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Biochemistry

Extraction et purification de la protéine FAHD1 du rein de porc et du foie de souris

Published: February 18, 2022 doi: 10.3791/63333
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Research Institute for Biomedical Aging Research, University of Innsbruck

Summary

Ce protocole décrit comment extraire la protéine 1 contenant le domaine de l’hydrolase fumarylacétoacétate (FAHD1) du rein et du foie de souris. Les méthodes énumérées peuvent être adaptées à d’autres protéines d’intérêt et modifiées pour d’autres tissus.

Abstract

La protéine 1 contenant le domaine de l’hydrolase fumarylacétoacétate (FAHD1) est le premier membre identifié de la superfamille FAH chez les eucaryotes, agissant comme oxaloacétate décarboxylase dans les mitochondries. Cet article présente une série de méthodes pour l’extraction et la purification de FAHD1 à partir de reins de porcs et de foies de souris. Les méthodes couvertes sont la chromatographie par échange ionique avec chromatographie liquide à protéines rapides (FPLC), la filtration sur gel préparatif et analytique avec FPLC et les approches protéomiques. Après l’extraction des protéines totales, la précipitation du sulfate d’ammonium et la chromatographie par échange ionique ont été explorées, et FAHD1 a été extrait via une stratégie séquentielle utilisant la chromatographie par échange ionique et par exclusion de taille. Cette approche représentative peut être adaptée à d’autres protéines d’intérêt (exprimées à des niveaux significatifs) et modifiée pour d’autres tissus. Les protéines purifiées des tissus peuvent favoriser le développement d’anticorps de haute qualité et/ou d’inhibiteurs pharmacologiques puissants et spécifiques.

Introduction

La protéine 1 eucaryote contenant le domaine FAH (FAHD1) agit sous forme d’oxaloacétate bifonctionnel (OAA), decarboxylase (ODx)1 et d’hydrolase acylpyruvate (ApH)2. Il est localisé dans les mitochondries2 et appartient à la vaste superfamille faH des enzymes 1,2,3,4,5,6. Bien que son activité ApH ne soit que d’une pertinence mineure, l’activité ODx de FAHD1 est impliquée dans la régulation du flux de cycle TCA 1,7,8,9. L’OAA est non seulement nécessaire pour la réaction centrale de la citrate synthase dans le cycle de l’acide tricarboxylique, mais agit également comme un inhibiteur compétitif de la succinate déshydrogénase dans le cadre du système de transport d’électrons et comme métabolite cataplérotique. La régulation négative de l’expression du gène FAHD1 dans les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) a entraîné une réduction significative du taux de prolifération cellulaire10 et une inhibition significative du potentiel de la membrane mitochondriale, associée à un passage concomitant à la glycolyse. Le modèle de travail fait référence à la sénescence associée au dysfonctionnement mitochondrial (MiDAS)phénotype 8 de type MiDAS,11, où les niveaux d’OAA mitochondrial sont étroitement régulés par l’activité FAHD1 1,8,9.

La protéine recombinante est plus facile à obtenir par l’expression et la purification à partir de bactéries12 plutôt que de tissus. Cependant, une protéine exprimée dans les bactéries peut être biaisée par l’absence possible de modifications post-traductionnelles, ou peut simplement être problématique (c.-à-d. en raison de la perte de plasmides, des réponses au stress bactérien, des liaisons disulfures déformées / non formées, de l’absence ou d’une mauvaise sécrétion, de l’agrégation des protéines, du clivage protéolytique, etc.). Pour certaines applications, la protéine doit être obtenue à partir de lysat cellulaire ou de tissu, afin d’inclure de telles modifications et/ou d’exclure d’éventuels artefacts. Les protéines purifiées des tissus favorisent le développement d’anticorps de haute qualité et/ou d’inhibiteurs pharmacologiques puissants et spécifiques pour certaines enzymes, comme pour FAHD113.

Ce manuscrit présente une série de méthodes pour l’extraction et la purification de FAHD1 à partir de reins de porcs et de foies de souris. Les méthodes décrites nécessitent une chromatographie liquide à protéines rapides (FPLC), mais utilisent autrement un équipement de laboratoire commun. D’autres méthodes peuvent être trouvées ailleurs 14,15,16,17. Après l’extraction des protéines totales, le protocole proposé comprend une phase d’essai, au cours de laquelle les sous-protocoles de précipitation du sulfate d’ammonium et de chromatographie par échange ionique sont discutés (figure 1). Après avoir défini ces sous-protocoles, la protéine d’intérêt est extraite via une stratégie séquentielle utilisant l’échange ionique et la chromatographie d’exclusion de taille avec FPLC. Sur la base de ces lignes directrices, le protocole final peut être adapté individuellement à d’autres protéines d’intérêt.

Figure 1
Figure 1 : La stratégie globale de ce protocole. De haut en bas : Les protéines sont extraites des tissus. L’homogénat tissulaire est préparé, centrifugé et filtré. Pour chaque paire d’échantillons surnageants et d’échantillons dérivés de granulés, des tests de précipitation de sulfate d’ammonium et de chromatographie par échange ionique (FPLC) doivent être effectués pour sonder les conditions optimales. Après avoir établi ces sous-protocoles, la protéine peut être extraite par une procédure séquentielle de précipitation du sulfate d’ammonium, de chromatographie par échange ionique et de chromatographie d’exclusion de taille répétitive (FPLC) à des concentrations variables de pH et de sel. Toutes les étapes doivent être contrôlées par transfert western. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Protocol

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles. Le rein de porc a été obtenu frais du supermarché local. Des tissus hépatiques ont été prélevés sur des souris de type sauvage C57BL6 conservées à l’Institut de recherche biomédicale sur le vieillissement de l’Université d’Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Autriche, sous la supervision de l’Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr, couvert par l’autorisation éthique en tant que chef de projet délivrée en 2013 (BMWF-66.008/0007-II/3b/2013). L’entretien et l’utilisation des souris pour le projet sont couverts par l’autorisation éthique n ° 2020-0.242.978 du 5 mai 2020, délivrée par le ministère autrichien de l’Éducation, des Sciences et de la Recherche (BMBWF).

1. Préparatifs

REMARQUE: Avant le début du protocole, plusieurs choses doivent être préparées, c’est-à-dire le tampon de lyse des protéines, l’échantillon de tissu brut et un anticorps spécifique, en plus des produits chimiques généraux et des matériaux.

  1. Préparer 250 mL de tampon de lyse des protéines par 100 g de poids net de tissu : 250 mL de 1x PBS avec 50 mM de NaF, 1 mM de PMSF, 2 μg/mL d’aprotinine et 1 mM d’orthovanadate activé (voir tableau 1). Filtrer la solution à l’aide d’une unité de filtration de seringue de 0,22 μm.
    REMARQUE: L’activation de l’orthovanadate est nécessaire avant utilisation pour le convertir en un inhibiteur plus puissant de la protéine tyrosine phosphatases18. L’orthovanadate activé peut être obtenu auprès de fournisseurs commerciaux, mais également préparé comme suit.
    1. Préparer une solution mère de 200 mM d’orthovanadate (sodium) dans ddH2O. Pour préparer 10 mL de solution, ajouter 368 mg de Na3VO4 à 9 mL d’eau et dissoudre par agitation. Une fois dissous, porter le volume à 10 mL avec ddH2O.
      REMARQUE: Le pH de départ de la solution d’orthovanadate de sodium peut varier en fonction de la source du matériau, et le pH doit être ajusté à 10 dans une approche répétitive comme suit.
    2. Selon le pH initial de la solution, ajuster le pH à 10 avec NaOH ou HCl. À un pH > 10, la solution aura une couleur jaune. Faites bouillir la solution jusqu’à ce qu’elle devienne incolore, refroidissez-la à la température ambiante et vérifiez le pH. Si le pH est >10, ajoutez un petit volume de HCl pour ajuster le pH à 10. À ce stade, la solution peut redevenir jaune.
    3. Répétez l’ébullition et le refroidissement jusqu’à ce que la solution reste incolore et que le pH se stabilise à 10 (environ 5-7 fois). À ce stade, l’ajout de HCl entraîne une légère apparence de couleur jaune dans la solution. Conserver l’orthovanadate activé dans des aliquotes de 1 mL à -20 °C.
  2. Préparez des tubes avec 2 mL de tampon de lyse par gramme de tissu et placez-les sur de la glace.
    REMARQUE: Ce protocole utilisait huit tubes de 50 mL, chacun rempli de 30 mL de tampon de lyse au total pour un rein de porc (environ 100-150 g), et deux tubes remplis chacun de 40 mL de tampon de lyse pour 20 foies de souris (chacun 1-2 g) au total.
  3. Préparez le tissu: disséquez le tissu sur une plaque de verre pré-nettoyée placée sur de la glace dans une boîte en mousse de polystyrène. Couper des morceaux de tissu d’environ 100 mg chacun pour être facilement transférés dans les tubes respectifs pour une lyse ultérieure. Transférer les morceaux de tissu dans les tubes préparés (étape 1.2).
  4. Préparer une solution saturée de sulfate d’ammonium : chauffer 500 mL de ddH2O à 70 °C et, en remuant, ajouter progressivement la poudre de sulfate d’ammonium (voir tableau des matières) jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de sulfate d’ammonium dissous. Refroidir cette solution (sur)saturée à température ambiante et la conserver à 4 °C pendant la nuit.

2. Extraction des protéines totales

NOTE Après avoir préparé l’échantillon dans un tampon de lyse des protéines froides (voir étape 1.3), homogénéiser le tissu le mieux possible par sonication par une sonde à ultrasons, ou en utilisant un homogénéisateur électrique comme suit.

  1. Homogénéisation des tissus
    1. Dans le cas d’un rein de porc, soniquer la suspension de préférence par une sonde à ultrasons tout en gardant l’échantillon sur de la glace (10 cycles de 15 s d’impulsion, avec des intervalles de 30 s entre les impulsions pour refroidir l’échantillon sur de la glace, à amplitude moyenne avec un rapport cyclique de 50%).
    2. Dans le cas des organes de souris, homogénéiser la suspension à l’aide d’un homogénéisateur électrique (en commençant par une faible force et en accélérant lentement jusqu’à une force moyenne) tout en gardant l’échantillon sur la glace. Lavez régulièrement l’homogénéisateur électrique dans PBS pour éliminer toute matière organique obstruant l’appareil.
    3. Prélever 20 μL des échantillons et vérifier au microscope si les cellules du tissu homogénéisé sont correctement détruites; sinon, répétez l’homogénéisation.
  2. Centrifuger les tubes dans une centrifugeuse de table à 10 000 x g pendant 30 min à 4 °C.
    REMARQUE: En option, centrifugez le surnageant une deuxième fois à 20 000 x g pendant 30 min à 4 °C pour éliminer les petites fractions de la pastille initiale qui peuvent avoir été transférées. Cela simplifiera la filtration ultérieure à l’étape 2.3.
  3. Recueillez le surnageant dans un tube frais et placez-le sur de la glace. Filtrer séquentiellement le surnageant à l’aide d’unités de filtration de seringue de 0,45 μm et 0,22 μm. Aliquoter le surnageant en lots de 10 mL et les congeler à -20 °C pour un stockage à court terme ou à -80 °C pour un stockage plus long.
    REMARQUE: Le préfiltrage à 0,45 μm élimine la majorité des particules avant qu’une deuxième étape de filtrage de 0,22 μm n’élimine les particules les plus fines. L’utilisation directe du filtre de 0,22 μm peut entraîner le risque d’encrassement des filtres.
  4. Préparer un échantillon de 50 μL pour l’analyse SDS-PAGE/Western blot en ajoutant 10 μL de tampon d’échantillon SDS 5x (voir tableau 1) à 40 μL du surnageant, puis en les faisant bouillir à 95 °C pendant 10 min.
    1. Éventuellement, remettez en suspension environ 100 μL de pastille obtenue à l’étape 2.2 dans 900 μL de ddH2O et préparez un échantillon pour l’analyse SDS-PAGE/Western blot comme décrit ci-dessus.
      REMARQUE : L’inclusion d’échantillons dérivés de granulés dans l’analyse par transfert western, en plus du témoin positif, indiquera si l’expression de la protéine est faible ou si l’anticorps est problématique.

3. Analyse SDS-PAGE et Western Blot

REMARQUE: Une analyse par transfert western est nécessaire pour vérifier la solubilité des protéines. Ce qui suit décrit un protocole d’électrobuvardage, à l’aide d’un système de buvard humide/réservoir (voir tableau des matériaux). Un autre protocole pour SDS-PAGE peut être trouvé ailleurs19.

  1. Préparer un gel SDS-PAGE de polyacrylamide discontinu à 12,5 % conformément aux instructions du fabricant (c.-à-d. un gel empilable sur un gel résolvant; voir le tableau 1). Exécutez les exemples précédemment préparés à l’étape 2 (similaire aux étapes 4, 5 et 6 ; voir ci-dessous).
    1. Chargez une échelle de marqueurs protéiques dans le premier puits (voir tableau des matériaux). Charge 5 ng de protéine recombinante hFAHD1 (obtenue à partir de bactéries12; voir tableau 1) comme témoin positif dans le deuxième puits.
    2. Par la suite, chargez 20 μL de l’échantillon à analyser et remplissez tous les puits restants avec 20 μL de tampon d’échantillon SDS-PAGE 1x préparé (c.-à-d. 5x tampon d’échantillon dilué avec ddH2O). Exécutez les gels SDS-PAGE à 125 V à l’aide du tampon SDS (voir tableau 1).
  2. Une fois SDS-PAGE terminé, effectuez une analyse par transfert western et sondez les membranes à l’aide de l’anticorps disponible soulevé contre FAHD1 (voir le tableau 1).
    REMARQUE: Comme les échantillons sont prélevés dans un homogénat de tissu brut, la qualité de la FDS-PAGE et de l’analyse par transfert western à ce stade est généralement compromise; cependant, il est important de vérifier si la protéine à extraire est soluble dans le surnageant. Le protocole suivant a été testé pour le rein porcin et différents organes de souris, y compris le foie, le cœur, le cerveau et les reins.
    1. Préparez le tampon de transfert western blot 10x (voir tableau 1). Préparez le tampon de transfert western blot 1x (voir tableau 1) et refroidissez-le à 4 °C.
    2. Activer une membrane PVDF pendant 2 min dans du méthanol. Laver la membrane en ddH2O pendant 2 min. Équilibrez la membrane pendant 15 min dans 1x tampon de transfert western blot.
    3. Lavez le gel SDS avec 1x PBS pendant 10 min en agitant pour retirer le tampon SDS, puis incubez le gel dans 1x tampon de transfert western blot pendant 10 min pour l’équilibrage. Assemblez la cassette d’électrobuvardage (c’est-à-dire en combinant la membrane PVDF activée et les gels) conformément aux instructions du fabricant.
    4. Faire passer le blot par électroblotting à 300 mA pendant 1 h dans une boîte en mousse de polystyrène remplie de glace ou dans la chambre froide (4 °C). Transférez la membrane PVDF dans un tube de 50 mL avec son côté exposé face à la face interne du tube. Incuber la membrane dans 20 mL de tampon bloquant le transfert western (voir tableau 1) pendant la nuit à 4 °C tout en roulant sur un rouleau tubulaire (voir tableau des matériaux).
    5. Le lendemain, lavez la membrane pendant 5 min avec 20 mL de tampon de lavage western blot (PBS avec 0,1% (v/v) Tween 20) dans le même tube pendant le laminage. Incuber la membrane dans le même tube avec l’anticorps primaire2 (ciblant FAHD1; voir tableau 1) dilué à 1:500 dans un tampon bloquant le transfert western pendant 1 h à température ambiante pendant le laminage.
    6. Lavez la membrane dans le même tube trois fois pendant 10 minutes chacune avec 20 mL de tampon de lavage western pendant le laminage. Incuber la membrane pendant 30 min à température ambiante avec un anticorps secondaire conjugué HRP (voir Tableau des matériaux) dilué à 1:3000 dans 5 mL de tampon bloquant le transfert western.
    7. Lavez la membrane dans le même tube trois fois pendant 10 minutes chacune avec 20 mL de tampon de lavage western blot et deux fois pendant 5 minutes chacune avec 1x PBS. Séchez la membrane en la tenant soigneusement avec une pince à épiler sur un bord et en touchant un morceau de cellulose ou un morceau de papier Whatman avec le bord opposé (inférieur) de la membrane. Placez la membrane (côté exposé vers le haut) sur une plaque de verre nettoyée.
    8. Couvrez soigneusement toute la membrane avec 1 mL de substrat de western blot ECL préparé à l’aide d’une pipette, en prenant soin de ne pas créer de bulles d’air. Laissez la solution ECL incuber pendant 3 min et développez immédiatement la membrane à l’aide d’un film radiographique ou d’un système d’imagerie.
      REMARQUE: Si la protéine n’a été détectée dans aucun des échantillons, mais seulement dans le témoin positif, cela peut indiquer que la protéine est insoluble ou qu’elle n’est pas présente en quantités suffisantes pour être détectée par l’anticorps. Si seulement des nanogrammes du témoin positif étaient chargés, le premier scénario est plus probable. Si aucune protéine n’a été détectée, vérifiez la qualité de l’anticorps et passez peut-être à un anticorps polyclonal plutôt qu’à un anticorps monoclonal. En de rares occasions, c’est-à-dire pour certaines protéines hydrophobes, la protéine peut être détectable après centrifugation, mais pas après filtration. Dans un tel cas, il est recommandé d’utiliser des unités de filtration spéciales pour les protéines hydrophobes.
  3. En option, colorez les membranes PVDF après le transfert western pour contrôler le transfert réussi de la protéine du gel SDS-PAGE vers la membrane PVDF.
    REMARQUE: La coloration de Coomassie est recommandée pour le dépannage, le développement de méthodes et la documentation, mais gardez à l’esprit qu’après l’application de ce protocole, les membranes sont perdues pour une analyse ultérieure du transfert Western. La coloration Ponceau S donne une coloration plus faible, mais peut être utilisée si les membranes doivent être re-sondées.
    1. Préparez de petits plateaux contenant les solutions de coloration (Coomassie ou Ponceau S) et de décoloration.
    2. À l’aide d’une pince à épiler, mettez la membrane dans la solution de coloration et secouez doucement jusqu’à ce que la membrane soit bien colorée (5-10 min).
    3. Transférer la membrane dans la solution de conservation et agiter jusqu’à ce que la solution soit saturée (5-10 min). Répétez l’étape de conservation jusqu’à ce que les bandes protéiques puissent être observées sur la membrane; si aucune bande n’est observée, répétez la coloration avec un temps d’incubation plus long. Séchez la membrane en la plaçant sur une plaque de verre à l’aide d’une pince à épiler.

4. Essais : Précipitation du sulfate d’ammonium

REMARQUE: La précipitation du sulfate d’ammonium est une méthode de purification des protéines en modifiant la solubilité de la protéine. Dans une expérience préliminaire, la concentration de sulfate d’ammonium est augmentée séquentiellement à une valeur qui précipite une quantité maximale de contaminants protéiques, tout en laissant FAHD1 en solution. La solubilité de la protéine est à nouveau sondée par l’analyse par transfert de Western.

  1. Procéder à l’étape 2.3 : soit décongeler une aliquote de l’échantillon, soit procéder directement après l’extraction des protéines (c.-à-d. sans congeler l’échantillon). Filtrer l’échantillon à l’aide d’une unité de filtration de 0,22 μm pour exclure les précipités possibles après décongélation. Préparer six tubes de 1,5 mL sur de la glace et transférer 250 μL d’échantillon dans chaque tube.
  2. Préparer une série de dilution de 5%, 10%, 15%, 20%, 25% et 30% de sulfate d’ammonium dans les tubes préparés ci-dessus, et porter le volume final à 1000 μL avec un tampon de lyse des protéines. Incuber les échantillons à 4 °C pendant la nuit sur un rotateur tubulaire (voir tableau des matériaux).
  3. À l’aide d’une centrifugeuse de table, centrifuger à 10 000 x g pendant 30 min à 4 °C et transférer soigneusement tous les surnageants dans des tubes séparés. Sécher à l’air libre les granulés résultants et remettre en suspension chacune d’elles dans 1000 μL de ddH2O.
  4. Pour chaque paire de granulés et de surnageants remis en suspension de l’étape précédente, mélanger 40 μL avec 10 μL de tampon d’échantillon 5x SDS et faire bouillir à 95 °C avec les couvercles ouverts jusqu’à ce que la majeure partie du liquide se soit vaporisée. Ensuite, remettez en suspension la pastille dans un mélange de 50% de DMSO dans ddH2O.
  5. Effectuez SDS-PAGE (étape 3) mais exécutez les gels à 80 V pendant 3 h. Pour chaque concentration de sulfate d’ammonium, charger les échantillons dérivés de la pastille remise en suspension et du surnageant (étape 4.3) par paires. Effectuez une analyse western blot (étape 3).
  6. Vérifiez la concentration la plus élevée de sulfate d’ammonium, à laquelle la protéine à purifier (c.-à-d. FAHD1) reste dans l’échantillon dérivé du surnageant. Sur la base des résultats, définir un protocole de précipitation de sulfate d’ammonium pour la protéine d’intérêt, à utiliser dans de futures expériences.
    REMARQUE: Le sulfate d’ammonium est bien connu pour déformer SDS-PAGE et Western Blot. À mesure que la concentration de sulfate d’ammonium augmente, la qualité de l’analyse par transfert western sera compromise. Cependant, comme à l’étape 3 précédente, cette analyse est utilisée pour vérifier la solubilité de la protéine d’intérêt à des concentrations données de sulfate d’ammonium. Ce protocole vise à précipiter d’autres protéines, tandis que la protéine à purifier doit rester soluble.

5. Essais : chromatographie par échange ionique avec FPLC

REMARQUE: Les molécules avec des groupes fonctionnels chargés sont liées à une colonne de particules de silice pour FPLC, permettant la différenciation des protéines en fonction de leur charge de surface. Effectuez cette étape deux fois, à l’aide de la colonne d’échange cationique et de la colonne d’échange anionique (voir Tableau des matériaux). Les étapes du protocole sont les mêmes pour la chromatographie cationique ou anionique, mais les tampons à utiliser sont différents (voir tableau 1); les deux avec des conditions de NaCl « faible teneur en sel » de 15 mM et de « sel élevé » de 1 M NaCl. Pour les colonnes utilisées, un débit de 1 mL/min est recommandé.

  1. Configurez le système FPLC avec la colonne d’échange anionique ou cationique. Laver la colonne avec 5 volumes de colonne (CV) de 20% EtOH (enH2O), suivi de 5 CV de ddH2O. Alternativement, laver la colonne avec 1 CV de tampon à faible teneur en sel, un tampon à haute teneur en sel et à nouveau un tampon à faible teneur en sel dans l’ordre jusqu’à ce qu’aucun autre pic ne soit observé dans le chromatogramme, mais lavez au moins une fois.
  2. Après avoir déterminé le protocole optimal pour la précipitation du sulfate d’ammonium à petite échelle (étape 4), appliquez le protocole de précipitation à 10 mL d’homogénat tissulaire d’origine (étape 2). En option, dialysez l’échantillon par rapport au tampon à faible teneur en sel.
    1. Appliquez l’échantillon sur la colonne (p. ex., par injection ou à l’aide d’une pompe à échantillon) et prélevez le débit. Lavez la colonne avec 1 CV du tampon à faible teneur en sel.
  3. Mettez en place une élution à gradient linéaire de 100% de tampon à faible teneur en sel / 0% de tampon à sel élevé à 0% de tampon à faible teneur en sel / 100% de tampon à sel élevé dans 3 CV. Collectez en continu des fractions de 1 mL. Une fois le gradient terminé, continuez à fonctionner avec le tampon de sel élevé jusqu’à ce qu’aucun autre pic associé aux protéines (absorption UV à 280/255 nm) ne soit détecté dans le chromatogramme sur la plage de 1 CV.
  4. Appliquer 1 mL de FDS à 25 % dissous dans 0,5 M de NaOH (en ddH2O) pour nettoyer la colonne. Lavez consécutivement la colonne avec 3 CV de ddH2O et 3 CV de 20% EtOH (en ddH2O).
  5. Prélever des échantillons SDS-PAGE de toutes les fractions de crête et de l’écoulement, et les sonder via le transfert Western pour détecter la présence de la protéine d’intérêt (étape 3). Congeler les fractions collectées dans de l’azote liquide et les stocker à -80 °C.
  6. Une fois l’analyse par transfert western terminée, décongeler et mettre en commun les fractions contenant la protéine d’intérêt et jeter les autres. Répétez les étapes 5.1 à 5.5 avec la colonne alternative (c.-à-d. colonne d’échange cationique ou anionique).
  7. Une fois les deux colonnes sondées, définissez un protocole FPLC pour la protéine d’intérêt, à utiliser dans de futures expériences. Réduire le volume de la solution protéique à l’aide d’unités de filtration ultra-centrifugation (10 kDa, voir Tableau des matériaux) jusqu’à 2 mL.
    NOTE: Il y a deux résultats attendus de cette série d’expériences. Soit la protéine d’intérêt s’est attachée à l’une des colonnes, et la solution protéique est déjà assez pure après l’élution, soit la protéine est restée dans le flux dans les deux cas. Dans ce dernier scénario, bien que la protéine soit dans le flux, l’effet nettoyant de cette étape peut encore être significatif. Dans un tel cas, comme pour FAHD1 dans le rein porcin et le foie de souris, cette étape d’échange ionique sera toujours effectuée. Si ni la colonne d’échange cationique ni la colonne d’échange anionique ne peuvent fournir un effet de nettoyage approprié, on peut essayer de modifier le pH du lysat et du tampon, et de dialyser l’échantillon par rapport au tampon en cours d’exécution avant l’application sur FPLC.

6. Extraction des protéines à l’aide de sous-protocoles définis pour la précipitation du sulfate d’ammonium et la FPLC

NOTE: Les particules poreuses dans une colonne de gel de silice pour FPLC (Voir Tableau des matériaux) permettent la différenciation des protéines en fonction de leur rayon hydrodynamique. Les étapes décrites doivent être effectuées avec un système FPLC, en utilisant la chromatographie d’exclusion de taille (SEC). Pour la colonne SEC utilisée (voir Tableau des matériaux), un débit de 0,3 mL/min est recommandé.

  1. Préparez tous les matériaux nécessaires (voir l’étape 1) et extrayez la protéine totale du tissu (voir l’étape 2). Effectuer une précipitation de sulfate d’ammonium avec tout l’homogénat tissulaire qui n’a pas été utilisé pour les tests (voir étape 4). Pour les plus grands volumes, concentrez le lysat à l’aide d’unités de filtration ultracentrifugation (10 kDa; voir Tableau des matériaux) jusqu’à un volume plus petit de 50 mL ou moins.
  2. Effectuer une première étape de purification à l’aide de la chromatographie par échange ionique (voir étape 5).
    1. Préparez des échantillons pour le transfert Western, comme décrit dans les étapes précédentes. Effectuer une analyse par transfert western et regrouper toutes les fractions contenant faHD1 provenant de la chromatographie par échange ionique.
    2. Réduire le volume de la solution protéique jusqu’à 2 mL à l’aide d’unités de filtration ultracentrifugation (10 kDa). Filtrer séquentiellement la solution avec des unités de filtration de seringue de 0,45 μm et 0,22 μm pour éliminer toute microprécipline.
  3. Équilibrez la colonne SEC avec 1 CV de tampon d’exécution SEC (voir Tableau 1), contenant 1 mM TNT. Chargez l’échantillon sur la colonne et exécutez la chromatographie jusqu’à ce que toutes les protéines soient éluées (1-2 CV).
    1. Prélever des fractions de 1 mL de l’écoulement qui correspondent à des pics significatifs dans le chromatogramme (absorption UV à 280/255 nm) et préparer des échantillons de 50 μL de chaque fraction collectée pour l’analyse SDS-PAGE et Western blot, comme décrit dans les étapes précédentes. Congelez toutes les fractions à l’aide d’azote liquide et stockez-les à -80 °C.
  4. Laver consécutivement la colonne SEC avec 1 CV de ddH2O et 1 CV de 20% EtOH (en ddH2O). Effectuez une analyse Western-Blot et regroupez toutes les fractions contenant FAHD1. Réduire le volume de la solution protéique jusqu’à 2 mL à l’aide d’unités de filtration à ultracentrifugation (10 kDa, voir tableau des matériaux).
  5. Évaluer la concentration en protéines à l’aide d’une trousse commerciale d’analyse de l’ACB (voir tableau des matériaux).
    REMARQUE: Le pH et la teneur en sel de la phase mobile peuvent influencer le profil d’élution des protéines globulaires20. Les conditions acides ou basiques peuvent entraîner une diminution de la définition des pics et une augmentation des interactions protéine-matrice conduisant à une rétention partielle des protéines sur la colonne20. Cet effet peut être exploité pour une purification ultérieure des protéines. Une répétition de l’étape 6 avec des débits, des pH et des concentrations de sel différents peut améliorer la pureté de la protéine20.

7. Coloration à l’argent

REMARQUE: L’analyse de la coloration à l’argent des gels SDS-PAGE est nécessaire pour vérifier les contaminations protéiques qui peuvent ne pas être observées avec la coloration de Coomassie. Le protocole suivant est l’une des nombreuses versions que l’on peut trouver dans la littérature21. Effectuez toutes les étapes d’incubation en secouant dans un plateau en verre propre. Recueillir tous les liquides contenant de l’argent et du formaldéhyde dans un conteneur à déchets spéciaux et les jeter correctement.

  1. Incuber les gels SDS-PAGE dans une solution de fixation de coloration à l’argent (voir tableau 1) pendant la nuit dans la chambre froide. Incuber les gels dans une solution d’incubation de coloration à l’argent (voir tableau 1) pendant 3 h à température ambiante. Éventuellement, ajouter du glutaraldéhyde (voir tableau 1) pour améliorer la détection des bandes faibles. Laver les gels quatre fois dans ddH2O pendant 10 min chacun.
  2. Incuber les gels dans une solution d’argent colorant à l’argent (voir tableau 1) pendant 1 h.
    REMARQUE: Gardez à l’esprit qu’à partir de maintenant, tous les liquides et le gel lui-même contiennent de l’argent et du formaldéhyde qui sont toxiques.
  3. Incuber les gels dans une solution de révélateur de coloration à l’argent (voir tableau 1) en agitant vigoureusement jusqu’à ce que les bandes soient clairement visibles. Pour arrêter la réaction, jeter la solution de développement et incuber immédiatement les gels dans une solution d’arrêt de coloration à l’argent (voir tableau 1) pendant au moins 10 min.
    REMARQUE: Les bandes colorées dans les étapes 7.2 et 7.3 deviendront constamment plus développées. L’ajout de plus de formaldéhyde à la solution que prévu peut être nécessaire si la coloration est faible.

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Representative Results

La protéine FAHD1 a été extraite du rein du porc et du foie de souris à l’aide du protocole présenté. Pour les tissus de souris, plusieurs organes sont nécessaires pour obtenir plusieurs μg après l’étape finale de purification. Pour cette raison, cet article se concentre sur l’extraction de FAHD1 à partir de reins de porcs, ce qui est une expérience beaucoup plus exemplaire. L’extraction de FAHD1 du foie de souris est effectuée pour présenter les difficultés et les pièges possibles de ce protocole. Il est généralement recommandé d’utiliser des organes qui présentent un niveau d’expression élevé de la protéine que l’on veut purifier. L’Atlas des protéines humaines22 peut être utile pour estimer l’expression dans le système modèle, ou on peut effectuer des expériences préliminaires de transfert de Western avec différents lysats de tissus bruts pour évaluer ces niveaux. Le témoin positif utilisé dans toutes les analyses par transfert western était une protéine recombinante marquée, fonctionnant à un poids moléculaire légèrement plus élevé.

Comme première expérience, l’extraction de FAHD1 du rein porcin est présentée. Le processus d’homogénéisation des tissus (étape 1) et d’extraction des protéines totales (étape 2) est présenté à la figure supplémentaire 1 (voir la légende pour une description des différentes étapes). Un dixième aliquote du lysat total a été utilisé pour les expériences suivantes.

La précipitation du sulfate d’ammonium a été testée une fois pour ce lysat, en ajoutant du sulfate d’ammonium au lysat à différentes concentrations (étape 4) (figure 2). Après centrifugation, les granulés et les surnageants ont été échantillonnés et analysés par transfert western à l’aide d’un anticorps polyclonaldéfini 2 élevé contre le FAHD1 humain. 200 ng de FAHD1 humain recombinant marqué His/S obtenu à partir d’E. coli12 ont été chargés comme témoin positif. La bande protéique FAHD1 peut être observée à 25 kDa, tandis que le témoin positif marqué fonctionne à 34 kDa. Sur la base de ces données, un protocole a été défini où le lysat est traité avec du sulfate d’ammonium à 25%, c’est-à-dire des conditions dans lesquelles FAHD1 est toujours dans le surnageant, tandis que la majorité des autres protéines est précipitée. Il s’agit d’une étape majeure dans la stratégie de purification. La précipitation du sulfate d’ammonium est une étape de nettoyage efficace avant de procéder à d’autres méthodes. Il est à noter que des quantités de sulfate d’ammonium supérieures à 30% ne seront pas utilisées, car le sulfate d’ammonium fausse progressivement la qualité de SDS-PAGE et de Western Blot.

Figure 2
Figure 2 : Précipitation du sulfate d’ammonium et dépistage par transfert western pour le PORC FAHD1. (A) Du sulfate d’ammonium a été ajouté au lysat à différentes concentrations (5 % à 25 % maximum) pour précipiter les protéines de la solution. (B) La présence de FAHD1 porcin (25 kDa) a été déterminée dans les paires individuelles de granulés et de surnageant correspondant à des concentrations variables de sulfate d’ammonium par transfert western à l’aide d’un anticorps polyclonal élevé contre le FAHD1 humain. Le surnageant correspondant à 25% de précipitation de sulfate d’ammonium montre toujours la présence de FAHD1 porcin dans le surnageant, précipitant en même temps une bonne quantité d’autres protéines. 200 ng de protéine recombinante marquée His/S ont été chargées en tant que témoin positif (34 kDa). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Après avoir testé des colonnes d’échange ionique avec FPLC, une stratégie a été définie où le FAHD1 porcin reste dans l’écoulement d’une chromatographie d’échange anionique à pH 9 (étape 5). En commençant par le lysat obtenu par précipitation de sulfate d’ammonium à 25% (tel que défini par des expériences d’essai précédentes), la chromatographie par échange anionique a été utilisée pour éliminer d’autres protéines de la solution (Figure 3A). Les protéines de liaison ont été éliminées par élution de la colonne, tandis que l’écoulement a été purifié par SEC à un pH de 7,4 (figure 3B). En suivant les deux étapes, l’analyse par transfert western a permis d’identifier toutes les fractions contenant du FAHD1 porcin, qui ont été regroupées et concentrées à 2 mL.

Figure 3
Figure 3 : Purification du FAHD1 porcin avec FPLC - partie 1. Des flèches rouges dans le chromatogramme et des taches indiquent la présence de FAHD1. Dans le chromatogramme, « UV » désigne l’absorption UV à 280 nm, « Cond » indique la conductivité (liée à la concentration de sel dans le tampon) et « Conc B » indique le pourcentage de tampon à sel élevé dans le gradient tampon (0% de tampon pur à faible teneur en sel; 100% de tampon de sel pur à haute teneur en sel). (A) Purification du FAHD1 porcin à partir de lysat obtenu par précipitation de sulfate d’ammonium à 25 % avec une colonne d’échange anionique (FPLC). Alors que de nombreuses protéines se lient à la colonne, le porc FAHD1 se trouve dans le flux. Les contaminants sales et non protéiques sont éliminés par élution de la colonne, tandis que l’écoulement est traité ultérieurement. (B) L’écoulement de la chromatographie par échange anionique précédente en (A) est ensuite purifié par chromatographie d’exclusion de taille (FPLC) à pH 7,4. (A,B) L’analyse par transfert western (taches recadrées au fond) a permis d’identifier des fractions contenant du FAHD1 porcin, qui sont regroupées et concentrées. Les taches complètes représentent la membrane tachée de Coomassie après l’analyse par transfert de Western. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’échantillon filtré a été appliqué à nouveau à la SEC, mais dans des conditions tampons à pH 9 (voir tableau 1) (figure 4). La raison d’être de cette approche est que le pH et la teneur en sel de la phase mobile peuvent influencer le profil d’élution des protéines globulaires20, et un profil d’élution amélioré pour FAHD1 a été trouvé dans ces conditions tampons. Une fraction contenait des protéines de pureté adéquates pour les tests d’activité enzymatique de base12 pour finalement confirmer l’identité de la protéine.

Figure 4
Figure 4 : Purification du FAHD1 porcin avec FPLC - partie 2. Des flèches rouges dans le chromatogramme et des taches indiquent la présence de FAHD1. Les échantillons de protéines préalablement purifiés par échange anionique et chromatographie d’exclusion de taille sont ensuite purifiés par chromatographie d’exclusion de taille (FPLC) à pH 9 (panneau supérieur). L’analyse par transfert western représentée en bas à droite identifie les fractions qui contiennent du FAHD1 porcin, qui sont regroupées et concentrées (panneaux inférieurs). La tache en bas à gauche montre la coloration de Coomassie de la membrane après le transfert western. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Une autre stratégie (c.-à-d. SEC suivie d’une chromatographie par échange ionique) a été mise à l’essai avec 2 mL de lysat obtenu après précipitation du sulfate d’ammonium (étape 4) (figure supplémentaire 2). La raison d’être de cette expérience est qu’en utilisant d’abord SEC, les fractions contenant FAHD1 peuvent être séparées de la majorité des autres protéines, tandis qu’une chromatographie d’échange ionique ultérieure peut être utilisée pour purifier davantage la protéine. Tout d’abord, le lysat a été fractionné à l’aide de SEC à un pH de 7,4 (étape 6). L’analyse par transfert western a permis d’identifier toutes les fractions contenant du FAHD1 porcin. Deuxièmement, ces fractions ont été concentrées et purifiées à l’aide d’une colonne d’échange anionique à pH 9 (étape 5). Les chromatogrammes et l’analyse par transfert de Western (figure supplémentaire 2) montrent que cette stratégie est encourageante parce que le chromatogramme d’échange ionique montre un pic étroit défini qui est associé à des niveaux de protéines enrichies dans le transfert de Western. Cependant, l’inconvénient de cette stratégie est qu’elle est limitée par le volume initial à appliquer sur le SEC (2 mL), de sorte que le débit de cette méthode est très faible. Le traitement d’un rein de porc entier, par exemple, n’est pas pratique.

Comme autre modification de ce protocole, une colonne d’échange cationique a été incluse avant la colonne d’échange anionique lorsque le porc FAHD1 était également présent dans le flux. À chaque étape du protocole, des échantillons de fractions de faHD1 porcines ont été échantillonnés et analysés à l’aide d’un essai ODx, tel que décrit ailleurs12 (figure supplémentaire 3). L’activité enzymatique spécifique augmente avec le niveau de pureté, c’est-à-dire avec l’augmentation de la quantité relative de FAHD1 par protéine totale.

Comme deuxième exemple, l’extraction de FAHD1 à partir du foie de souris, c’est-à-dire une collection de tissu hépatique obtenue à partir de 20 souris, est présentée. Comparée à l’extraction de FAHD1 du rein de porc présentée ci-dessus, cette extraction s’est avérée plus fastidieuse. Des problèmes ont été rencontrés à plusieurs étapes du protocole, qui seront présentées ci-dessous. La protéine totale a été extraite comme décrit à l’étape 2 (figure supplémentaire 4). Comme l’homogénat du foie de souris a tendance à être une entité très collante et visqueuse, des papiers filtres (similaires aux unités de filtre à café) ont été utilisés pour préfiltrer le lysat, qui a été dilué 1: 3 dans un tampon de lyse après extraction, pour rendre la solution plus semblable à un liquide. Cette dilution a amélioré la procédure de filtration; cependant, cela a rendu la détection ultérieure de la protéine avec western blot plus fastidieuse. Après filtration, le lysat préparé devait être concentré avant une utilisation ultérieure. Un dixième aliquote du lysat total a été utilisé pour les expériences suivantes.

Une première étape d’essai pour la précipitation du sulfate d’ammonium (figure supplémentaire 4I) a montré un problème possible qui pourrait être rencontré. Le sulfate d’ammonium à des concentrations plus élevées perturbe les gels SDS-PAGE et provoque un effet de sourire lorsqu’il est exécuté à 150 V (figure supplémentaire 5A; résultat négatif). La même SDS-PAGE exécutée à 80 V affiche un résultat positif (Figure supplémentaire 5B). Dans ce dernier cas, l’effet sourire se forme initialement mais est finalement résolu en raison de la tension plus faible appliquée. Comme la solution initiale devait être fortement diluée pour pouvoir filtrer le lysat, l’analyse initiale par transfert western de ces échantillons a échoué, c’est-à-dire que le contrôle positif a été détecté par l’anticorps, mais pas la protéine dans les échantillons appliqués. Ce problème a été résolu en utilisant une concentration plus élevée de lysat (concentré à l’aide d’unités de filtre centrifuge) et d’anticorps, et en appliquant l’anticorps pendant la nuit dans la chambre froide tout en secouant. En fin de compte, l’analyse par transfert de Western a fourni à la fois des éléments d’information selon lesquels la protéine était présente dans le lysat et que la protéine était toujours présente dans le surnageant à 15 % de sulfate d’ammonium (figure supplémentaire 5C). Il convient de noter que les échantillons de FDS contenant des quantités plus élevées de sulfate d’ammonium (>15%) ont précipité pendant le chauffage et que la protéine a été perdue. Cela peut également être vu dans la coloration de Coomassie et le transfert de Western (figure supplémentaire 5C). Cet effet n’a pas été observé pour le rein du porc, il peut donc être spécifique au tissu.

Après précipitation du sulfate d’ammonium à 15 %, 10 mL de lysat ont été appliqués à la chromatographie par échange cationique à un pH de 6,8. L’analyse par transfert Western a montré que la protéine FAHD1 de la souris se trouvait dans le flux (Figure 5A). La fraction protéique éluée semble être mineure; cependant, cet exemple montre un effet secondaire de la chromatographie par échange ionique. À cette étape du protocole, la solution peut encore contenir de nombreux composés qui pourraient ne pas être des protéines. La chromatographie par échange ionique est un moyen rapide et facile de se débarrasser de telles contaminations. Étant donné que la chromatographie par échange ionique prend quelques heures à effectuer (y compris toutes les étapes de lavage, l’expérience elle-même prend une demi-heure), elle fournit une méthode simple pour nettoyer l’échantillon des contaminations non protéiques.

Figure 5
Figure 5 : Purification de la souris FAHD1 avec FPLC. Des flèches rouges dans le chromatogramme et des taches indiquent la présence de FAHD1. (A) Après précipitation de sulfate d’ammonium à 15 %, l’échantillon a été centrifugé, filtré (0,22 μm) et appliqué sur une colonne d’échange cationique. L’analyse par transfert western montre que la protéine est dans le flux et le chromatogramme montre que peu d’autres protéines ont été éliminées par cette étape. Cependant, la comparaison de l’apparence et de la viscosité de l’entrée avec l’écoulement direct montre que le flux collecté est beaucoup plus clair (panneau de droite comparant l’entrée et le flux). B) L’écoulement recueilli dans la colonne d’échange cationique a été réduit à 2 mL au moyen de filtres de centrifugation et appliqué à la chromatographie d’exclusion granulométrique à pH 7,4. (C) Les fractions contenant du FAHD1 ont été regroupées, concentrées et appliquées à une deuxième série de chromatographies d’exclusion granulométrique à pH 9. (D) Les fractions contenant du FAHD1 ont de nouveau été regroupées et appliquées sur la FDS-PAGE avec coloration à l’argent, pour voir les contaminations restantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’échantillon a ensuite été appliqué à la chromatographie d’exclusion de taille à pH 7,4 (figure 5B). L’analyse par transfert Western a montré des fractions contenant la protéine FAHD1 de la souris, qui ont été regroupées et concentrées à 2 mL. Ce concentré de 2 mL a été congelé à -20 °C avec 10 μL de β-mercaptoéthanol et décongelé le lendemain. Un précipité a été formé qui a été filtré via des unités de filtre à seringue (0,22 μm). Des échantillons pour l’analyse SDS-PAGE et Western Blot ont été prélevés pour s’assurer que la protéine FAHD1 de souris était toujours en solution.

Les échantillons contenant la protéine (provenant de l’analyse par transfert western) ont été regroupés, concentrés via des filtres de centrifugation et appliqués sur SDS-PAGE avec une coloration à l’argent pour voir les contaminations restantes (figure 5D). Cela a révélé que la solution protéique n’est pas très pure et que les quantités de protéines obtenues par cette méthode à partir du foie de souris n’étaient pas très élevées non plus (quelques μg au total tels que déterminés à l’aide du kit de dosage BCA; voir Tableau des matériaux). Le rendement en protéines était beaucoup plus élevé dans le cas du porc FAHD1 (environ 1 mg dans cette étape). Le niveau de pureté de la protéine FAHD1 extraite du rein du porc est d’environ 80% (estimé après coloration à l’argent; données non montrées). Cette pureté peut être encore augmentée par, par exemple, la chromatographie d’affinité à l’aide d’un anticorps défini. Ces limitations et d’autres de ce protocole seront discutées en détail ci-dessous.

Nom du tampon/solution/matériau Composition
Solution de décoloration Coomassie 30 % (v/v) EtOH; 5 % (v/v) HOAc; en ddH2O
Solution de coloration Coomassie 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250; 50 % (v/v) MeOH; 10 % (v/v) HOAc; en ddH2O
Tampon mono Q à haute teneur en sel 20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % de glycérol; en ddH2O; ajuster le pH à 9,0 avec NaOH
Mono Q tampon à faible teneur en sel 20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; en ddH2O; ajuster le pH à 9,0 avec NaOH
Mono S tampon à haute teneur en sel 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1 M NaCl; en ddH2O; ajuster le pH à 6,8 avec HCl
Mono S tampon à faible teneur en sel 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 15 mM NaCl; en ddH2O; ajuster le pH à 6,8 avec HCl
Tampon de lyse des protéines 1x PBS (250 mL); 50 mM NaF; 1mM PMSF; 2 μg/mL d’aprotinine, 1 mM d’orthovanadate activé; en ddH2O
Anticorps polyclonal anti-hFAHD1 de lapin (isolé par affinité) Fait sur mesure; anticorps polyclonal anti-hFAHD1 purifié à partir de sérum de lapin et purifié avec FPLC selon la référence 12
Contrôle du transfert western de la protéine hFAHD1 recombinante Protéine de contrôle western blot exprimée dans E. coli et purifiée avec FPLC selon la référence 12.
Exemple de tampon SDS-PAGE 5x 300 mM Tris HCl; 500 mM DDT; 10 % (p/v) FDS; 50% (v / v) glycérine; 0,05 % (p/v) de bleu de bromophénol; en ddH2O; ajuster le pH à 6,8 avec HCl
Gel résolvant SDS-PAGE (12,5 %) pour PAGE discontinu ddH2O (9,5 mL); 3 M Tris HCl (2,2 mL); 5,5 mL de solution d’acrylamide/bis à 40 % (rapport 29:1); 20 % de FDS (175 μL); TEMED (17 μL); 10 % de persulfate d’ammonium (175 μL); couler avant le gel empilable et le laisser polymériser; jeter le gel empilable sur le dessus
SDS-PAGE en cours d’exécution de la mémoire tampon 25 mM Tris HCl; 190 mM de glycine; 0,5 % (p/v) FDS; en ddH2O; ajuster le pH à 8,3 avec NaOH
Gel empilable SDS-PAGE (12,5 %) pour PAGE discontinu ddH2O (3,8 mL); 1 M Tris HCl (630 μL); 500 μL de solution d’acrylamide/bis à 40 % (ration 29:1); 20 % de FDS (25 μL); TEMED (5 μL); 10 % de persulfate d’ammonium (50 μL); coulé après que le gel de résolution a polymérisé; appliquer un peigne en gel pour créer des puits
SEC (G75) en cours d’exécution de la mémoire tampon 15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; en ddH2O; ajuster le pH à 7,4 avec NaOH
Solution de développement de coloration à l’argent 250 mM Na2CO3 dans ddH2O; ajouter 12 μL de formaldéhyde à 37 % (v/v) à 100 mL avant utilisation
Solution de fixation de coloration à l’argent 40 % (v/v) EtOH; 10 % (v/v) HOAc; en ddH2O
Solution d’incubation de coloration à l’argent 30 % (v/v) EtOH; 500 mM NaOAc; 8 mM Na2S2O3; en ddH2O; facultatif : ajouter 600 μL de glutaraldéhyde à 50 % (v/v) par 100 mL avant utilisation
Solution d’argent colorant l’argent 0,1 % (p/v) AgNO3; en ddH2O; ajouter 25 μL de formaldéhyde à 37 % (v/v) à 100 mL avant utilisation
Solution d’arrêt de coloration à l’argent Solution d’EDTA de 40 mM à pH 7,6; transférer 744 mg d’EDTA dans 40 mL de ddH2O, puis ajouter du NaOH pour dissoudre et ajuster le pH à 7,6. Enfin, réglez le volume total à 50 mL.
Tampon de blocage western blot PBS avec 0,1 % (v/v) Tween 20 et 5 % (p/v) de lait écrémé en poudre; filtré
Tampon de transfert Western Blot (10x) Tris-HCl 250 mM; glycine 1,92 M; en ddH2O; ajuster le pH à 8,3 avec NaOH; conserver à température ambiante
Tampon de transfert Western Blot (1x) Tampon de transfert Western blot (10x) 100 mL; 800 mL de ddH2O; 100 mL de MeOH; conserver à 4 °C
Tampon de lavage western blot (PBS-T) PBS avec 0,1 % (v/v) Tween 20

Tableau 1.

Figure supplémentaire 1 : Extraction totale des protéines du rein porcin. (A) Le tissu rénal a été coupé à l’aide d’un scalpel sur une plaque de verre préparée et correctement nettoyée, placée sur de la mousse de polystyrène pour éviter le glissement; B) des tubes de 50 mL contenant 20 mL de tampon de lyse glacée avec des inhibiteurs de protéines/protéases sont incubés sur de la glace; C) des morceaux de tissu rénal ont été placés dans le tampon jusqu’à ce que le volume atteigne environ 30 mL; (D) le tissu rénal a été homogénéisé à l’aide d’ultrasons (c.-à-d. sonication); E) l’homogénat brut a été centrifugé dans une centrifugeuse de table à vitesse moyenne pendant 30 min; F) plusieurs échantillons ont été traités simultanément; G) après la première centrifugation, le surnageant a été transféré dans des tubes centrifuges (par rapport à E) et centrifugé à grande vitesse (10 000 x g) pendant 30 min; H) cette étape de centrifugation donne une autre pastille et un surnageant, qui sont transférés dans des tubes de 50 mL; (I/J) le pré-lysat est filtré séquentiellement par des unités filtrantes de 0,45 μm et 0,2 μm, aliquote en lots de 10 mL et congelé avec de l’azote liquide pour être ensuite stocké à -80 °C. L’analyse par transfert Western est utilisée pour vérifier la présence de la protéine dans tous les échantillons (granulés, surnageants, lysat filtré). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Purification du FAHD1 porcin avec FPLC ; stratégie alternative. Des flèches rouges dans le chromatogramme et des taches indiquent la présence de FAHD1. (A) Purification du FAHD1 porcin à partir de lysat obtenu par précipitation de sulfate d’ammonium à 25 % avec chromatographie d’exclusion granulométrique (FPLC) à pH 7,4. L’analyse par transfert western a permis d’identifier les fractions qui contiennent du FAHD1 porcin, qui ont été regroupées et concentrées. (B) Les échantillons de protéines précédemment purifiés par chromatographie d’exclusion de taille (panneau A) ont ensuite été purifiés par chromatographie par échange anionique (FPLC). L’analyse par transfert western identifie les fractions qui contiennent du FAHD1 porcin, qui ont été regroupées et concentrées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : Activité enzymatique spécifique du porc FAHD1. Mesure de l’activité enzymatique spécifique en fonction de l’augmentation du niveau de pureté. Le tableau compare l’activité enzymatique relative (nmol/min) avec l’activité enzymatique spécifique (μmol/min/mg). Le test montre une activité en constante augmentation du porc FAHD1 après chaque étape de purification. Par rapport au FAHD1 recombinant His/S-humain (vert) obtenu à partir d’E. coli. 12, le porc FAHD1 a montré une activité légèrement plus élevée (rouge) (n = 3). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 4 : Extraction totale de protéines du foie de souris. (A, B, C) Le tissu hépatique surgelé de 20 souris et le tampon de lyse ont été préparés sur de la glace dans des tubes de 50 ml; (D,E,F) le tissu hépatique a été homogénéisé à l’aide d’ultrasons (c.-à-d. sonication); l’homogénat brut a été centrifugé dans une centrifugeuse de table à vitesse moyenne pendant 30 minutes; le surnageant a été transféré dans des tubes centrifuges et centrifugé à grande vitesse (10 000 x g) pendant 30 min; (G,H,I) le pré-lysat est filtré séquentiellement par des filtres en papier, des unités de filtration de 0,45 μm et 0,2 μm, aliquotes en lots de 10 mL, et congelés avec de l’azote liquide pour être ensuite stockés à -80 °C; J) du sulfate d’ammonium a été ajouté au lysat à différentes concentrations (5 % à 30 % maximum) pour précipiter la protéine de la solution; (K) les pastilles obtenues après précipitation de sulfate d’ammonium (panneau J) ont été remises en suspension dans H2O pour prélever des échantillons en vue de l’analyse SDS-PAGE et western blot. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 5 : Précipitation du sulfate d’ammonium et dépistage par transfert western pour la souris FAHD1. Des flèches rouges dans les taches indiquent la présence de FAHD1. (A) FDS-PAGE avec des échantillons obtenus après précipitation de sulfate d’ammonium à 125 V. Ce gel a montré un effet de sourire drastique, et un tel gel ne peut pas être évalué. Ceci est un exemple de résultat négatif. (B) SDS-PAGE avec les mêmes échantillons (panneau A) a été exécuté à 80 V jusqu’à ce qu’il soit terminé. Il n’y a pas d’effet sourire dans ce gel, et c’est un exemple de résultat positif. (C) SDS PAGE et analyse par transfert western des échantillons obtenus après précipitation de sulfate d’ammonium. Les échantillons à des concentrations plus élevées de sulfate d’ammonium peuvent précipiter à l’intérieur du tampon de l’échantillon, comme indiqué. Ils sont perdus et ne peuvent plus être détectés, que ce soit par coloration de Coomassie (à gauche) ou par analyse par transfert western (à droite). La meilleure concentration de sulfate d’ammonium, dans ce cas, a été déterminée à 15%. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Étapes critiques du protocole
Il est essentiel de suivre les directives communes pour la manipulation des protéines, comme le travail sur la glace et à des conditions de pH et de sel modérées. L’utilisation d’inhibiteurs de la protéase est bénéfique pour la méthode, tandis que l’utilisation d’inhibiteurs du protéasome est fortement recommandée. La congélation et la décongélation de l’échantillon peuvent toujours entraîner une précipitation protéique (au moins partielle), de sorte que toute aliquote décongelée de lysat protéique initial (étape 2) doit être traitée en continu sans interruption. La centrifugation et la filtration après décongélation sont généralement recommandées pour éliminer la microprécipitation.

Le lysat protéique initial obtenu à partir d’un tissu contient encore de nombreuses substances en plus des protéines. Les colonnes de chromatographie par échange ionique peuvent être utilisées pour éliminer le lysat. Même si la protéine que l’on veut extraire ne se lie pas à la colonne d’échange ionique, le flux peut être beaucoup plus clair que la solution d’entrée et plus facile à traiter dans les étapes suivantes. Ceci est montré pour l’extraction de FAHD1 à partir de reins de souris (voir figure 5A).

Limitations et modifications de la méthode
Ce protocole décrit un protocole pour l’extraction de FAHD1 du tissu. Sur la base de cette stratégie, une approche générale pour l’extraction des protéines FAHD (FAHD1, FAHD2) d’autres tissus peut être dérivée, tandis que des adaptations spécifiques peuvent être nécessaires pour des cas individuels. La limitation implicite de cette méthode est les niveaux d’expression relatifs de FAHD1 (ou protéines FAHD) dans un tissu donné et la disponibilité de ce tissu en quantités adéquates. Le schéma global décrit dans ce protocole nécessite une expression élevée de la protéine dans une quantité appropriée de tissu pour commencer. Des exemples d’extraction de FAHD1 du rein de porc et du foie de souris ont été fournis, qui sont deux organes qui présentent des niveaux d’expression élevés de la protéine. À chaque étape décrite dans ce protocole, il y a une perte implicite d’échantillon, c’est-à-dire que la faible quantité initiale de protéines est encore diminuée. En fin de compte, seules de faibles quantités de protéines peuvent être obtenues en utilisant ce protocole. Parce que le rein du porc est un gros organe, environ un gramme de protéine (environ 80% de pureté; estimé) pourrait être extrait par cette approche de deux reins. L’application du même protocole pour l’extraction de FAHD1 à partir du foie de souris a nécessité de prélever des échantillons de foie sur 20 souris, pour obtenir seulement quelques μg de protéines au final. Obtenir une plus grande pureté de la protéine en utilisant les méthodes décrites peut être fastidieux, et la coloration à l’argent révèle qu’après la chromatographie d’exclusion de taille, il pourrait encore y avoir beaucoup d’autres protéines en solution. On pourrait augmenter ce protocole par chromatographie d’affinité (colonnes activées par le NHS), en utilisant un anticorps monoclonal (par exemple, CAB025530).

Tous les protocoles énumérés ici nécessitent que la protéine que l’on veut extraire soit soluble. Les conditions optimales de précipitation du sulfate d’ammonium et les ajustements pH/sel pour la chromatographie doivent être testés et définis. Dans le cas où la chromatographie par échange ionique ne fournit pas de bons résultats de purification, la dialyse contre un tampon de chromatographie avant d’effectuer FPLC peut être une option pour améliorer la solubilité de la protéine et la résolution de la chromatographie. Il n’est pas recommandé, cependant, de dialyser le lysat brut, car cela peut entraîner une précipitation massive et incontrôlée des protéines à l’intérieur du tube de dialyse. Des problèmes peuvent survenir si la protéine a tendance à être hydrophobe, et les protocoles peuvent ne pas être applicables si la protéine est très hydrophobe (p. ex., protéines membranaires). Si les protéines FAHD sont partiellement insolubles comme on le trouve pour FAHD2 (données non présentées) dans un lysat tissulaire donné, d’autres types de chromatographie, par exemple la chromatographie par interaction hydrophobe (HIC) peuvent également être explorés12.

Deux modifications du protocole standard ont été présentées dans la section des résultats. Pour la purification de FAHD1 à partir d’un rein de porc, la chromatographie d’exclusion de taille a été utilisée avant la chromatographie par échange ionique (voir la figure supplémentaire 2). Un problème avec cette méthode est que la chromatographie d’exclusion de taille comporte des pistes de course plus grandes et que le volume de l’échantillon augmente fortement pendant l’exécution. Le volume de l’échantillon ne doit pas dépasser 2 % du volume du lit pour atteindre une résolution élevéede 23, et le facteur de dilution final dépend également du volume d’élution recueilli. Dans l’exemple fourni utilisant une colonne de 120 mL, un volume initial de 2 mL est recommandé. L’échantillon initial peut être prélevé sur plusieurs mL de lysat après précipitation du sulfate d’ammonium, par concentration à l’aide d’unités de filtration centrifuges, sans artefacts d’agrégation ou de précipitation. Un exemple de purification de FAHD1 à partir d’un rein de porc est fourni comme résultat représentatif (voir également la figure supplémentaire 2). Toutefois, la limitation à de petits volumes d’échantillons peut rendre cette approche peu pratique.

Applications ou orientations de la méthode
L’expression et la purification des protéines recombinantes à partir de bactéries est une méthode simple et bien établie, pour obtenir des quantités réalisables (en grammes) deprotéines 24,25. Ceci a été présenté pour FAHD112. Cependant, l’utilisation de ces méthodes présente plusieurs inconvénients possibles, tels qu’une mauvaise croissance possible de l’hôte, la formation du corps d’inclusion, la perte ou l’altération de l’activité protéique et, par conséquent, la possibilité de ne pas obtenir de protéine du tout, ou d’entraîner une forme biaisée de la protéine (mauvais repliement, mauvaises modifications post-traductionnelles, etc.). Développer des méthodes capables d’extraire directement des protéines bien repliées et correctement modifiées des tissus est donc attrayant. Le problème majeur, cependant, est que la plupart des protéines ne sont pas exprimées à des niveaux significatifs, et par rapport à l’induction implicite et à l’extraction ultérieure de protéines à partir de bactéries, la quantité de protéines à obtenir est généralement inférieure de plusieurs ordres de grandeur. Il existe un compromis entre l’extraction peu coûteuse et facile de protéines recombinantes à partir de bactéries et l’extraction plus coûteuse et fastidieuse de protéines de tissus. L’avancée majeure avec ce dernier est que l’on peut extraire la protéine sous sa forme physiologique qui est présente dans le tissu, y compris tous les effets mutuels qui peuvent avoir un impact sur son repliement et / ou son activité catalytique.

Les protéines extraites et purifiées par ce protocole aideront à identifier les inhibiteurs compétents de FAHD113, les partenaires d’interaction protéique possibles9 et les rôles possibles encore non découverts de la protéine9. L’étude des inhibiteurs enzymatiques, le développement d’anticorps monoclonaux et l’étude de la structure protéique en premier lieu sont grandement soutenus lorsque des protéines de haute pureté sont extraites des tissus plutôt que des bactéries.

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Disclosures

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Les auteurs sont très reconnaissants de l’assistance technique d’Ayse Öztürk et Eva Albertini. Les souris utilisées pour la génération de tissu hépatique ont été maintenues sous la supervision de Univ.-Doz. Dr Pidder Jansen-Dürr (Institut de recherche biomédicale sur le vieillissement de l’Université d’Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Autriche).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm filter units MERCK SLGP033RS Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, not steril
0.45 µm filter units MERCK SLHP033NS Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, not steril
15 mL Falcon tubes VWR 734-0451 centrifugal tubes
50 mL Falcon tubes VWR 734-0448 centrifugal tubes
96-Well UV Microplate Thermo-Fischer 8404 UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates
Acrylamide/Bis Solution (40%, 29:1 ratio) BIO-RAD #1610147 40% acrylamide/bis-acrylamide, 29:1 (3.3% crosslinker) solution for casting polyacrylamide gels
ÄKTA FPLC system GE Healthcare Life Sciences / Cytiva - using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the "ÄKTA pure" system
Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa MERCK UFC901024 centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 15 mL
Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa MERCK UFC801024 centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 4 mL
Ammonium sulfate powder MERCK A4418 ammonium sulphate for molecular biology, ≥99.0%
Ammoniumpersulfat reagent grade, 98% MERCK 215589 Catalyst for acrylamide gel polymerization.
Coomassie Brilliant blue R 250 MERCK 1125530025 Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) for electrophoresis Trademark of Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g/l, H2O, 25 °C)
Dialysis tubing cellulose membrane MERCK D9277 Cellulose membranes for the exchange of buffers via dialysis.
Eppendof tubes 1.5 mL VWR 525-1042 microcentrifugal tubes; autoclaved
HiLoad 26/600 Superdex 75 pg GE Healthcare Life Sciences / Cytiva 28989334 HiLoad Superdex 75 pg prepacked columns are for high-resolution size exclusion chromatography of recombinant proteins
Immun-Blot PVDF Membrane BIO-RAD #1620177 PVDF membranes are protein blotting membranes optimized for fluorescent and multiplex fluorescent applications.
Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell BIO-RAD #1703930 Use the Mini Trans-Blot Cell for rapid blotting of Mini-PROTEAN precast and handcast gels.
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels BIO-RAD #1658004 4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam.
Mono Q 10/100 GL GE Healthcare Life Sciences / Cytiva 17516701 Mono Q columns are strong anion exchange chromatography columns for protein analysis or small scale, high resolution polishing of proteins.
Mono S 10/100 GL GE Healthcare Life Sciences / Cytiva 17516901 Mono S columns are strong cation exchange chromatography columns for protein analysis or small scale high resolution polishing of proteins.
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa Thermo-Fischer 26616 A mixture of 10 blue-, orange-, and green-stained proteins (10 to 180 kDa) for use as size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting.
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo-Fischer 23225 A two-component, high-precision, detergent-compatible protein assay for determination of protein concentration.
Sonifier 250; Ultrasonic Cell Disruptor w/ Converter Branson - New models at https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf
Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (affinity isolated) Agilent Dako P0399 The antibody used for horseradish peroxidase conjugation reacts with rabbit immunoglobulins of all classes.
TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethane, TMEDA MERCK T9281 TEMED (N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine) is molecule which allows rapid polymerization of polyacrylamide gels.
Tube Roller - - A general tube rotator roller; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71
Tube Rotator - - A general tube rotator wheel; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123
ULTRA-TURRAX; T 25 digital IKA 0003725000 New models at https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/

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References

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Biochimie Numéro 180 FAHD FAHD1 oxaloacétate décarboxylase ODx tissu FPLC chromatographie extraction de protéines
Extraction et purification de la protéine FAHD1 du rein de porc et du foie de souris
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Andric, A., Wagner, E., Heberle, A., … More

Andric, A., Wagner, E., Heberle, A., Holzknecht, M., Weiss, A. K. H. Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver. J. Vis. Exp. (180), e63333, doi:10.3791/63333 (2022).

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