Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Ekstraksjon og rensing av FAHD1 Protein fra svin nyre og mus lever

Published: February 18, 2022 doi: 10.3791/63333
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Research Institute for Biomedical Aging Research, University of Innsbruck

Summary

Denne protokollen beskriver hvordan du trekker ut fumarylacetoaceaceacetathydrlase domeneholdig protein 1 (FAHD1) fra svin nyre og mus lever. De oppførte metodene kan tilpasses andre proteiner av interesse og modifiseres for andre vev.

Abstract

Fumarylacetoaceacetathydrlasedomeneholdig protein 1 (FAHD1) er det første identifiserte medlemmet av FAH-superfamilien i eukaryoter, som fungerer som oksaacetatdekarboksylase i mitokondrier. Denne artikkelen presenterer en rekke metoder for utvinning og rensing av FAHD1 fra svin nyre og mus lever. Dekkede metoder er ionisk utvekslingskromatografi med rask proteinvæskekromatografi (FPLC), forberedende og analytisk gelfiltrering med FPLC og proteomiske tilnærminger. Etter total proteinutvinning ble ammoniumsulfatutfelling og ionisk utvekslingskromatografi utforsket, og FAHD1 ble ekstrahert via en sekvensiell strategi ved hjelp av ionisk utveksling og størrelsesekskluderingskromatografi. Denne representative tilnærmingen kan tilpasses andre proteiner av interesse (uttrykt på betydelige nivåer) og modifisert for andre vev. Renset protein fra vev kan støtte utviklingen av antistoffer av høy kvalitet, og/eller potente og spesifikke farmakologiske hemmere.

Introduction

Det eukaryote FAH-domenet som inneholder protein 1 (FAHD1) fungerer som bifunksjonelt oksalacetat (OAA) dekarboksylase (ODx)1 og acylpyruvathydroklase (ApH)2. Den er lokalisert i mitokondrier2 og tilhører den brede FAH superfamilien av enzymer 1,2,3,4,5,6. Mens ApH-aktiviteten bare er av liten relevans, er ODx-aktiviteten til FAHD1 involvert i reguleringen av TCA-syklusfluksen 1,7,8,9. OAA er ikke bare nødvendig for den sentrale sitratsyntasereaksjonen i trikarboksylsyresyklusen, men fungerer også som en konkurransedyktig hemmer av succinat dehydrogenase som en del av elektrontransportsystemet og som en katalakerotisk metabolitt. Nedregulering av FAHD1 genuttrykk i humane navlestrengsvene endotelceller (HUVEC) resulterte i en betydelig reduksjon i frekvensen av celleproliferasjon10, og betydelig hemming av mitokondriemembranpotensial, forbundet med en samtidig bytte til glykolyse. Arbeidsmodellen refererer til mitokondrie dysfunksjon assosiert senescence (MiDAS)11-lignende fenotype8, hvor mitokondrie OAA nivåer er tett regulert av FAHD1 aktivitet 1,8,9.

Rekombinant protein er lettere å oppnå via uttrykk og rensing fra bakterier12 i stedet for fra vev. Imidlertid kan et protein uttrykt i bakterier være partisk av mulig mangel på post-translasjonelle modifikasjoner, eller kan ganske enkelt være problematisk (dvs. på grunn av plasmidtap, bakterielle stressresponser, forvrengte / uformede disulfidbindinger, ingen eller dårlig sekresjon, proteinaggregering, proteolytisk spalting, etc.). For visse bruksområder må protein fås fra cellelys eller vev, for å inkludere slike modifikasjoner og / eller for å utelukke mulige gjenstander. Renset protein fra vev støtter utviklingen av høykvalitets antistoffer, og / eller potente og spesifikke farmakologiske hemmere for utvalgte enzymer, for eksempel for FAHD113.

Dette manuskriptet presenterer en rekke metoder for utvinning og rensing av FAHD1 fra svin nyre og mus lever. De beskrevne metodene krever rask proteinvæskekromatografi (FPLC), men bruker ellers vanlig laboratorieutstyr. Alternative metoder finnes andre steder 14,15,16,17. Etter total proteinutvinning innebærer den foreslåtte protokollen en testfase, der underprotokoller for ammoniumsulfatutfelling og ionisk utvekslingskromatografi diskuteres (figur 1). Etter å ha definert disse underprotokollene, ekstraheres proteinet av interesse via en sekvensiell strategi ved hjelp av ionisk utveksling og størrelsesekskluderingskromatografi med FPLC. Basert på disse retningslinjene kan den endelige protokollen tilpasses individuelt for andre proteiner av interesse.

Figure 1
Figur 1: Den overordnede strategien for denne protokollen. Fra topp til bunn: Protein ekstraheres fra vev. Vev homogenat er tilberedt, sentrifugert og filtrated. For hvert par supernatante og pelletsavledede prøver må tester for ammoniumsulfatutfelling og FPLC (onic exchange chromatography) utføres for å sonde for optimale forhold. Etter å ha etablert disse underprotokollene, kan proteinet ekstraheres via en sekvensiell prosedyre for ammoniumsulfatutfelling, ionisk utvekslingskromatografi og repeterende størrelseseksklusjonskromatografi (FPLC) ved varierende pH- og saltkonsentrasjoner. Alle trinn må kontrolleres av vestlig blott. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter ble utført i samsvar med institusjonelle retningslinjer. Svin nyre ble hentet frisk fra det lokale supermarkedet. Levervev ble høstet fra C57BL6 villtype mus opprettholdt ved Institute for Biomedical Aging Research ved Innsbruck University, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Østerrike under tilsyn av Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr, dekket av etisk tillatelse som prosjektleder utstedt i 2013 (BMWF-66.008/0007-II/3b/2013). Vedlikehold og bruk av musene til prosjektet dekkes under etisk tillatelse Nr. 2020-0.242.978 fra 5.

1. Forberedelser

MERK: Før protokollen starter, må flere ting være forberedt, det vil si proteinlysebufferen, råvevsprøven og et spesifikt antistoff, i tillegg til generelle kjemikalier og materialer.

  1. Forbered 250 ml proteinlysbuffer per 100 g nettovekt av vev: 250 ml 1x PBS med 50 mM NaF, 1 mM PMSF, 2 μg/ml aprotinin og 1 mM aktivert orthovanadate (se tabell 1). Filtrer oppløsningen ved hjelp av en 0,22 μm sprøytefilterenhet.
    MERK: Aktivering av orthovanadate er nødvendig før bruk for å konvertere den til en mer potent hemmer av protein tyrosinfosfater18. Aktivert orthovanadate kan fås fra kommersielle leverandører, men også utarbeidet som følger.
    1. Forbered en 200 mM lageroppløsning av (natrium) orthovanadate i ddH2O. For tilberedning av 10 ml oppløsning, tilsett 368 mg Na3VO4 til 9 ml vann og oppløses ved omrøring. Når det er oppløst, utgjør volumet til 10 ml med ddH2O.
      MERK: Start-pH i natrium orthovanadate-oppløsningen kan variere med materialkilden, og pH må justeres til 10 i en repeterende tilnærming som følger.
    2. Avhengig av den første pH-en til løsningen, juster pH til 10 med NaOH eller HCl. Ved pH-> 10 vil løsningen ha en gul farge. Kok løsningen til den blir fargeløs, avkjøl den ned til romtemperatur, og kontroller pH. Hvis pH er >10, legger du til et lite volum HCl for å justere pH til 10. På dette tidspunktet kan løsningen bli gul igjen.
    3. Gjenta kokingen og kjølingen til oppløsningen forblir fargeløs og pH stabiliserer seg ved 10 (ca. 5-7 ganger). På dette tidspunktet resulterer det å legge til HCl i et svakt utseende av gul farge i løsningen. Oppbevar aktivert orthovanadate i 1 ml aliquots ved -20 °C.
  2. Forbered rør med 2 ml lysisbuffer per gram vev og legg dem på is.
    MERK: Denne protokollen brukte åtte 50 ml rør, hver fylt med 30 ml lysisbuffer totalt for en svin nyre (ca. 100-150 g), og to rør hver fylt med 40 ml lysisbuffer for 20 muselever (hver 1-2 g) totalt.
  3. Forbered vevet: disseker vevet på en forhåndsrenset glassplate plassert på is i en polystyrenskumboks. Klipp vevstykker på ca 100 mg hver for enkelt å bli overført til respektive rør for etterfølgende lysis. Overfør vevstykkene inn i de forberedte rørene (trinn 1.2).
  4. Forbered en mettet ammoniumsulfatløsning: Varm 500 ml ddH2O til 70 °C, og legg gradvis til ammoniumsulfatpulver (se Materialtabellen) til ikke mer ammoniumsulfat oppløses. Avkjøl denne (over)mettede oppløsningen til romtemperatur og oppbevar den ved 4 °C over natten.

2. Total proteinutvinning

MERK Etter å ha forberedt prøven i kaldprotein lysisbuffer (se trinn 1.3), homogeniser vevet best mulig via sonikering av en ultralydsonde, eller bruk en elektrisk homogenisator som følger.

  1. Homogenisering av vev
    1. I tilfelle av en svin nyre, soniker suspensjonen helst av en ultralyd sonde mens du holder prøven på is (10 sykluser av 15 s puls, med intervaller på 30 s mellom pulsene for å avkjøle prøven på is, ved middels amplitude med 50% driftssyklus).
    2. Når det gjelder museorganer, homogeniser suspensjonen ved hjelp av en elektrisk homogenisator (starter med lav kraft, og akselererer sakte til middels kraft) mens du holder prøven på is. Vask den elektriske homogenisatoren regelmessig i PBS for å fjerne organisk materiale som tetter enheten.
    3. Ta 20 μL ut av prøvene og kontroller under mikroskopet om cellene i det homogeniserte vevet er riktig ødelagt; Ellers gjentar du homogeniseringen.
  2. Sentrifuger rørene i en bordplate sentrifuge ved 10.000 x g i 30 min ved 4 °C.
    MERK: Eventuelt sentrifuger supernatanten for andre gang på 20.000 x g i 30 min ved 4 °C for å eliminere små brøkdeler av den første pelletsen som kan ha blitt overført. Dette vil forenkle den påfølgende filtreringen i trinn 2.3.
  3. Samle supernatanten i et friskt rør og legg det på is. Filtrer supernatanten sekvensielt med 0,45 μm og 0,22 μm sprøytefilterenheter. Aliquot supernatanten i 10 ml partier og frys dem ved -20 °C for korttidslagring eller ved -80 °C for lengre lagring.
    MERK: Forfiltrering med 0,45 μm fjerner mesteparten av partiklene før et nytt filtreringstrinn med 0,22 μm fjerner de finere partiklene. Bruk av 0,22 μm-filteret direkte kan føre til risiko for tilstopping av filtrene.
  4. Forbered en 50 μL prøve for SDS-PAGE/western blot analyse ved å legge til 10 μL 5x SDS prøvebuffer (se tabell 1) til 40 μL av supernatanten, og kok deretter ved 95 °C i 10 minutter.
    1. Eventuelt, resuspend ca 100 μL pellet oppnådd i trinn 2.2 i 900 μL av ddH2O, og forberede en prøve for SDS-PAGE / western blot analyse som beskrevet ovenfor.
      MERK: Inkludering av pelletsavledede prøver i den vestlige blotanalysen, i tillegg til den positive kontrollen, vil indikere om uttrykket av proteinet er lavt, eller antistoffet er problematisk.

3. SDS-PAGE og western blot analyse

MERK: Vestlig flekkanalyse er nødvendig for å se etter proteinløselighet. Nedenfor beskrives en protokoll for elektroblotting ved hjelp av et vått/tank-blottingssystem (se Materialfortegnelser). Du finner en alternativ protokoll for SDS-PAGE andre stederenn 19.

  1. Forbered en diskontinuerlig 12,5% polyakrylamid SDS-PAGE gel i henhold til produsentens instruksjoner (dvs. en stablingsgel på toppen av en løsningsgel; se tabell 1). Kjør prøvene som tidligere ble klargjort i trinn 2 (på samme måte som trinn 4, 5 og 6, se nedenfor).
    1. Last en proteinmarkør stige inn i den første brønnen (se Materialtabell). Last 5 ng hFAHD1 rekombinant protein (hentet fra bakterier12; se tabell 1) som en positiv kontroll i den andre brønnen.
    2. Last deretter 20 μL av prøven som skal analyseres, og fyll alle de gjenværende brønnene med 20 μL preparert SDS-PAGE 1x prøvebuffer (dvs. 5x prøvebuffer fortynnet med ddH2O). Kjør SDS-PAGE gels ved 125 V ved hjelp av SDS-kjørende buffer (se tabell 1).
  2. Når SDS-PAGE er fullført, utfører du en vestlig blotanalyse og gransker membranene ved hjelp av det tilgjengelige antistoffet som er reist mot FAHD1 (se tabell 1).
    MERK: Ettersom prøvene er tatt fra råvev homogenat, er vanligvis kvaliteten på SDS-SIDEN og den vestlige blotanalysen på dette tidspunktet kompromittert; Det er imidlertid viktig å sjekke om proteinet som skal trekkes ut er løselig i supernatanten. Følgende protokoll ble testet for svin nyre, og forskjellige museorganer, inkludert lever, hjerte, hjerne og nyre.
    1. Klargjør overføringsbufferen på 10x western blot (se tabell 1). Forbered den 1x vestlige blot overføringsbufferen (se tabell 1) og avkjøl den til 4 °C.
    2. Aktiver en PVDF-membran i 2 min i metanol. Vask membranen i ddH2O i 2 min. Likevekt membranen i 15 min i 1x vestlig blot overføringsbuffer.
    3. Vask SDS-gel med 1x PBS i 10 minutter mens du rister for å fjerne SDS-løpebufferen, og inkuber deretter gelen i 1x vestlig blot overføringsbuffer i 10 minutter for likevekt. Monter elektroblottingskassett (dvs. kombinere den aktiverte PVDF membranen og gelene) i henhold til produsentens instruksjoner.
    4. Kjør flekken via elektroblotting ved 300 mA i 1 time i en skumboks i polystyren fylt med is eller i kjølerommet (4 °C). Overfør PVDF-membranen til et 50 ml rør med den eksponerte siden vendt mot innsiden av røret. Inkuber membranen i 20 ml vestlig blotblokkeringsbuffer (se tabell 1) over natten ved 4 °C mens du ruller på en rørrulle (se Materialtabell).
    5. Neste dag, vask membranen i 5 min med 20 ml vestlig blotvaskbuffer (PBS med 0,1% (v / v) Tween 20) i samme rør mens du ruller. Inkuber membranen i samme rør med det primæreantistoffet 2 (rettet mot FAHD1; se tabell 1) fortynnet 1:500 i vestlig blot blokkeringsbuffer i 1 time ved romtemperatur under rulling.
    6. Vask membranen i samme rør tre ganger i 10 minutter hver med 20 ml vestlig blotvaskbuffer mens du ruller. Inkuber membranen i 30 minutter ved romtemperatur med HRP-konjugert sekundært antistoff (se materialtabell) fortynnet 1:3000 i 5 ml vestlig blot blokkeringsbuffer.
    7. Vask membranen i samme rør tre ganger i 10 minutter hver med 20 ml vestlig blotvaskbuffer og to ganger i 5 minutter hver med 1x PBS. Tørk membranen ved å holde den forsiktig med pinsett på den ene kanten, og ved å berøre et stykke cellulose eller et stykke Whatman-papir med motsatt (nedre) kant av membranen. Sett membranen (eksponert side opp) på en rengjort glassplate.
    8. Dekk forsiktig hele membranen med 1 ml forberedt ECL vestlig blot substrat ved hjelp av en pipette, pass på at du ikke lager noen luftbobler. La ECL-oppløsningen inkubere i 3 min, og umiddelbart utvikle membranen ved hjelp av røntgenfilm eller ved hjelp av et bildebehandlingssystem.
      MERK: Hvis proteinet ble oppdaget i ingen av prøvene, men bare i positiv kontroll, kan dette tyde på at proteinet er uoppløselig, eller ikke til stede i tilstrekkelige mengder som skal påvises av antistoffet. Hvis bare nanogram av den positive kontrollen ble lastet inn, er det første scenariet mer sannsynlig. Hvis det ikke ble oppdaget noe protein i det hele tatt, kontroller kvaliteten på antistoffet, og bytt kanskje til et polyklonalt antistoff i stedet for et monoklonalt antistoff. I sjeldne tilfeller, det vil si for noen hydrofobe proteiner, kan proteinet være påviselig etter sentrifugering, men ikke etter filtrering. I et slikt tilfelle anbefales det å bruke spesielle filterenheter for hydrofobe proteiner.
  3. Eventuelt, flekk PVDF membranene etter vestlig blott for å kontrollere vellykket overføring av proteinet fra SDS-PAGE gel til PVDF membranen.
    MERK: Coomassie farging anbefales for feilsøking, metodeutvikling og dokumentasjon, men husk at etter å ha brukt denne protokollen, går membraner tapt til ytterligere vestlig blotanalyse. Ponceau S farging gir svakere farging, men kan brukes hvis membranene skal re-probed.
    1. Forbered små skuffer som inneholder farging (Coomassie eller Ponceau S) og avfargingsløsninger.
    2. Bruk pinsett, legg membranen i fargeløsningen og rist forsiktig til membranen er farget godt (5-10 min).
    3. Overfør membranen inn i destainingsløsningen og rist til løsningen er mettet (5-10 min). Gjenta destaining trinnet til proteinbåndene kan observeres på membranen; Hvis ingen bånd observeres i det hele tatt, gjenta fargingen med lengre inkubasjonstid. Tørk membranen ved å plassere den på en glassplate ved hjelp av pinsett.

4. Testing: Ammonium sulfat nedbør

MERK: Ammoniumsulfatutfelling er en metode for proteinrensing ved å endre oppløseligheten av proteinet. I et foreløpig eksperiment økes ammoniumsulfatkonsentrasjonen sekvensielt til en verdi som utfeller en maksimal mengde proteinforurensninger, samtidig som FAHD1 blir igjen i oppløsning. Oppløseligheten av proteinet blir igjen undersøkt via vestlig blotanalyse.

  1. Fortsett fra trinn 2.3: enten tine en aliquot av prøven eller fortsette direkte etter proteinutvinning (dvs. uten å fryse prøven). Filtrer prøven ved hjelp av en 0,22 μm filterenhet for å utelukke mulige utfellinger etter opptining. Forbered seks 1,5 ml rør på is, og overfør 250 μL prøve inn i hvert rør.
  2. Forbered en fortynningsserie på 5%, 10%, 15%, 20%, 25% og 30% ammoniumsulfat i rørene som er tilberedt ovenfor, og utgjør det endelige volumet til 1000 μL med proteinlysbuffer. Inkuber prøvene ved 4 °C over natten på en rørrotator (se Materialtabell).
  3. Ved hjelp av en sentrifuge på bordplaten, sentrifuge ved 10.000 x g i 30 min ved 4 °C og overfør forsiktig alle supernatantene til separate rør. Lufttørk de resulterende pelletsene og resuspend hver av dem i 1000 μL ddH2O.
  4. For hvert par resuspended pellet og supernatant fra forrige trinn, bland 40 μL med 10 μL 5x SDS prøvebuffer og kok ved 95 °C med åpne lokk til det meste av væsken har fordampet. Deretter bruker du pelletsen på nytt i en blanding av 50% DMSO i ddH2O.
  5. Utfør SDS-PAGE (trinn 3), men kjør gelene på 80 V i 3 timer. For hver konsentrasjon av ammoniumsulfat, last prøvene avledet fra den resuspenderte pellets og supernatanten (trinn 4.3) parvis. Utfør en vestlig blotanalyse (trinn 3).
  6. Se etter den høyeste konsentrasjonen av ammoniumsulfat, hvor proteinet som skal renses (dvs. FAHD1) forblir i prøven avledet fra supernatanten. Basert på resultatene definerer du en ammoniumsulfatutfellingsprotokoll for proteinet av interesse, som skal brukes i fremtidige eksperimenter.
    MERK: Ammoniumsulfat er kjent for å forvrenge SDS-PAGE og vestlig blott. Etter hvert som konsentrasjonen av ammoniumsulfat øker, vil kvaliteten på den vestlige blotanalysen bli kompromittert. Men som med trinn 3 før, brukes denne analysen til å sjekke om oppløseligheten av proteinet av interesse ved gitte konsentrasjoner av ammoniumsulfat. Denne protokollen tar sikte på å utfelle andre proteiner, mens proteinet som skal renses må forbli løselig.

5. Testing: Ionisk utvekslingskromatografi med FPLC

MERK: Molekyler med ladede funksjonelle grupper er bundet til en silikapartikkelkolonne for FPLC, noe som muliggjør differensiering av proteiner i henhold til overflateladningen. Utfør dette trinnet to ganger ved hjelp av kolonnen for kationisk utveksling og anionisk utveksling (se Materialfortegnelse). Protokolltrinnene er de samme for enten kationisk eller anionisk utvekslingskromatografi, men bufferne som skal brukes, er forskjellige (se tabell 1); begge med "lavt salt" 15 mM NaCl og "høyt salt" 1 M NaCl forhold. For kolonnene som brukes, anbefales en strømningshastighet på 1 ml / min.

  1. Konfigurer FPLC-systemet med den anioniske eller kationiske utvekslingskolonnen. Vask kolonnen med 5 kolonnevolumer (CV-er) på 20% EtOH (i H2O), etterfulgt av 5 CVer ddH2O. Vask kolonnen vekselvis med 1 CV lav saltbuffer, høy saltbuffer og igjen lav saltbuffer i rekkefølgen til ingen flere topper blir observert i kromatogrammet, men vask minst en gang.
  2. Etter å ha bestemt den optimale protokollen for ammoniumsulfatutfelling i liten skala (trinn 4), bruk utfellingsprotokollen på 10 ml originalt vevshomogenat (trinn 2). Alternativt kan du dialyze prøven mot lav saltbuffer.
    1. Påfør prøven på kolonnen (f.eks. ved injeksjon eller ved hjelp av en prøvepumpe) og samle gjennomstrømningen. Vask kolonnen med 1 CV av lav saltbuffer.
  3. Sett opp en lineær gradient elution fra 100% lav saltbuffer / 0% høy saltbuffer til 0% lav saltbuffer / 100% høy saltbuffer innen 3 CV-er. Samle kontinuerlig 1 ml fraksjoner. Etter at gradienten er ferdig, fortsett å kjøre med den høye saltbufferen til det ikke oppdages flere proteinrelaterte topper (UV-absorpsjon ved 280/255 nm) i kromatogrammet over området 1 CV.
  4. Påfør 1 ml 25% SDS oppløst i 0,5 M NaOH (i ddH2O) for å rengjøre kolonnen. Vask kolonnen fortløpende med 3 CD-er med ddH2O og 3 CD-er på 20 % EtOH (i ddH2O).
  5. Samle SDS-PAGE-prøver av alle toppfraksjoner og gjennomstrømningen, og sonder dem via vestlig blot for tilstedeværelsen av proteinet av interesse (trinn 3). Frysing av de oppsamlede fraksjonene i flytende nitrogen og oppbevar dem ved -80 °C.
  6. Etter at vestlig blotanalyse er fullført, tiner og bassenger fraksjonene som inneholder proteinet av interesse og kaster de andre. Gjenta trinn 5.1-5.5 med den alternative kolonnen (dvs. kationisk eller anionisk utvekslingskolonne).
  7. Etter at begge kolonnene er undersøkt, definerer du en FPLC-protokoll for proteinet av interesse, som skal brukes i fremtidige eksperimenter. Reduser volumet av proteinoppløsningen ved hjelp av ultra-sentrifugeringsfilterenheter (10 kDa, se Materialfortegnelse) ned til 2 ml.
    MERK: Det er to forventede resultater av denne serien av eksperimenter. Enten har proteinet av interesse festet seg til en av kolonnene, og proteinoppløsningen er allerede ganske ren etter elution, eller proteinet forblir i gjennomstrømningen i begge tilfeller. I sistnevnte scenario, selv om proteinet er i gjennomstrømningen, kan rengjøringseffekten av dette trinnet fortsatt være betydelig. I et slikt tilfelle, som for FAHD1 i svin nyre- og muselever, vil dette trinnet med ionisk utveksling fortsatt bli utført. Hvis verken den kationiske eller anioniske utvekslingskolonnen kan gi en riktig rengjøringseffekt, kan man prøve å endre pH for lysatet og bufferen, og å ringe prøven mot den kjørende bufferen før programmet til FPLC.

6. Proteinutvinning ved bruk av definerte underprotokoller for ammoniumsulfat-utfelling og FPLC

MERK: Porøse partikler i en silikagelkolonne for FPLC (Se materialfortegnelse) muliggjør differensiering av proteiner i henhold til deres hydrodynamiske radius. De beskrevne trinnene skal utføres med et FPLC-system, ved hjelp av størrelsesekskluderingskromatografi (SEC). For SEC-kolonnen som brukes (se Materialtabell), anbefales en strømningshastighet på 0,3 ml/min.

  1. Forbered alle nødvendige materialer (se trinn 1), og trekk ut det totale proteinet fra vevet (se trinn 2). Utfør en ammoniumsulfatutfelling med alt vevshomogenat som ikke ble brukt til testing (se trinn 4). For større volumer konsentrerer du lysatet ved hjelp av ultra-sentrifugeringsfilterenheter (10 kDa, se Materialliste) ned til et mindre volum på 50 ml eller mindre.
  2. Utfør et første rensetrinn ved hjelp av ionisk utvekslingskromatografi (se trinn 5).
    1. Forbered prøver for vestlig blott, som beskrevet i de forrige trinnene. Utfør vestlig blotanalyse og samle alle FAHD1 som inneholder brøker fra ionisk utvekslingskromatografi.
    2. Reduser volumet av proteinoppløsningen ned til 2 ml ved hjelp av ultra-sentrifugeringsfilterenheter (10 kDa). Filtrer oppløsningen sekvensielt med 0,45 μm og 0,22 μm sprøytefilterenheter for å fjerne eventuell mikronedbør.
  3. Likevekt SEC-kolonnen med 1 CV med SEC-buffer (se tabell 1), som inneholder 1 mM DTT. Last prøven på kolonnen og kjør kromatografien til alle proteinene er eluted (1-2 CV).
    1. Samle brøkdeler av 1 ml av gjennomstrømningen som tilsvarer betydelige topper i kromatogrammet (UV-absorpsjon ved 280/255 nm) og lag 50 μL prøver av hver innsamlede brøkdel for SDS-PAGE og vestlig blotanalyse, som beskrevet i de forrige trinnene. Frys alle fraksjonene ved hjelp av flytende nitrogen, og oppbevar dem ved -80 °C.
  4. Vask SEC-kolonnen fortløpende med 1 CV ddH2O og 1 CV på 20% EtOH (i ddH2O). Utfør western-Blot-analyse, og samle alle FAHD1 som inneholder brøker. Reduser volumet av proteinoppløsningen ned til 2 ml ved hjelp av ultra-sentrifugeringsfilterenheter (10 kDa, se Materialfortegnelse).
  5. Vurder proteinkonsentrasjonen ved hjelp av et kommersielt BCA-analysesett (se Materialtabell).
    MERK: pH- og saltinnholdet i mobilfasen kan påvirke elutionprofilen til kuleformede proteiner20. Sure eller grunnleggende forhold kan føre til at toppene blir mindre definerte og økte proteinmatriseinteraksjoner som fører til delvis oppbevaring av protein i kolonne20. Denne effekten kan utnyttes for ytterligere proteinrensing. En repetisjon av trinn 6 med forskjellige strømningshastigheter, pH og saltkonsentrasjoner kan forbedre renheten til proteinet20.

7. Sølv flekker

MERK: Sølvfargingsanalyse av SDS-PAGE geler er nødvendig for å se etter proteinforurensninger som kanskje ikke sees med Coomassie-farging. Følgende protokoll er en av mange versjoner som finnes i litteraturen21. Utfør alle inkubasjonstrinnene ved å riste i et rent glassbrett. Samle alle sølv- og formaldehydholdige væsker i en spesiell avfallsbeholder og kast dem riktig.

  1. Inkuber SDS-PAGE gelene i sølvflekkingsfikseringsløsning (se tabell 1) over natten i kjølerommet. Inkuber gelene i sølvfarging inkubasjonsoppløsning (se tabell 1) i 3 timer ved romtemperatur. Du kan også legge til glutaraldehyd (se tabell 1) for å forbedre påvisning av svake bånd. Vask gelene fire ganger i ddH2O i 10 min hver.
  2. Inkuber gelene i sølvfarget sølvoppløsning (se tabell 1) i 1 time.
    MERK: Husk at fra nå av inneholder alle væskene og selve gelen sølv og formaldehyd som er giftige.
  3. Inkuber gelene i sølvfargingsutviklerløsningen (se tabell 1) med kraftig risting til båndene er godt synlige. For å stoppe reaksjonen, kast utviklerløsningen og inkuber straks gelene i sølvflekkeringsstoppløsning (se tabell 1) i minst 10 minutter.
    MERK: Bånd som er farget i trinn 7.2 og 7.3 vil stadig bli mer utviklede. Å legge til mer formaldehyd til løsningen enn angitt kan være nødvendig hvis fargingen er svak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

FAHD1 protein ble ekstrahert fra svin nyre og mus lever ved hjelp av den presenterte protokollen. For musevev er det nødvendig med flere organer for å oppnå flere μg etter det endelige rensetrinnet. Av denne grunn fokuserer denne artikkelen på utvinning av FAHD1 fra svin nyrer, som er et mye mer eksemplarisk eksperiment. Utvinningen av FAHD1 fra muselever utføres for å presentere vanskelighetene og mulige fallgruver i denne protokollen. Det anbefales generelt å bruke organer som viser et høyt uttrykksnivå av proteinet man ønsker å rense. Human Protein Atlas22 kan være til hjelp for å estimere uttrykket i modellsystemet, eller man kan utføre foreløpige vestlige bloteksperimenter med forskjellige råvevslysater for å vurdere disse nivåene. Den positive kontrollen som ble brukt i alle vestlige blotanalyser var et merket rekombinant protein, som gikk med en litt høyere molekylvekt.

Som et første eksperiment presenteres utvinningen av FAHD1 fra svin nyre. Prosessen med vevshomogenisering (trinn 1) og total proteinekstraksjon (trinn 2) presenteres i supplerende figur 1 (se forklaringen for en beskrivelse av de enkelte trinnene). En aliquoted tiendedel av den totale lysate ble brukt til følgende eksperimenter.

Ammoniumsulfatutfelling ble testet en gang for dette lysatet, ved å tilsette ammoniumsulfat til lysatet i forskjellige konsentrasjoner (trinn 4) (figur 2). Etter sentrifugering ble pellets og supernatanter samplet og analysert med vestlig flekk ved hjelp av et definert polyklonalt antistoff2 hevet mot human FAHD1. 200 ng rekombinant Hans/S-merket humant FAHD1 hentet fra E. coli12 ble lastet som den positive kontrollen. FAHD1 proteinbånd kan sees på 25 kDa, mens den taggede positive kontrollen kjører på 34 kDa. Basert på disse dataene ble det definert en protokoll der lysatet behandles med 25% ammoniumsulfat, det vil si forhold der FAHD1 fortsatt er i supernatanten, mens flertallet av andre proteiner er utfelt. Dette er et stort skritt i renselsesstrategien. Ammoniumsulfatutfelling er et effektivt rengjøringstrinn før du fortsetter med andre metoder. Vær oppmerksom på at mengder ammoniumsulfat høyere enn 30% ikke vil bli brukt, fordi ammoniumsulfat gradvis forvrenger kvaliteten på SDS-PAGE og vestlig blott.

Figure 2
Figur 2: Ammoniumsulfatutfelling og vestlig blotscreening for svin FAHD1. (A) Ammoniumsulfat ble tilsatt til lysatet i forskjellige konsentrasjoner (5% til 25% maksimum) for å utfelle proteiner fra løsningen. (B) Tilstedeværelsen av svin FAHD1 (25 kDa) ble bestemt i de enkelte par pellets og supernatant tilsvarende varierende ammoniumsulfatkonsentrasjoner via vestlig flekk ved hjelp av et polyklonalt antistoff reist mot menneskelig FAHD1. Den supernatante tilsvarende 25% ammoniumsulfatutfellingen viser fortsatt tilstedeværelsen av svin FAHD1 i supernatanten, samtidig som det utfeller en god mengde andre proteiner. 200 ng his/s-tagget rekombinant protein ble lastet som en positiv kontroll (34 kDa). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Etter å ha testet ioniske utvekslingskolonner med FPLC, ble det definert en strategi der svin FAHD1 forblir i gjennomstrømningen av en anionisk utvekslingskromatografi ved pH 9 (trinn 5). Fra og med lysat oppnådd ved ammoniumsulfatutfelling på 25% (som definert av tidligere testforsøk), ble anionisk utvekslingskromatografi brukt til å eliminere ytterligere proteiner fra løsningen (figur 3A). Bindende proteiner ble fjernet ved elution fra kolonnen, mens gjennomstrømningen ble ytterligere renset via SEC ved pH 7.4 (figur 3B). Etter begge trinnene identifiserte vestlig blotanalyse alle fraksjonene som inneholdt svin FAHD1, som var samlet og konsentrert til 2 ml.

Figure 3
Figur 3: Rensing av svin FAHD1 med FPLC - del 1. Røde piler i kromatogrammet og flekker indikerer tilstedeværelsen av FAHD1. I kromatogrammet betegner "UV" UV-absorpsjonen ved 280 nm, "Cond" betegner ledningsevnen (relatert til saltkonsentrasjonen i bufferen), og "Conc B" betegner prosentandelen av høy saltbuffer i buffergradienten (0% ren lav saltbuffer; 100% ren høy saltbuffer). (A) Rensing av svin FAHD1 fra lysat oppnådd ved ammoniumsulfatnedbør på 25% med en anionisk utvekslingskolonne (FPLC). Mens mange proteiner binder seg til kolonnen, finnes svin FAHD1 i gjennomstrømningen. Smuss og ikke-proteinkontaminanter fjernes ved elution fra kolonnen, mens gjennomstrømningen behandles videre. (B) Gjennomstrømning fra tidligere anionisk utvekslingskromatografi i (A) renses ytterligere via størrelseseksklusjonskromatografi (FPLC) ved pH 7.4. (A,B) Vestlig blotanalyse (beskårne flekker nederst) identifiserte brøker som inneholder svin FAHD1, som er samlet og konsentrert. De fulle blotter skildrer Coomassie-farget membran etter vestlig blot analyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Den filtrerte prøven ble brukt på nytt på SEC, men ved bufferforhold ved pH 9 (se tabell 1) (figur 4). Begrunnelsen bak denne tilnærmingen er at pH- og saltinnholdet i den mobile fasen kan påvirke elutionprofilen til kuleformede proteiner20, og en forbedret elutionprofil for FAHD1 ble funnet under disse bufferforholdene. En brøkdel inneholdt protein med tilstrekkelig renhetsnivå for grunnleggende enzymaktivitetsanalyser12 for endelig å bekrefte proteinets identitet.

Figure 4
Figur 4: Rensing av svin FAHD1 med FPLC - del 2. Røde piler i kromatogrammet og flekker indikerer tilstedeværelsen av FAHD1. Proteinprøver som tidligere er renset med anionisk utveksling og størrelseseksklusjonskromatografi, renses ytterligere via størrelseseksklusjonskromatografi (FPLC) ved pH 9 (topppanel). Vestlig blotanalyse avbildet nederst til høyre identifiserer brøker som inneholder svin FAHD1, som er samlet og konsentrert (bunnpaneler). Flekken i nedre venstre viser Coomassie-fargingen av membranen etter den vestlige blokken. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

En alternativ strategi (dvs. SEC etterfulgt av ionisk utvekslingskromatografi) ble testet med 2 ml lysat oppnådd etter ammoniumsulfatnedbør (trinn 4) (Supplerende figur 2). Begrunnelsen for dette eksperimentet er at ved først å bruke SEC, kan FAHD1 som inneholder fraksjoner skilles fra de fleste andre proteiner, mens en påfølgende ionisk utvekslingskromatografi kan brukes til å rense proteinet ytterligere. For det første ble lysatet fraksjonert ved hjelp av SEC ved pH 7.4 (trinn 6). Vestlig blotanalyse identifiserte alle fraksjoner som inneholdt svin FAHD1. For det andre ble disse fraksjonene konsentrert og ytterligere renset ved hjelp av en anionisk utvekslingskolonne ved pH 9 (trinn 5). Kromatogrammer og vestlig blotanalyse (Supplementary Figure 2) viser at denne strategien er oppmuntrende fordi det ioniske utvekslingskromatogrammet viser en definert smal topp som er forbundet med beriket proteinnivå i den vestlige blotten. Ulempen med denne strategien er imidlertid at den er begrenset av det opprinnelige volumet som skal brukes på SEC (2 ml), så gjennomstrømningen av denne metoden er svært lav. Behandling av en hel svin nyre, for eksempel, er ikke praktisk.

Som en annen endring i denne protokollen ble en kationisk utvekslingskolonne inkludert før den anioniske utvekslingskolonnen da svinet FAHD1 også var til stede i gjennomstrømningen. På hvert trinn i protokollen ble prøver av svin FAHD1 som inneholder brøker samplet og testet med en ODx-analyse, som beskrevet andre steder12 (Tilleggs figur 3). Den spesifikke enzymatiske aktiviteten øker sammen med renhetsnivået, det vil si sammen med den økende relative mengden FAHD1 per totalt protein.

Som et annet eksempel presenteres utvinning av FAHD1 fra muselever, det vil si en samling levervev hentet fra 20 mus. Sammenlignet med utvinning av FAHD1 fra svin nyre presentert ovenfor, viste denne utvinningen seg å være mer kjedelig. Det oppstod problemer ved flere trinn i protokollen, som vil bli presentert i følgende. Totalt protein ble ekstrahert som beskrevet i trinn 2 (Supplerende figur 4). Ettersom muslever homogenat har en tendens til å være en veldig klebrig og slimete enhet, ble filterpapir (lik kaffefilterenheter) brukt til å forhåndsfiltrere lysatet, som ble fortynnet 1:3 i lysisbuffer etter ekstraksjon, for å gjøre løsningen mer som en væske. Denne fortynning forbedret filtreringsprosedyren; Det gjorde imidlertid den påfølgende påvisning av proteinet med vestlig blot mer kjedelig. Etter filtrering måtte den tilberedte lysatet konsentreres før videre bruk. En aliquoted tiendedel av den totale lysate ble brukt til følgende eksperimenter.

Et første testtrinn for ammoniumsulfatnedbør (tilleggsfigur 4I) viste et mulig problem som kan oppstå. Ammoniumsulfat ved høyere konsentrasjoner forstyrrer SDS-PAGE geler og forårsaker en smileeffekt når det kjøres ved 150 V (tilleggs figur 5A; negativt resultat). Den samme SDS-PAGE-kjøringen ved 80 V viser et positivt resultat (tilleggs figur 5B). I sistnevnte tilfelle dannes smileeffekten i utgangspunktet, men løses til slutt på grunn av den lavere spenningen som brukes. Ettersom den første løsningen måtte fortynnes sterkt for å kunne filtrate lysatet, var den første vestlige blotanalysen av disse prøvene mislykket, det vil si at den positive kontrollen ble oppdaget av antistoffet, men ikke proteinet i de påførte prøvene. Dette problemet ble løst ved hjelp av en høyere konsentrasjon av både lysate (konsentrert ved hjelp av sentrifugalfilterenheter) og antistoffet, og ved å bruke antistoffet over natten i det kalde rommet mens du ristet. Til slutt ga den vestlige blotanalysen både informasjonsbitene som proteinet var til stede i lysatet, og at proteinet fortsatt var til stede i supernatanten ved 15% ammoniumsulfat (Supplerende figur 5C). Vær oppmerksom på at SDS-prøver som inneholder høyere mengder ammoniumsulfat (>15%) utfelles under oppvarming og proteinet gikk tapt. Dette kan også ses i Coomassie farging og den vestlige blot (Supplementary Figure 5C). Denne effekten ble ikke observert for svin nyre, så det kan være vevsspesifikk.

Etter ammoniumsulfatnedbør på 15%, ble 10 ml lysat brukt på kationisk utvekslingskromatografi ved pH 6,8. Vestlig blotanalyse viste musen FAHD1 protein å være i gjennomstrømningen (figur 5A). Den rømte proteinfraksjonen ser ut til å være liten; Dette eksemplet viser imidlertid en sekundær effekt av ionisk utvekslingskromatografi. På dette trinnet i protokollen kan løsningen fortsatt inneholde mange forbindelser som kanskje ikke er protein. Ionisk utvekslingskromatografi er en rask og enkel måte å kvitte seg med slike forurensninger. Gitt at det tar noen timer å utføre ionisk utvekslingskromatografi (inkludert alle vasketrinn, tar selve eksperimentet en halv time), det gir en enkel metode for å fjerne prøven fra ikke-proteinforurensninger.

Figure 5
Figur 5: Rensing av musen FAHD1 med FPLC. Røde piler i kromatogrammet og flekker indikerer tilstedeværelsen av FAHD1. (A) Etter ammoniumsulfatutfelling på 15%, ble prøven sentrifugert, filtrert (0,22 μm), og påført en kationisk utvekslingskolonne. Vestlig blotanalyse viser at proteinet er i gjennomstrømningen og kromatogrammet viser at ikke mye av de andre proteinene er fjernet av dette trinnet. Sammenligning av utseendet og viskositeten til inngangen med gjennomstrømningen viser imidlertid at den innsamlede gjennomstrømningen er mye tydeligere (høyre panel som sammenligner inndata og gjennomstrømning). (B) Gjennomstrømningen som ble samlet inn fra kationisk utvekslingskolonne ble redusert til 2 ml via sentrifugeringsfiltre og brukt på størrelseseksklusjonskromatografi ved pH 7.4. (C) Fraksjonene som inneholder FAHD1 ble samlet, konsentrert og anvendt på en andre runde med størrelseseksklusjonskromatografi ved pH 9. (D) Brøkene som inneholder FAHD1 ble igjen samlet og påført SDS-PAGE med sølvfarging, for å se de resterende forurensningene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Utvalget ble videre brukt på størrelseseksklusjonsk kromatografi ved pH 7.4 (figur 5B). Western blot analyse viste brøkdeler som inneholder musen FAHD1 protein, som var samlet og konsentrert til 2 ml. Dette 2 ml konsentratet ble frosset ved -20 °C med 10 μL β-mercaptoetanol og tint neste dag. Det ble dannet et bunnfall som ble filtrert via sprøytefilterenheter (0,22 μm). Prøver for SDS-PAGE og vestlig blotanalyse ble tatt for å sikre at musen FAHD1 protein fortsatt var i løsning.

Prøver som inneholder proteinet (fra vestlig blotanalyse) ble samlet, konsentrert via sentrifugeringsfiltre, og brukt på SDS-PAGE med sølvfarging for å se de resterende forurensningene (figur 5D). Dette avslørte at proteinløsningen ikke er svært ren, og at mengden protein oppnådd via denne metoden fra muselever heller ikke var veldig høy (noen få μg totalt som bestemt ved hjelp av BCA-analysesett; se Materialtabell). Proteinutbyttet var mye høyere når det gjelder svin FAHD1 (ca. 1 mg i dette trinnet). Nivået av renhet av FAHD1 protein ekstrahert fra svin nyre er ca 80% (estimert etter sølvfarging; data ikke vist). Denne renheten kan økes ytterligere via for eksempel affinitetskromatografi ved hjelp av et definert antistoff. Slike og andre begrensninger i denne protokollen vil bli diskutert i detalj lenger nedenfor.

Navn på buffer/løsning/materiale Komposisjon
Coomassie destaining løsning 30% (v / v) EtOH; 5 % (v/v) HOAc; i ddH2O
Coomassie farging løsning 0,05% Coomassie Strålende Blå R-250; 50 % (v/v) MeOH; 10 % (v/v) HOAc; i ddH2O
Mono Q høy saltbuffer 20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % glyserol; i ddH2O; justere pH til 9,0 med NaOH
Mono Q lav saltbuffer 20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; i ddH2O; justere pH til 9,0 med NaOH
Mono S høy saltbuffer 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1 M NaCl; i ddH2O; justere pH til 6,8 med HCl
Mono S lav saltbuffer 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 15 mM NaCl; i ddH2O; justere pH til 6,8 med HCl
Protein lysis buffer 1x PBS (250 ml); 50 mM NaF; 1mM PMSF; 2 μg/ml aprotinin, 1 mM aktivert orthovanadate; i ddH2O
Kanin Anti-hFAHD1 polyklonalt antistoff (affinitet isolert) Skreddersydd; polyklonalt anti-hFAHD1 antistoff renset fra kaninserum og renset med FPLC i henhold til referanse 12
Rekombinant hFAHD1 protein vestlig blot kontroll Vestlig flekkkontrollprotein uttrykt i E.coli og renset med FPLC i henhold til referanse 12.
SDS-PAGE 5x-eksempelbuffer 300 mM Tris HCl; 500 mM DDT; 10% (m / v) SDS; 50% (v / v) glyserin; 0,05% (m/v) bromofenol blå; i ddH2O; justere pH til 6,8 med HCl
SDS-PAGE-oppløsning av gel (12,5 %) for seponert SIDE ddH2O (9,5 ml); 3 M Tris HCl (2,2 ml); 5,5 ml 40 % akrylamid/bis-løsning (29:1-forhold); 20% SDS (175 μL); TEMED (17 μL); 10% ammoniumpersulfat (175 μL); støpt før stablingsgelen og la den polymerisere; støpt stablingsgelen på toppen
SDS-PAGE-buffer som kjører 25 mM Tris HCl; 190 mM glycin; 0,5 % (m/v) SDS; i ddH2O; justere pH til 8,3 med NaOH
SDS-PAGE stablingsgel (12,5 %) for seponert side ddH2O (3,8 ml); 1 M Tris HCl (630 μL); 500 μL 40% akrylamid/bis-oppløsning (29:1-rasjon); 20% SDS (25 μL); TEMED (5 μL); 10% ammoniumpersulfat (50 μL); støpt etter at den løsende gelen har polymerisert; påfør en gelkam for å lage brønner
SEC (G75) som kjører buffer 15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; i ddH2O; justere pH til 7,4 med NaOH
Sølv farging utviklende løsning 250 mM Na2CO3 i ddH2O; tilsett 12 μL 37 % (v/v) formaldehyd til 100 ml før bruk
Sølv farging fikse løsning 40% (v / v) EtOH; 10% (v / v) HOAc; i ddH2O
Sølv farging inkubasjon løsning 30% (v / v) EtOH; 500 mM NaOAc; 8 mM Na2S2O3; i ddH2O; valgfritt: tilsett 600 μL 50 % (v/v) glutaraldehyd per 100 ml før bruk
Sølv farging sølv løsning 0,1 % (m/v) AgNO3; i ddH2O; tilsett 25 μL 37 % (v/v) formaldehyd til 100 ml før bruk
Sølv farging stopp løsning 40 mM EDTA-oppløsning ved pH 7.6; overføre 744 mg EDTA til 40 ml ddH2O og tilsett deretter NaOH for å oppløse og justere pH til 7,6. Til slutt justerer du det totale volumet til 50 ml.
Vestlig blot blokkeringsbuffer PBS med 0,1% (v/v) Tween 20 og 5% (m/v) skummet melkepulver; filtrated
Vestlig blot overføringsbuffer (10x) Tris-HCl 250 mM; glycin 1,92 M; i ddH2O; justere pH til 8,3 med NaOH; oppbevare ved romtemperatur
Vestlig blot overføringsbuffer (1x) Vestlig blot overføringsbuffer (10x) 100 ml; 800 ml ddH2O; 100 ml MeOH; oppbevare ved 4 °C
Vestlig blot vaskebuffer (PBS-T) PBS med 0,1 % (v/v) Tween 20

Tabell 1.

Supplerende figur 1: Total proteinekstraksjon fra svin nyre. (A) Nyrevev ble kuttet ved hjelp av en skalpell på en forberedt riktig rengjort glassplate satt på polystyrenskum for å forhindre glidning; (B) 50 ml rør som inneholder 20 ml iskald lysisbuffer med protein/proteasehemmere inkuberes på is; (C) nyrevevsstykker ble satt inn i bufferen til volumet nådde ca. 30 ml; (D) nyrevev ble homogenisert ved hjelp av ultralyd (dvs. sonikering); (E) rå homogenat ble sentrifugert i en bord-topp sentrifuge med middels hastighet i 30 min; (F) flere prøver ble behandlet samtidig; (G) etter første sentrifugering ble supernatanten overført til sentrifugerør (sammenlignet med E), og sentrifugert med høy hastighet (10.000 x g) i 30 min; (H) dette sentrifugeringstrinnet gir en annen pellets og supernatant, som overføres til 50 ml rør; (I/J) pre-lysatet filtreres sekvensielt med 0,45 μm og 0,2 μm filterenheter, aliquoted i 10 ml partier, og snap-frozen med flytende nitrogen for senere lagring ved -80 °C. Vestlig blotanalyse brukes til å verifisere tilstedeværelsen av proteinet i alle prøver (pellets, supernatanter, filtrert lysat). Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 2: Rensing av svin FAHD1 med FPLC; alternativ strategi. Røde piler i kromatogrammet og flekker indikerer tilstedeværelsen av FAHD1. (A) Rensing av svin FAHD1 fra lysat oppnådd ved ammoniumsulfatutfelling ved 25% med størrelseseksklusjonskromatografi (FPLC) ved pH 7.4. Vestlig blotanalyse identifiserte brøker som inneholder svin FAHD1, som var samlet og konsentrert. (B) Proteinprøver som tidligere ble renset med størrelsesekskluderingskromatografi (panel A) ble ytterligere renset via anionisk utvekslingskromatografi (FPLC). Vestlig blotanalyse identifiserer brøker som inneholder svin FAHD1, som var samlet og konsentrert. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 3: Spesifikk enzymaktivitet av svin FAHD1. Målt spesifikk enzymaktivitet som en funksjon av økende renhetsnivå. Tabellen sammenligner relativ enzymaktivitet (nmol/min) med spesifikk enzymaktivitet (μmol/min/mg). Analysen viser en stadig økende aktivitet av svin FAHD1 etter hvert rensetrinn. Sammenlignet med den rekombinante Hans/S-menneskelige FAHD1 (grønn) hentet fra E. coli. 12, svin FAHD1 viste en litt høyere aktivitet (rød) (n = 3). Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 4: Total proteinutvinning fra muselever. (A,B,C) Snap-frossent levervev fra 20 mus og lysisbuffer ble tilberedt på is i 50 ml rør; (D,E,F) levervev ble homogenisert ved hjelp av ultralyd (dvs. sonikering); rå homogenat ble sentrifugert i en bord-topp sentrifuge med middels hastighet i 30 min; supernatanten ble overført til sentrifugerør, og sentrifugert med høy hastighet (10.000 x g) i 30 min; (G,H,I) pre-lysate filtreres sekvensielt av papirfiltre, 0,45 μm og 0,2 μm filterenheter, aliquoted i 10 ml partier og snap-frozen med flytende nitrogen for senere lagring ved -80 °C; (J) ammoniumsulfat ble tilsatt til lysatet i forskjellige konsentrasjoner (5% til 30% maksimum) for å utfelle protein fra løsningen; (K) pellets oppnådd etter ammoniumsulfatutfelling (panel J) ble resuspendert i H2O for å ta prøver for SDS-PAGE og vestlig blotanalyse. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 5: Ammoniumsulfatutfelling og vestlig blotscreening for mus FAHD1. Røde piler i blottene indikerer tilstedeværelsen av FAHD1. (A) SDS-PAGE med prøver innhentet etter at ammoniumsulfatutfelling ble kjørt ved 125 V. Denne gelen viste en drastisk smileffekt, og en slik gel kan ikke evalueres. Dette er et eksempel på et negativt resultat. (B) SDS-PAGE med de samme prøvene (panel A) ble kjørt ved 80 V til den var fullført. Det er ingen smileeffekt i denne gelen, og dette er et eksempel på et positivt resultat. (C) SDS PAGE og vestlig blotanalyse av prøvene oppnådd etter ammoniumsulfatutfelling. Prøver ved høyere konsentrasjoner av ammoniumsulfat kan utløses inne i prøvebufferen, som angitt. De går tapt og kan ikke oppdages lenger, verken via Coomassie farging (venstre) eller vestlig blot analyse (høyre). Den beste konsentrasjonen av ammoniumsulfat, i dette tilfellet, ble fastslått å være 15%. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiske trinn i protokollen
Det er viktig å følge vanlige retningslinjer for håndtering av proteiner, som å jobbe på is og ved moderate pH- og saltforhold. Bruken av proteasehemmere er gunstig for metoden, mens bruk av proteasomhemmere anbefales på det sterkeste. Frysing og opptining av prøven kan alltid resultere i proteinutfelling (i det minste delvis), slik at eventuell tint aliquot av innledende proteinlysat (trinn 2) skal behandles kontinuerlig uten pause. Sentrifugering og filtrering etter opptining anbefales vanligvis å fjerne mikroprecipitation.

Det første proteinlyset som er oppnådd fra et vev, inneholder fortsatt mange stoffer i tillegg til proteiner. Ionisk utveksling kromatografi kolonner kan brukes til å fjerne lysate. Selv om proteinet man ønsker å trekke ut ikke binder seg til ionisk utvekslingskolonne, kan gjennomstrømningen være mye tydeligere enn inngangsløsningen, og lettere å bli behandlet i etterfølgende trinn. Dette er vist for utvinning av FAHD1 fra muse nyrer (se figur 5A).

Begrensninger og modifikasjoner av metoden
Denne protokollen beskriver en protokoll for utvinning av FAHD1 fra vevet. Basert på denne strategien kan en generell tilnærming for utvinning av FAHD-proteiner (FAHD1, FAHD2) fra annet vev avledes, mens spesifikke tilpasninger kan være nødvendig for individuelle tilfeller. Den implisitte begrensningen av denne metoden er de relative uttrykksnivåene til FAHD1 (eller FAHD-proteiner) i et gitt vev og tilgjengeligheten av dette vevet i tilstrekkelige mengder. Den generelle ordningen beskrevet i denne protokollen krever et høyt uttrykk for proteinet i en passende mengde vev til å begynne med. Eksempler på utvinning av FAHD1 fra svin nyre og mus lever har blitt gitt, som er to organer som viser høye uttrykk nivåer av proteinet. På hvert trinn som er beskrevet i denne protokollen, er det et implisitt tap av prøve, det vil si at den lave innledende mengden protein blir enda mindre. Til syvende og sist kan bare lave mengder protein oppnås ved hjelp av denne protokollen. Fordi svin nyre er et stort organ, omtrent et gram protein (ca 80% renhet; estimert) kan ekstraheres ved denne tilnærmingen fra to nyrer. Påføring av samme protokoll for utvinning av FAHD1 fra muselever krevde innsamling av leverprøver fra 20 mus, for å oppnå bare noen få μg protein til slutt. Å oppnå høyere renhet av proteinet ved hjelp av de skisserte metodene kan være kjedelig, og sølvfarging avslører at etter størrelseseksklusjonskromatografi kan det fortsatt være mange andre proteiner i løsningen. Man kan forsterke denne protokollen via affinitetskromatografi (NHS-aktiverte kolonner), ved hjelp av et monoklonalt antistoff (f.eks.

Alle protokollene som er oppført her, krever at proteinet man ønsker å trekke ut er løselig. Optimale forhold for ammoniumsulfatutfelling og pH/saltjusteringer for kromatografi må testes og defineres. I tilfelle den ioniske utvekslingskromatografien ikke gir noen gode renseresultater, kan dialyse mot en kromatografibuffer før du utfører FPLC være et alternativ for å forbedre oppløseligheten av proteinet og oppløsningen av kromatografien. Det anbefales imidlertid ikke å dialyze råoljelyset, da dette kan føre til massiv og ukontrollert proteinutfelling inne i dialyserøret. Problemer kan oppstå hvis proteinet har en tendens til å være hydrofobt, og protokollene kan ikke være aktuelle hvis proteinet er svært hydrofobt (f.eks. membranproteiner). Hvis FAHD-proteiner er delvis uoppløselige som funnet for FAHD2 (data ikke vist) i et gitt vevslysat, kan andre typer kromatografi, for eksempel hydrofob interaksjonskromatografi (HIC), utforskes også12.

To endringer i standardprotokollen er vist i resultatdelen. For rensing av FAHD1 fra en svin nyre, ble størrelseseksklusjon kromatografi brukt før ionisk utveksling kromatografi (se supplerende figur 2). Et problem med denne metoden er at størrelsesekskluderingskromatografi har større løpende spor, og prøvevolumet øker sterkt under kjøringen. Prøvevolumet bør ikke overstige 2% av sengevolumet for å oppnå høy oppløsning23, og den endelige fortynningsfaktoren avhenger også av det innsamlede elutionvolumet. I det medfølgende eksemplet ved hjelp av en 120 ml kolonne anbefales et innledende volum på 2 ml. Den første prøven kan hentes fra flere ml av lysatet etter ammoniumsulfatutfelling, ved konsentrasjon ved hjelp av sentrifugalfilterenheter, uten aggregering eller nedbørsartefakter. Et eksempel for rensing av FAHD1 fra svin nyre er gitt som et representativt resultat (se også Supplerende figur 2). Begrensningen for bare små utvalgsvolumer kan imidlertid gjøre denne tilnærmingen uraktisk.

Bruksområder eller retninger for metoden
Uttrykk og rensing av rekombinante proteiner fra bakterier er en enkel og veletablert metode for å oppnå mulige mengder (i gram) protein24,25. Dette er presentert for FAHD112. Det er imidlertid flere mulige ulemper ved å bruke disse metodene, for eksempel mulig dårlig vekst av verten, inkluderingskroppsdannelse, tap av eller endret proteinaktivitet, og derfor muligheten for ikke å skaffe noe protein i det hele tatt, eller resultere i en partisk form av proteinet (feilfolding, dårlige postoversettelsesendringer, etc.). Å utvikle metoder som kan trekke ut godt brettet og riktig modifisert protein fra vev direkte, er derfor tiltalende. Det største problemet er imidlertid at de fleste proteiner ikke uttrykkes på betydelige nivåer, og sammenlignet med implisitt induksjon og etterfølgende utvinning av protein fra bakterier, er mengden protein som skal oppnås vanligvis flere størrelsesordener lavere. Det er en avveining mellom billig og enkel utvinning av rekombinant protein fra bakterier og den dyrere og kjedeligere utvinningen av protein fra vev. Det viktigste fremskrittet med sistnevnte er at man kan trekke ut proteinet i sin fysiologiske form som er tilstede i vevet, inkludert alle gjensidige effekter som kan påvirke folding og / eller katalytisk aktivitet.

Protein ekstrahert og renset av denne protokollen vil bidra til å identifisere kompetente hemmere av FAHD113, mulige proteininteraksjonspartnere9, og mulige, men likevel uoppdagede roller avproteinet 9. Studien av enzymatiske hemmere, utvikling av monoklonale antistoffer og studiet av proteinstrukturen i utgangspunktet støttes sterkt når man har protein ved høy renhet ekstrahert fra vev i stedet for ekstrahert fra bakterier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forfatterne er svært takknemlige for den tekniske hjelpen til Ayse Öztürk og Eva Albertini. Mus som brukes til generering av levervev ble opprettholdt under tilsyn av Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr (Institutt for biomedisinsk aldringsforskning ved Innsbruck University, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Østerrike).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm filter units MERCK SLGP033RS Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, not steril
0.45 µm filter units MERCK SLHP033NS Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, not steril
15 mL Falcon tubes VWR 734-0451 centrifugal tubes
50 mL Falcon tubes VWR 734-0448 centrifugal tubes
96-Well UV Microplate Thermo-Fischer 8404 UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates
Acrylamide/Bis Solution (40%, 29:1 ratio) BIO-RAD #1610147 40% acrylamide/bis-acrylamide, 29:1 (3.3% crosslinker) solution for casting polyacrylamide gels
ÄKTA FPLC system GE Healthcare Life Sciences / Cytiva - using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the "ÄKTA pure" system
Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa MERCK UFC901024 centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 15 mL
Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa MERCK UFC801024 centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 4 mL
Ammonium sulfate powder MERCK A4418 ammonium sulphate for molecular biology, ≥99.0%
Ammoniumpersulfat reagent grade, 98% MERCK 215589 Catalyst for acrylamide gel polymerization.
Coomassie Brilliant blue R 250 MERCK 1125530025 Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) for electrophoresis Trademark of Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g/l, H2O, 25 °C)
Dialysis tubing cellulose membrane MERCK D9277 Cellulose membranes for the exchange of buffers via dialysis.
Eppendof tubes 1.5 mL VWR 525-1042 microcentrifugal tubes; autoclaved
HiLoad 26/600 Superdex 75 pg GE Healthcare Life Sciences / Cytiva 28989334 HiLoad Superdex 75 pg prepacked columns are for high-resolution size exclusion chromatography of recombinant proteins
Immun-Blot PVDF Membrane BIO-RAD #1620177 PVDF membranes are protein blotting membranes optimized for fluorescent and multiplex fluorescent applications.
Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell BIO-RAD #1703930 Use the Mini Trans-Blot Cell for rapid blotting of Mini-PROTEAN precast and handcast gels.
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels BIO-RAD #1658004 4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam.
Mono Q 10/100 GL GE Healthcare Life Sciences / Cytiva 17516701 Mono Q columns are strong anion exchange chromatography columns for protein analysis or small scale, high resolution polishing of proteins.
Mono S 10/100 GL GE Healthcare Life Sciences / Cytiva 17516901 Mono S columns are strong cation exchange chromatography columns for protein analysis or small scale high resolution polishing of proteins.
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa Thermo-Fischer 26616 A mixture of 10 blue-, orange-, and green-stained proteins (10 to 180 kDa) for use as size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting.
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo-Fischer 23225 A two-component, high-precision, detergent-compatible protein assay for determination of protein concentration.
Sonifier 250; Ultrasonic Cell Disruptor w/ Converter Branson - New models at https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf
Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (affinity isolated) Agilent Dako P0399 The antibody used for horseradish peroxidase conjugation reacts with rabbit immunoglobulins of all classes.
TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethane, TMEDA MERCK T9281 TEMED (N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine) is molecule which allows rapid polymerization of polyacrylamide gels.
Tube Roller - - A general tube rotator roller; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71
Tube Rotator - - A general tube rotator wheel; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123
ULTRA-TURRAX; T 25 digital IKA 0003725000 New models at https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pircher, H., et al. Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase. Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).
  2. Pircher, H., et al. Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase. Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).
  3. Kang, T. -W., et al. Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development. Nature. 479 (7374), 547-551 (2011).
  4. Hong, H., Seo, H., Park, W., Kim, K. K. -J. Sequence, structure and function-based classification of the broadly conserved FAH superfamily reveals two distinct fumarylpyruvate hydrolase subfamilies. Environmental Microbiology. 22 (1), 270-285 (2020).
  5. Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase. Structure. 7 (9), London, England. 1023-1033 (1999).
  6. Bateman, R. L., et al. Mechanistic inferences from the crystal structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a bound phosphorus-based inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 276 (18), 15284-15291 (2001).
  7. Weiss, A. K. H., et al. Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1. Biochemical Journal. 475 (22), 3561-3576 (2018).
  8. Etemad, S., et al. Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 - a new regulator of mitochondrial function and senescence. Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).
  9. Weiss, A. K. H., et al. Regulation of cellular senescence by eukaryotic members of the FAH superfamily - A role in calcium homeostasis. Mechanisms of Ageing and Development. 190, 111284 (2020).
  10. Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-Dürr, P. Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells. Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).
  11. Wiley, C. D., et al. Mitochondrial dysfunction induces senescence with a distinct secretory phenotype. Cell Metabolism. 23 (2), 303-314 (2016).
  12. Weiss, A. K. H., et al. Expression, purification, crystallization, and enzyme assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59729 (2019).
  13. Weiss, A. K. H., et al. Inhibitors of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain Containing Protein 1 (FAHD1). Molcules. 26 (16), 5009 (2021).
  14. Mizutani, H., Kunishima, N. Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8. Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).
  15. Lee, C. H. A simple outline of methods for protein isolation and purification. Endocrinology and Metabolism. 32 (1), Seoul, Korea. 18-22 (2017).
  16. Amer, H. E. A. Purification of proteins: Between meaning and different methods). Proteomics Technologies and Applications. , (2019).
  17. Niu, L., Yuan, H., Gong, F., Wu, X., Wang, W. Protein extraction methods shape much of the extracted proteomes. Frontiers in Plant Science. 9, 802 (2018).
  18. Gordon, J. A. Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).
  19. Gallagher, S. R. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. , (2012).
  20. Ahmed, U., Saunders, G. Effect of pH on Protein Size Exclusion Chromatography. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf (2011).
  21. Sørensen, B. K., et al. Silver staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 304 (1), 33-41 (2002).
  22. Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).
  23. Cytiva Life Fundamentals of size exclusion chromatography. , Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography (2022).
  24. Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Frontiers in Microbiology. 5, 172 (2014).
  25. Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).

Tags

Biokjemi Utgave 180 FAHD FAHD1 oksalacetat dekarboksylase ODx vev FPLC kromatografi proteinekstraksjon
Ekstraksjon og rensing av FAHD1 Protein fra svin nyre og mus lever
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Andric, A., Wagner, E., Heberle, A., … More

Andric, A., Wagner, E., Heberle, A., Holzknecht, M., Weiss, A. K. H. Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver. J. Vis. Exp. (180), e63333, doi:10.3791/63333 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter