties kunnen worden gescheiden van de meeste andere eiwitten, terwijl een daaropvolgende ionische uitwisselingschromatografie kan worden gebruikt om het eiwit verder te zuiveren. Ten eerste werd het lysaat gefractioneerd met SEC bij pH 7,4 (stap 6). Western blot-analyse identificeerde alle fracties die varkens FAHD1 bevatten. Ten tweede werden deze fracties geconcentreerd en verder gezuiverd met behulp van een anionische uitwisselingskolom bij pH 9 (stap 5). De chromatogrammen en western blot-analyse (aanvullende figuur 2) laten zien dat deze strategie bemoedigend is omdat het ionische uitwisselingschromatogram een gedefinieerde smalle piek laat zien die geassocieerd is met verrijkte eiwitniveaus in de western blot. Het nadeel van deze strategie is echter dat deze wordt beperkt door het initiële volume dat op de SEC (2 ml) moet worden toegepast, dus de doorvoer van deze methode is erg laag. Het verwerken van een hele varkensnier is bijvoorbeeld niet praktisch.

Als een andere wijziging van dit protocol werd een kationische uitwisselingskolom opgenomen vóór de anionische uitwisselingskolom wanneer het varken FAHD1 ook in de doorstroom aanwezig was. Bij elke stap van het protocol werden monsters van de varkens FAHD1 die fracties bevatten, bemonsterd en getest met een ODx-assay, zoals elders beschreven12 (aanvullende figuur 3). De specifieke enzymatische activiteit neemt toe samen met het zuiverheidsniveau, d.w.z. samen met de toenemende relatieve hoeveelheid FAHD1 per totaal eiwit.

Als tweede voorbeeld wordt de extractie van FAHD1 uit de lever van muizen gepresenteerd, d.w.z. een verzameling leverweefsel verkregen uit 20 muizen. Vergeleken met de extractie van FAHD1 uit de varkensnier die hierboven wordt gepresenteerd, bleek deze extractie vervelender te zijn. Er zijn problemen opgetreden bij verschillende stappen van het protocol, die hieronder zullen worden gepresenteerd. Het totale eiwit werd geëxtraheerd zoals beschreven in stap 2 (aanvullende figuur 4). Omdat leverhomogenaat van muizen de neiging heeft een zeer kleverige en slijmerige entiteit te zijn, werden filterpapier (vergelijkbaar met koffiefiltereenheden) gebruikt om het lysaat voor te filteren, dat na extractie 1: 3 in lysisbuffer werd verdund, om de oplossing meer als een vloeistof te maken. Deze verdunning verbeterde de filtratieprocedure; het maakte de daaropvolgende detectie van het eiwit met western blot echter vervelender. Na filtratie moest het bereide lysaat worden geconcentreerd voor verder gebruik. Een aliquoted tiende van het totale lysaat werd gebruikt voor de volgende experimenten.

Een eerste teststap voor de neerslag van ammoniumsulfaat (aanvullende figuur 4I) toonde een mogelijk probleem dat kan worden ondervonden. Ammoniumsulfaat in hogere concentraties verstoort SDS-PAGE-gels en veroorzaakt een glimlacheffect bij 150 V (aanvullende figuur 5A; negatief resultaat). Dezelfde SDS-PAGE run op 80 V geeft een positief resultaat (aanvullende figuur 5B). In het laatste geval vormt het glimlacheffect zich in eerste instantie, maar wordt uiteindelijk opgelost vanwege de lagere spanning die wordt toegepast. Omdat de initiële oplossing sterk verdund moest worden om het lysaat te kunnen filteren, was de eerste western blot-analyse van deze monsters niet succesvol, d.w.z. de positieve controle werd gedetecteerd door het antilichaam, maar niet door het eiwit in de aangebrachte monsters. Dit probleem werd opgelost met een hogere concentratie van zowel het lysaat (geconcentreerd met behulp van centrifugaalfiltereenheden) als het antilichaam, en door het antilichaam 's nachts in de koelruimte aan te brengen tijdens het schudden. Uiteindelijk leverde de western blot-analyse zowel de stukjes informatie op dat het eiwit aanwezig was in het lysaat, als dat het eiwit nog steeds aanwezig was in het supernatant bij 15% ammoniumsulfaat (aanvullende figuur 5C). Van belang is dat SDS-monsters met grotere hoeveelheden ammoniumsulfaat (>15%) neerspoelden tijdens het verwarmen en het eiwit verloren ging. Dit is ook te zien in de Coomassie-kleuring en de western blot (aanvullende figuur 5C). Dit effect werd niet waargenomen voor de varkensnier, dus het kan weefselspecifiek zijn.

Na ammoniumsulfaatprecipitatie bij 15% werd 10 ml lysaat toegepast op kationische uitwisselingschromatografie bij pH 6,8. Western blot-analyse toonde aan dat het FAHD1-eiwit van de muis zich in de doorstroom bevond (figuur 5A). De geëlueerde eiwitfractie lijkt gering te zijn; dit voorbeeld toont echter een secundair effect van ionische uitwisselingschromatografie. Bij deze stap van het protocol kan de oplossing nog steeds veel verbindingen bevatten die mogelijk geen eiwit zijn. Ionische uitwisselingschromatografie is een snelle en gemakkelijke manier om van dergelijke verontreinigingen af te komen. Aangezien het uitvoeren van ionische uitwisselingschromatografie een paar uur duurt om uit te voeren (inclusief alle wasstappen, duurt het experiment zelf een half uur), biedt het een eenvoudige methode om het monster te zuiveren van niet-eiwitverontreinigingen.

Figure 5
Figuur 5: Zuivering van muis FAHD1 met FPLC. Rode pijlen in het chromatogram en vlekken geven de aanwezigheid van FAHD1 aan. (A) Na ammoniumsulfaatprecipitatie bij 15% werd het monster gecentrifugeerd, gefilterd (0,22 μm) en aangebracht op een kationische uitwisselingskolom. Western blot analyse laat zien dat het eiwit zich in de doorstroming bevindt en het chromatogram laat zien dat niet veel van de andere eiwitten door deze stap is verwijderd. Het vergelijken van het uiterlijk en de viscositeit van de input met de flow-through laat echter zien dat de verzamelde flow-through veel duidelijker is (rechterpaneel vergelijkt input en flow-through). (B) De doorstroming die uit de kationische uitwisselingskolom werd verzameld, werd via centrifugatiefilters teruggebracht tot 2 ml en toegepast op maatuitsluitingschromatografie bij pH 7,4. (C) De fracties die FAHD1 bevatten, werden gepoold, geconcentreerd en toegepast op een tweede ronde van maatuitsluitingschromatografie bij pH 9. (D) De fracties die FAHD1 bevatten, werden opnieuw samengevoegd en met zilverkleuring op SDS-PAGE aangebracht om de resterende verontreinigingen te zien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het monster werd verder toegepast op maatuitsluitingschromatografie bij pH 7,4 (figuur 5B). Western blot-analyse toonde fracties met het FAHD1-eiwit van de muis, die werden samengevoegd en geconcentreerd tot 2 ml. Dit concentraat van 2 ml werd ingevroren bij -20 °C met 10 μL β-mercaptoethanol en de volgende dag ontdooid. Er werd een neerslag gevormd dat werd gefilterd via spuitfiltereenheden (0,22 μm). Monsters voor SDS-PAGE en western blot-analyse werden genomen om er zeker van te zijn dat het FAHD1-eiwit van de muis nog steeds in oplossing was.

Monsters die het eiwit bevatten (uit western blot-analyse) werden samengevoegd, geconcentreerd via centrifugatiefilters en aangebracht op SDS-PAGE met zilverkleuring om de resterende verontreinigingen te zien (figuur 5D). Hieruit bleek dat de eiwitoplossing niet zeer zuiver is en dat de hoeveelheden eiwit die via deze methode uit muizenlever werden verkregen ook niet erg hoog waren (in totaal enkele μg zoals bepaald met behulp van BCA-testkit; zie Tabel met materialen). De eiwitopbrengst was veel hoger in het geval van varkens FAHD1 (ongeveer 1 mg in deze stap). Het zuiverheidsniveau van FAHD1-eiwit geëxtraheerd uit de varkensnier is ongeveer 80% (geschat na zilverkleuring; gegevens niet getoond). Deze zuiverheid kan verder worden verhoogd door bijvoorbeeld affiniteitschromatografie met behulp van een gedefinieerd antilichaam. Dergelijke en andere beperkingen van dit protocol zullen hieronder in detail worden besproken.

Naam van buffer/oplossing/materiaal Compositie
Coomassie detentie oplossing 30% (v/v) EtOH; 5 % (v/v) HoAc; in ddH2O
Coomassie kleuroplossing 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250; 50 % (v/v) MeOH; 10 % (v/v) HoAc; in ddH2O
Mono Q hoge zoutbuffer 20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % glycerol; in ddH2O; stel de pH in op 9,0 met NaOH
Mono Q lage zoutbuffer 20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; in ddH2O; stel de pH in op 9,0 met NaOH
Mono S hoge zoutbuffer 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1 M NaCl; in ddH2O; stel de pH in op 6,8 met HCl
Mono S lage zoutbuffer 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 15 mM NaCl; in ddH2O; stel de pH in op 6,8 met HCl
Eiwitlysisbuffer 1x PBS (250 ml); 50 mM NaF; 1mM PMSF; 2 μg/ml aprotinine, 1 mM geactiveerd orthovanadaat; in ddH2O
Konijn Anti-hFAHD1 polyklonaal antilichaam (affiniteit geïsoleerd) Op maat gemaakt; polyklonaal anti-hFAHD1-antilichaam gezuiverd uit konijnenserum en gezuiverd met FPLC volgens referentie 12
Recombinant hFAHD1 eiwit western blot controle Western blot-controle-eiwit uitgedrukt in E.coli en gezuiverd met FPLC volgens referentie 12.
SDS-PAGE 5x voorbeeldbuffer 300 mM Tris HCl; 500 mM DDT; 10% (w / v) SDS; 50% (v/v) glycerine; 0,05% (w / v) broomfenolblauw; in ddH2O; stel de pH in op 6,8 met HCl
SDS-PAGE resolving gel (12,5%) voor discontinue PAGE ddH2O (9,5 ml); 3 M Tris HCl (2,2 ml); 5,5 ml 40% acrylamide/bis-oplossing (verhouding 29:1); 20% SDS (175 μL); TEMED (17 μL); 10% ammoniumperssulfaat (175 μL); giet voor de stapelgel en laat het polymeriseren; giet de stapelgel erop
SDS-PAGE actieve buffer 25 mM Tris HCl; 190 mM glycine; 0,5 % (m/v) SDS; in ddH2O; stel de pH in op 8,3 met NaOH
SDS-PAGE stapelgel (12,5%) voor discontinue PAGE ddH2O (3,8 ml); 1 M Tris HCl (630 μL); 500 μL 40% acrylamide/bis-oplossing (29:1 rantsoen); 20% SDS (25 μL); TEMED (5 μL); 10% ammoniumperssulfaat (50 μL); gegoten nadat de oplossende gel is gepolymeriseerd; breng een gelkam aan om putjes te maken
SEC (G75) lopende buffer 15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; in ddH2O; stel de pH in op 7,4 met NaOH
Oplossing voor het ontwikkelen van zilverkleuring 250 mM Na2CO3 in ddH2O; voeg voor gebruik 12 μL van 37% (v/v) formaldehyde toe aan 100 ml
Oplossing voor het bevestigen van zilverkleuringen 40% (v/v) EtOH; 10% (v/v) HoAc; in ddH2O
Zilverkleuring incubatie oplossing 30% (v/v) EtOH; 500 mM NaOAc; 8 mM Na2S2O3; in ddH2O; optioneel: voeg voor gebruik 600 μL 50% (v/v) glutaaraldehyde per 100 ml toe
Zilverkleuring zilver oplossing 0,1% (w/v) AgNO3; in ddH2O; voeg vóór gebruik 25 μL van 37% (v/v) formaldehyde toe aan 100 ml
Zilverkleuring stop oplossing 40 mM EDTA-oplossing bij pH 7,6; breng 744 mg EDTA over in 40 ml ddH2O en voeg vervolgens NaOH toe om op te lossen en de pH aan te passen aan 7,6. Stel ten slotte het totale volume in op 50 ml.
Western blot blokkering buffer PBS met 0,1% (v/v) Tween 20 en 5% (w/v) magere melkpoeder; gefiltreerd
Western blot transfer buffer (10x) Tris-HCl 250 mM; glycine 1,92 M; in ddH2O; stel de pH in op 8,3 met NaOH; bewaren bij kamertemperatuur
Western blot transfer buffer (1x) Western blot transfer buffer (10x) 100 ml; 800 ml ddH2O; 100 ml MeOH; bewaren bij 4 °C
Western blot wasbuffer (PBS-T) PBS met 0,1% (v/v) Tween 20

Tabel 1.

Aanvullende figuur 1: Totale eiwitextractie uit varkensnieren. (A) Nierweefsel werd gesneden met behulp van een scalpel op een voorbereide goed gereinigde glasplaat op polystyreenschuim om glijden te voorkomen; B) 50 ml buizen met 20 ml ijskoude lysisbuffer met eiwit-/proteaseremmers worden geïncubeerd op ijs; C) stukjes nierweefsel werden in de buffer geplaatst totdat het volume ongeveer 30 ml bereikte; (D) nierweefsel werd gehomogeniseerd met behulp van echografie (d.w.z. ultrasoonapparaat); E) ruw homogenaat werd gedurende 30 minuten bij gemiddelde snelheid in een tafelcentrifuge gecentrifugeerd; F) meerdere monsters tegelijk zijn verwerkt; G) na de eerste centrifugering werd het supernatant overgebracht in centrifugebuizen (vergelijk met E) en gedurende 30 minuten met hoge snelheid (10.000 x g) gecentrifugeerd; H) deze centrifugatiestap levert nog een pellet en supernatant op, die wordt overgebracht in buizen van 50 ml; (I/J) het prelysaat wordt achtereenvolgens gefilterd met filtereenheden van 0,45 μm en 0,2 μm, aliquoteerd in batches van 10 ml en vastgevroren met vloeibare stikstof om vervolgens bij -80 °C te worden bewaard. Western blot-analyse wordt gebruikt om de aanwezigheid van het eiwit in alle monsters (pellets, supernatanten, gefilterd lysaat) te verifiëren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Zuivering van varkens FAHD1 met FPLC; alternatieve strategie. Rode pijlen in het chromatogram en vlekken geven de aanwezigheid van FAHD1 aan. (A) Zuivering van varkens FAHD1 van lysaat verkregen door ammoniumsulfaatprecipitatie bij 25 % met maatuitsluitingschromatografie (FPLC) bij pH 7,4. Western blot-analyse identificeerde fracties die varkens FAHD1 bevatten, die werden samengevoegd en geconcentreerd. (B) Eiwitmonsters die eerder waren gezuiverd met grootte-uitsluitingschromatografie (paneel A) werden verder gezuiverd via anionische uitwisselingschromatografie (FPLC). Western blot-analyse identificeert fracties die varkens FAHD1 bevatten, die werden samengevoegd en geconcentreerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Specifieke enzymactiviteit van varkens FAHD1. Gemeten specifieke enzymactiviteit als functie van toenemende zuiverheid. De tabel vergelijkt de relatieve enzymactiviteit (nmol/min) met de specifieke enzymactiviteit (μmol/min/mg). De test toont een voortdurend toenemende activiteit van varkens FAHD1 na elke zuiveringsstap. Vergeleken met de recombinant His/S-human FAHD1 (groen) verkregen uit E. coli. 12, varkens FAHD1 vertoonden een iets hogere activiteit (rood) (n = 3). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 4: Totale eiwitextractie uit muizenlever. (A,B,C) Snap-bevroren leverweefsel van 20 muizen en lysisbuffer werden bereid op ijs in buizen van 50 ml; (D, E, F) leverweefsel werd gehomogeniseerd met behulp van echografie (d.w.z. ultrasoonapparaat); ruw homogenaat werd gedurende 30 minuten op middelhoge snelheid in een tafelcentrifuge gecentrifugeerd; het supernatant werd overgebracht in centrifugebuizen en gedurende 30 minuten met hoge snelheid (10.000 x g) gecentrifugeerd; (G,H,I) het prelysaat wordt achtereenvolgens gefilterd door papieren filters, filtereenheden van 0,45 μm en 0,2 μm, aliquoteerd in batches van 10 ml en vastgevroren met vloeibare stikstof om vervolgens bij -80 °C te worden bewaard; J) ammoniumsulfaat in verschillende concentraties (maximaal 5% tot 30%) aan het lysaat werd toegevoegd om eiwit uit de oplossing neer te slaan; K) pellets verkregen na ammoniumsulfaatprecipitatie (paneel J) werden geresuspendeerd in H2O om monsters te nemen voor SDS-PAGE- en western blot-analyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 5: Ammoniumsulfaatprecipitatie en western blotscreening voor muis FAHD1. Rode pijlen in de vlekken geven de aanwezigheid van FAHD1 aan. (A) SDS-PAGE met monsters verkregen nadat ammoniumsulfaatprecipitatie werd uitgevoerd bij 125 V. Deze gel vertoonde een drastisch glimlacheffect en zo'n gel kan niet worden geëvalueerd. Dit is een voorbeeld van een negatief resultaat. (B) SDS-PAGE met dezelfde monsters (paneel A) werd uitgevoerd op 80 V totdat het voltooid was. Er is geen glimlacheffect in deze gel en dit is een voorbeeld van een positief resultaat. C) SDS PAGE en western blot-analyse van de monsters verkregen na precipitatie van ammoniumsulfaat. Monsters bij hogere concentraties ammoniumsulfaat kunnen neerslaan in de monsterbuffer, zoals aangegeven. Ze gaan verloren en kunnen niet meer worden gedetecteerd, noch via Coomassie-kleuring (links) of western blot-analyse (rechts). De beste concentratie ammoniumsulfaat werd in dit geval vastgesteld op 15%. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritieke stappen in het protocol
Het volgen van gemeenschappelijke richtlijnen voor de omgang met eiwitten is essentieel, zoals werken op ijs en bij matige pH- en zoutcondities. Het gebruik van proteaseremmers is gunstig voor de methode, terwijl het gebruik van proteasoomremmers ten zeerste wordt aanbevolen. Het invriezen en ontdooien van het monster kan altijd leiden tot eiwitprecipitatie (ten minste gedeeltelijk), dus elk ontdooide aliquot van initieel eiwitlysaat (stap 2) moet continu worden verwerkt zonder een pauze. Centrifugeren en filtratie na het ontdooien wordt over het algemeen aanbevolen om microprecipitatie te verwijderen.

