Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

निष्कर्षण और सूअर गुर्दे और माउस जिगर से FAHD1 प्रोटीन की शुद्धि

Published: February 18, 2022 doi: 10.3791/63333
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Research Institute for Biomedical Aging Research, University of Innsbruck

Summary

यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि सूअर गुर्दे और माउस जिगर से fumarylacetoacetoacetate hydrolase डोमेन युक्त प्रोटीन 1 (FAHD1) को निकालने के लिए कैसे। सूचीबद्ध विधियों को ब्याज के अन्य प्रोटीनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और अन्य ऊतकों के लिए संशोधित किया जा सकता है।

Abstract

Fumarylacetoacetate hydrolase डोमेन युक्त प्रोटीन 1 (FAHD1) यूकेरियोट्स में FAH superfamily का पहला पहचाना गया सदस्य है, जो माइटोकॉन्ड्रिया में oxaloacetate decarboxylase के रूप में कार्य करता है। यह लेख सूअर गुर्दे और माउस जिगर से FAHD1 के निष्कर्षण और शुद्धिकरण के लिए तरीकों की एक श्रृंखला प्रस्तुत करता है। कवर किए गए तरीके तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (एफपीएलसी) के साथ आयनिक एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी, एफपीएलसी के साथ पूर्ववर्ती और विश्लेषणात्मक जेल निस्पंदन, और प्रोटिओमिक दृष्टिकोण हैं। कुल प्रोटीन निष्कर्षण के बाद, अमोनियम सल्फेट वर्षा और आयनिक विनिमय क्रोमैटोग्राफी का पता लगाया गया था, और एफएएचडी 1 को आयनिक विनिमय और आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके एक अनुक्रमिक रणनीति के माध्यम से निकाला गया था। इस प्रतिनिधि दृष्टिकोण को ब्याज के अन्य प्रोटीन (महत्वपूर्ण स्तरों पर व्यक्त) के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और अन्य ऊतकों के लिए संशोधित किया जा सकता है। ऊतक से शुद्ध प्रोटीन उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी, और / या शक्तिशाली और विशिष्ट औषधीय अवरोधकों के विकास का समर्थन कर सकता है।

Introduction

यूकेरियोटिक एफएएच डोमेन युक्त प्रोटीन 1 (एफएएचडी 1) द्वि-कार्यात्मक ऑक्सालोएसीटेट (ओएए) डिकार्बोक्सिलेज (ओडीएक्स) 1 और एसाइलपाइरूवेट हाइड्रोलेस (एपीएच) 2 के रूप में कार्य करता है। यह माइटोकॉन्ड्रिया 2 में स्थानीयकृत है और 1,2,3,4,5,6 एंजाइमों के व्यापक एफएएच सुपरफैमिली से संबंधित है। जबकि इसकी ApH गतिविधि केवल मामूली प्रासंगिकता की है, FAHD1 की ODx गतिविधि TCA चक्र फ्लक्स 1,7,8,9 के विनियमन में शामिल है। ओएए न केवल ट्राइकार्बोक्सिलिक एसिड चक्र में केंद्रीय साइट्रेट सिंथेज़ प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक है, बल्कि इलेक्ट्रॉन परिवहन प्रणाली के हिस्से के रूप में और एक कैटाप्लेरोटिक मेटाबोलाइट के रूप में सक्सिनेट डिहाइड्रोजनेज के प्रतिस्पर्धी अवरोधक के रूप में भी कार्य करता है। मानव नाभि शिरा एंडोथेलियल कोशिकाओं (HUVEC) में FAHD1 जीन अभिव्यक्ति के डाउनरेगुलेशन के परिणामस्वरूप सेल प्रसार10 की दर में महत्वपूर्ण कमी आई, और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता का महत्वपूर्ण निषेध, ग्लाइकोलाइसिस के लिए एक सहवर्ती स्विच से जुड़ा हुआ है। वर्किंग मॉडल माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन से जुड़े सेनेसेंस (MiDAS) 11-जैसे फेनोटाइप8 को संदर्भित करता है, जहां माइटोकॉन्ड्रियल OAA स्तरों को FAHD1 गतिविधि 1,8,9 द्वारा कसकर विनियमित किया जाता है।

पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति और ऊतक से बजाय बैक्टीरिया12 से शुद्धिकरण के माध्यम से प्राप्त करने के लिए आसान है। हालांकि, बैक्टीरिया में व्यक्त एक प्रोटीन पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों की संभावित कमी से पक्षपाती हो सकता है, या बस समस्याग्रस्त हो सकता है (यानी, प्लास्मिड हानि, जीवाणु तनाव प्रतिक्रियाओं, विकृत / अनिर्मित डाइसल्फ़ाइड बांड, कोई भी या खराब स्राव, प्रोटीन एकत्रीकरण, प्रोटियोलिटिक दरार, आदि के कारण)। कुछ अनुप्रयोगों के लिए, प्रोटीन को सेल लिसेट या ऊतक से प्राप्त करने की आवश्यकता होती है, ताकि इस तरह के संशोधनों को शामिल किया जा सके और / या संभावित कलाकृतियों को बाहर किया जा सके। ऊतक से शुद्ध प्रोटीन उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी के विकास का समर्थन करता है, और / या चयनित एंजाइमों के लिए शक्तिशाली और विशिष्ट औषधीय अवरोधक, जैसे कि एफएएचडी 113 के लिए।

यह पांडुलिपि सूअर गुर्दे और माउस जिगर से FAHD1 के निष्कर्षण और शुद्धिकरण के लिए तरीकों की एक श्रृंखला प्रस्तुत करती है। वर्णित विधियों को तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (एफपीएलसी) की आवश्यकता होती है, लेकिन अन्यथा सामान्य प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करें। वैकल्पिक तरीके कहीं और 14,15,16,17 पाए जा सकते हैं। कुल प्रोटीन निष्कर्षण के बाद, प्रस्तावित प्रोटोकॉल में एक परीक्षण चरण शामिल होता है, जिसमें अमोनियम सल्फेट वर्षा और आयनिक विनिमय क्रोमैटोग्राफी के लिए उप-प्रोटोकॉल पर चर्चा की जाती है (चित्रा 1)। इन उप-प्रोटोकॉल को परिभाषित करने के बाद, ब्याज के प्रोटीन को एफपीएलसी के साथ आयनिक विनिमय और आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके एक अनुक्रमिक रणनीति के माध्यम से निकाला जाता है। इन दिशानिर्देशों के आधार पर, अंतिम प्रोटोकॉल को ब्याज के अन्य प्रोटीनों के लिए व्यक्तिगत रूप से अनुकूलित किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: इस प्रोटोकॉल की समग्र रणनीति। ऊपर से नीचे तक: प्रोटीन ऊतकों से निकाला जाता है। ऊतक होमोजेनेट तैयार किया जाता है, सेंट्रीफ्यूज किया जाता है, और फ़िल्टर किया जाता है। supernatant और गोली व्युत्पन्न नमूनों की प्रत्येक जोड़ी के लिए, अमोनियम सल्फेट वर्षा और आयनिक विनिमय क्रोमैटोग्राफी (FPLC) के लिए परीक्षण इष्टतम परिस्थितियों के लिए जांच करने के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए। इन उप-प्रोटोकॉल की स्थापना के बाद, प्रोटीन को अमोनियम सल्फेट वर्षा, आयनिक विनिमय क्रोमैटोग्राफी, और दोहराए जाने वाले आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एफपीएलसी) की एक अनुक्रमिक प्रक्रिया के माध्यम से अलग-अलग पीएच और नमक सांद्रता में निकाला जा सकता है। सभी चरणों को पश्चिमी धब्बा द्वारा नियंत्रित करने की आवश्यकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी प्रयोग संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुपालन में किए गए थे। सूअर गुर्दे स्थानीय सुपरमार्केट से ताजा प्राप्त किया गया था। जिगर के ऊतकों को C57BL6 जंगली प्रकार के चूहों से काटा गया था, जो Innsbruck University, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, ऑस्ट्रिया में बायोमेडिकल एजिंग रिसर्च के लिए संस्थान में बनाए रखा गया था। डॉ पिडर जानसेन-ड्यूर, 2013 में जारी परियोजना नेता के रूप में नैतिक अनुमति द्वारा कवर किया गया (BMWF-66.008/0007-II/3b/2013)। परियोजना के लिए चूहों के रखरखाव और उपयोग को 5 मई, 2020 से नैतिक अनुमति संख्या 2020-0.242.978 के तहत कवर किया गया है, जो ऑस्ट्रियाई शिक्षा, विज्ञान और अनुसंधान मंत्रालय (BMBWF) द्वारा जारी किया गया है।

1. तैयारी

नोट: प्रोटोकॉल शुरू होने से पहले, कई चीजों को तैयार करने की आवश्यकता होती है, यानी, प्रोटीन लाइसिस बफर, कच्चे ऊतक का नमूना, और एक विशिष्ट एंटीबॉडी, सामान्य रसायनों और सामग्रियों के अलावा।

  1. ऊतक के शुद्ध वजन के प्रति 100 ग्राम प्रोटीन लाइसिस बफर के 250 मिलीलीटर तैयार करें: 50 mM NaF, 1 mM PMSF, 2 μg / mL एप्रोटिनिन, और 1 mM सक्रिय ऑर्थोवैनाडेट के साथ 1x PBS के 250 mL ( तालिका 1 देखें)। एक 0.22 μm सिरिंज फ़िल्टर इकाई का उपयोग कर समाधान फ़िल्टर करें।
    नोट: प्रोटीन tyrosine फॉस्फेट18 के एक अधिक शक्तिशाली अवरोधक में परिवर्तित करने के लिए उपयोग करने से पहले orthovanadate के सक्रियण की आवश्यकता है। सक्रिय ऑर्थोवैनाडेट वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ताओं से प्राप्त किया जा सकता है, लेकिन निम्नानुसार भी तैयार किया जा सकता है।
    1. ddH 2 O में (सोडियम) orthovanadate काएक 200mM स्टॉक समाधान तैयार करें। 10 मिली लीटर घोल तैयार करने के लिए, 368 मिलीग्राम Na3VO4 से 9 मिलीलीटर पानी जोड़ें और सरगर्मी से भंग करें। एक बार भंग हो जाने के बाद, डीडीएच2ओ के साथ 10 मिलीलीटर तक मात्रा बनाएं।
      नोट: सोडियम ऑर्थोवैनाडेट समाधान का प्रारंभिक पीएच सामग्री के स्रोत के साथ भिन्न हो सकता है, और पीएच को निम्नानुसार दोहराए जाने वाले दृष्टिकोण में 10 तक समायोजित करने की आवश्यकता होती है।
    2. समाधान के प्रारंभिक पीएच के आधार पर, पीएच को NaOH या HCl के साथ 10 में समायोजित करें। पीएच > 10 पर, समाधान में एक पीला रंग होगा। समाधान को तब तक उबालें जब तक कि यह रंगहीन न हो जाए, इसे कमरे के तापमान पर ठंडा करें, और पीएच की जांच करें। यदि pH >10 है, तो pH को 10 में समायोजित करने के लिए HCl की एक छोटी मात्रा जोड़ें। इस बिंदु पर, समाधान फिर से पीला हो सकता है।
    3. उबलते और ठंडा करने को तब तक दोहराएं जब तक कि समाधान रंगहीन न हो जाए और पीएच 10 (लगभग 5-7 बार) पर स्थिर न हो जाए। इस बिंदु पर, HCl जोड़ने के परिणामस्वरूप समाधान में पीले रंग की बेहोश उपस्थिति होती है। -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 एमएल ऐलीकोट में सक्रिय ऑर्थोवैनाडेट स्टोर करें।
  2. ऊतक के प्रति ग्राम lysis बफर के 2 मिलीलीटर के साथ ट्यूब तैयार करें और उन्हें बर्फ पर रखें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में आठ 50 एमएल ट्यूबों का उपयोग किया गया था, जिनमें से प्रत्येक एक सूअर गुर्दे (लगभग 100-150 ग्राम) के लिए कुल मिलाकर 30 मिलीलीटर लाइसिस बफर से भरा हुआ था, और दो ट्यूबों में से प्रत्येक 20 माउस लिवर (प्रत्येक 1-2 ग्राम) के लिए 40 एमएल लाइसिस बफर से भरा हुआ था।
  3. ऊतक तैयार करें: पॉलीस्टीरीन फोम बॉक्स में बर्फ पर रखी गई एक पूर्व-साफ ग्लास प्लेट पर ऊतक को विच्छेदित करें। लगभग 100 मिलीग्राम के ऊतक टुकड़ों को काट लें, जिन्हें बाद के लाइसिस के लिए संबंधित ट्यूबों में आसानी से स्थानांतरित किया जा सकता है। ऊतक के टुकड़ों को तैयार ट्यूबों में स्थानांतरित करें (चरण 1.2)।
  4. एक संतृप्त अमोनियम सल्फेट समाधान तैयार करें: डीडीएच2ओ से 70 डिग्री सेल्सियस के 500 मिलीलीटर को गर्म करें और सरगर्मी करते समय, धीरे-धीरे अमोनियम सल्फेट पाउडर जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें) जब तक कि कोई और अमोनियम सल्फेट भंग न हो जाए। कमरे के तापमान पर इस (अधिक) संतृप्त समाधान को ठंडा करें और इसे रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. कुल प्रोटीन निष्कर्षण

नोट ठंडे प्रोटीन lysis बफर में नमूना तैयार करने के बाद (चरण 1.3 देखें), एक अल्ट्रासोनिक जांच द्वारा sonication के माध्यम से संभव के रूप में संभव के रूप में सबसे अच्छा के रूप में ऊतक homogenize, या निम्नानुसार एक इलेक्ट्रिक homogenizer का उपयोग कर।

  1. ऊतकों का समरूपीकरण
    1. एक सूअर गुर्दे के मामले में, निलंबन अधिमानतः एक अल्ट्रासोनिक जांच द्वारा sonicate जबकि बर्फ पर नमूना रखने (15 एस नाड़ी के 10 चक्र, दालों के बीच 30 s के अंतराल के साथ बर्फ पर नमूना ठंडा करने के लिए, 50% शुल्क चक्र के साथ मध्यम आयाम पर).
    2. माउस अंगों के मामले में, बर्फ पर नमूने को रखते हुए एक इलेक्ट्रिक होमोजेनाइज़र (कम बल के साथ शुरू, और धीरे-धीरे मध्यम बल में तेजी लाने) का उपयोग करके निलंबन को homogenize करें। नियमित रूप से पीबीएस में इलेक्ट्रिक homogenizer धोने के लिए किसी भी कार्बनिक सामग्री डिवाइस clogging हटाने के लिए.
    3. नमूनों से 20 μL लें और माइक्रोस्कोप के नीचे जांचें कि क्या homogenized ऊतक की कोशिकाओं को ठीक से नष्ट कर दिया गया है; अन्यथा, homogenization को दोहराएं।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 10,000 x g पर एक tabletop centrifuge में ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, supernatant 20,000 x g पर दूसरी बार 4 °C पर 30 मिनट के लिए 4 °C पर प्रारंभिक गोली है कि स्थानांतरित किया गया हो सकता है के छोटे अंशों को खत्म करने के लिए centrifuge. यह चरण 2.3 में बाद के निस्पंदन को सरल बनाएगा।
  3. एक ताजा ट्यूब में supernatant ले लीजिए और यह बर्फ पर जगह. अनुक्रमिक रूप से 0.45 μm और 0.22 μm सिरिंज फ़िल्टर इकाइयों का उपयोग करके supernatant फ़िल्टर करें। 10 एमएल बैचों में supernatant को एलीकोट करें और उन्हें अल्पकालिक भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर या लंबे समय तक भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
    नोट: 0.45 μm के साथ पूर्व फ़िल्टरिंग 0.22 μm के साथ एक दूसरे फ़िल्टरिंग चरण से पहले कणों के बहुमत को हटा देता है महीन कणों को हटा देता है। सीधे 0.22 μm फ़िल्टर का उपयोग करने से फ़िल्टर को बंद करने का खतरा हो सकता है।
  4. SDS-PAGE/Western Blot analysis के लिए 50 μL नमूना तैयार करें, जिसमें 5x SDS नमूना बफर के 10 μL को जोड़कर ( तालिका 1 देखें) supernatant के 40 μL में, और फिर 10 मिनट के लिए 95 °C पर उबलते हुए।
    1. वैकल्पिक रूप से,ddH 2O के 900 μL में चरण 2.2 में प्राप्त गोली के लगभग 100 μL को फिर से निलंबित करें, और ऊपर वर्णित के रूप में SDS-PAGE / पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए एक नमूना तैयार करें।
      नोट: सकारात्मक नियंत्रण के अलावा, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण में गोली-व्युत्पन्न नमूनों को शामिल करना, यह इंगित करेगा कि प्रोटीन की अभिव्यक्ति कम है, या एंटीबॉडी समस्याग्रस्त है या नहीं।

3. SDS-पृष्ठ और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण

नोट: प्रोटीन घुलनशीलता के लिए जांच करने के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण की आवश्यकता होती है। निम्नलिखित एक गीला / टैंक ब्लोटिंग सिस्टम का उपयोग करके इलेक्ट्रोब्लॉटिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है (सामग्री की तालिका देखें)। SDS-PAGE के लिए एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल कहीं और पाया जा सकताहै 19.

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक असंतत 12.5% पॉलीएक्रिलामाइड एसडीएस-पेज जेल तैयार करें (यानी, एक समाधान जेल के शीर्ष पर एक स्टैकिंग जेल; तालिका 1 देखें)। चरण 2 के दौरान पहले तैयार किए गए नमूने चलाएँ (चरण 4, 5, और 6 के समान; नीचे देखें)।
    1. पहले कुएं में एक प्रोटीन मार्कर सीढ़ी लोड करें ( सामग्री की तालिका देखें)। hFAHD1 पुनः संयोजक प्रोटीन के 5 एनजी लोड करें (बैक्टीरिया12 से प्राप्त; तालिका 1 देखें) दूसरे कुएं में एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में।
    2. इसके बाद, विश्लेषण किए जाने वाले नमूने के 20 μL लोड करें, और तैयार किए गए SDS-PAGE 1x नमूना बफर के 20 μL के साथ सभी शेष कुओं को भरें (यानी, 5x नमूना बफर ddH2O के साथ पतला)। SDS-चल रहे बफ़र का उपयोग कर 125 V पर SDS-PAGE जैल चलाएँ ( तालिका 1 देखें)।
  2. SDS-PAGE के पूरा होने के बाद, एक पश्चिमी धब्बा विश्लेषण करें और FAHD1 के खिलाफ उठाए गए उपलब्ध एंटीबॉडी का उपयोग करके झिल्ली की जांच करें ( तालिका 1 देखें)।
    नोट: जैसा कि नमूने कच्चे ऊतक homogenate से लिए जाते हैं, आमतौर पर SDS-PAGE की गुणवत्ता और इस बिंदु पर पश्चिमी धब्बा विश्लेषण से समझौता किया जाता है; हालांकि, यह जांचना महत्वपूर्ण है कि निकालने के लिए प्रोटीन supernatant में घुलनशील है या नहीं। निम्नलिखित प्रोटोकॉल सूअर गुर्दे, और जिगर, हृदय, मस्तिष्क और गुर्दे सहित विभिन्न माउस अंगों के लिए परीक्षण किया गया था।
    1. 10x पश्चिमी धब्बा स्थानांतरण बफ़र तैयार करें ( तालिका 1 देखें)। 1x पश्चिमी धब्बा हस्तांतरण बफर तैयार करें ( तालिका 1 देखें) और इसे 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
    2. मेथनॉल में 2 मिनट के लिए एक PVDF झिल्ली को सक्रिय करें। झिल्ली को 2 मिनट के लिए ddH2O में धोएं। 1x पश्चिमी धब्बा हस्तांतरण बफर में 15 मिनट के लिए झिल्ली को संतुलित करें।
    3. एसडीएस-रनिंग बफर को हटाने के लिए हिलाते हुए 10 मिनट के लिए 1x पीबीएस के साथ एसडीएस-जेल को धोएं, और फिर संतुलन के लिए 10 मिनट के लिए 1x पश्चिमी धब्बा हस्तांतरण बफर में जेल को इनक्यूबेट करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार इलेक्ट्रोब्लॉटिंग कैसेट (यानी, सक्रिय पीवीडीएफ झिल्ली और जैल के संयोजन) को इकट्ठा करें।
    4. बर्फ से भरे पॉलीस्टीरीन फोम बॉक्स में या ठंडे कमरे (4 डिग्री सेल्सियस) में 1 घंटे के लिए 300 एमए पर इलेक्ट्रोब्लॉटिंग के माध्यम से धब्बा चलाएं। PVDF झिल्ली को एक 50 mL ट्यूब में स्थानांतरित करें, जिसमें इसकी उजागर पक्ष ट्यूब के आंतरिक पक्ष का सामना कर रही है। पश्चिमी धब्बा अवरुद्ध बफर के 20 मिलीलीटर में झिल्ली को इनक्यूबेट करें ( तालिका 1 देखें) एक ट्यूब रोलर पर रोलिंग करते समय 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ( सामग्री की तालिका देखें)।
    5. अगले दिन, रोलिंग करते समय एक ही ट्यूब में पश्चिमी धब्बा धोने के बफर (0.1% (v / v) Tween 20 के साथ PBS) के 20 मिलीलीटर के साथ 5 मिनट के लिए झिल्ली को धोएं। प्राथमिक एंटीबॉडी2 के साथ एक ही ट्यूब में झिल्ली को इनक्यूबेट करें (FAHD1 को लक्षित करना; तालिका 1 देखें) रोलिंग करते समय कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पश्चिमी धब्बा ब्लॉकिंग बफर में 1: 500 पतला।
    6. रोलिंग करते समय पश्चिमी धब्बा धोने के बफर के 20 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक 10 मिनट के लिए एक ही ट्यूब में झिल्ली को तीन बार धोएं। HRP-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए झिल्ली को इनक्यूबेट करें ( सामग्री की तालिका देखें) पश्चिमी धब्बा अवरुद्ध बफर के 5 मिलीलीटर में 1: 3000 पतला।
    7. पश्चिमी धब्बा धोने के बफर के 20 मिलीलीटर के साथ 10 मिनट के लिए एक ही ट्यूब में झिल्ली को तीन बार धोएं और 1x पीबीएस के साथ प्रत्येक 5 मिनट के लिए दो बार धोएं। झिल्ली को एक किनारे पर चिमटी के साथ सावधानीपूर्वक पकड़कर सुखाएं, और झिल्ली के विपरीत (निचले) किनारे के साथ सेल्यूलोज के एक टुकड़े या व्हाटमैन पेपर के एक टुकड़े को छूकर। एक साफ कांच की प्लेट पर झिल्ली (उजागर पक्ष ऊपर) रखो।
    8. सावधानी से एक पिपेट का उपयोग करके तैयार ईसीएल पश्चिमी धब्बा सब्सट्रेट के 1 मिलीलीटर के साथ पूरी झिल्ली को कवर करें, किसी भी हवा के बुलबुले न बनाने का ध्यान रखें। ईसीएल समाधान को 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने दें, और तुरंत एक्स-रे फिल्म का उपयोग करके या इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके झिल्ली विकसित करें।
      नोट: यदि प्रोटीन किसी भी नमूने में नहीं बल्कि केवल सकारात्मक नियंत्रण में पाया गया था, तो यह इंगित कर सकता है कि प्रोटीन अघुलनशील है, या एंटीबॉडी द्वारा पता लगाने के लिए पर्याप्त मात्रा में मौजूद नहीं है। यदि सकारात्मक नियंत्रण के केवल नैनोग्राम लोड किए गए थे, तो पहला परिदृश्य अधिक संभावना है। यदि कोई प्रोटीन बिल्कुल भी नहीं पाया गया था, तो एंटीबॉडी की गुणवत्ता की जांच करें, और शायद मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के बजाय पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी पर स्विच करें। दुर्लभ अवसरों में, यानी, कुछ हाइड्रोफोबिक प्रोटीन के लिए, प्रोटीन सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद पता लगाने योग्य हो सकता है, लेकिन निस्पंदन के बाद नहीं। ऐसे मामले में, हाइड्रोफोबिक प्रोटीन के लिए विशेष फ़िल्टर इकाइयों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
  3. वैकल्पिक रूप से, पश्चिमी धब्बा के बाद PVDF झिल्ली दाग SDS-पेज जेल से PVDF झिल्ली के लिए प्रोटीन के सफल हस्तांतरण को नियंत्रित करने के लिए।
    नोट: Coomassie धुंधला समस्या निवारण, विधि विकास, और प्रलेखन के लिए अनुशंसित है, लेकिन ध्यान रखें कि इस प्रोटोकॉल को लागू करने के बाद, झिल्ली आगे पश्चिमी धब्बा विश्लेषण करने के लिए खो रहे हैं। Ponceau एस धुंधला कमजोर धुंधला देता है, लेकिन अगर झिल्ली फिर से जांच की जा रही है इस्तेमाल किया जा सकता है.
    1. दाग (Coomassie या Ponceau एस) और डी धुंधला समाधान युक्त छोटे ट्रे तैयार करें.
    2. चिमटी का उपयोग करते हुए, झिल्ली को धुंधला समाधान में डालें और धीरे-धीरे हिलाएं जब तक कि झिल्ली को अच्छी तरह से दाग न दिया जाए (5-10 मिनट)।
    3. झिल्ली को destaining समाधान में स्थानांतरित करें और तब तक हिलाएं जब तक कि समाधान संतृप्त न हो जाए (5-10 मिनट)। जब तक प्रोटीन बैंड झिल्ली पर मनाया जा सकता है destaining कदम को दोहराएँ; यदि कोई बैंड बिल्कुल भी नहीं देखा जाता है, तो लंबे समय तक इनक्यूबेशन समय के साथ धुंधला दोहराएं। चिमटी का उपयोग करके झिल्ली को कांच की प्लेट पर रखकर सुखाएं।

4. परीक्षण: अमोनियम सल्फेट वर्षा

नोट: अमोनियम सल्फेट वर्षा प्रोटीन की घुलनशीलता को बदलकर प्रोटीन शुद्धिकरण की एक विधि है। एक प्रारंभिक प्रयोग में, अमोनियम सल्फेट एकाग्रता को क्रमिक रूप से एक मूल्य तक बढ़ाया जाता है जो प्रोटीन संदूषकों की अधिकतम मात्रा को अवक्षेपित करता है, जबकि समाधान में FAHD1 को छोड़ देता है। प्रोटीन की घुलनशीलता को फिर से पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के माध्यम से जांचा जाता है।

  1. चरण 2.3 से आगे बढ़ें: या तो नमूने का एक एलीकोट पिघलाएं या प्रोटीन निष्कर्षण के बाद सीधे आगे बढ़ें (यानी, नमूने को ठंडा किए बिना)। एक 0.22 μm फ़िल्टर इकाई का उपयोग करके नमूना फ़िल्टर करने के लिए thawing के बाद संभावित अवक्षेप को बाहर करने के लिए. बर्फ पर छह 1.5 मिलीलीटर ट्यूब तैयार करें, और प्रत्येक ट्यूब में नमूने के 250 μL को स्थानांतरित करें।
  2. ऊपर तैयार ट्यूबों में 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, और 30% अमोनियम सल्फेट की एक कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला तैयार करें, और प्रोटीन लाइसिस बफर के साथ 1000 μL तक अंतिम मात्रा बनाएं। एक ट्यूब रोटेटर पर रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को इनक्यूबेट करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. एक टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करते हुए, 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 10,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज और सावधानीपूर्वक सभी supernatants को अलग ट्यूबों में स्थानांतरित करें। हवा के परिणामस्वरूप छर्रों सूखी और उनमें से प्रत्येक ddH2O के 1000 μL में resuspend.
  4. पिछले चरण से पुन: निलंबित गोली और supernatant की प्रत्येक जोड़ी के लिए, 5x SDS नमूना बफर के 10 μL के साथ 40 μL मिश्रण और खुले ढक्कन के साथ 95 डिग्री सेल्सियस पर उबाल जब तक कि तरल के अधिकांश vaporized है. फिर, डीडीएच2ओ में 50% डीएमएसओ के मिश्रण में गोली को फिर से निलंबित करें।
  5. SDS-PAGE (चरण 3) निष्पादित करें, लेकिन 3 घंटे के लिए 80 V पर जैल चलाएं। अमोनियम सल्फेट की प्रत्येक एकाग्रता के लिए, जोड़े में पुन: निलंबित गोली और supernatant (चरण 4.3) से व्युत्पन्न नमूनों को लोड करें। एक पश्चिमी धब्बा विश्लेषण (चरण 3) निष्पादित करें।
  6. अमोनियम सल्फेट की उच्चतम सांद्रता की जांच करें, जिस पर प्रोटीन को शुद्ध किया जाना है (यानी, एफएएचडी 1) supernatant से व्युत्पन्न नमूने में रहता है। परिणामों के आधार पर, ब्याज के प्रोटीन के लिए एक अमोनियम सल्फेट वर्षा प्रोटोकॉल को परिभाषित करें, जिसका उपयोग भविष्य के प्रयोगों में किया जाना है।
    नोट: अमोनियम सल्फेट अच्छी तरह से SDS-पेज और पश्चिमी धब्बा विकृत करने के लिए जाना जाता है। जैसे-जैसे अमोनियम सल्फेट की एकाग्रता बढ़ती है, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण की गुणवत्ता से समझौता किया जाएगा। हालांकि, पहले चरण 3 के साथ, इस विश्लेषण का उपयोग अमोनियम सल्फेट की दी गई सांद्रता में ब्याज के प्रोटीन की घुलनशीलता की जांच करने के लिए किया जाता है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य अन्य प्रोटीनों को अवक्षेपित करना है, जबकि शुद्ध किए जाने वाले प्रोटीन को घुलनशील रहना चाहिए।

5. परीक्षण: FPLC के साथ आयनिक विनिमय क्रोमैटोग्राफी

नोट: आवेशित कार्यात्मक समूहों के साथ अणु एफपीएलसी के लिए एक सिलिका कण स्तंभ से बंधे होते हैं, जिससे उनकी सतह के चार्ज के अनुसार प्रोटीन का विभेदन सक्षम होता है। इस चरण को दो बार निष्पादित करें, कैटिओनिक एक्सचेंज कॉलम और एनिओनिक एक्सचेंज कॉलम का उपयोग करके ( सामग्री की तालिका देखें)। प्रोटोकॉल चरण या तो कैटिओनिक या एनिओनिक एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी के लिए समान हैं, लेकिन उपयोग किए जाने वाले बफर अलग-अलग हैं ( तालिका 1 देखें); दोनों "कम नमक" 15 mM NaCl और "उच्च नमक" 1 M NaCl शर्तों के साथ. उपयोग किए गए स्तंभों के लिए, 1 एमएल / मिनट की प्रवाह दर की सिफारिश की जाती है।

  1. एनिओनिक या कैटिओनिक एक्सचेंज कॉलम के साथ FPLC सिस्टम सेट करें। 20% EtOH(H 2O में) के 5 कॉलम वॉल्यूम (CVs) के साथ कॉलम को धोएं, इसके बाद ddH2O के 5 CVs वैकल्पिक रूप से, कॉलम को कम नमक बफर, उच्च नमक बफर के 1 CV के साथ धोएं, और फिर से कम नमक बफर के क्रम में जब तक कि क्रोमैटोग्राम में कोई और चोटियां नहीं देखी जातीं, लेकिन कम से कम एक बार धोलें।
  2. छोटे पैमाने पर अमोनियम सल्फेट वर्षा के लिए इष्टतम प्रोटोकॉल निर्धारित करने के बाद (चरण 4), मूल ऊतक होमोजेनेट (चरण 2) के 10 मिलीलीटर पर वर्षा प्रोटोकॉल लागू करें। वैकल्पिक रूप से, कम नमक बफर के खिलाफ नमूना dialyze.
    1. नमूना को कॉलम पर लागू करें (उदाहरण के लिए, इंजेक्शन द्वारा या नमूना पंप का उपयोग करके) और प्रवाह-थ्रू एकत्र करें। कम नमक बफर के 1 CV के साथ स्तंभ धोएं।
  3. 100% कम नमक बफर / 0% उच्च नमक बफर से 0% कम नमक बफर / 3 सीवी के भीतर 100% उच्च नमक बफर तक एक रैखिक ढाल क्षालन स्थापित करें। लगातार 1 एमएल अंश एकत्र करें। ढाल समाप्त होने के बाद, उच्च नमक बफर के साथ तब तक दौड़ना जारी रखें जब तक कि 1 सीवी की सीमा पर क्रोमैटोग्राम में कोई और प्रोटीन-संबद्ध चोटियों (280/255 एनएम पर यूवी अवशोषण) का पता नहीं लगाया जाता है।
  4. स्तंभ को साफ करने के लिए 0.5 M NaOH (ddH 2 O में) में भंग25% SDS का 1 mL लागू करें। लगातार, ddH 2 O के 3 CVs और20% EtOH के 3 CVs (ddH2O में) के साथ कॉलम को धोएं।
  5. सभी पीक-अंशों और प्रवाह-थ्रू के एसडीएस-पेज नमूने एकत्र करें, और ब्याज के प्रोटीन की उपस्थिति के लिए पश्चिमी धब्बा के माध्यम से उनकी जांच करें (चरण 3)। तरल नाइट्रोजन में एकत्र किए गए अंशों को स्नैप-फ्रीज करें और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण पूरा होने के बाद, ब्याज के प्रोटीन वाले अंशों को पिघलाएं और पूल करें और दूसरों को छोड़ दें। वैकल्पिक स्तंभ (यानी, catyonic या anionic exchange स्तंभ) के साथ चरण 5.1-5.5 दोहराएँ।
  7. दोनों स्तंभों की जांच के बाद, ब्याज के प्रोटीन के लिए एक एफपीएलसी प्रोटोकॉल को परिभाषित करें, जिसका उपयोग भविष्य के प्रयोगों में किया जाना है। अल्ट्रा-सेंट्रीफ्यूजेशन फ़िल्टर इकाइयों (10 kDa, सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके प्रोटीन समाधान की मात्रा को 2 एमएल तक कम करें।
    नोट: प्रयोगों की इस श्रृंखला के दो अपेक्षित परिणाम हैं। या तो ब्याज का प्रोटीन कॉलम में से एक से जुड़ा हुआ है, और प्रोटीन समाधान पहले से ही क्षालन के बाद काफी शुद्ध है, या प्रोटीन दोनों मामलों में प्रवाह के माध्यम से बना हुआ है। बाद के परिदृश्य में, हालांकि प्रोटीन प्रवाह-थ्रू में है, इस चरण का सफाई प्रभाव अभी भी महत्वपूर्ण हो सकता है। ऐसे मामले में, सूअर गुर्दे और माउस जिगर में FAHD1 के लिए के रूप में, आयनिक विनिमय के इस कदम अभी भी प्रदर्शन किया जाएगा. यदि न तो कैटिओनिक या एनिओनिक एक्सचेंज कॉलम एक उचित सफाई प्रभाव प्रदान कर सकता है, तो कोई भी लिसेट और बफर के पीएच को संशोधित करने का प्रयास कर सकता है, और एफपीएलसी के लिए आवेदन करने से पहले चल रहे बफर के खिलाफ नमूने को डायलाइज़ करने का प्रयास कर सकता है।

6. अमोनियम सल्फेट-वर्षा और FPLC के लिए परिभाषित उप प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्रोटीन निष्कर्षण

नोट: FPLC के लिए एक सिलिका जेल कॉलम में झरझरा कणों ( सामग्री की तालिका देखें) उनके hydrodynamic त्रिज्या के अनुसार प्रोटीन के भेदभाव को सक्षम. वर्णित चरणों को आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) का उपयोग करके एक एफपीएलसी सिस्टम के साथ किया जाना है। उपयोग किए गए SEC स्तंभ के लिए ( सामग्री की तालिका देखें), 0.3 mL/min की प्रवाह दर की सिफारिश की जाती है।

  1. सभी आवश्यक सामग्रियों को तैयार करें (चरण 1 देखें), और ऊतक से कुल प्रोटीन निकालें (चरण 2 देखें)। परीक्षण के लिए उपयोग नहीं किए जाने वाले सभी ऊतक होमोजेनेट के साथ एक अमोनियम सल्फेट वर्षा करें (चरण 4 देखें)। बड़े वॉल्यूम के लिए, अल्ट्रा-सेंट्रीफ्यूजेशन फ़िल्टर इकाइयों (10 kDa; सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके लिसेट को 50 एमएल या उससे कम की छोटी मात्रा में ध्यान केंद्रित करें।
  2. आयनिक विनिमय क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके पहला शुद्धिकरण चरण निष्पादित करें (चरण 5 देखें)।
    1. पश्चिमी धब्बा के लिए नमूने तैयार करें, जैसा कि पिछले चरणों में वर्णित है। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण प्रदर्शन और आयनिक विनिमय क्रोमैटोग्राफी से अंशों युक्त सभी FAHD1 पूल.
    2. अल्ट्रा-सेंट्रीफ्यूजेशन फ़िल्टर इकाइयों (10 केडीए) का उपयोग करके प्रोटीन समाधान की मात्रा को 2 एमएल तक कम करें। किसी भी सूक्ष्म-वर्षा को हटाने के लिए 0.45 μm और 0.22 μm सिरिंज फ़िल्टर इकाइयों के साथ समाधान को क्रमिक रूप से फ़िल्टर करें।
  3. SEC स्तंभ को 1 CV के साथ SEC स्तंभ को संतुलित करें जो बफ़र चला रहा है ( तालिका 1 देखें), जिसमें 1 mM DTT है. कॉलम पर नमूना लोड करें और क्रोमैटोग्राफी को तब तक चलाएं जब तक कि सभी प्रोटीन (1-2 सीवी) नहीं हो जाते।
    1. प्रवाह के 1 मिलीलीटर के अंशों को इकट्ठा करें- जो क्रोमैटोग्राम (280/255 एनएम पर यूवी अवशोषण) में महत्वपूर्ण चोटियों से मेल खाती है और एसडीएस-पेज और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए प्रत्येक एकत्र किए गए अंश के 50 μL नमूने तैयार करती है, जैसा कि पिछले चरणों में वर्णित है। तरल नाइट्रोजन का उपयोग करके सभी अंशों को स्नैप-फ्रीज करें, और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।
  4. लगातार डी.सी.ई.डी.एच. 2 ओ के 1 सीवी और20% ईटीओएच के 1 सीवी (डीडीएच2ओ में) के साथ एसईसी कॉलम को धोएं। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण प्रदर्शन, और पूल सभी FAHD1 अंशों युक्त. अल्ट्रा-सेंट्रीफ्यूजेशन फ़िल्टर इकाइयों का उपयोग करके प्रोटीन समाधान की मात्रा को 2 एमएल तक कम करें (10 केडीए, सामग्री की तालिका देखें)।
  5. एक वाणिज्यिक बीसीए परख किट का उपयोग कर प्रोटीन एकाग्रता का आकलन ( सामग्री की तालिका देखें).
    नोट: मोबाइल चरण की पीएच और नमक सामग्री गोलाकार प्रोटीन20 के क्षालन प्रोफ़ाइल को प्रभावित कर सकती है। अम्लीय या बुनियादी स्थितियों के परिणामस्वरूप चोटियों को कम परिभाषित किया जा सकता है और प्रोटीन-मैट्रिक्स इंटरैक्शन में वृद्धि हो सकती है जिससे कॉलम20 पर प्रोटीन का आंशिक प्रतिधारण हो सकता है। इस प्रभाव को आगे प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए शोषण किया जा सकता है। विभिन्न प्रवाह दरों, पीएच, और नमक सांद्रता के साथ चरण 6 की पुनरावृत्ति प्रोटीन20 की शुद्धता को बढ़ा सकती है।

7. चांदी धुंधला

नोट: SDS-PAGE जैल के चांदी धुंधला विश्लेषण प्रोटीन संदूषण है कि Coomassie धुंधला के साथ नहीं देखा जा सकता है के लिए जाँच करने के लिए आवश्यक है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल कई संस्करणों में से एक है जो साहित्य21 में पाया जा सकता है। एक साफ ग्लास ट्रे में हिलाकर सभी इनक्यूबेशन चरणों का प्रदर्शन करें। एक विशेष अपशिष्ट कंटेनर में सभी चांदी और फॉर्मेल्डिहाइड युक्त तरल पदार्थों को इकट्ठा करें और उन्हें ठीक से त्याग दें।

  1. ठंडे कमरे में रात भर चांदी धुंधला फिक्सिंग समाधान में SDS-PAGE जैल इनक्यूबेट ( तालिका 1 देखें)। कमरे के तापमान पर 3 घंटे के लिए चांदी धुंधला इनक्यूबेशन समाधान ( तालिका 1 देखें) में जैल इनक्यूबेट करें। वैकल्पिक रूप से, बेहोश बैंड का पता लगाने में सुधार करने के लिए ग्लूटाराल्डिहाइड जोड़ें ( तालिका 1 देखें)। जैल को 10 मिनट के लिए डीडीएच2ओ में चार बार धोएं।
  2. 1 घंटे के लिए चांदी धुंधला चांदी के घोल में जैल इनक्यूबेट ( तालिका 1 देखें)।
    नोट: ध्यान रखें कि अब से सभी तरल पदार्थ और जेल में चांदी और फॉर्मेल्डिहाइड होते हैं जो विषाक्त होते हैं।
  3. चांदी धुंधला डेवलपर समाधान में जैल इनक्यूबेट ( तालिका 1 देखें) जोरदार मिलाते हुए के साथ जब तक बैंड स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं. प्रतिक्रिया को रोकने के लिए, डेवलपर समाधान को छोड़ दें और तुरंत कम से कम 10 मिनट के लिए सिल्वर स्टेनिंग स्टॉप सॉल्यूशन ( तालिका 1 देखें) में जैल को इनक्यूबेट करें।
    नोट: चरण 7.2 और 7.3 में दाग बैंड लगातार और अधिक विकसित हो जाएगा। समाधान में अधिक फॉर्मेल्डिहाइड जोड़ना आवश्यक हो सकता है यदि धुंधला कमजोर है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

FAHD1 प्रोटीन प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग कर सूअर गुर्दे और माउस जिगर से निकाला गया था। माउस ऊतक के लिए, अंतिम शुद्धिकरण चरण के बाद कई μg प्राप्त करने के लिए कई अंगों की आवश्यकता होती है। इस कारण से, यह लेख सूअर गुर्दे से FAHD1 के निष्कर्षण पर केंद्रित है, जो एक बहुत अधिक अनुकरणीय प्रयोग है। माउस जिगर से FAHD1 का निष्कर्षण इस प्रोटोकॉल की कठिनाइयों और संभावित नुकसान को प्रस्तुत करने के लिए किया जाता है। आमतौर पर उन अंगों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है जो प्रोटीन के उच्च अभिव्यक्ति स्तर को दिखाते हैं जो एक शुद्ध करना चाहता है। मानव प्रोटीन एटलस22 मॉडल प्रणाली में अभिव्यक्ति का अनुमान लगाने में मदद कर सकता है, या कोई भी इन स्तरों का आकलन करने के लिए विभिन्न कच्चे ऊतक लिसेट के साथ प्रारंभिक पश्चिमी धब्बा प्रयोग कर सकता है। सभी पश्चिमी धब्बा विश्लेषणों में उपयोग किया जाने वाला सकारात्मक नियंत्रण एक टैग किया गया पुनः संयोजक प्रोटीन था, जो थोड़ा अधिक आणविक वजन पर चल रहा था।

पहले प्रयोग के रूप में, सूअर गुर्दे से FAHD1 का निष्कर्षण प्रस्तुत किया गया है। ऊतक समरूपता (चरण 1) और कुल प्रोटीन निष्कर्षण (चरण 2) की प्रक्रिया अनुपूरक चित्र1 में प्रस्तुत की गई है (व्यक्तिगत चरणों के विवरण के लिए किंवदंती देखें)। निम्नलिखित प्रयोगों के लिए कुल लिसेट का एक एलीकोट दसवां हिस्सा उपयोग किया गया था।

अमोनियम सल्फेट वर्षा का परीक्षण इस लिसेट के लिए एक बार किया गया था, विभिन्न सांद्रता (चरण 4) (चित्रा 2) में लिसेट में अमोनियम सल्फेट जोड़कर। centrifugation के बाद, छर्रों, और supernatants नमूना और एक परिभाषित polyclonal एंटीबॉडी2 मानव FAHD1 के खिलाफ उठाया का उपयोग कर पश्चिमी धब्बा के साथ विश्लेषण किया गया. पुनः संयोजक के 200 एनजी अपने / एस टैग मानव FAHD1 ई कोलाई12 से प्राप्त सकारात्मक नियंत्रण के रूप में लोड किया गया था। FAHD1 प्रोटीन बैंड को 25 kDa पर देखा जा सकता है, जबकि टैग किए गए सकारात्मक नियंत्रण 34 kDA पर चलता है। इस डेटा के आधार पर, एक प्रोटोकॉल को परिभाषित किया गया था जहां लिसेट को 25% अमोनियम सल्फेट के साथ इलाज किया जाता है, यानी, ऐसी स्थितियां जिस पर एफएएचडी 1 अभी भी supernatant में है, जबकि अधिकांश अन्य प्रोटीन अवक्षेपित होते हैं। यह शुद्धिकरण रणनीति में एक बड़ा कदम है। अमोनियम सल्फेट वर्षा अन्य तरीकों के साथ आगे बढ़ने से पहले एक प्रभावी सफाई कदम है। ध्यान दें, 30% से अधिक अमोनियम सल्फेट की मात्रा का उपयोग नहीं किया जाएगा, क्योंकि अमोनियम सल्फेट धीरे-धीरे एसडीएस-पेज और पश्चिमी धब्बा की गुणवत्ता को विकृत करता है।

Figure 2
चित्रा 2: अमोनियम सल्फेट वर्षा और सूअर FAHD1 के लिए पश्चिमी धब्बा स्क्रीनिंग. (A) अमोनियम सल्फेट को समाधान से प्रोटीन को अवक्षेपित करने के लिए विभिन्न सांद्रता (5% से 25% अधिकतम) में लिसेट में जोड़ा गया था। (बी) सूअर एफएएचडी 1 (25 केडीए) की उपस्थिति को छर्रों के व्यक्तिगत जोड़े में निर्धारित किया गया था और मानव एफएएचडी 1 के खिलाफ उठाए गए पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करके पश्चिमी धब्बा के माध्यम से अमोनियम सल्फेट सांद्रता को अलग-अलग करने के लिए संगत supernatant। supernatant 25% अमोनियम सल्फेट वर्षा के अनुरूप अभी भी supernatant में सूअर FAHD1 की उपस्थिति से पता चलता है, एक ही समय में अन्य प्रोटीन की एक अच्छी मात्रा precipitating. उनके / एस-टैग किए गए पुनः संयोजक प्रोटीन के 200 एनजी को सकारात्मक नियंत्रण (34 केडीए) के रूप में लोड किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एफपीएलसी के साथ आयनिक एक्सचेंज कॉलम का परीक्षण करने के बाद, एक रणनीति को परिभाषित किया गया था जहां सूअर एफएएचडी 1 पीएच 9 (चरण 5) पर एक एनिओनिक एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी के प्रवाह-माध्यम से रहता है। 25% पर अमोनियम सल्फेट वर्षा द्वारा प्राप्त लिसेट के साथ शुरू करना (जैसा कि पिछले परीक्षण प्रयोगों द्वारा परिभाषित किया गया है), एनिओनिक एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी का उपयोग समाधान (चित्रा 3 ए) से आगे के प्रोटीन को खत्म करने के लिए किया गया था। बाध्यकारी प्रोटीन को स्तंभ से क्षालन द्वारा हटा दिया गया था, जबकि प्रवाह-थ्रू को पीएच 7.4 (चित्रा 3 बी) पर एसईसी के माध्यम से और शुद्ध किया गया था। दोनों चरणों के बाद, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण ने उन सभी अंशों की पहचान की जिनमें सूअर एफएएचडी 1 शामिल था, जिन्हें पूल किया गया था और 2 एमएल तक केंद्रित किया गया था।

Figure 3
चित्रा 3: FPLC के साथ सूअर FAHD1 का शुद्धिकरण - भाग 1. क्रोमैटोग्राम और धब्बों में लाल तीर FAHD1 की उपस्थिति का संकेत देते हैं। क्रोमैटोग्राम में, "यूवी" 280 एनएम पर यूवी अवशोषण को दर्शाता है, "कोंड" चालकता को दर्शाता है (बफर में नमक एकाग्रता से संबंधित), और "कॉन्क बी" बफर ग्रेडिएंट में उच्च नमक बफर के प्रतिशत को दर्शाता है (0% शुद्ध कम नमक बफर; 100% शुद्ध उच्च नमक बफर)। (ए) अमोनियम सल्फेट वर्षा द्वारा प्राप्त लिसेट से स्वाइन एफएएचडी 1 का शुद्धिकरण एक एनिओनिक एक्सचेंज कॉलम (एफपीएलसी) के साथ 25% पर। जबकि कई प्रोटीन स्तंभ से बंधे होते हैं, सूअर एफएएचडी 1 प्रवाह के माध्यम से पाया जाता है। गंदगी और गैर-प्रोटीन संदूषकों को कॉलम से क्षालन द्वारा हटा दिया जाता है, जबकि प्रवाह-थ्रू को आगे संसाधित किया जाता है। (बी) (ए) में पिछले एनिओनिक एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी से फ्लो-थ्रू को पीएच 7.4 पर आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एफपीएलसी) के माध्यम से और शुद्ध किया जाता है। (A, B) पश्चिमी धब्बा विश्लेषण (नीचे फसली धब्बे) सूअर FAHD1 युक्त अंशों की पहचान की, जो पूल और केंद्रित हैं। पूर्ण धब्बे पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के बाद Coomassie-दाग झिल्ली को दर्शाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

फ़िल्टर किए गए नमूने को फिर से एसईसी पर लागू किया गया था, लेकिन पीएच 9 पर बफर शर्तों पर ( तालिका 1 देखें) (चित्रा 4)। इस दृष्टिकोण के पीछे तर्क यह है कि मोबाइल चरण की पीएच और नमक सामग्री गोलाकार प्रोटीन20 के क्षालन प्रोफ़ाइल को प्रभावित कर सकती है, और इन बफर परिस्थितियों के तहत एफएएचडी 1 के लिए एक बढ़ी हुई क्षालन प्रोफ़ाइल पाई गई थी। एक अंश में बुनियादी एंजाइम गतिविधि के लिए पर्याप्त शुद्धता के स्तर का प्रोटीन शामिल था, अंतमें प्रोटीन की पहचान की पुष्टि करने के लिए12 ।

Figure 4
चित्रा 4: FPLC के साथ सूअर FAHD1 का शुद्धिकरण - भाग 2. क्रोमैटोग्राम और धब्बों में लाल तीर FAHD1 की उपस्थिति का संकेत देते हैं। एनिओनिक एक्सचेंज और आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी के साथ पहले शुद्ध किए गए प्रोटीन के नमूनों को पीएच 9 (शीर्ष पैनल) पर आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एफपीएलसी) के माध्यम से और शुद्ध किया जाता है। निचले दाईं ओर चित्रित पश्चिमी धब्बा विश्लेषण उन अंशों की पहचान करता है जिनमें सूअर एफएएचडी 1 होता है, जो पूल किए गए और केंद्रित होते हैं (नीचे पैनल)। निचले बाएं में धब्बा पश्चिमी धब्बा के बाद झिल्ली के कूमासी धुंधला दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एक वैकल्पिक रणनीति (यानी, एसईसी आयनिक विनिमय क्रोमैटोग्राफी के बाद) अमोनियम सल्फेट वर्षा (चरण 4) (पूरक चित्रा 2) के बाद प्राप्त लिसेट के 2 एमएल के साथ परीक्षण किया गया था। इस प्रयोग के लिए तर्क यह है कि पहले एसईसी का उपयोग करके, अंशों वाले FAHD1 को अन्य प्रोटीनों के बहुमत से अलग किया जा सकता है, जबकि बाद के आयनिक एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी का उपयोग प्रोटीन को और शुद्ध करने के लिए किया जा सकता है। सबसे पहले, lysate पीएच 7.4 (चरण 6) पर SEC का उपयोग करके fractionated था। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण ने उन सभी अंशों की पहचान की जिनमें सूअर FAHD1 शामिल था। दूसरे, इन अंशों को पीएच 9 (चरण 5) पर एक एनिओनिक एक्सचेंज कॉलम का उपयोग करके केंद्रित और शुद्ध किया गया था। क्रोमैटोग्राम और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण (पूरक चित्रा 2) से पता चलता है कि यह रणनीति उत्साहजनक है क्योंकि आयनिक विनिमय क्रोमैटोग्राम एक परिभाषित संकीर्ण चोटी दिखाता है जो पश्चिमी धब्बा में समृद्ध प्रोटीन के स्तर से जुड़ा हुआ है। हालांकि, इस रणनीति का दोष यह है कि यह एसईसी (2 एमएल) पर लागू होने वाली प्रारंभिक मात्रा द्वारा सीमित है, इसलिए इस विधि का थ्रूपुट बहुत कम है। उदाहरण के लिए, एक पूरे सूअर गुर्दे को संसाधित करना व्यावहारिक नहीं है।

इस प्रोटोकॉल के लिए एक और संशोधन के रूप में, एक कैटिओनिक एक्सचेंज कॉलम को एनिओनिक एक्सचेंज कॉलम से पहले शामिल किया गया था जब सूअर एफएएचडी 1 भी प्रवाह-थ्रू में मौजूद था। प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण में, सूअर FAHD1 अंशों युक्त के नमूनों का नमूना लिया गया था और एक ODx परख के साथ परीक्षण किया गया था, जैसा कि कहीं और12 (पूरक चित्रा 3) वर्णित है। विशिष्ट एंजाइमेटिक गतिविधि शुद्धता के स्तर के साथ-साथ बढ़ती है, यानी, प्रति कुल प्रोटीन एफएएचडी 1 की बढ़ती सापेक्ष मात्रा के साथ।

एक दूसरे उदाहरण के रूप में, माउस जिगर से FAHD1 का निष्कर्षण, यानी, 20 चूहों से प्राप्त जिगर के ऊतकों का एक संग्रह प्रस्तुत किया गया है। ऊपर प्रस्तुत सूअर गुर्दे से FAHD1 के निष्कर्षण की तुलना में, यह निष्कर्षण अधिक थकाऊ साबित हुआ। प्रोटोकॉल के कई चरणों में समस्याओं का सामना करना पड़ा, जो निम्नलिखित में प्रस्तुत किया जाएगा। कुल प्रोटीन को चरण 2 (अनुपूरक चित्र4) में वर्णित के रूप में निकाला गया था। जैसा कि माउस लिवर होमोजेनेट एक बहुत ही चिपचिपा और पतला इकाई होता है, फिल्टर पेपर (कॉफी फिल्टर इकाइयों के समान) का उपयोग लिसेट को पूर्व-फ़िल्टर करने के लिए किया जाता था, जिसे निष्कर्षण के बाद लाइसिस बफर में 1: 3 पतला किया गया था, ताकि समाधान को तरल की तरह बनाया जा सके। इस कमजोर पड़ने से निस्पंदन प्रक्रिया में वृद्धि हुई; हालांकि, इसने पश्चिमी धब्बा के साथ प्रोटीन का बाद का पता लगाने को और अधिक थकाऊ बना दिया। निस्पंदन के बाद, तैयार लिसेट को आगे के उपयोग से पहले केंद्रित किया जाना था। निम्नलिखित प्रयोगों के लिए कुल लिसेट का एक एलीकोट दसवां हिस्सा उपयोग किया गया था।

अमोनियम सल्फेट वर्षा (अनुपूरक चित्रा 4I) के लिए एक पहला परीक्षण चरण एक संभावित समस्या का सामना किया जा सकता है जो प्रदर्शित किया जा सकता है। उच्च सांद्रता पर अमोनियम सल्फेट एसडीएस-पेज जैल को बाधित करता है और 150 वी (पूरक चित्रा 5 ए; नकारात्मक परिणाम) पर चलने पर एक मुस्कान प्रभाव का कारण बनता है। 80 V पर चलने वाला एक ही SDS-PAGE एक सकारात्मक परिणाम प्रदर्शित करता है (अनुपूरक चित्रा 5B). बाद के मामले में, मुस्कुराहट प्रभाव शुरू में बनता है लेकिन अंततः लागू कम वोल्टेज के कारण हल हो जाता है। चूंकि प्रारंभिक समाधान को लिसेट को छानने में सक्षम होने के लिए भारी पतला किया जाना था, इसलिए इन नमूनों का प्रारंभिक पश्चिमी धब्बा विश्लेषण असफल रहा, यानी, सकारात्मक नियंत्रण एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया गया था, लेकिन लागू नमूनों में प्रोटीन नहीं। इस समस्या को लिसेट (केन्द्रापसारक फिल्टर इकाइयों का उपयोग करके केंद्रित) और एंटीबॉडी दोनों की उच्च एकाग्रता का उपयोग करके हल किया गया था, और हिलाते समय ठंडे कमरे में रात भर एंटीबॉडी लागू करके। आखिरकार, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण ने जानकारी के दोनों टुकड़े प्रदान किए कि प्रोटीन लिसेट में मौजूद था, और प्रोटीन अभी भी 15% अमोनियम सल्फेट (पूरक चित्रा 5 सी) पर supernatant में मौजूद था। ध्यान दें, अमोनियम सल्फेट (>15%) की उच्च मात्रा वाले एसडीएस नमूने हीटिंग के दौरान अवक्षेपित हो गए और प्रोटीन खो गया। यह भी Coomassie धुंधला और पश्चिमी धब्बा (पूरक चित्रा 5C) में देखा जा सकता है. यह प्रभाव सूअर गुर्दे के लिए नहीं देखा गया था, इसलिए यह ऊतक-विशिष्ट हो सकता है।

15% पर अमोनियम सल्फेट वर्षा के बाद, 10 मिलीलीटर लिसेट को पीएच 6.8 पर कैटिओनिक एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी पर लागू किया गया था। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण माउस FAHD1 प्रोटीन प्रवाह के माध्यम से (चित्रा 5A) में होने के लिए प्रदर्शित किया। एल्यूटेड प्रोटीन अंश मामूली प्रतीत होता है; हालांकि, यह उदाहरण आयनिक विनिमय क्रोमैटोग्राफी का एक माध्यमिक प्रभाव प्रदर्शित करता है। प्रोटोकॉल के इस चरण में, समाधान में अभी भी कई यौगिक हो सकते हैं जो प्रोटीन नहीं हो सकते हैं। आयनिक एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी इस तरह के संदूषणों से छुटकारा पाने का एक तेज़ और आसान तरीका है। यह देखते हुए कि आयनिक एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी करने में कुछ घंटे लगते हैं (सभी धोने के चरणों सहित, प्रयोग में आधे घंटे लगते हैं), यह गैर-प्रोटीन संदूषणों से नमूने को साफ करने का एक सरल तरीका प्रदान करता है।

Figure 5
चित्रा 5: FPLC के साथ माउस FAHD1 का शुद्धिकरण. क्रोमैटोग्राम और धब्बों में लाल तीर FAHD1 की उपस्थिति का संकेत देते हैं। (ए) 15% पर अमोनियम सल्फेट वर्षा के बाद, नमूना सेंट्रीफ्यूज किया गया था, फ़िल्टर किया गया था (0.22 μm), और एक कैटिओनिक एक्सचेंज कॉलम पर लागू किया गया था। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण से पता चलता है कि प्रोटीन प्रवाह के माध्यम से है और क्रोमैटोग्राम से पता चलता है कि इस चरण द्वारा अन्य प्रोटीनों को बहुत कुछ नहीं हटाया गया है। हालांकि, प्रवाह-थ्रू के साथ इनपुट की उपस्थिति और चिपचिपाहट की तुलना करने से पता चलता है कि एकत्र किए गए प्रवाह-थ्रू बहुत स्पष्ट है (इनपुट और प्रवाह-थ्रू की तुलना में सही पैनल)। (बी) कैटिओनिक एक्सचेंज कॉलम से एकत्र किए गए प्रवाह-थ्रू को सेंट्रीफ्यूजेशन फिल्टर के माध्यम से 2 एमएल तक कम कर दिया गया था और पीएच 7.4 पर आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी पर लागू किया गया था। (सी) FAHD1 युक्त अंशों को पूल किया गया, केंद्रित किया गया, और पीएच 9 पर आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी के दूसरे दौर पर लागू किया गया। (डी) FAHD1 युक्त अंशों को फिर से पूल किया गया था और शेष संदूषणों को देखने के लिए चांदी के दाग के साथ एसडीएस-पेज पर लागू किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

नमूना आगे पीएच 7.4 (चित्रा 5 बी) पर आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी के लिए लागू किया गया था। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण माउस FAHD1 प्रोटीन युक्त अंशों को प्रदर्शित किया, कि पूल और 2 मिलीलीटर करने के लिए केंद्रित थे. यह 2 मिलीलीटर ध्यान -20 डिग्री सेल्सियस पर β-मर्केप्टोएथेनॉल के 10 μL के साथ जमे हुए था और अगले दिन पिघल गया था। एक अवक्षेप का गठन किया गया था जिसे सिरिंज फ़िल्टर इकाइयों (0.22 μm) के माध्यम से फ़िल्टर किया गया था। एसडीएस-पेज और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए नमूने यह सुनिश्चित करने के लिए लिए लिए गए थे कि माउस एफएएचडी 1 प्रोटीन अभी भी समाधान में था।

प्रोटीन युक्त नमूने (पश्चिमी धब्बा विश्लेषण से) पूल किए गए थे, सेंट्रीफ्यूजेशन फिल्टर के माध्यम से केंद्रित थे, और शेष संदूषणों (चित्रा 5 डी) को देखने के लिए चांदी के दाग के साथ एसडीएस-पेज पर लागू किए गए थे। इससे पता चला कि प्रोटीन समाधान अत्यधिक शुद्ध नहीं है और माउस जिगर से इस विधि के माध्यम से प्राप्त प्रोटीन की मात्रा या तो बहुत अधिक नहीं थी (बीसीए परख किट का उपयोग करके निर्धारित कुल मिलाकर कुछ μg; सामग्री की तालिका देखें)। सूअर FAHD1 (इस चरण में लगभग 1 मिलीग्राम) के मामले में प्रोटीन की उपज बहुत अधिक थी। सूअर गुर्दे से निकाले गए FAHD1 प्रोटीन की शुद्धता का स्तर लगभग 80% है (चांदी के दाग के बाद अनुमानित; डेटा नहीं दिखाया गया है)। इस शुद्धता को आगे बढ़ाया जा सकता है, उदाहरण के लिए, एक परिभाषित एंटीबॉडी का उपयोग करके आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी। इस प्रोटोकॉल की ऐसी और अन्य सीमाओं पर नीचे विस्तार से चर्चा की जाएगी।

बफर/समाधान/सामग्री का नाम संयोजन
कूमैसी डेस्टेनिंग समाधान 30% (v/v) EtOH; 5% (v/v) HOAc; ddH2O में
कूमैसी धुंधला समाधान 0.05% Coomassie ब्रिलियंट ब्लू आर -250; 50% (v/v) MeOH; 10% (v/v) HOAc; ddH2O में
मोनो क्यू उच्च नमक बफर 20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10% ग्लिसरॉल; ddH2O में; NaOH के साथ 9.0 करने के लिए पीएच समायोजित करें
मोनो क्यू कम नमक बफर 20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; ddH2O में; NaOH के साथ 9.0 करने के लिए पीएच समायोजित करें
मोनो एस उच्च नमक बफर 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1 M NaCl; ddH2O में; HCl के साथ 6.8 करने के लिए पीएच समायोजित करें
मोनो एस कम नमक बफर 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 15 mM NaCl; ddH2O में; HCl के साथ 6.8 करने के लिए पीएच समायोजित करें
प्रोटीन लाइसिस बफर 1x PBS (250 mL); 50 mM NaF; 1mM PMSF; 2 μg / mL एप्रोटिनिन, 1 mM सक्रिय orthovanadate; ddH2O में
खरगोश विरोधी hFAHD1 polyclonal एंटीबॉडी (आत्मीयता अलग) कस्टम बनाया गया; polyclonal विरोधी hFAHD1 एंटीबॉडी खरगोश सीरम से शुद्ध और संदर्भ 12 के अनुसार FPLC के साथ शुद्ध
पुनः संयोजक hFAHD1 प्रोटीन पश्चिमी धब्बा नियंत्रण पश्चिमी धब्बा नियंत्रण प्रोटीन ई कोलाई में व्यक्त किया और संदर्भ 12 के अनुसार FPLC के साथ शुद्ध.
SDS-पृष्ठ 5x नमूना बफ़र 300 mM Tris HCl; 500 mM DDT; 10% (w / v) SDS; 50% (v / v) ग्लिसरीन; 0.05% (डब्ल्यू / वी) ब्रोमोफेनोल नीला; ddH2O में; HCl के साथ 6.8 करने के लिए पीएच समायोजित करें
SDS-पृष्ठ को हल जेल (12.5%) असंतत पृष्ठ के लिए ddH2O (9.5 mL); 3 M Tris HCl (2.2 mL); 40% एक्रिलामाइड / बीआईएस समाधान के 5.5 मिलीलीटर (29: 1 अनुपात); 20% एसडीएस (175 μL); TEMED (17 μL); 10% अमोनियम परसल्फेट (175 μL); स्टैकिंग जेल से पहले डाली और इसे polymerize करते हैं; शीर्ष पर स्टैकिंग जेल डाली
SDS-पृष्ठ चल रहा बफ़र 25 mM Tris HCl; 190 mM ग्लाइसिन; 0.5% (w/v) SDS; ddH2O में; NaOH के साथ 8.3 करने के लिए पीएच समायोजित करें
असंतत पृष्ठ के लिए SDS-PAGE स्टैकिंग जेल (12.5%) ddH2O (3.8 mL); 1 M Tris HCl (630 μL); 40% एक्रिलामाइड / बीआईएस समाधान के 500 μL (29: 1 राशन); 20% एसडीएस (25 μL); TEMED (5 μL); 10% अमोनियम परसल्फेट (50 μL); हल जेल polymerized है के बाद डाली; कुओं को बनाने के लिए एक जेल कंघी लागू करें
SEC (G75) बफ़र चल रहा है 15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; ddH2O में; NaOH के साथ 7.4 करने के लिए पीएच समायोजित
चांदी धुंधला विकासशील समाधान 250 mM Na2CO3 में ddH2O; उपयोग करने से पहले 100 mL में 37% (v/v) फॉर्मेल्डिहाइड का 12 μL जोड़ें
चांदी धुंधला फिक्सिंग समाधान 40% (v/v) EtOH; 10% (v/v) HOAc; ddH2O में
चांदी धुंधला इनक्यूबेशन समाधान 30% (v/v) EtOH; 500 mM NaOAc; 8 mM Na2S2O3; ddH2O में; वैकल्पिक: उपयोग से पहले 50% (v / v) ग्लूटाराल्डिहाइड प्रति 100 मिलीलीटर के 600 μL जोड़ें
चांदी धुंधला चांदी का घोल 0.1% (w/v) AgNO3; ddH2O में; उपयोग करने से पहले 100 मिलीलीटर में 37% (v/v) फॉर्मेल्डिहाइड का 25 μL जोड़ें
चांदी धुंधला बंद समाधान पीएच 7.6 पर 40 mM EDTA समाधान; 40 mL ddH2O में EDTA के 744 मिलीग्राम हस्तांतरण और फिर 7.6 करने के लिए पीएच भंग करने और समायोजित करने के लिए NaOH जोड़ें। अंत में, कुल मात्रा को 50 मिलीलीटर में समायोजित करें।
पश्चिमी धब्बा अवरुद्ध बफर 0.1% (v / v) Tween 20 और 5% (w / v) स्किम दूध पाउडर के साथ पीबीएस; निस्यंदित
पश्चिमी धब्बा स्थानांतरण बफर (10x) Tris-HCl 250 mM; ग्लाइसिन 1.92 एम; ddH2O में; NaOH के साथ 8.3 करने के लिए पीएच समायोजित; कमरे के तापमान पर स्टोर
पश्चिमी धब्बा स्थानांतरण बफर (1x) पश्चिमी धब्बा हस्तांतरण बफर (10x) 100 मिलीलीटर; ddH2O के 800 mL; MeOH के 100 mL; 4 °C पर स्टोर
पश्चिमी धब्बा धुलाई बफर (PBS-T) 0.1% के साथ पीबीएस (v / v) Tween 20

तालिका 1.

पूरक चित्रा 1: सूअर गुर्दे से कुल प्रोटीन निष्कर्षण। (ए) गुर्दे के ऊतकों को स्लाइडिंग को रोकने के लिए पॉलीस्टीरीन फोम पर रखे गए तैयार ठीक से साफ ग्लास प्लेट पर एक स्केलपेल का उपयोग करके काटा गया था; (बी) प्रोटीन / प्रोटीज अवरोधकों के साथ 20 मिलीलीटर बर्फ-ठंडे लाइसिस बफर वाले 50 एमएल ट्यूबों को बर्फ पर इनक्यूबेट किया जाता है; (सी) गुर्दे के ऊतकों के टुकड़ों को बफर में तब तक रखा गया था जब तक कि मात्रा लगभग 30 मिलीलीटर तक नहीं पहुंच गई; (डी) गुर्दे के ऊतकों को अल्ट्रासाउंड (यानी, sonication) का उपयोग करके homogenized किया गया था; (ई) कच्चे होमोजेनेट को 30 मिनट के लिए मध्यम गति पर एक टेबल-टॉप सेंट्रीफ्यूज में सेंट्रीफ्यूज किया गया था; (च) कई नमूनों को एक साथ संसाधित किया गया था; (जी) पहले सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, supernatant centrifuge ट्यूबों ( ई की तुलना में) में स्थानांतरित कर दिया गया था, और 30 मिनट के लिए उच्च गति (10,000 x g) पर centrifuged; (एच) यह सेंट्रीफ्यूजेशन चरण एक और गोली और supernatant उपज, जो 50 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित किया जाता है; (I/J) प्री-लिसेट को क्रमिक रूप से 0.45 μm और 0.2 μm फ़िल्टर इकाइयों द्वारा फ़िल्टर किया जाता है, जिसे 10 mL बैचों में एलीकोट किया जाता है, और बाद में -80 °C पर संग्रहीत करने के लिए तरल नाइट्रोजन के साथ स्नैप-फ्रोजन किया जाता है। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का उपयोग सभी नमूनों में प्रोटीन की उपस्थिति को सत्यापित करने के लिए किया जाता है (छर्रों, supernatants, फ़िल्टर किए गए लिसेट)। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 2: FPLC के साथ सूअर FAHD1 का शुद्धिकरण; वैकल्पिक रणनीति। क्रोमैटोग्राम और धब्बों में लाल तीर FAHD1 की उपस्थिति का संकेत देते हैं। (ए) अमोनियम सल्फेट वर्षा द्वारा प्राप्त लीसेट से सूअर एफएएचडी 1 का शुद्धिकरण पीएच 74 पर आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एफपीएलसी) के साथ 25% पर। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण ने उन अंशों की पहचान की जिनमें सूअर एफएएचडी 1 होता है, जिन्हें पूल और केंद्रित किया गया था। (बी) प्रोटीन के नमूने पहले आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (पैनल ए) के साथ शुद्ध किए गए थे, जिन्हें एनिओनिक एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी (एफपीएलसी) के माध्यम से और शुद्ध किया गया था। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण उन अंशों की पहचान करता है जिनमें सूअर एफएएचडी 1 होता है, जिन्हें पूल और केंद्रित किया गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 3: सूअर FAHD1 की विशिष्ट एंजाइम गतिविधि। शुद्धता के बढ़ते स्तर के एक समारोह के रूप में विशिष्ट एंजाइम गतिविधि को मापा जाता है। तालिका विशिष्ट एंजाइम गतिविधि (μmol / min / mg) के साथ सापेक्ष एंजाइम गतिविधि (nmol / min) की तुलना करती है। परख हर शुद्धिकरण कदम के बाद सूअर FAHD1 की एक लगातार बढ़ती गतिविधि से पता चलता है. ई कोलाई से प्राप्त पुनः संयोजक उसकी / एस-मानव FAHD1 (हरे) की तुलना में। 12, सूअर FAHD1 एक थोड़ा उच्च गतिविधि (लाल) (एन = 3) दिखाया. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 4: माउस जिगर से कुल प्रोटीन निष्कर्षण. (A, B, C) 20 चूहों और लाइसिस बफर से स्नैप-जमे हुए जिगर के ऊतकों को 50 एमएल ट्यूबों में बर्फ पर तैयार किया गया था; (डी, ई, एफ) जिगर के ऊतकों को अल्ट्रासाउंड (यानी, sonication) का उपयोग करके homogenized किया गया था; क्रूड होमोजेनेट को 30 मिनट के लिए मध्यम गति से एक टेबल-टॉप सेंट्रीफ्यूज में सेंट्रीफ्यूज किया गया था; supernatant centrifuge ट्यूबों में स्थानांतरित कर दिया गया था, और 30 मिनट के लिए उच्च गति (10,000 x g) पर centrifuged; (जी, एच, आई) प्री-लिसेट को क्रमिक रूप से पेपर फिल्टर, 0.45 μm और 0.2 μm फ़िल्टर इकाइयों द्वारा फ़िल्टर किया जाता है, जिसे 10 एमएल बैचों में एलीकोट किया जाता है, और बाद में -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करने के लिए तरल नाइट्रोजन के साथ स्नैप-जमे हुए; (जे) अमोनियम सल्फेट को समाधान से प्रोटीन को अवक्षेपित करने के लिए विभिन्न सांद्रता (5% से 30% अधिकतम) में लिसेट में जोड़ा गया था; (के) अमोनियम सल्फेट वर्षा (पैनल जे) के बाद प्राप्त छर्रों को एसडीएस-पेज और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए नमूने लेने के लिए एच2ओ में फिर से निलंबित कर दिया गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 5: अमोनियम सल्फेट वर्षा और माउस FAHD1 के लिए पश्चिमी धब्बा स्क्रीनिंग. धब्बों में लाल तीर FAHD1 की उपस्थिति का संकेत देते हैं। (ए) अमोनियम सल्फेट वर्षा के बाद प्राप्त नमूनों के साथ एसडीएस-पेज 125 वी पर चलाया गया था। इस जेल ने एक कठोर मुस्कान प्रभाव प्रदर्शित किया, और इस तरह के जेल का मूल्यांकन नहीं किया जा सकता है। यह एक नकारात्मक परिणाम का एक उदाहरण है। (बी) एक ही नमूने (पैनल ए) के साथ एसडीएस-पेज को पूरा होने तक 80 वी पर चलाया गया था। इस जेल में कोई मुस्कान प्रभाव नहीं है, और यह एक सकारात्मक परिणाम का एक उदाहरण है। (ग) अमोनियम सल्फेट वर्षा के बाद प्राप्त नमूनों का एसडीएस पृष्ठ और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। अमोनियम सल्फेट की उच्च सांद्रता पर नमूने नमूना बफर के अंदर अवक्षेपित हो सकते हैं, जैसा कि संकेत दिया गया है। वे खो गए हैं और अब और पता नहीं लगाया जा सकता है, या तो कूमासी स्टेनिंग (बाएं) या पश्चिमी धब्बा विश्लेषण (दाएं) के माध्यम से । अमोनियम सल्फेट की सबसे अच्छी एकाग्रता, इस मामले में, 15% होने के लिए निर्धारित की गई थी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम
प्रोटीन से निपटने के लिए सामान्य दिशानिर्देशों का पालन करना आवश्यक है, जैसे कि बर्फ पर और मध्यम पीएच और नमक की स्थिति में काम करना। प्रोटीज इनहिबिटर का उपयोग विधि के लिए फायदेमंद है, जबकि एंटीऑक्सीड इनहिबिटर के उपयोग की अत्यधिक सिफारिश की जाती है। नमूने को ठंडा करने और पिघलाने के परिणामस्वरूप हमेशा प्रोटीन वर्षा (कम से कम आंशिक रूप से) हो सकती है, इसलिए प्रारंभिक प्रोटीन लिसेट (चरण 2) के किसी भी पिघले हुए ऐलीकोट को ब्रेक के बिना लगातार संसाधित किया जाना चाहिए। पिघलने के बाद सेंट्रीफ्यूजेशन और निस्पंदन आमतौर पर माइक्रोप्रिसिपिटेशन को हटाने के लिए अनुशंसित किया जाता है।

एक ऊतक से प्राप्त प्रारंभिक प्रोटीन लिसेट में अभी भी प्रोटीन के अलावा कई पदार्थ होते हैं। आयनिक विनिमय क्रोमैटोग्राफी कॉलम का उपयोग लिसेट को साफ करने के लिए किया जा सकता है। यहां तक कि अगर प्रोटीन जो निकालना चाहता है वह आयनिक एक्सचेंज कॉलम से नहीं बंधता है, तो प्रवाह-माध्यम इनपुट समाधान की तुलना में बहुत स्पष्ट हो सकता है, और बाद के चरणों में संसाधित करना आसान हो सकता है। यह माउस गुर्दे से FAHD1 के निष्कर्षण के लिए दिखाया गया है ( चित्रा 5A देखें)।

सीमाएँ और विधि के संशोधन
यह प्रोटोकॉल ऊतक से FAHD1 के निष्कर्षण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। इस रणनीति के आधार पर, अन्य ऊतकों से एफएएचडी प्रोटीन (एफएएचडी 1, एफएएचडी 2) के निष्कर्षण के लिए एक सामान्य दृष्टिकोण व्युत्पन्न किया जा सकता है, जबकि व्यक्तिगत मामलों के लिए विशिष्ट अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। इस विधि की अंतर्निहित सीमा किसी दिए गए ऊतक में FAHD1 (या FAHD प्रोटीन) के सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर और पर्याप्त मात्रा में इस ऊतक की उपलब्धता है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित समग्र योजना के साथ शुरू करने के लिए ऊतक की एक उपयुक्त मात्रा में प्रोटीन की एक उच्च अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है। सूअर गुर्दे और माउस जिगर से FAHD1 के निष्कर्षण के लिए उदाहरण प्रदान किए गए हैं, जो दो अंग हैं जो प्रोटीन के उच्च अभिव्यक्ति स्तर को दिखाते हैं। इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रत्येक चरण में, नमूने का एक अंतर्निहित नुकसान होता है, यानी, प्रोटीन की कम प्रारंभिक मात्रा और भी कम हो जाती है। आखिरकार, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके केवल कम मात्रा में प्रोटीन प्राप्त किया जा सकता है। क्योंकि सूअर गुर्दे एक बड़ा अंग है, प्रोटीन के बारे में एक ग्राम (लगभग 80% शुद्धता; अनुमानित) दो गुर्दे से इस दृष्टिकोण से निकाला जा सकता है। माउस जिगर से FAHD1 के निष्कर्षण के लिए एक ही प्रोटोकॉल लागू करने के लिए 20 चूहों से जिगर के नमूने एकत्र करने की आवश्यकता होती है, अंत में प्रोटीन के केवल कुछ μg प्राप्त करने के लिए। उल्लिखित तरीकों का उपयोग करके प्रोटीन की उच्च शुद्धता प्राप्त करना थकाऊ हो सकता है, और चांदी के दाग से पता चलता है कि आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी के बाद भी समाधान में कई अन्य प्रोटीन हो सकते हैं। एक एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (जैसे, CAB025530) का उपयोग करके, आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी (एनएचएस सक्रिय कॉलम) के माध्यम से इस प्रोटोकॉल को बढ़ा सकता है।

यहां सूचीबद्ध सभी प्रोटोकॉल की आवश्यकता है कि जो प्रोटीन निकालना चाहता है वह घुलनशील है। क्रोमैटोग्राफी के लिए अमोनियम सल्फेट वर्षा और पीएच / नमक समायोजन की इष्टतम स्थितियों का परीक्षण और परिभाषित करने की आवश्यकता है। मामले में आयनिक विनिमय क्रोमैटोग्राफी किसी भी अच्छे शुद्धिकरण परिणाम प्रदान नहीं करता है, एफपीएलसी प्रदर्शन करने से पहले क्रोमैटोग्राफी बफर के खिलाफ डायलिसिस प्रोटीन की घुलनशीलता और क्रोमैटोग्राफी के संकल्प में सुधार का एक विकल्प हो सकता है। हालांकि, कच्चे लिसेट को डायलाइज़ करने की सिफारिश नहीं की जाती है, क्योंकि इससे डायलिसिस ट्यूब के अंदर बड़े पैमाने पर और अनियंत्रित प्रोटीन वर्षा हो सकती है। समस्याएं तब हो सकती हैं जब प्रोटीन हाइड्रोफोबिक हो जाता है, और प्रोटोकॉल लागू नहीं हो सकते हैं यदि प्रोटीन अत्यधिक हाइड्रोफोबिक (जैसे, झिल्ली प्रोटीन) है। यदि एफएएचडी प्रोटीन आंशिक रूप से अघुलनशील होते हैं जैसा कि किसी दिए गए ऊतक लिसेट में एफएएचडी 2 (डेटा नहीं दिखाया गया है) के लिए पाया जाता है, तो अन्य प्रकार की क्रोमैटोग्राफी, उदाहरण के लिए, हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन क्रोमैटोग्राफी (एचआईसी) का भी पता लगाया जा सकता है।

परिणाम अनुभाग में मानक प्रोटोकॉल के दो संशोधन दिखाए गए हैं. एक सूअर गुर्दे से FAHD1 के शुद्धिकरण के लिए, आयनिक विनिमय क्रोमैटोग्राफी से पहले आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी का उपयोग किया गया था ( अनुपूरक चित्रा 2 देखें)। इस विधि के साथ एक समस्या यह है कि आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी बड़े चल रहे पटरियों की सुविधा है, और नमूना मात्रा रन के दौरान दृढ़ता से बढ़ जाती है। नमूना मात्रा उच्च रिज़ॉल्यूशन23 प्राप्त करने के लिए बिस्तर की मात्रा के 2% से अधिक नहीं होनी चाहिए, और अंतिम कमजोर पड़ने वाला कारक भी एकत्र किए गए क्षालन मात्रा पर निर्भर करता है। 120 mL स्तंभ का उपयोग करके प्रदान किए गए उदाहरण में, 2 mL का प्रारंभिक वॉल्यूम अनुशंसित है। प्रारंभिक नमूना अमोनियम सल्फेट वर्षा के बाद लिसेट के कई एमएल से एकत्र किया जा सकता है, केंद्रापसारक फिल्टर इकाइयों का उपयोग करके एकाग्रता द्वारा, एकत्रीकरण या वर्षा कलाकृतियों के बिना। एक सूअर गुर्दे से FAHD1 के शुद्धिकरण के लिए एक उदाहरण एक प्रतिनिधि परिणाम के रूप में प्रदान किया जाता है ( पूरक चित्रा 2 भी देखें)। हालांकि, केवल छोटे नमूना वॉल्यूम के लिए सीमा इस दृष्टिकोण को अव्यावहारिक होने के लिए रेंडर कर सकती है।

अनुप्रयोग या विधि के निर्देश
बैक्टीरिया से पुनः संयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण एक सीधी और अच्छी तरह से स्थापित विधि है, जो प्रोटीन24,25 की व्यवहार्य मात्रा (ग्राम में) प्राप्त करने के लिए है। यह FAHD112 के लिए प्रस्तुत किया गया है। हालांकि, इन तरीकों का उपयोग करने में कई संभावित कमियां हैं, जैसे कि मेजबान की संभावित खराब वृद्धि, शामिल शरीर का गठन, प्रोटीन गतिविधि का नुकसान या परिवर्तित, और इसलिए, किसी भी प्रोटीन को प्राप्त नहीं करने की संभावना, या जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीन का पक्षपाती रूप होता है (मिसफोल्डिंग, खराब पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन, आदि)। ऐसे तरीके विकसित करना जो ऊतक से सीधे अच्छी तरह से मुड़े हुए और ठीक से संशोधित प्रोटीन निकाल सकते हैं, इसलिए, आकर्षक है। हालांकि, प्रमुख समस्या यह है कि अधिकांश प्रोटीन महत्वपूर्ण स्तरों पर व्यक्त नहीं किए जाते हैं, और बैक्टीरिया से प्रोटीन के अंतर्निहित प्रेरण और बाद के निष्कर्षण की तुलना में, प्राप्त होने वाले प्रोटीन की मात्रा आमतौर पर परिमाण के कई आदेश कम होती है। बैक्टीरिया से पुनः संयोजक प्रोटीन के सस्ती और आसान निष्कर्षण और ऊतक से प्रोटीन के अधिक महंगे और थकाऊ निष्कर्षण के बीच एक ट्रेडऑफ है। उत्तरार्द्ध के साथ प्रमुख अग्रिम यह है कि कोई भी प्रोटीन को अपने शारीरिक रूप में निकाल सकता है जो ऊतक में मौजूद है, जिसमें सभी पारस्परिक प्रभाव शामिल हैं जो इसकी तह और / या उत्प्रेरक गतिविधि को प्रभावित कर सकते हैं।

इस प्रोटोकॉल द्वारा निकाले गए और शुद्ध प्रोटीन FAHD113 के सक्षम अवरोधकों की पहचान करने में मदद करेंगे, संभावित प्रोटीन इंटरैक्शन पार्टनर9, और प्रोटीन9 की संभावित अभी तक अनदेखी भूमिकाएं। एंजाइमेटिक इनहिबिटर का अध्ययन, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का विकास, और पहली जगह में प्रोटीन संरचना के अध्ययन को बैक्टीरिया से निकाले जाने के बजाय ऊतक से निकाले गए उच्च शुद्धता पर प्रोटीन होने पर बहुत समर्थन किया जाता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों Ayse Öztürk और ईवा Albertini द्वारा तकनीकी सहायता के लिए बहुत आभारी हैं. जिगर के ऊतकों की पीढ़ी के लिए उपयोग किए जाने वाले चूहों को Univ.-Doz की देखरेख में बनाए रखा गया था। डॉ. Pidder Jansen-Dürr (Innsbruck University, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, ऑस्ट्रिया में बायोमेडिकल एजिंग रिसर्च के लिए संस्थान)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm filter units MERCK SLGP033RS Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, not steril
0.45 µm filter units MERCK SLHP033NS Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, not steril
15 mL Falcon tubes VWR 734-0451 centrifugal tubes
50 mL Falcon tubes VWR 734-0448 centrifugal tubes
96-Well UV Microplate Thermo-Fischer 8404 UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates
Acrylamide/Bis Solution (40%, 29:1 ratio) BIO-RAD #1610147 40% acrylamide/bis-acrylamide, 29:1 (3.3% crosslinker) solution for casting polyacrylamide gels
ÄKTA FPLC system GE Healthcare Life Sciences / Cytiva - using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the "ÄKTA pure" system
Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa MERCK UFC901024 centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 15 mL
Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa MERCK UFC801024 centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 4 mL
Ammonium sulfate powder MERCK A4418 ammonium sulphate for molecular biology, ≥99.0%
Ammoniumpersulfat reagent grade, 98% MERCK 215589 Catalyst for acrylamide gel polymerization.
Coomassie Brilliant blue R 250 MERCK 1125530025 Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) for electrophoresis Trademark of Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g/l, H2O, 25 °C)
Dialysis tubing cellulose membrane MERCK D9277 Cellulose membranes for the exchange of buffers via dialysis.
Eppendof tubes 1.5 mL VWR 525-1042 microcentrifugal tubes; autoclaved
HiLoad 26/600 Superdex 75 pg GE Healthcare Life Sciences / Cytiva 28989334 HiLoad Superdex 75 pg prepacked columns are for high-resolution size exclusion chromatography of recombinant proteins
Immun-Blot PVDF Membrane BIO-RAD #1620177 PVDF membranes are protein blotting membranes optimized for fluorescent and multiplex fluorescent applications.
Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell BIO-RAD #1703930 Use the Mini Trans-Blot Cell for rapid blotting of Mini-PROTEAN precast and handcast gels.
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels BIO-RAD #1658004 4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam.
Mono Q 10/100 GL GE Healthcare Life Sciences / Cytiva 17516701 Mono Q columns are strong anion exchange chromatography columns for protein analysis or small scale, high resolution polishing of proteins.
Mono S 10/100 GL GE Healthcare Life Sciences / Cytiva 17516901 Mono S columns are strong cation exchange chromatography columns for protein analysis or small scale high resolution polishing of proteins.
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa Thermo-Fischer 26616 A mixture of 10 blue-, orange-, and green-stained proteins (10 to 180 kDa) for use as size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting.
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo-Fischer 23225 A two-component, high-precision, detergent-compatible protein assay for determination of protein concentration.
Sonifier 250; Ultrasonic Cell Disruptor w/ Converter Branson - New models at https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf
Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (affinity isolated) Agilent Dako P0399 The antibody used for horseradish peroxidase conjugation reacts with rabbit immunoglobulins of all classes.
TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethane, TMEDA MERCK T9281 TEMED (N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine) is molecule which allows rapid polymerization of polyacrylamide gels.
Tube Roller - - A general tube rotator roller; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71
Tube Rotator - - A general tube rotator wheel; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123
ULTRA-TURRAX; T 25 digital IKA 0003725000 New models at https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pircher, H., et al. Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase. Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).
  2. Pircher, H., et al. Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase. Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).
  3. Kang, T. -W., et al. Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development. Nature. 479 (7374), 547-551 (2011).
  4. Hong, H., Seo, H., Park, W., Kim, K. K. -J. Sequence, structure and function-based classification of the broadly conserved FAH superfamily reveals two distinct fumarylpyruvate hydrolase subfamilies. Environmental Microbiology. 22 (1), 270-285 (2020).
  5. Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase. Structure. 7 (9), London, England. 1023-1033 (1999).
  6. Bateman, R. L., et al. Mechanistic inferences from the crystal structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a bound phosphorus-based inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 276 (18), 15284-15291 (2001).
  7. Weiss, A. K. H., et al. Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1. Biochemical Journal. 475 (22), 3561-3576 (2018).
  8. Etemad, S., et al. Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 - a new regulator of mitochondrial function and senescence. Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).
  9. Weiss, A. K. H., et al. Regulation of cellular senescence by eukaryotic members of the FAH superfamily - A role in calcium homeostasis. Mechanisms of Ageing and Development. 190, 111284 (2020).
  10. Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-Dürr, P. Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells. Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).
  11. Wiley, C. D., et al. Mitochondrial dysfunction induces senescence with a distinct secretory phenotype. Cell Metabolism. 23 (2), 303-314 (2016).
  12. Weiss, A. K. H., et al. Expression, purification, crystallization, and enzyme assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59729 (2019).
  13. Weiss, A. K. H., et al. Inhibitors of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain Containing Protein 1 (FAHD1). Molcules. 26 (16), 5009 (2021).
  14. Mizutani, H., Kunishima, N. Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8. Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).
  15. Lee, C. H. A simple outline of methods for protein isolation and purification. Endocrinology and Metabolism. 32 (1), Seoul, Korea. 18-22 (2017).
  16. Amer, H. E. A. Purification of proteins: Between meaning and different methods). Proteomics Technologies and Applications. , (2019).
  17. Niu, L., Yuan, H., Gong, F., Wu, X., Wang, W. Protein extraction methods shape much of the extracted proteomes. Frontiers in Plant Science. 9, 802 (2018).
  18. Gordon, J. A. Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).
  19. Gallagher, S. R. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. , (2012).
  20. Ahmed, U., Saunders, G. Effect of pH on Protein Size Exclusion Chromatography. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf (2011).
  21. Sørensen, B. K., et al. Silver staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 304 (1), 33-41 (2002).
  22. Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).
  23. Cytiva Life Fundamentals of size exclusion chromatography. , Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography (2022).
  24. Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Frontiers in Microbiology. 5, 172 (2014).
  25. Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).

Tags

जैव रसायन अंक 180 FAHD FAHD1 oxaloacetate decarboxylase ODx ऊतक FPLC क्रोमैटोग्राफी प्रोटीन निष्कर्षण
निष्कर्षण और सूअर गुर्दे और माउस जिगर से FAHD1 प्रोटीन की शुद्धि
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Andric, A., Wagner, E., Heberle, A., … More

Andric, A., Wagner, E., Heberle, A., Holzknecht, M., Weiss, A. K. H. Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver. J. Vis. Exp. (180), e63333, doi:10.3791/63333 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter