Summary
Этот протокол описывает, как извлечь фумарилацетоацетат гидролазу, содержащий домен белка 1 (FAHD1), из почек свиней и печени мыши. Перечисленные способы могут быть адаптированы к другим белкам, представляющим интерес, и модифицированы для других тканей.
Abstract
Фумарилацетоацетат гидролаза, содержащий домен белка 1 (FAHD1), является первым идентифицированным членом надсемейства FAH у эукариот, действующим как оксалоацетатдекарбоксилаза в митохондриях. В данной статье представлен ряд методов экстракции и очистки FAHD1 из почек свиней и печени мышей. Охватываемыми методами являются ионообменная хроматография с быстрой белковой жидкостной хроматографией (FPLC), препаративная и аналитическая гелевая фильтрация с FPLC и протеомные подходы. После полной экстракции белка были исследованы осаждение сульфата аммония и хроматография ионного обмена, а FAHD1 экстрагировали с помощью последовательной стратегии с использованием ионного обмена и размерно-эксклюзионной хроматографии. Этот репрезентативный подход может быть адаптирован к другим белкам, представляющим интерес (выраженным на значительных уровнях) и модифицирован для других тканей. Очищенный белок из ткани может поддерживать выработку высококачественных антител и/или мощных и специфических фармакологических ингибиторов.
Introduction
Эукариотический домен FAH-содержащий белок 1 (FAHD1) действует как бифункциональная оксалоацетат (OAA), декарбоксилаза (ODx)1 и ацилпируватгидролаза (ApH)2. Он локализован в митохондриях2 и принадлежит к широкому надсемейству ферментовFAH 1,2,3,4,5,6. В то время как его активность ApH имеет лишь незначительное значение, активность ODx FAHD1 участвует в регулировании потока цикла TCA 1,7,8,9. OAA не только необходим для реакции центральной цитратсинтазы в цикле трикарбоновой кислоты, но также действует как конкурентный ингибитор сукцинатдегидрогеназы как часть системы переноса электронов и как катаплеротический метаболит. Снижение регуляции экспрессии гена FAHD1 в эндотелиальных клетках пупочных вен человека (HUVEC) привело к значительному снижению скорости пролиферации клеток10 и значительному ингибированию потенциала митохондриальной мембраны, связанного с сопутствующим переходом на гликолиз. Рабочая модель относится к митохондриальной дисфункции, связанной со старением (MiDAS)11-подобным фенотипом8, где уровни митохондриального OAA жестко регулируются активностью FAHD1 1,8,9.
Рекомбинантный белок легче получить путем экспрессии и очистки от бактерий12 , а не от ткани. Однако белок, экспрессируемый в бактериях, может быть смещен из-за возможного отсутствия посттрансляционных модификаций или может быть просто проблематичным (т. Е. Из-за потери плазмид, реакций бактериального стресса, искаженных / несформированных дисульфидных связей, отсутствия или плохой секреции, агрегации белка, протеолитического расщепления и т. Д.). Для определенных применений белок должен быть получен из клеточного лизата или ткани, чтобы включить такие модификации и/или исключить возможные артефакты. Очищенный белок из ткани поддерживает выработку высококачественных антител и/или мощных и специфических фармакологических ингибиторов для выбранных ферментов, таких как FAHD113.
В данной рукописи представлен ряд методов извлечения и очистки FAHD1 из печени свиной почки и мыши. Описанные методы требуют быстрой белковой жидкостной хроматографии (ФПЛК), но в остальном используют общее лабораторное оборудование. Альтернативные методы можно найти в других местах 14,15,16,17. После полной экстракции белка предлагаемый протокол включает в себя фазу тестирования, на которой обсуждаются подпротоколы для осаждения сульфата аммония и хроматографии ионного обмена (рисунок 1). После определения этих подпротоколов интересующий белок извлекается с помощью последовательной стратегии с использованием ионного обмена и размерно-эксклюзионной хроматографии с FPLC. Основываясь на этих руководящих принципах, окончательный протокол может быть адаптирован индивидуально для других белков, представляющих интерес.
Рисунок 1: Общая стратегия этого протокола. Сверху донизу: Белок извлекается из тканей. Тканевый гомогенат готовят, центрифугируют и фильтруют. Для каждой пары образцов, полученных из супернатанта и гранул, необходимо провести испытания на осаждение сульфата аммония и ионно-обменную хроматографию (FPLC) для определения оптимальных условий. После установления этих подпротоколов белок может быть извлечен с помощью последовательной процедуры осаждения сульфата аммония, хроматографии ионнообменной хроматографии и повторяющейся хроматографии с исключением размера (FPLC) при различных концентрациях рН и солей. Все шаги должны контролироваться западным пятном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами. Почки свиней были получены свежими из местного супермаркета. Ткани печени были собраны у мышей дикого типа C57BL6, поддерживаемых в Институте биомедицинских исследований старения при Университете Инсбрука, Rennweg 10, 6020 Инсбрук, Австрия под наблюдением Univ.-Doz. Д-р Пиддер Янсен-Дюрр, на которого распространяется этическое разрешение в качестве руководителя проекта, выданное в 2013 году (BMWF-66.008/0007-II/3b/2013). Обслуживание и использование мышей для проекта охватываются этическим разрешением No 2020-0.242.978 от 5 мая 2020 года, выданным Министерством образования, науки и исследований Австрии (BMBWF).
1. Препараты
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом протокола необходимо подготовить несколько вещей, например, буфер лизиса белка, образец сырой ткани и специфическое антитело, помимо общих химических веществ и материалов.
- Готовят 250 мл буфера лизиса белка на 100 г чистой массы ткани: 250 мл 1x PBS с 50 мМ NaF, 1 мМ PMSF, 2 мкг/мл апротинина и 1 мМ активированного ортованадата (см. Таблицу 1). Отфильтруйте раствор с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Активация ортованадата требуется перед использованием для превращения его в более мощный ингибитор белка тирозинфосфатаз18. Активированный ортованадат может быть получен от коммерческих поставщиков, но также приготовлен следующим образом.- Готовят 200 мМ запасного раствора (натрия) ортованадата в ddH2O. Для приготовления 10 мл раствора добавляют 368 мг Na3VO4 - 9 мл воды и растворяют путем перемешивания. После растворения восполняют объем до 10 мл с ddH2O.
ПРИМЕЧАНИЕ: Начальный рН раствора ортованадата натрия может изменяться в зависимости от источника материала, и рН необходимо скорректировать до 10 при повторяющемся подходе следующим образом. - В зависимости от исходного рН раствора отрегулируйте рН до 10 с NaOH или HCl. При рН > 10 раствор будет иметь желтый цвет. Вскипятите раствор, пока он не станет бесцветным, охладите его до комнатной температуры и проверьте pH. Если pH составляет >10, добавьте небольшой объем HCl, чтобы отрегулировать pH до 10. В этот момент раствор может снова пожелтеть.
- Повторяют кипячение и охлаждение до тех пор, пока раствор не останется бесцветным и рН не стабилизируется на уровне 10 (примерно в 5-7 раз). На этом этапе добавление HCl приводит к слабому появлению желтого цвета в растворе. Хранить активированный ортованадат в 1 мл аликвоты при -20 °C.
- Готовят 200 мМ запасного раствора (натрия) ортованадата в ddH2O. Для приготовления 10 мл раствора добавляют 368 мг Na3VO4 - 9 мл воды и растворяют путем перемешивания. После растворения восполняют объем до 10 мл с ddH2O.
- Подготовьте пробирки с 2 мл лизисного буфера на грамм ткани и поместите их на лед.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе использовались восемь пробирок по 50 мл, каждая из которых заполнена 30 мл лизисного буфера в общей сложности для одной почки свиньи (около 100-150 г), и две трубки, каждая из которых заполнена 40 мл лизисного буфера для 20 печени мышей (каждая 1-2 г) в общей сложности. - Подготовьте ткань: рассекните ткань на предварительно очищенной стеклянной пластине, помещенной на лед в коробке из пенополистирола. Разрезанные кусочки ткани по 100 мг каждый должны быть легко перенесены в соответствующие трубки для последующего лизиса. Переложите кусочки ткани в подготовленные пробирки (этап 1.2).
- Готовят насыщенный раствор сульфата аммония: нагревают 500 мл ddH2Oдо 70 °C и при перемешивании постепенно добавляют порошок сульфата аммония (см. Таблицу материалов) до тех пор, пока не растворится сульфат аммония. Охладите этот (пере)насыщенный раствор до комнатной температуры и храните его при 4 °C в течение ночи.
2. Общая экстракция белка
ПРИМЕЧАНИЕ После подготовки образца в буфере лизиса холодного белка (см. этап 1.3) гомогенизируйте ткань как можно лучше с помощью ультразвукового зонда или с использованием электрического гомогенизатора следующим образом.
- Гомогенизация тканей
- В случае свиной почки обжарьте суспензию ультразвуком, предпочтительно с помощью ультразвукового зонда, сохраняя образец на льду (10 циклов импульса 15 с, с интервалами 30 с между импульсами для охлаждения образца на льду, на средней амплитуде с 50% рабочим циклом).
- В случае органов мыши гомогенизируйте суспензию с помощью электрического гомогенизатора (начиная с низкой силы и медленно ускоряясь до средней силы), сохраняя образец на льду. Регулярно мойте электрический гомогенизатор в PBS, чтобы удалить любой органический материал, засоряющий устройство.
- Возьмите 20 мкл из образцов и проверьте под микроскопом, правильно ли разрушены клетки гомогенизированной ткани; в противном случае повторите гомогенизацию.
- Центрифугируйте трубки в настольной центрифуге при 10 000 х г в течение 30 мин при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необязательно центрифугировать супернатант во второй раз при 20 000 х г в течение 30 мин при 4 °C для устранения небольших фракций исходной гранулы, которые могли быть перенесены. Это упростит последующую фильтрацию на этапе 2.3. - Соберите супернатант в свежую трубку и поместите его на лед. Последовательно фильтруйте супернатант с помощью шприцевых фильтрующих блоков 0,45 мкм и 0,22 мкм. Aliquot супернатант в партии по 10 мл и заморозьте их при -20 °C для краткосрочного хранения или при -80 °C для более длительного хранения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительная фильтрация с 0,45 мкм удаляет большинство частиц, прежде чем вторая стадия фильтрации с 0,22 мкм удаляет более мелкие частицы. Использование фильтра 0,22 мкм напрямую может вызвать риск засорения фильтров. - Подготовьте образец объемом 50 мкл для анализа SDS-PAGE/western blot путем добавления 10 мкл буфера образца 5x SDS (см. Таблицу 1) к 40 мкл надводного вещества, а затем кипячения при 95 °C в течение 10 мин.
- Необязательно повторно суспендируют около 100 мкл гранул, полученных на стадии 2.2 в 900 мкл ddH2O, и готовят образец для анализа SDS-PAGE/western blot, как описано выше.
ПРИМЕЧАНИЕ: Включение образцов, полученных из гранул, в анализ вестерн-блоттинга, в дополнение к положительному контролю, укажет, является ли экспрессия белка низкой, или антитело проблематично.
- Необязательно повторно суспендируют около 100 мкл гранул, полученных на стадии 2.2 в 900 мкл ddH2O, и готовят образец для анализа SDS-PAGE/western blot, как описано выше.
3. SDS-PAGE и вестерн-блот анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ вестерн-блоттинга необходим для проверки растворимости белка. Ниже описан протокол для электроблоттинга с использованием системы мокрого и резервуарного блоттинга (см. Таблицу материалов). Альтернативный протокол для SDS-PAGE можно найти в другом месте19.
- Приготовьте прерывистый 12,5% полиакриламидный гель SDS-PAGE в соответствии с инструкциями производителя (т.е. гель для укладки поверх разрешающего геля; см. таблицу 1). Запустите образцы, ранее подготовленные на шаге 2 (аналогично шагам 4, 5 и 6; см. ниже).
- Загрузите белковую маркерную лестницу в первую лунку (см. Таблицу материалов). Нагрузка 5 нг рекомбинантного белка hFAHD1 (полученного избактерий 12; см. табл. 1) в качестве положительного контроля во вторую лунку.
- Затем загрузите 20 мкл анализируемого образца и заполните все оставшиеся скважины 20 мкл подготовленного буфера проб SDS-PAGE 1x (т.е. 5x буфера образцов, разбавленного ddH2O). Запускайте гели SDS-PAGE при напряжении 125 В с помощью буфера, работающего под управлением SDS (см. таблицу 1).
- После того, как SDS-PAGE будет завершен, выполните анализ вестерн-блоттинга и исследуйте мембраны, используя доступное антитело, поднятое против FAHD1 (см. Таблицу 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку образцы берутся из сырого гомогената ткани, обычно качество SDS-PAGE и анализа вестерн-блот на этом этапе ставится под угрозу; однако важно проверить, является ли белок для извлечения растворимым в надосадочном веществе. Следующий протокол был протестирован для свиной почки и различных органов мыши, включая печень, сердце, мозг и почки.- Подготовьте 10-кратный буфер переноса вестерн-блотов (см. таблицу 1). Подготовьте 1-кратный буфер переноса вестерн-блоттинга (см. таблицу 1) и охладите его до 4 °C.
- Активируйте мембрану PVDF в течение 2 мин в метаноле. Промыть мембрану в ddH2Oв течение 2 мин. Уравновешивайте мембрану в течение 15 мин в 1x западном буфере переноса блоттинга.
- Вымойте SDS-гель с 1x PBS в течение 10 минут во время встряхивания, чтобы удалить буфер, работающий под SDS, а затем инкубируйте гель в 1x западном буфере переноса пятен в течение 10 минут для уравновешивания. Смонтируйте электроблоттинговую кассету (т.е. комбинируя активированную PVDF-мембрану и гели) в соответствии с инструкциями производителя.
- Запустите пятно с помощью электроблоттинга при 300 мА в течение 1 ч в пенополистирольной коробке, заполненной льдом, или в холодном помещении (4 °C). Переложите мембрану PVDF в трубку объемом 50 мл с открытой стороной, обращенной к внутренней стороне трубки. Инкубируют мембрану в 20 мл буфера блокировки вестерн-блоттинга (см. Таблицу 1) в течение ночи при 4 °C при катании на трубчатом ролике (см. Таблицу материалов).
- На следующий день промывайте мембрану в течение 5 мин 20 мл вестерн-блот-промывочного буфера (PBS с 0,1% (v/v) Tween 20) в той же трубке во время прокатки. Инкубируют мембрану в той же пробирке с первичным антителом2 (нацеливающимся на FAHD1; см. Таблицу 1), разбавленным 1:500 в западном блокирующем буфере в течение 1 ч при комнатной температуре во время прокатки.
- Промывайте мембрану в одной и той же трубке три раза в течение 10 мин каждая с 20 мл буфера для промывки вестерн-блот во время прокатки. Инкубируют мембрану в течение 30 мин при комнатной температуре с HRP-конъюгированным вторичным антителом (см. Таблицу материалов), разбавленным 1:3000 в 5 мл буфера блокировки вестерн-блоттинга.
- Промывайте мембрану в одной и той же трубке три раза в течение 10 мин каждая с 20 мл вестерн-блот-промывочного буфера и дважды в течение 5 минут каждый с 1x PBS. Высушите мембрану, осторожно удерживая ее пинцетом на одном краю, и касаясь куска целлюлозы или куска бумаги Whatman противоположным (нижним) краем мембраны. Поместите мембрану (открытой стороной вверх) на очищенную стеклянную пластину.
- Тщательно накройте всю мембрану 1 мл подготовленного ECL вестерн-блот-субстрата с помощью пипетки, следя за тем, чтобы не создавать пузырьков воздуха. Дайте раствору ECL инкубироваться в течение 3 минут и сразу же развивайте мембрану с помощью рентгеновской пленки или с помощью системы визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если белок не был обнаружен ни в одном из образцов, а только в положительном контроле, это может указывать на то, что белок нерастворим или не присутствует в достаточных количествах, которые могут быть обнаружены антителом. Если были загружены только нанограммы положительного контроля, то более вероятен первый сценарий. Если белка вообще не было обнаружено, проверьте качество антитела и, возможно, переключитесь на поликлональное антитело, а не на моноклональное антитело. В редких случаях, т.е. для некоторых гидрофобных белков, белок может быть обнаружен после центрифугирования, но не после фильтрации. В таком случае рекомендуется использовать специальные фильтрующие устройства для гидрофобных белков.
- Необязательно окрашивать мембраны PVDF после вестерн-блоттинга, чтобы контролировать успешную передачу белка из геля SDS-PAGE в мембрану PVDF.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание Coomassie рекомендуется для поиска и устранения неисправностей, разработки метода и документации, но имейте в виду, что после применения этого протокола мембраны теряются для дальнейшего анализа вестерн-блоттинга. Окрашивание Ponceau S дает более слабое окрашивание, но может быть использовано, если мембраны должны быть повторно исследованы.- Подготовьте небольшие лотки, содержащие окрашивание (Coomassie или Ponceau S) и растворы для окрашивания.
- С помощью пинцета поместите мембрану в окрашивающий раствор и аккуратно встряхните до тех пор, пока мембрана не будет хорошо окрашена (5-10 мин).
- Переложите мембрану в очищающий раствор и встряхните до тех пор, пока раствор не насытится (5-10 мин). Повторяйте стадию обезболивания до тех пор, пока на мембране не будут наблюдаться белковые полосы; если полос не наблюдается вообще, повторите окрашивание с более длительным временем инкубации. Высушите мембрану, поместив ее на стеклянную пластину с помощью пинцета.
4. Тестирование: осаждение сульфата аммония
ПРИМЕЧАНИЕ: Осаждение сульфата аммония представляет собой метод очистки белка путем изменения растворимости белка. В предварительном эксперименте концентрацию сульфата аммония последовательно увеличивают до значения, которое выпадает в осадок максимального количества белковых загрязнителей, оставляя ПРИ этом FAHD1 в растворе. Растворимость белка снова исследуется с помощью анализа вестерн-блоттинга.
- Исходя из шага 2.3: либо разморозить аликвоту образца, либо приступить непосредственно после экстракции белка (т.е. без замораживания образца). Отфильтруйте образец с помощью фильтрующего блока 0,22 мкм, чтобы исключить возможные осадки после оттаивания. Подготовьте шесть пробирок по 1,5 мл на льду и переложите 250 мкл образца в каждую пробирку.
- Готовят серию разбавления 5%, 10%, 15%, 20%, 25% и 30% сульфата аммония в подготовленных выше пробирках и составляют конечный объем до 1000 мкл с буфером лизиса белка. Инкубируйте образцы при 4 °C в течение ночи на трубчатом ротаторе (см. Таблицу материалов).
- Используя настольную центрифугу, центрифугу при 10 000 х г в течение 30 мин при 4 °C и осторожно переложите все супернатанты в отдельные трубки. Высушите полученные гранулы на воздухе и повторно суспендируйте каждую из них в 1000 мкл ddH2O.
- Для каждой пары повторно суспендированных гранул и супернатанта с предыдущей стадии смешайте 40 мкл с 10 мкл 5x SDS буфера образца и кипятите при 95 °C с открытыми крышками до тех пор, пока большая часть жидкости не испарится. Затем повторно суспендируют гранулу в смеси 50% ДМСО в ddH2O.
- Выполните SDS-PAGE (шаг 3), но запустите гели при 80 В в течение 3 часов. Для каждой концентрации сульфата аммония загрузите образцы, полученные из повторно суспендированных гранул и супернатанта (стадия 4.3), парами. Выполните анализ вестерн-блоттинга (шаг 3).
- Проверьте самую высокую концентрацию сульфата аммония, при которой очищаемый белок (т.е. FAHD1) остается в образце, полученном из супернатанта. Основываясь на результатах, определите протокол осаждения сульфата аммония для интересующего белка, который будет использоваться в будущих экспериментах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Известно, что сульфат аммония искажает SDS-PAGE и вестерн-блоттинг. По мере увеличения концентрации сульфата аммония качество анализа вестерн-блот будет поставлено под угрозу. Однако, как и на этапе 3 ранее, этот анализ используется для проверки растворимости интересующего белка при заданных концентрациях сульфата аммония. Этот протокол направлен на осаждение других белков, в то время как очищаемый белок должен оставаться растворимым.
5. Тестирование: ионообменная хроматография с ФПЛК
ПРИМЕЧАНИЕ: Молекулы с заряженными функциональными группами связаны с колонкой частиц кремнезема для FPLC, что позволяет дифференцировать белки в соответствии с их поверхностным зарядом. Выполните этот шаг дважды, используя катионно-обменную колонну и анионную обменную колонну (см. Таблицу материалов). Этапы протокола одинаковы для катионной или анионной обменной хроматографии, но используемые буферы различны (см. таблицу 1); как с «низким содержанием соли» 15 мМ NaCl, так и с «высоким содержанием соли» 1 М NaCl. Для используемых колонок рекомендуется расход 1 мл/мин.
- Настройте систему FPLC с анионной или катионной обменной колонкой. Промывайте колонну с 5 объемами колонн (CV) 20% EtOH (вH2O), затем 5 CV ddH2O. Поочередно промывайте колонну с 1 CV низкосолевого буфера, высокого солевого буфера и снова низкосолевого буфера в порядке, пока в хроматограмме больше не наблюдаются пики, но промывайте хотя бы один раз.
- После определения оптимального протокола осаждения сульфата аммония в малых масштабах (этап 4) применяют протокол осаждения к 10 мл исходного гомогената ткани (этап 2). При желании диализуйте образец по буферу с низким содержанием соли.
- Нанесите образец на колонну (например, путем впрыска или с помощью насоса для отбора проб) и соберите сквозной поток. Вымойте колонну с 1 CV буфера с низким содержанием соли.
- Установите линейное градиентное элюирование от 100% низкосолевого буфера / 0% буфера с высоким содержанием соли до 0% буфера с низким содержанием соли / 100% буфера с высоким содержанием соли в пределах 3 CV. Непрерывно собирайте фракции 1 мл. После того, как градиент закончился, продолжайте работать с буфером с высоким содержанием соли до тех пор, пока в хроматограмме не будут обнаружены больше связанные с белком пики (поглощение ультрафиолета при 280/255 нм) в диапазоне 1 CV.
- Применяют 1 мл 25% SDS, растворенного в 0,5 М NaOH (в ddH2O) для очистки колонки. Последовательно промываем колонну с 3 CV ddH2O и 3 CV 20% EtOH (в ddH2O).
- Соберите образцы SDS-PAGE всех пиковых фракций и проточных фракций и исследуйте их с помощью вестерн-блоттинга на наличие интересующего белка (этап 3). Заморозьте собранные фракции в жидком азоте и храните их при -80 °C.
- После того, как анализ вестерн-блот завершен, разморозьте и объедините фракции, содержащие интересующий белок, и отбросьте другие. Повторите шаги 5.1-5.5 с альтернативной колонкой (т.е. катионной или анионной обменной колонкой).
- После того, как обе колонки будут исследованы, определите протокол FPLC для интересующего белка, который будет использоваться в будущих экспериментах. Уменьшить объем белкового раствора с помощью ультрацентрифугирующих фильтрующих установок (10 кДа, см. Таблицу материалов) до 2 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Есть два ожидаемых результата этой серии экспериментов. Либо интересующий белок прикрепился к одной из колонок, а белковый раствор уже достаточно чист после элюирования, либо белок остался в протекании в обоих случаях. В последнем сценарии, хотя белок находится в потоке, очищающий эффект этого шага все еще может быть значительным. В таком случае, как и для FAHD1 в печени свиней и мышей, этот этап ионного обмена все равно будет выполнен. Если ни катионный, ни анионный обменный столб не может обеспечить надлежащий эффект очистки, можно попытаться изменить рН лизата и буфера и диализовать образец по отношению к работающему буферу перед применением к FPLC.
6. Экстракция белка с использованием определенных подпротоколов для осаждения сульфата аммония и FPLC
ПРИМЕЧАНИЕ: Пористые частицы в колонке силикагеля для FPLC (см. Таблицу материалов) позволяют дифференцировать белки в соответствии с их гидродинамическим радиусом. Описанные этапы должны быть выполнены с помощью системы FPLC с использованием хроматографии исключения размеров (SEC). Для используемой колонки SEC (см. Таблицу материалов) рекомендуется расход 0,3 мл/мин.
- Подготовьте все необходимые материалы (см. этап 1) и извлеките общий белок из ткани (см. шаг 2). Выполняют осаждение сульфата аммония со всем гомогенатом ткани, который не использовался для тестирования (см. этап 4). Для больших объемов концентрируйте лизат с помощью ультрацентрифугирующих фильтрующих установок (10 кДа; см. Таблицу материалов) до меньшего объема 50 мл или менее.
- Выполните первый этап очистки с помощью ионной обменной хроматографии (см. шаг 5).
- Подготовьте образцы для вестерн-блоттинга, как описано в предыдущих шагах. Выполните анализ вестерн-блоттинга и объедините все фракции, содержащие FAHD1, из ионной обменной хроматографии.
- Уменьшить объем белкового раствора до 2 мл с помощью ультрацентрифугирующих фильтрующих установок (10 кДа). Последовательно фильтруйте раствор с помощью 0,45 мкм и 0,22 мкм шприцевых фильтрующих устройств для удаления любых микроосаждений.
- Уравновешивайте столбец SEC 1 CV рабочего буфера SEC (см. Таблицу 1), содержащего 1 мМ DTT. Загрузите образец на колонку и выполняйте хроматографию до тех пор, пока все белки не будут элюированы (1-2 CV).
- Соберите фракции 1 мл сквозного потока, что соответствует значительным пикам в хроматограмме (поглощение ультрафиолета при 280/255 нм) и подготовьте образцы 50 мкл каждой собранной фракции для анализа SDS-PAGE и вестерн-блоттинга, как описано на предыдущих этапах. Заморозьте все фракции, используя жидкий азот, и храните их при -80 °C.
- Последовательно промывайте колонну SEC с 1 CV ddH2O и 1 CV 20% EtOH (в ddH2O). Выполните анализ вестерн-Блот и объедините все фракции, содержащие FAHD1. Уменьшить объем белкового раствора до 2 мл с помощью ультрацентрифугирующих фильтрующих установок (10 кДа, см. Таблицу материалов).
- Оцените концентрацию белка с помощью коммерческого набора для анализа BCA (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: рН и содержание соли в подвижной фазе могут влиять на профиль элюирования шаровидных белков20. Кислотные или основные условия могут привести к тому, что пики будут менее определенными, а увеличение белково-матричных взаимодействий приведет к частичному удержанию белка на колонке20. Этот эффект может быть использован для дальнейшей очистки белка. Повторение шага 6 с различными скоростями потока, рН и концентрациями соли может повысить чистоту белка20.
7. Серебряное окрашивание
ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ серебряного окрашивания гелей SDS-PAGE необходим для проверки белковых загрязнений, которые могут не быть замечены при окрашивании Coomassie. Следующий протокол является одной из многих версий, которые можно найти в литературе21. Выполните все этапы инкубации, встряхнув в чистом стеклянном лотке. Соберите все серебряные и формальдегидсодержащие жидкости в специальный контейнер для отходов и правильно выбрасывайте их.
- Инкубируйте гели SDS-PAGE в серебряном фиксирующем растворе для окрашивания (см. Таблицу 1) в холодном помещении. Инкубировать гели в серебряном окрашивающем инкубационном растворе (см. табл. 1) в течение 3 ч при комнатной температуре. Необязательно добавляют глутаральдегид (см. таблицу 1) для улучшения обнаружения слабых полос. Промыть гели четыре раза в ddH2Oв течение 10 мин каждый.
- Инкубировать гели в серебряном окрашивающем растворе серебра (см. табл. 1) в течение 1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Имейте в виду, что отныне все жидкости и сам гель содержат серебро и формальдегид, которые являются токсичными. - Инкубируйте гели в растворе для окрашивания серебром (см. таблицу 1) с сильным встряхиванием до тех пор, пока полосы не станут хорошо видны. Чтобы остановить реакцию, отбросьте раствор разработчика и немедленно инкубируйте гели в растворе для окрашивания серебром (см. таблицу 1) в течение минимум 10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полосы, окрашенные на шагах 7.2 и 7.3, будут постоянно становиться все более развитыми. Добавление большего количества формальдегида в раствор, чем указано, может потребоваться, если окрашивание слабое.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Белок FAHD1 экстрагировали из почек свиней и печени мыши с использованием представленного протокола. Для тканей мышей требуется несколько органов, чтобы получить несколько мкг после окончательной стадии очистки. По этой причине в данной статье основное внимание уделяется извлечению FAHD1 из почек свиней, что является гораздо более образцовым экспериментом. Извлечение FAHD1 из печени мыши выполняется для представления трудностей и возможных ловушек этого протокола. Обычно рекомендуется использовать органы, которые показывают высокий уровень экспрессии белка, который человек хочет очистить. Атлас белков человека22 может помочь оценить экспрессию в модельной системе, или можно выполнить предварительные эксперименты с западным пятном с различными сырыми лизатами ткани для оценки этих уровней. Положительный контроль, используемый во всех анализах вестерн-блоттинга, представлял собой помеченный рекомбинантный белок, работающий с немного более высокой молекулярной массой.
В качестве первого эксперимента представлена экстракция FAHD1 из почки свиньи. Процесс гомогенизации тканей (этап 1) и полной экстракции белка (этап 2) представлен на дополнительном рисунке 1 (см. легенду для описания отдельных этапов). Аликвотированная десятая часть общего лизата была использована для следующих экспериментов.
Осаждение сульфата аммония было испытано один раз для этого лизата путем добавления сульфата аммония к лизату в различных концентрациях (стадия 4) (рисунок 2). После центрифугирования гранулы и супернатанты были отобраны и проанализированы с помощью вестерн-блоттинга с использованием определенного поликлонального антитела2 , выращенного против FAHD1 человека. 200 нг рекомбинантного His/S меченого человека FAHD1, полученного из E. coli12 , были загружены в качестве положительного контроля. Полосу белка FAHD1 можно увидеть при 25 кДа, в то время как помеченный положительный контроль работает при 34 кДа. На основе этих данных был определен протокол, где лизат обрабатывают 25% сульфатом аммония, то есть условия, при которых FAHD1 все еще находится в супернатанте, в то время как большинство других белков осаждается. Это важный шаг в стратегии очищения. Осаждение сульфата аммония является эффективным этапом очистки, прежде чем приступать к другим методам. Следует отметить, что количество сульфата аммония выше 30% не будет использоваться, поскольку сульфат аммония постепенно искажает качество SDS-PAGE и вестерн-блоттинга.
Рисунок 2: Осаждение сульфата аммония и скрининг вестерн-блоттинга для свиней FAHD1. (A) Сульфат аммония добавляли к лизату в различных концентрациях (максимум от 5% до 25%) для осаждения белков из раствора. (B) Присутствие свиней FAHD1 (25 кДа) определяли в отдельных парах гранул и надосадочного вещества, соответствующих изменяющимся концентрациям сульфата аммония , с помощью западного пятна с использованием поликлонального антитела, поднятого против FAHD1 человека. Супернатант, соответствующий 25% осаждению сульфата аммония, по-прежнему показывает присутствие свиньи FAHD1 в супернатанте, в то же время осаждая большое количество других белков. 200 нг рекомбинантного белка, помеченного His/S, были загружены в качестве положительного контроля (34 кДа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
После тестирования ионнообменных колонн с помощью FPLC была определена стратегия, в которой свиней FAHD1 остается в потоке анионнообменной хроматографии при рН 9 (этап 5). Начиная с лизата, полученного осаждением сульфата аммония на 25% (как определено предыдущими экспериментами по тестированию), анионнообменной хроматографией использовали для устранения дальнейших белков из раствора (рисунок 3А). Связывающие белки удаляли элюированием из колонки, в то время как протекание дополнительно очищали через SEC при рН 7,4 (рисунок 3B). После обоих этапов анализ вестерн-блот выявил все фракции, которые содержали свиней FAHD1, которые были объединены и сконцентрированы до 2 мл.
Рисунок 3: Очистка свиней FAHD1 с помощью FPLC - часть 1. Красные стрелки на хроматограмме и пятна указывают на наличие FAHD1. В хроматограмме «UV» обозначает поглощение УФ при 280 нм, «Cond» обозначает проводимость (связанную с концентрацией соли в буфере), а «Conc B» обозначает процент буфера с высоким содержанием соли в буферном градиенте (0% чистый буфер с низким содержанием соли; 100% чистый буфер с высоким содержанием соли). (A) Очистка свиней FAHD1 от лизата, полученного осаждением сульфата аммония на 25% с помощью анионообменной колонки (FPLC). В то время как многие белки связываются с колонкой, свиней FAHD1 находится в проточном потоке. Грязь и небелковые загрязнения удаляются путем элюирования из колонны, в то время как проточная часть подвергается дальнейшей обработке. (B) Поток от предыдущей анионной обменной хроматографии в (A) дополнительно очищают с помощью эксклюзионной хроматографии (FPLC) при рН 7,4. (А,Б) Анализ вестерн-блоттинга (обрезанные пятна на дне) выявил фракции, содержащие свиней FAHD1, которые объединены и концентрированы. Полные пятна изображают окрашенную Кумасси мембрану после анализа вестерн-блоттинга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Отфильтрованный образец снова применяли к SEC, но в буферных условиях при рН 9 (см. таблицу 1) (рисунок 4). Обоснование этого подхода заключается в том, что рН и содержание соли в подвижной фазе могут влиять на профиль элюирования глобулярных белков20, и в этих буферных условиях был обнаружен расширенный профиль элюирования для FAHD1. Одна фракция содержала белок с адекватными уровнями чистоты для анализа основной активности фермента12 , чтобы окончательно подтвердить идентичность белка.
Рисунок 4: Очистка свиней FAHD1 с помощью FPLC - часть 2. Красные стрелки на хроматограмме и пятна указывают на наличие FAHD1. Образцы белка, предварительно очищенные с помощью анионного обмена и хроматографии с исключением размера, дополнительно очищаются с помощью эксклюзионной хроматографии размера (FPLC) при рН 9 (верхняя панель). Вестерн-блот-анализ, изображенный в правом нижнем углу, идентифицирует фракции, содержащие свиней FAHD1, которые объединены и концентрированы (нижние панели). Пятно в левом нижнем углу показывает окрашивание мембраны Кумасси после западного пятна. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Альтернативную стратегию (т.е. SEC с последующей ионной обменной хроматографией) тестировали с 2 мл лизата, полученного после осаждения сульфата аммония (этап 4) (дополнительный рисунок 2). Обоснование этого эксперимента заключается в том, что при первом использовании SEC фракции, содержащие FAHD1, могут быть отделены от большинства других белков, в то время как последующая хроматография ионного обмена может быть использована для дальнейшей очистки белка. Во-первых, лизат фракционировали с помощью SEC при рН 7,4 (шаг 6). Вестерн-блот-анализ выявил все фракции, которые содержали свиней FAHD1. Во-вторых, эти фракции концентрировали и дополнительно очищали с помощью анионнообменной колонны при рН 9 (стадия 5). Хроматограммы и анализ вестерн-блоттинга (дополнительный рисунок 2) показывают, что эта стратегия обнадеживает, потому что хроматограмма ионного обмена показывает определенный узкий пик, который связан с уровнями обогащенного белка в западном блоте. Однако недостатком этой стратегии является то, что она ограничена начальным объемом, который будет применяться на SEC (2 мл), поэтому пропускная способность этого метода очень низкая. Обработка целой свиной почки, например, непрактична.
В качестве еще одной модификации этого протокола катионообменная колонна была включена перед анионной обменной колонной, когда свинья FAHD1 также присутствовала в потоке. На каждом этапе протокола образцы свиней FAHD1, содержащих фракции, были отобраны и протестированы с помощью анализа ODx, как описано в другом месте12 (дополнительный рисунок 3). Специфическая ферментативная активность увеличивается вместе с уровнем чистоты, т. е. вместе с увеличением относительного количества FAHD1 на общий белок.
В качестве второго примера представлена экстракция FAHD1 из печени мыши, т.е. коллекция печеночной ткани, полученная от 20 мышей. По сравнению с извлечением FAHD1 из свиной почки, представленной выше, эта экстракция оказалась более утомительной. Проблемы возникли на нескольких этапах протокола, которые будут представлены ниже. Общий белок экстрагировали, как описано на этапе 2 (дополнительный рисунок 4). Поскольку гомогенат печени мыши имеет тенденцию быть очень липким и слизистым объектом, фильтровальная бумага (похожая на блоки фильтра для кофе) использовалась для предварительной фильтрации лизата, который был разбавлен 1: 3 в буфере лизиса после экстракции, чтобы сделать раствор более похожим на жидкость. Это разбавление улучшило процедуру фильтрации; однако это сделало последующее обнаружение белка с вестерн-блотом более утомительным. После фильтрации приготовленный лизат должен был быть концентрирован перед дальнейшим использованием. Аликвотированная десятая часть общего лизата была использована для следующих экспериментов.
Первый этап тестирования осаждения сульфата аммония (дополнительный рисунок 4I) показал возможную проблему, которая может возникнуть. Сульфат аммония в более высоких концентрациях разрушает гели SDS-PAGE и вызывает эффект улыбки при запуске при 150 В (дополнительный рисунок 5А; отрицательный результат). Тот же запуск SDS-PAGE при напряжении 80 В показывает положительный результат (дополнительный рисунок 5B). В последнем случае эффект улыбки формируется изначально, но в конечном итоге разрешается из-за более низкого напряжения. Поскольку исходный раствор должен был быть сильно разбавлен, чтобы иметь возможность фильтровать лизат, первоначальный анализ вестерн-блоттинга этих образцов был неудачным, то есть положительный контроль был обнаружен антителом, но не белком в примененных образцах. Эта проблема была решена с использованием более высокой концентрации как лизата (концентрированного с использованием центробежных фильтрующих устройств), так и антитела, а также путем применения антитела на ночь в холодном помещении при встряхивании. В конечном счете, анализ вестерн-блота предоставил как часть информации о том, что белок присутствовал в лизате, так и то, что белок все еще присутствовал в супернатанте при 15% сульфате аммония (дополнительный рисунок 5C). Следует отметить, что образцы SDS, содержащие более высокое количество сульфата аммония (>15%), выпадали в осадок при нагревании, и белок терялся. Это также можно увидеть в окрашивании Кумасси и западном пятне (дополнительный рисунок 5C). Этот эффект не наблюдался для свиной почки, поэтому он может быть тканеспецифичным.
После осаждения сульфата аммония при 15%, 10 мл лизата наносили на катиообменную хроматографию при рН 6,8. Анализ вестерн-блоттинг показал, что мышиный белок FAHD1 находится в протекании (рисунок 5A). Элюированная белковая фракция, по-видимому, незначительна; однако в этом примере показан вторичный эффект ионной обменной хроматографии. На этом этапе протокола раствор может по-прежнему содержать много соединений, которые могут не быть белком. Ионообменная хроматография – это быстрый и простой способ избавиться от таких загрязнений. Учитывая, что выполнение ионно-обменной хроматографии занимает несколько часов (включая все этапы промывки, сам эксперимент занимает полчаса), он обеспечивает простой метод очистки образца от небелковых загрязнений.
Рисунок 5: Очистка мыши FAHD1 с помощью FPLC. Красные стрелки на хроматограмме и пятна указывают на наличие FAHD1. (A) После осаждения сульфата аммония на уровне 15% образец центрифугировали, фильтровали (0,22 мкм) и наносили на катионообменную колонну. Анализ вестерн-блоттинга показывает, что белок находится в протекании, а хроматограмма показывает, что не так много других белков было удалено на этом этапе. Однако сравнение внешнего вида и вязкости входных данных с проточным потоком показывает, что собранный поток намного четче (правая панель сравнивает вход и сквозной поток). (B) Проточный поток, собранный из катионообменной колонки, был уменьшен до 2 мл с помощью центрифугирующих фильтров и применен к размерной эксклюзионной хроматографии при рН 7,4. (C) Фракции, содержащие FAHD1, были объединены, концентрированы и применены ко второму раунду размерной эксклюзионной хроматографии при рН 9. (D) Фракции, содержащие FAHD1, были вновь объединены и нанесены на SDS-PAGE с серебряным окрашиванием, чтобы увидеть оставшиеся загрязнения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Образец дополнительно применяли к размерной эксклюзионной хроматографии при рН 7,4 (рисунок 5В). Анализ вестерн-блоттинга показал фракции, содержащие мышиный белок FAHD1, которые были объединены и сконцентрированы до 2 мл. Этот 2 мл концентрата замораживали при -20 °C с 10 мкл β-меркаптоэтанола и размораживали на следующий день. Образовался осадок, который фильтровали через шприцевые фильтрующие блоки (0,22 мкм). Образцы для анализа SDS-PAGE и вестерн-блоттинга были взяты, чтобы убедиться, что мышиный белок FAHD1 все еще находится в растворе.
Образцы, содержащие белок (из анализа вестерн-блоттинга), были объединены, сконцентрированы с помощью центрифугирующих фильтров и нанесены на SDS-PAGE с серебряным окрашиванием, чтобы увидеть оставшиеся загрязнения (рисунок 5D). Это показало, что белковый раствор не является высокочистым и что количество белка, полученного с помощью этого метода из печени мыши, также не было очень высоким (в общей сложности несколько мкг, как определено с использованием набора для анализа BCA; см. Таблицу материалов). Выход белка был намного выше в случае свиного FAHD1 (около 1 мг на этом этапе). Уровень чистоты белка FAHD1, извлеченного из свиной почки, составляет около 80% (оценивается после окрашивания серебром; данные не показаны). Эта чистота может быть дополнительно увеличена с помощью, например, аффинной хроматографии с использованием определенного антитела. Такие и другие ограничения настоящего протокола будут подробно рассмотрены ниже.
| Название буфера/раствора/материала | Состав | ||
| Решение для очистки Coomassie | 30% (v/v) EtOH; 5 % (об/об) HOAc; в ddH2O | ||
| Раствор для окрашивания Coomassie | 0.05% Coomassie Бриллиантовый синий R-250; 50 % (об/об) MeOH; 10 % (об/об) HOAc; в ddH2O | ||
| Mono Q высокосолевой буфер | 20 мМ Tris-HCl; 1 М НаКл; 10 % глицерин; в ddH2O; отрегулируйте pH до 9,0 с помощью NaOH | ||
| Mono Q низкосолевой буфер | 20 мМ Tris-HCl; 15 мМ NaCl; в ddH2O; отрегулируйте pH до 9,0 с помощью NaOH | ||
| Буфер с высоким содержанием соли Mono S | 44 мМ NaH2PO4; 6 мМ Na2HPO4; 1 М НаКл; в ddH2O; отрегулируйте pH до 6,8 с HCl | ||
| Mono S низкосолевой буфер | 44 мМ NaH2PO4; 6 мМ Na2HPO4; 15 мМ NaCl; в ddH2O; отрегулируйте pH до 6,8 с HCl | ||
| Буфер лизиса белка | 1x PBS (250 мл); 50 мМ НаФ; 1мМ ПМСФ; 2 мкг/мл апротинина, 1 мМ активированный ортованадат; в ddH2O | ||
| Кроличье анти-hFAHD1 поликлональное антитело (изолированное сродство) | Изготовление на заказ; поликлональное анти-hFAHD1 антитело, очищенное из кроличьей сыворотки и очищенное FPLC согласно ссылке 12 | ||
| Рекомбинантный белок hFAHD1 вестерн блот контроль | Контрольный белок вестерн-блотт, экспрессируемый в E.coli и очищенный FPLC согласно ссылке 12. | ||
| Буфер образцов SDS-PAGE 5x | 300 мМ Tris HCl; 500 мМ ДДТ; 10% (с/об) SDS; 50% (v/v) глицерина; 0,05% (мас./об.) бромфенола синего; в ddH2O; отрегулируйте pH до 6,8 с HCl | ||
| Разрешающий гель SDS-PAGE (12,5 %) для прерывистых PAGE | ddH2O (9,5 мл); 3 M Tris HCl (2,2 мл); 5,5 мл 40% раствора акриламида/биса (соотношение 29:1); 20% SDS (175 мкл); ТЕМЕД (17 мкл); 10% персульфат аммония (175 мкл); отлить перед укладкой геля и дать ему полимеризоваться; отлить укладочный гель сверху | ||
| Буфер выполнения SDS-PAGE | 25 мМ Tris HCl; 190 мМ глицина; 0,5 % (по весу) SDS; в ddH2O; отрегулируйте pH до 8,3 с помощью NaOH | ||
| Гель для укладки SDS-PAGE (12,5 %) для прерывистых PAGE | ddH2O (3,8 мл); 1 M Tris HCl (630 мкл); 500 мкл 40% раствора акриламида/биса (рацион 29:1); 20% SDS (25 мкл); ТЕМЕД (5 мкл); 10% персульфат аммония (50 мкл); отливка после полимеризации рассасывающегося геля; нанесите гель-гребень для создания лунок | ||
| SEC (G75) работающий буфер | 15 мМ Трис-HCl; 300 мМ NaCl; в ddH2O; отрегулируйте pH до 7,4 с помощью NaOH | ||
| Раствор для окрашивания серебра | 250 мМNa2CO3 в ddH2O; добавьте 12 мкл 37% (v/v) формальдегида до 100 мл перед использованием | ||
| Серебряный окрашивающий фиксирующий раствор | 40% (v/v) EtOH; 10% (об/об) HOAc; в ddH2O | ||
| Раствор для инкубации серебряного окрашивания | 30% (v/v) EtOH; 500 мМ NaOAc; 8 мМ Na2S2O3; в ddH2O; необязательно: перед использованием добавить 600 мкл 50% (v/v) глутарового альдегида на 100 мл | ||
| Серебряный окрашивающий серебряный раствор | 0,1% (мас./об.) AgNO3; в ddH2O; добавить 25 мкл 37% (v/v) формальдегида к 100 мл перед использованием | ||
| Раствор для серебристого окрашивания | 40 мМ раствор ЭДТА при рН 7,6; переложить 744 мг ЭДТА в 40 мл ddH2O, а затем добавить NaOH для растворения и регулировки рН до 7,6. Наконец, отрегулируйте общий объем до 50 мл. | ||
| Буфер блокировки вестерн-блоттинга | PBS с 0,1% (v/v) Tween 20 и 5% (мас./v) сухого обезжиренного молока; фильтрованный | ||
| Буфер передачи вестерн-блоттинга (10x) | Tris-HCl 250 мМ; глицин 1,92 М; в ddH2O; отрегулировать pH до 8,3 с NaOH; хранить при комнатной температуре | ||
| Буфер передачи вестерн-блоттинга (1x) | Буфер переноса вестерн-блотт (10x) 100 мл; 800 мл ddH2O; 100 мл MeOH; хранить при 4 °C | ||
| Вестерн-блот-моющий буфер (PBS-T) | PBS с 0,1% (v/v) Tween 20 | ||
Таблица 1.
Дополнительный рисунок 1: Общая экстракция белка из почек свиней. (A) Почечную ткань разрезали с помощью скальпеля на подготовленной должным образом очищенной стеклянной пластине, нанесенной на пенополистирол для предотвращения скольжения; (B) пробирки объемом 50 мл, содержащие 20 мл ледяного лизисного буфера с ингибиторами белка/протеазы, инкубируются на льду; (C) кусочки почечной ткани помещали в буфер до тех пор, пока объем не достигал около 30 мл; (D) ткань почек гомогенизировали с помощью ультразвука (т.е. обработки ультразвуком); (E) сырой гомогенат центрифугировали в настольной центрифуге со средней скоростью в течение 30 мин; F) одновременно обрабатывалось несколько проб; (G) после первого центрифугирования супернатант переносили в центрифужные трубки (сравните с E) и центрифугировали на высокой скорости (10 000 x g) в течение 30 мин; (H) эта стадия центрифугирования дает еще одну гранулу и супернатант, которые переносятся в трубки объемом 50 мл; (I/J) прелизат последовательно фильтруют фильтрующими блоками 0,45 мкм и 0,2 мкм, аликвотируют в партии по 10 мл и замораживают жидким азотом для последующего хранения при -80 °C. Вестерн-блоттинг-анализ используется для проверки наличия белка во всех образцах (гранулы, супернатанты, фильтрованный лизат). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Очистка свиней FAHD1 с помощью FPLC; альтернативная стратегия. Красные стрелки на хроматограмме и пятна указывают на наличие FAHD1. (А) Очистка свиней FAHD1 от лизата, полученного осаждением сульфата аммония при 25% с помощью эксклюзионной хроматографии (ФПЛК) при рН 7,4. Анализ вестерн-блоттинга выявил фракции, содержащие свиней FAHD1, которые были объединены и концентрированы. (B) Образцы белка, ранее очищенные с помощью эксклюзионной хроматографии (панель А), были дополнительно очищены с помощью анионнообменной хроматографии (FPLC). Вестерн-блот-анализ выявляет фракции, содержащие свиней FAHD1, которые были объединены и концентрированы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 3: Специфическая ферментная активность свиней FAHD1. Измеряется специфическая активность фермента в зависимости от повышения уровня чистоты. В таблице сравнивается относительная активность фермента (нмоль/мин) со специфической активностью фермента (мкмоль/мин/мг). Анализ показывает постоянно возрастающую активность свиней FAHD1 после каждого этапа очистки. По сравнению с рекомбинантным His/S-человеческим FAHD1 (зеленым), полученным из кишечной палочки. 12, свиньи FAHD1 показали несколько более высокую активность (красный) (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 4: Общая экстракция белка из печени мыши. (А,Б,С) Замороженную ткань печени у 20 мышей и буфер лизиса готовили на льду в пробирках по 50 мл; (D,E,F) ткань печени гомогенизировали с помощью ультразвука (т.е. обработки ультразвуком); сырой гомогенат центрифугировали в настольной центрифуге на средней скорости в течение 30 мин; супернатант переносили в центрифужные трубки и центрифугировали на высокой скорости (10 000 х г) в течение 30 мин; (G,H,I) предварительный лизат последовательно фильтруют бумажными фильтрами, фильтрующими блоками 0,45 мкм и 0,2 мкм, аликвотируют в партии по 10 мл и замораживают жидким азотом для последующего хранения при -80°С; (J) сульфат аммония добавляли к лизату в различных концентрациях (максимум от 5% до 30%) для осаждения белка из раствора; (K) гранулы, полученные после осаждения сульфата аммония (панель J), повторно суспендировали вH2Oдля отбора проб для анализа SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 5: Осаждение сульфата аммония и скрининг вестерн-блоттинга для мыши FAHD1. Красные стрелки в пятнах указывают на наличие FAHD1. (A) SDS-PAGE с образцами, полученными после осаждения сульфата аммония при напряжении 125 В. Этот гель демонстрировал резкий эффект улыбки, и такой гель не может быть оценен. Это пример отрицательного результата. (B) SDS-PAGE с теми же образцами (панель A) запускался при 80 В до завершения. Эффекта улыбки в этом геле нет, и это пример положительного результата. (C) SDS PAGE и вестерн-блот-анализ образцов, полученных после осаждения сульфата аммония. Образцы с более высокими концентрациями сульфата аммония могут выпадать в осадок внутри буфера образца, как указано. Они теряются и больше не могут быть обнаружены с помощью окрашивания Кумасси (слева) или анализа вестерн-блоттинга (справа). Наилучшая концентрация сульфата аммония, в данном случае, была определена на уровне 15%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические шаги в протоколе
Соблюдение общих рекомендаций по обращению с белками имеет важное значение, например, работа на льду и в умеренных условиях pH и соли. Применение ингибиторов протеазы выгодно для метода, в то время как использование ингибиторов протеасом настоятельно рекомендуется. Замораживание и размораживание образца всегда может привести к осаждению белка (по крайней мере, частично), поэтому любая размороженная аликвота исходного лизата белка (стадия 2) должна обрабатываться непрерывно без перерыва. Центрифугирование и фильтрация после оттаивания обычно рекомендуется для удаления микропреципитации.
Исходный белковый лизат, полученный из ткани, по-прежнему содержит много веществ, помимо белков. Ионные обменные хроматографические колонки могут быть использованы для очистки лизата. Даже если белок, который нужно извлечь, не связывается с ионной обменной колонкой, протекание может быть намного четче, чем входной раствор, и его легче обрабатывать на последующих этапах. Это показано для экстракции FAHD1 из почек мыши (см. Рисунок 5А).
Ограничения и модификации метода
Этот протокол описывает протокол извлечения FAHD1 из ткани. На основе этой стратегии может быть получен общий подход к извлечению белков FAHD (FAHD1, FAHD2) из другой ткани, в то время как для отдельных случаев могут потребоваться специфические адаптации. Неявным ограничением этого метода являются относительные уровни экспрессии FAHD1 (или белков FAHD) в данной ткани и доступность этой ткани в адекватных количествах. Общая схема, описанная в этом протоколе, требует высокой экспрессии белка в подходящем для начала количестве ткани. Были приведены примеры извлечения FAHD1 из почек и печени свиньих и мышей, которые являются двумя органами, которые показывают высокий уровень экспрессии белка. На каждой стадии, описанной в этом протоколе, происходит неявная потеря образца, то есть низкое начальное количество белка еще больше уменьшается. В конечном счете, только низкое количество белка может быть достигнуто с использованием этого протокола. Поскольку свиная почка является большим органом, около грамма белка (около 80% чистоты; оценка) может быть извлечено таким подходом из двух почек. Применение того же протокола для извлечения FAHD1 из печени мыши потребовало сбора образцов печени у 20 мышей, чтобы получить только несколько мкг белка в конце. Получение более высокой чистоты белка с использованием описанных способов может быть утомительным, и окрашивание серебром показывает, что после хроматографии исключения размера в растворе все еще может быть много других белков. Можно было бы дополнить этот протокол с помощью аффинной хроматографии (активированные столбцы NHS), используя моноклональное антитело (например, CAB025530).
Все протоколы, перечисленные здесь, требуют, чтобы белок, который вы хотите извлечь, был растворимым. Необходимо проверить и определить оптимальные условия осаждения сульфата аммония и корректировки pH/соли для хроматографии. В случае, если ионообменная хроматография не дает хороших результатов очистки, диализ против хроматографического буфера перед выполнением FPLC может быть вариантом улучшения растворимости белка и разрешения хроматографии. Однако не рекомендуется диализовать сырой лизат, так как это может привести к массивному и неконтролируемому осаждению белка внутри диализной трубки. Проблемы могут возникнуть, если белок имеет тенденцию быть гидрофобным, и протоколы могут быть неприменимы, если белок является высокогидрофобным (например, мембранные белки). Если белки FAHD частично нерастворимы, как это установлено для FAHD2 (данные не показаны) в данном тканевом лизате, другие типы хроматографии, например, гидрофобная хроматография (HIC), также могут быть изучены12.
В разделе результатов были показаны две модификации стандартного протокола. Для очистки FAHD1 от почки свиньи перед ионообменной хроматографией использовалась эксклюзионная хроматография размеров (см. Дополнительный рисунок 2). Проблема с этим методом заключается в том, что хроматография исключения размера имеет большие беговые дорожки, а объем выборки сильно увеличивается во время пробега. Объем образца не должен превышать 2% от объема слоя для достижения высокого разрешения23, а конечный коэффициент разбавления также зависит от собранного объема элюирования. В приведенном примере с использованием столбца 120 мл рекомендуется начальный объем 2 мл. Исходный образец может быть взят из нескольких мл лизата после осаждения сульфата аммония путем концентрации с использованием центробежных фильтрующих устройств без артефактов агрегации или осаждения. Пример очистки FAHD1 от почки свиньи приведен в качестве репрезентативного результата (см. также Дополнительный рисунок 2). Однако ограничение только небольшими объемами выборки может сделать этот подход непрактичным.
Применение или направления метода
Экспрессия и очистка рекомбинантных белков от бактерий является простым и хорошо зарекомендовавшим себя методом получения посильных количеств (в граммах) белка24,25. Это было представлено для FAHD112. Однако существует несколько возможных недостатков в использовании этих методов, таких как возможный плохой рост хозяина, образование тела включения, потеря или изменение активности белка и, следовательно, возможность вообще не получить какой-либо белок или привести к смещенной форме белка (неправильное сворачивание, плохие посттрансляционные модификации и т. Д.). Поэтому разработка методов, которые могут извлекать хорошо сложенный и правильно модифицированный белок из ткани напрямую, привлекательна. Основная проблема, однако, заключается в том, что большинство белков не экспрессируются на значительных уровнях, и по сравнению с неявной индукцией и последующей экстракцией белка из бактерий, количество белка, которое должно быть получено, обычно на несколько порядков ниже. Существует компромисс между недорогим и легким извлечением рекомбинантного белка из бактерий и более дорогим и утомительным извлечением белка из ткани. Основным достижением последнего является то, что можно извлечь белок в его физиологической форме, которая присутствует в ткани, включая все взаимные эффекты, которые могут повлиять на его складчатую и /или каталитическую активность.
Белок, экстрагированный и очищенный этим протоколом, поможет идентифицировать компетентные ингибиторы FAHD113, возможных партнеров белкового взаимодействия9 и возможные, еще не обнаруженные роли белка9. Изучение ферментативных ингибиторов, выработка моноклональных антител и изучение структуры белка в первую очередь значительно поддерживаются при наличии белка высокой чистоты, извлеченного из ткани, а не извлеченного из бактерий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы очень благодарны за техническую помощь Айсе Озтюрк и Еве Альбертини. Мыши, используемые для генерации ткани печени, содержались под наблюдением Univ.-Doz. Д-р Пиддер Янсен-Дюрр (Институт биомедицинских исследований старения при Инсбрукском университете, Реннвег 10, 6020 Инсбрук, Австрия).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filter units | MERCK | SLGP033RS | Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, not steril |
| 0.45 µm filter units | MERCK | SLHP033NS | Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, not steril |
| 15 mL Falcon tubes | VWR | 734-0451 | centrifugal tubes |
| 50 mL Falcon tubes | VWR | 734-0448 | centrifugal tubes |
| 96-Well UV Microplate | Thermo-Fischer | 8404 | UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates |
| Acrylamide/Bis Solution (40%, 29:1 ratio) | BIO-RAD | #1610147 | 40% acrylamide/bis-acrylamide, 29:1 (3.3% crosslinker) solution for casting polyacrylamide gels |
| ÄKTA FPLC system | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | - | using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the "ÄKTA pure" system |
| Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | MERCK | UFC901024 | centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 15 mL |
| Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | MERCK | UFC801024 | centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 4 mL |
| Ammonium sulfate powder | MERCK | A4418 | ammonium sulphate for molecular biology, ≥99.0% |
| Ammoniumpersulfat reagent grade, 98% | MERCK | 215589 | Catalyst for acrylamide gel polymerization. |
| Coomassie Brilliant blue R 250 | MERCK | 1125530025 | Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) for electrophoresis Trademark of Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g/l, H2O, 25 °C) |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MERCK | D9277 | Cellulose membranes for the exchange of buffers via dialysis. |
| Eppendof tubes 1.5 mL | VWR | 525-1042 | microcentrifugal tubes; autoclaved |
| HiLoad 26/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 28989334 | HiLoad Superdex 75 pg prepacked columns are for high-resolution size exclusion chromatography of recombinant proteins |
| Immun-Blot PVDF Membrane | BIO-RAD | #1620177 | PVDF membranes are protein blotting membranes optimized for fluorescent and multiplex fluorescent applications. |
| Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | #1703930 | Use the Mini Trans-Blot Cell for rapid blotting of Mini-PROTEAN precast and handcast gels. |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels | BIO-RAD | #1658004 | 4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam. |
| Mono Q 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 17516701 | Mono Q columns are strong anion exchange chromatography columns for protein analysis or small scale, high resolution polishing of proteins. |
| Mono S 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 17516901 | Mono S columns are strong cation exchange chromatography columns for protein analysis or small scale high resolution polishing of proteins. |
| PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa | Thermo-Fischer | 26616 | A mixture of 10 blue-, orange-, and green-stained proteins (10 to 180 kDa) for use as size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo-Fischer | 23225 | A two-component, high-precision, detergent-compatible protein assay for determination of protein concentration. |
| Sonifier 250; Ultrasonic Cell Disruptor w/ Converter | Branson | - | New models at https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf |
| Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (affinity isolated) | Agilent Dako | P0399 | The antibody used for horseradish peroxidase conjugation reacts with rabbit immunoglobulins of all classes. |
| TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethane, TMEDA | MERCK | T9281 | TEMED (N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine) is molecule which allows rapid polymerization of polyacrylamide gels. |
| Tube Roller | - | - | A general tube rotator roller; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71 |
| Tube Rotator | - | - | A general tube rotator wheel; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123 |
| ULTRA-TURRAX; T 25 digital | IKA | 0003725000 | New models at https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/ |
References
- Pircher, H., et al. Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase. Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).
- Pircher, H., et al. Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase. Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).
- Kang, T. -W., et al. Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development. Nature. 479 (7374), 547-551 (2011).
- Hong, H., Seo, H., Park, W., Kim, K. K. -J. Sequence, structure and function-based classification of the broadly conserved FAH superfamily reveals two distinct fumarylpyruvate hydrolase subfamilies. Environmental Microbiology. 22 (1), 270-285 (2020).
- Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase. Structure. 7 (9), London, England. 1023-1033 (1999).
- Bateman, R. L., et al. Mechanistic inferences from the crystal structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a bound phosphorus-based inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 276 (18), 15284-15291 (2001).
- Weiss, A. K. H., et al. Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1. Biochemical Journal. 475 (22), 3561-3576 (2018).
- Etemad, S., et al. Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 - a new regulator of mitochondrial function and senescence. Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).
- Weiss, A. K. H., et al. Regulation of cellular senescence by eukaryotic members of the FAH superfamily - A role in calcium homeostasis. Mechanisms of Ageing and Development. 190, 111284 (2020).
- Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-Dürr, P. Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells. Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).
- Wiley, C. D., et al. Mitochondrial dysfunction induces senescence with a distinct secretory phenotype. Cell Metabolism. 23 (2), 303-314 (2016).
- Weiss, A. K. H., et al. Expression, purification, crystallization, and enzyme assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59729 (2019).
- Weiss, A. K. H., et al. Inhibitors of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain Containing Protein 1 (FAHD1). Molcules. 26 (16), 5009 (2021).
- Mizutani, H., Kunishima, N. Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8. Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).
- Lee, C. H. A simple outline of methods for protein isolation and purification. Endocrinology and Metabolism. 32 (1), Seoul, Korea. 18-22 (2017).
- Amer, H. E. A. Purification of proteins: Between meaning and different methods). Proteomics Technologies and Applications. , (2019).
- Niu, L., Yuan, H., Gong, F., Wu, X., Wang, W. Protein extraction methods shape much of the extracted proteomes. Frontiers in Plant Science. 9, 802 (2018).
- Gordon, J. A. Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).
- Gallagher, S. R. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. , (2012).
- Ahmed, U., Saunders, G. Effect of pH on Protein Size Exclusion Chromatography. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf (2011).
- Sørensen, B. K., et al. Silver staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 304 (1), 33-41 (2002).
- Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).
- Cytiva Life Fundamentals of size exclusion chromatography. , Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography (2022).
- Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Frontiers in Microbiology. 5, 172 (2014).
- Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).