Het oorspronkelijke eiwit lysaat verkregen uit een weefsel bevat naast eiwitten nog veel stoffen. Ionische uitwisselingschromatografiekolommen kunnen worden gebruikt om het lysaat te zuiveren. Zelfs als het eiwit dat men wil extraheren niet bindt aan de ionische uitwisselingskolom, kan de doorstroming veel duidelijker zijn dan de invoeroplossing en gemakkelijker in volgende stappen worden verwerkt. Dit wordt getoond voor de extractie van FAHD1 uit muizennieren (zie figuur 5A).

Beperkingen en wijzigingen van de methode
Dit protocol beschrijft een protocol voor de extractie van FAHD1 uit het weefsel. Op basis van deze strategie kan een algemene benadering voor de extractie van FAHD-eiwitten (FAHD1, FAHD2) uit ander weefsel worden afgeleid, terwijl specifieke aanpassingen nodig kunnen zijn voor individuele gevallen. De impliciete beperking van deze methode is de relatieve expressieniveaus van FAHD1 (of FAHD-eiwitten) in een bepaald weefsel en de beschikbaarheid van dit weefsel in voldoende hoeveelheden. Het algemene schema dat in dit protocol wordt beschreven, vereist een hoge expressie van het eiwit in een geschikte hoeveelheid weefsel om mee te beginnen. Voorbeelden voor de extractie van FAHD1 uit varkensnier en muizenlever zijn gegeven, twee organen die hoge expressieniveaus van het eiwit vertonen. Bij elke stap die in dit protocol wordt beschreven, is er een impliciet verlies van monster, d.w.z. de lage initiële hoeveelheid eiwit wordt nog verder verminderd. Uiteindelijk kunnen met dit protocol slechts lage hoeveelheden eiwit worden bereikt. Omdat de varkensnier een groot orgaan is, kan ongeveer een gram eiwit (ongeveer 80% zuiverheid; geschat) door deze benadering uit twee nieren worden geëxtraheerd. Het toepassen van hetzelfde protocol voor de extractie van FAHD1 uit muizenlever vereiste het verzamelen van levermonsters van 20 muizen, om uiteindelijk slechts een paar μg eiwit te verkrijgen. Het verkrijgen van een hogere zuiverheid van het eiwit met behulp van de geschetste methoden kan vervelend zijn, en zilverkleuring onthult dat er na grootte-uitsluiting chromatografie nog steeds veel andere eiwitten in oplossing kunnen zijn. Men zou dit protocol kunnen uitbreiden via affiniteitschromatografie (NHS-geactiveerde kolommen), met behulp van een monoklonaal antilichaam (bijv. CAB025530).

Alle protocollen die hier worden vermeld, vereisen dat het eiwit dat men wil extraheren oplosbaar is. Optimale omstandigheden van ammoniumsulfaatprecipitatie en pH / zoutaanpassingen voor chromatografie moeten worden getest en gedefinieerd. In het geval dat de ionische uitwisselingschromatografie geen goede zuiveringsresultaten oplevert, kan dialyse tegen een chromatografiebuffer voor het uitvoeren van FPLC een optie zijn om de oplosbaarheid van het eiwit en de resolutie van de chromatografie te verbeteren. Het wordt echter niet aanbevolen om het ruwe lysaat te dialyseren, omdat dit kan leiden tot massale en ongecontroleerde eiwitneerslag in de dialysebuis. Problemen kunnen optreden als het eiwit de neiging heeft hydrofoob te zijn en de protocollen zijn mogelijk niet van toepassing als het eiwit zeer hydrofoob is (bijv. membraaneiwitten). Als FAHD-eiwitten gedeeltelijk onoplosbaar zijn zoals gevonden voor FAHD2 (gegevens niet weergegeven) in een bepaald weefsellysaat, kunnen andere soorten chromatografie, bijvoorbeeld hydrofobe interactiechromatografie (HIC), ook worden onderzocht12.

Twee wijzigingen van het standaardprotocol zijn weergegeven in de resultatensectie. Voor de zuivering van FAHD1 uit een varkensnier werd maatuitsluitingschromatografie gebruikt vóór ionische uitwisselingschromatografie (zie aanvullende figuur 2). Een probleem met deze methode is dat maatuitsluitingschromatografie grotere hardloopbanen bevat en dat het samplevolume sterk toeneemt tijdens de run. Het monstervolume mag niet groter zijn dan 2% van het bedvolume om een hoge resolutie23 te bereiken, en de uiteindelijke verdunningsfactor is ook afhankelijk van het verzamelde elutievolume. In het opgegeven voorbeeld met een kolom van 120 ml wordt een initieel volume van 2 ml aanbevolen. Het eerste monster kan worden verzameld uit verschillende ml van het lysaat na ammoniumsulfaatprecipitatie, door concentratie met behulp van centrifugale filtereenheden, zonder aggregatie- of neerslagartefacten. Een voorbeeld voor de zuivering van FAHD1 uit een varkensnier wordt als representatief resultaat gegeven (zie ook aanvullende figuur 2). De beperking tot slechts kleine steekproefvolumes kan deze aanpak echter onpraktisch maken.

Toepassingen of aanwijzingen van de methode
Expressie en zuivering van recombinante eiwitten uit bacteriën is een eenvoudige en gevestigde methode, om haalbare hoeveelheden (in grammen) eiwit24,25 te verkrijgen. Deze is gepresenteerd voor FAHD112. Er zijn echter verschillende mogelijke nadelen bij het gebruik van deze methoden, zoals mogelijke slechte groei van de gastheer, inclusie lichaamsvorming, verlies van of veranderde eiwitactiviteit, en daarom de mogelijkheid om helemaal geen eiwit te verkrijgen, of resulterend in een bevooroordeelde vorm van het eiwit (verkeerd vouwen, slechte posttranslationele modificaties, enz.). Het ontwikkelen van methoden die goed gevouwen en goed gemodificeerd eiwit direct uit weefsel kunnen halen, is daarom aantrekkelijk. Het grootste probleem is echter dat de meeste eiwitten niet op significante niveaus tot expressie komen, en in vergelijking met de impliciete inductie en daaropvolgende extractie van eiwit uit bacteriën, is de hoeveelheid eiwit die moet worden verkregen meestal enkele ordes van grootte lager. Er is een afweging tussen de goedkope en gemakkelijke extractie van recombinant eiwit uit bacteriën en de duurdere en vervelende extractie van eiwit uit weefsel. De belangrijkste vooruitgang met de laatste is dat men het eiwit in zijn fysiologische vorm kan extraheren dat in het weefsel aanwezig is, inclusief alle wederzijdse effecten die van invloed kunnen zijn op de vouwing en / of katalytische activiteit.

Eiwit geëxtraheerd en gezuiverd door dit protocol zal helpen bij het identificeren van competente remmers vanFAHD1 13, mogelijke eiwitinteractiepartners9 en mogelijke nog onontdekte rollen van het eiwit9. De studie van enzymatische remmers, de ontwikkeling van monoklonale antilichamen en de studie van de eiwitstructuur in de eerste plaats worden sterk ondersteund bij het hebben van eiwit met een hoge zuiverheid geëxtraheerd uit weefsel in plaats van geëxtraheerd uit bacteriën.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen tegenstrijdige financiële belangen.

Acknowledgments

De auteurs zijn erg dankbaar voor de technische assistentie van Ayse Öztürk en Eva Albertini. Muizen die werden gebruikt voor het genereren van leverweefsel werden onderhouden onder toezicht van Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr (Instituut voor Biomedisch Verouderingsonderzoek aan de Universiteit van Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Oostenrijk).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm filter units MERCK SLGP033RS Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, not steril
0.45 µm filter units MERCK SLHP033NS Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, not steril
15 mL Falcon tubes VWR 734-0451 centrifugal tubes
50 mL Falcon tubes VWR 734-0448 centrifugal tubes
96-Well UV Microplate Thermo-Fischer 8404 UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates
Acrylamide/Bis Solution (40%, 29:1 ratio) BIO-RAD #1610147 40% acrylamide/bis-acrylamide, 29:1 (3.3% crosslinker) solution for casting polyacrylamide gels
ÄKTA FPLC system GE Healthcare Life Sciences / Cytiva - using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the "ÄKTA pure" system
Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa MERCK UFC901024 centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 15 mL
Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa MERCK UFC801024 centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 4 mL
Ammonium sulfate powder MERCK A4418 ammonium sulphate for molecular biology, ≥99.0%
Ammoniumpersulfat reagent grade, 98% MERCK 215589 Catalyst for acrylamide gel polymerization.
Coomassie Brilliant blue R 250 MERCK 1125530025 Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) for electrophoresis Trademark of Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g/l, H2O, 25 °C)
Dialysis tubing cellulose membrane MERCK D9277 Cellulose membranes for the exchange of buffers via dialysis.
Eppendof tubes 1.5 mL VWR 525-1042 microcentrifugal tubes; autoclaved
HiLoad 26/600 Superdex 75 pg GE Healthcare Life Sciences / Cytiva 28989334 HiLoad Superdex 75 pg prepacked columns are for high-resolution size exclusion chromatography of recombinant proteins
Immun-Blot PVDF Membrane BIO-RAD #1620177 PVDF membranes are protein blotting membranes optimized for fluorescent and multiplex fluorescent applications.
Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell BIO-RAD #1703930 Use the Mini Trans-Blot Cell for rapid blotting of Mini-PROTEAN precast and handcast gels.
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels BIO-RAD #1658004 4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam.
Mono Q 10/100 GL GE Healthcare Life Sciences / Cytiva 17516701 Mono Q columns are strong anion exchange chromatography columns for protein analysis or small scale, high resolution polishing of proteins.
Mono S 10/100 GL GE Healthcare Life Sciences / Cytiva 17516901 Mono S columns are strong cation exchange chromatography columns for protein analysis or small scale high resolution polishing of proteins.
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa Thermo-Fischer 26616 A mixture of 10 blue-, orange-, and green-stained proteins (10 to 180 kDa) for use as size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting.
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo-Fischer 23225 A two-component, high-precision, detergent-compatible protein assay for determination of protein concentration.
Sonifier 250; Ultrasonic Cell Disruptor w/ Converter Branson - New models at https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf
Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (affinity isolated) Agilent Dako P0399 The antibody used for horseradish peroxidase conjugation reacts with rabbit immunoglobulins of all classes.
TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethane, TMEDA MERCK T9281 TEMED (N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine) is molecule which allows rapid polymerization of polyacrylamide gels.
Tube Roller - - A general tube rotator roller; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71
Tube Rotator - - A general tube rotator wheel; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123
ULTRA-TURRAX; T 25 digital IKA 0003725000 New models at https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pircher, H., et al. Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase. Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).
  2. Pircher, H., et al. Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase. Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).
  3. Kang, T. -W., et al. Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development. Nature. 479 (7374), 547-551 (2011).
  4. Hong, H., Seo, H., Park, W., Kim, K. K. -J. Sequence, structure and function-based classification of the broadly conserved FAH superfamily reveals two distinct fumarylpyruvate hydrolase subfamilies. Environmental Microbiology. 22 (1), 270-285 (2020).
  5. Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase. Structure. 7 (9), London, England. 1023-1033 (1999).
  6. Bateman, R. L., et al. Mechanistic inferences from the crystal structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a bound phosphorus-based inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 276 (18), 15284-15291 (2001).
  7. Weiss, A. K. H., et al. Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1. Biochemical Journal. 475 (22), 3561-3576 (2018).
  8. Etemad, S., et al. Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 - a new regulator of mitochondrial function and senescence. Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).
  9. Weiss, A. K. H., et al. Regulation of cellular senescence by eukaryotic members of the FAH superfamily - A role in calcium homeostasis. Mechanisms of Ageing and Development. 190, 111284 (2020).
  10. Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-Dürr, P. Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells. Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).
  11. Wiley, C. D., et al. Mitochondrial dysfunction induces senescence with a distinct secretory phenotype. Cell Metabolism. 23 (2), 303-314 (2016).
  12. Weiss, A. K. H., et al. Expression, purification, crystallization, and enzyme assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59729 (2019).
  13. Weiss, A. K. H., et al. Inhibitors of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain Containing Protein 1 (FAHD1). Molcules. 26 (16), 5009 (2021).
  14. Mizutani, H., Kunishima, N. Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8. Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).
  15. Lee, C. H. A simple outline of methods for protein isolation and purification. Endocrinology and Metabolism. 32 (1), Seoul, Korea. 18-22 (2017).
  16. Amer, H. E. A. Purification of proteins: Between meaning and different methods). Proteomics Technologies and Applications. , (2019).
  17. Niu, L., Yuan, H., Gong, F., Wu, X., Wang, W. Protein extraction methods shape much of the extracted proteomes. Frontiers in Plant Science. 9, 802 (2018).
  18. Gordon, J. A. Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).
  19. Gallagher, S. R. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. , (2012).
  20. Ahmed, U., Saunders, G. Effect of pH on Protein Size Exclusion Chromatography. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf (2011).
  21. Sørensen, B. K., et al. Silver staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 304 (1), 33-41 (2002).
  22. Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).
  23. Cytiva Life Fundamentals of size exclusion chromatography. , Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography (2022).
  24. Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Frontiers in Microbiology. 5, 172 (2014).
  25. Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).

Tags

Biochemie Nummer 180 FAHD FAHD1 oxaalacetaat decarboxylase ODx weefsel FPLC chromatografie eiwitextractie
Extractie en zuivering van FAHD1-eiwit uit varkensnier en muizenlever
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Andric, A., Wagner, E., Heberle, A., … More

Andric, A., Wagner, E., Heberle, A., Holzknecht, M., Weiss, A. K. H. Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver. J. Vis. Exp. (180), e63333, doi:10.3791/63333 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter