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Biochemistry

Extracción y purificación de la proteína FAHD1 del riñón porcino y el hígado de ratón

Published: February 18, 2022 doi: 10.3791/63333
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Research Institute for Biomedical Aging Research, University of Innsbruck

Summary

Este protocolo describe cómo extraer la proteína 1 que contiene el dominio fumarilacetato hidrolasa (FAHD1) del riñón porcino y el hígado de ratón. Los métodos enumerados pueden adaptarse a otras proteínas de interés y modificarse para otros tejidos.

Abstract

La proteína 1 que contiene el dominio de la fumarilacetoacetato hidrolasa (FAHD1) es el primer miembro identificado de la superfamilia FAH en eucariotas, actuando como oxaloacetato descarboxilasa en las mitocondrias. Este artículo presenta una serie de métodos para la extracción y purificación de FAHD1 a partir de riñón porcino e hígado de ratón. Los métodos cubiertos son la cromatografía de intercambio iónico con cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC), la filtración en gel preparativa y analítica con FPLC y los enfoques proteómicos. Después de la extracción total de proteínas, se exploró la precipitación de sulfato de amonio y la cromatografía de intercambio iónico, y se extrajo FAHD1 a través de una estrategia secuencial utilizando intercambio iónico y cromatografía de exclusión de tamaño. Este enfoque representativo puede adaptarse a otras proteínas de interés (expresadas a niveles significativos) y modificarse para otros tejidos. La proteína purificada del tejido puede apoyar el desarrollo de anticuerpos de alta calidad y/o inhibidores farmacológicos potentes y específicos.

Introduction

La proteína 1 que contiene el dominio faH eucariota (FAHD1) actúa como oxaloacetato bifuncional (OAA) descarboxilasa (ODx)1 y acilpiruvato hidrolasa (ApH)2. Se localiza en las mitocondrias2 y pertenece a la amplia superfamilia faH de enzimas 1,2,3,4,5,6. Mientras que su actividad apH es solo de menor relevancia, la actividad ODx de FAHD1 está involucrada en la regulación del flujo del ciclo TCA 1,7,8,9. La OAA no solo es necesaria para la reacción de la citrato sintasa central en el ciclo del ácido tricarboxílico, sino que también actúa como un inhibidor competitivo de la succinato deshidrogenasa como parte del sistema de transporte de electrones y como metabolito cataplerótico. La regulación a la baja de la expresión del gen FAHD1 en células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) resultó en una reducción significativa en la tasa de proliferación celular10, y una inhibición significativa del potencial de membrana mitocondrial, asociada con un cambio concomitante a la glucólisis. El modelo de trabajo se refiere a la disfunción mitocondrial asociada a la senescencia (MiDAS)11-como el fenotipo8, donde los niveles de OAA mitocondrial están estrechamente regulados por la actividad de FAHD1 1,8,9.

La proteína recombinante es más fácil de obtener a través de la expresión y purificación de la bacteria12 en lugar de a partir del tejido. Sin embargo, una proteína expresada en bacterias puede estar sesgada por la posible falta de modificaciones post-traduccionales, o simplemente puede ser problemática (es decir, debido a la pérdida de plásmidos, respuestas al estrés bacteriano, enlaces disulfuro distorsionados / no formados, secreción nula o deficiente, agregación de proteínas, escisión proteolítica, etc.). Para ciertas aplicaciones, la proteína debe obtenerse a partir de lisado celular o tejido, con el fin de incluir tales modificaciones y / o excluir posibles artefactos. La proteína purificada del tejido apoya el desarrollo de anticuerpos de alta calidad y/o inhibidores farmacológicos potentes y específicos para enzimas seleccionadas, como para FAHD113.

Este manuscrito presenta una serie de métodos para la extracción y purificación de FAHD1 a partir de riñón porcino e hígado de ratón. Los métodos descritos requieren cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC), pero por lo demás utilizan equipos de laboratorio comunes. Los métodos alternativos se pueden encontrar en otros lugares 14,15,16,17. Después de la extracción total de proteínas, el protocolo propuesto implica una fase de prueba, en la que se discuten los subprotocolos para la precipitación de sulfato de amonio y la cromatografía de intercambio iónico (Figura 1). Después de definir estos subprotos protocolos, la proteína de interés se extrae a través de una estrategia secuencial utilizando intercambio iónico y cromatografía de exclusión de tamaño con FPLC. Sobre la base de estas directrices, el protocolo final puede adaptarse individualmente para otras proteínas de interés.

Figure 1
Figura 1: La estrategia general de este protocolo. De arriba a abajo: La proteína se extrae de los tejidos. El homogeneizado tisular se prepara, centrifuga y filtra. Para cada par de muestras sobrenadantes y derivadas de pellets, se deben realizar pruebas de precipitación de sulfato de amonio y cromatografía de intercambio iónico (FPLC) para sondear las condiciones óptimas. Después de establecer estos subprotos protocolos, la proteína se puede extraer a través de un procedimiento secuencial de precipitación de sulfato de amonio, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de exclusión de tamaño repetitivo (FPLC) a diferentes concentraciones de pH y sal. Todos los pasos deben ser controlados por Western Blot. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocol

Todos los experimentos se realizaron de conformidad con las directrices institucionales. El riñón porcino se obtuvo fresco del supermercado local. Los tejidos hepáticos se cosecharon de ratones de tipo salvaje C57BL6 mantenidos en el Instituto de Investigación del Envejecimiento Biomédico de la Universidad de Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Austria bajo la supervisión de Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr, cubierto por un permiso ético como líder de proyecto emitido en 2013 (BMWF-66.008/0007-II/3b/2013). El mantenimiento y el uso de los ratones para el proyecto están cubiertos por el permiso ético No. 2020-0.242.978 del 5 de mayo de 2020, emitido por el Ministerio de Educación, Ciencia e Investigación de Austria (BMBWF).

1. Preparativos

NOTA: Antes de que comience el protocolo, se deben preparar varias cosas, es decir, el tampón de lisis de proteínas, la muestra de tejido crudo y un anticuerpo específico, además de productos químicos generales y materiales.

  1. Preparar 250 mL de tampón de lisis proteica por cada 100 g de peso neto de tejido: 250 mL de 1x PBS con 50 mM NaF, 1 mM PMSF, 2 μg/mL de aprotinina y 1 mM de ortovanadato activado (ver Tabla 1). Filtre la solución con una unidad de filtro de jeringa de 0,22 μm.
    NOTA: Se requiere la activación del ortovanadato antes de su uso para convertirlo en un inhibidor más potente de la proteína tirosina fosfatasas18. El ortovanadato activado se puede obtener de proveedores comerciales, pero también se puede preparar de la siguiente manera.
    1. Preparar una solución madre de 200 mM de ortovanadato (de sodio) en ddH2O. Para preparar 10 ml de solución, agregue 368 mg de Na3VO4 a 9 ml de agua y disuelva agitando. Una vez disuelto, enrasar el volumen hasta 10 mL con ddH2O.
      NOTA: El pH inicial de la solución de ortovanadato de sodio puede variar con la fuente del material, y el pH debe ajustarse a 10 en un enfoque repetitivo de la siguiente manera.
    2. Dependiendo del pH inicial de la solución, ajuste el pH a 10 con NaOH o HCl. A pH > 10, la solución tendrá un color amarillo. Hervir la solución hasta que se vuelva incolora, enfriarla a temperatura ambiente y verificar el pH. Si el pH es >10, agregue un pequeño volumen de HCl para ajustar el pH a 10. En este punto, la solución puede volverse amarilla nuevamente.
    3. Repita la ebullición y el enfriamiento hasta que la solución permanezca incolora y el pH se estabilice en 10 (aproximadamente 5-7 veces). En este punto, la adición de HCl da como resultado una apariencia débil de color amarillo en la solución. Conservar el ortovanadato activado en alícuotas de 1 ml a -20 °C.
  2. Prepare tubos con 2 ml de tampón de lisis por gramo de tejido y colóquelos sobre hielo.
    NOTA: Este protocolo utilizó ocho tubos de 50 ml, cada uno lleno de 30 ml de tampón de lisis en total para un riñón porcino (aproximadamente 100-150 g), y dos tubos cada uno lleno de 40 ml de tampón de lisis para 20 hígados de ratón (cada uno de 1-2 g) en total.
  3. Prepare el tejido: diseccione el tejido en una placa de vidrio prelimpiada colocada sobre hielo en una caja de espuma de poliestireno. Corte trozos de tejido de aproximadamente 100 mg cada uno para ser transferidos fácilmente a los tubos respectivos para la lisis posterior. Transfiera las piezas de tejido a los tubos preparados (paso 1.2).
  4. Prepare una solución saturada de sulfato de amonio: caliente 500 ml de ddH2O a 70 °C y, mientras agita, agregue gradualmente polvo de sulfato de amonio (consulte la Tabla de materiales) hasta que no se disuelva más sulfato de amonio. Enfríe esta solución (sobre)saturada a temperatura ambiente y guárdela a 4 °C durante la noche.

2. Extracción total de proteínas

NOTA Después de preparar la muestra en tampón de lisis de proteínas frías (consulte el paso 1.3), homogeneice el tejido lo mejor posible mediante sonicación mediante una sonda ultrasónica o utilizando un homogeneizador eléctrico de la siguiente manera.

  1. Homogeneización de tejidos
    1. En el caso de un riñón porcino, sonicar la suspensión preferiblemente mediante una sonda ultrasónica manteniendo la muestra en hielo (10 ciclos de pulso de 15 s, con intervalos de 30 s entre los pulsos para enfriar la muestra sobre hielo, a amplitud media con ciclo de trabajo del 50%).
    2. En el caso de los órganos de ratón, homogeneizar la suspensión utilizando un homogeneizador eléctrico (comenzando con una fuerza baja y acelerando lentamente a fuerza media) manteniendo la muestra en hielo. Lave regularmente el homogeneizador eléctrico en PBS para eliminar cualquier material orgánico que obstruya el dispositivo.
    3. Saque 20 μL de las muestras y compruebe bajo el microscopio si las células del tejido homogeneizado se destruyen adecuadamente; de lo contrario, repita la homogeneización.
  2. Centrifugar los tubos en una centrífuga de mesa a 10.000 x g durante 30 min a 4 °C.
    NOTA: Opcionalmente, centrifugar el sobrenadante por segunda vez a 20.000 x g durante 30 min a 4 °C para eliminar pequeñas fracciones del pellet inicial que puedan haber sido transferidas. Esto simplificará la filtración posterior en el paso 2.3.
  3. Recoge el sobrenadante en un tubo fresco y colócalo sobre hielo. Filtre secuencialmente el sobrenadante utilizando unidades de filtro de jeringa de 0,45 μm y 0,22 μm. Alícuota el sobrenadante en lotes de 10 ml y congélelos a -20 °C para un almacenamiento a corto plazo o a -80 °C para un almacenamiento más largo.
    NOTA: El filtrado previo con 0,45 μm elimina la mayoría de las partículas antes de que un segundo paso de filtrado con 0,22 μm elimine las partículas más finas. El uso del filtro de 0,22 μm directamente puede causar el riesgo de obstrucción de los filtros.
  4. Prepare una muestra de 50 μL para el análisis SDS-PAGE/western blot agregando 10 μL de tampón de muestra SDS 5x (consulte la Tabla 1) a 40 μL del sobrenadante, y luego hirviendo a 95 °C durante 10 min.
    1. Opcionalmente, resuspenda aproximadamente 100 μL de pellet obtenido en el paso 2.2 en 900 μL de ddH2O, y prepare una muestra para el análisis SDS-PAGE/western blot como se describió anteriormente.
      NOTA: La inclusión de muestras derivadas de pellets en el análisis de western blot, además del control positivo, indicará si la expresión de la proteína es baja o si el anticuerpo es problemático.

3. SDS-PAGE y análisis de western blot

NOTA: Se requiere el análisis de Western blot para verificar la solubilidad de la proteína. A continuación se describe un protocolo para la electroblotting, utilizando un sistema de borrado húmedo/tanque (consulte la Tabla de materiales). Un protocolo alternativo para SDS-PAGE se puede encontrar en otra parte19.

  1. Prepare un gel discontinuo de poliacrilamida SDS-PAGE al 12,5% de acuerdo con las instrucciones del fabricante (es decir, un gel de apilamiento encima de un gel de resolución; consulte la Tabla 1). Ejecute los ejemplos preparados previamente durante el paso 2 (similar a los pasos 4, 5 y 6; consulte a continuación).
    1. Cargue una escalera de marcadores de proteínas en el primer pozo (ver Tabla de Materiales). Carga 5 ng de proteína recombinante hFAHD1 (obtenida de la bacteria12; ver Tabla 1) como control positivo en el segundo pozo.
    2. Posteriormente, cargue 20 μL de la muestra a analizar y llene todos los pozos restantes con 20 μL de tampón de muestra SDS-PAGE 1x preparado (es decir, 5x tampón de muestra diluido con ddH2O). Ejecute los geles SDS-PAGE a 125 V utilizando el búfer de ejecución SDS (consulte la Tabla 1).
  2. Una vez que se complete SDS-PAGE, realice un análisis de western blot y sondee las membranas utilizando el anticuerpo disponible contra FAHD1 (ver Tabla 1).
    NOTA: Como las muestras se toman de homogeneizado de tejido crudo, generalmente la calidad del SDS-PAGE y el análisis de western blot en este punto se ve comprometida; sin embargo, es importante comprobar si la proteína a extraer es soluble en el sobrenadante. El siguiente protocolo se probó para el riñón porcino y diferentes órganos de ratón, incluidos el hígado, el corazón, el cerebro y el riñón.
    1. Prepare el búfer de transferencia de western blot 10x (consulte la Tabla 1). Prepare el búfer de transferencia de western blot 1x (consulte la Tabla 1) y enfríelo a 4 °C.
    2. Activar una membrana de PVDF durante 2 min en metanol. Lavar la membrana en ddH2O durante 2 min. Equilibre la membrana durante 15 min en 1x western blot transfer buffer.
    3. Lave el SDS-gel con 1x PBS durante 10 minutos mientras agita para eliminar el tampón de funcionamiento de SDS, y luego incube el gel en 1x búfer de transferencia de western blot durante 10 min para el equilibrio. Ensamble el cassette electroblotting (es decir, combinando la membrana de PVDF activada y los geles) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    4. Ejecute la mancha a través de electroblotting a 300 mA durante 1 h en una caja de espuma de poliestireno llena de hielo o en la cámara frigorífica (4 °C). Transfiera la membrana de PVDF a un tubo de 50 ml con su lado expuesto mirando hacia el lado interno del tubo. Incubar la membrana en 20 ml de tampón de bloqueo de western blot (ver Tabla 1) durante la noche a 4 °C mientras roda sobre un rodillo de tubo (ver Tabla de Materiales).
    5. Al día siguiente, lave la membrana durante 5 min con 20 ml de tampón de lavado de western blot (PBS con 0.1% (v / v) Tween 20) en el mismo tubo mientras rueda. Incubar la membrana en el mismo tubo con el anticuerpo primario2 (dirigido a FAHD1; ver Tabla 1) diluido 1:500 en el tampón de bloqueo de western blot durante 1 h a temperatura ambiente mientras se enrolla.
    6. Lave la membrana en el mismo tubo tres veces durante 10 minutos cada una con 20 ml de tampón de lavado de western blot mientras se enrolla. Incubar la membrana durante 30 min a temperatura ambiente con anticuerpo secundario conjugado con HRP (ver Tabla de Materiales) diluido 1:3000 en 5 mL de tampón de bloqueo de western blot.
    7. Lave la membrana en el mismo tubo tres veces durante 10 minutos cada una con 20 ml de tampón de lavado de western blot y dos veces durante 5 minutos cada una con 1x PBS. Seque la membrana sosteniéndola cuidadosamente con pinzas en un borde y tocando un trozo de celulosa o un trozo de papel Whatman con el borde opuesto (inferior) de la membrana. Coloque la membrana (lado expuesto hacia arriba) en una placa de vidrio limpia.
    8. Cubra cuidadosamente toda la membrana con 1 ml de sustrato ECL western blot preparado con una pipeta, teniendo cuidado de no crear burbujas de aire. Deje que la solución de ECL se incube durante 3 minutos e inmediatamente desarrolle la membrana utilizando una película de rayos X o utilizando un sistema de imágenes.
      NOTA: Si la proteína no se detectó en ninguna de las muestras, sino solo en el control positivo, esto puede indicar que la proteína es insoluble o no está presente en cantidades adecuadas para ser detectada por el anticuerpo. Si solo se cargaran nanogramos del control positivo, el primer escenario es más probable. Si no se detectó ninguna proteína, verifique la calidad del anticuerpo y tal vez cambie a un anticuerpo policlonal en lugar de un anticuerpo monoclonal. En raras ocasiones, es decir, para algunas proteínas hidrofóbicas, la proteína puede ser detectable después de la centrifugación, pero no después de la filtración. En tal caso, se recomienda utilizar unidades de filtro especiales para proteínas hidrofóbicas.
  3. Opcionalmente, tiñe las membranas de PVDF después de western blot para controlar la transferencia exitosa de la proteína del gel SDS-PAGE a la membrana de PVDF.
    NOTA: La tinción de coomassie se recomienda para la solución de problemas, el desarrollo de métodos y la documentación, pero tenga en cuenta que después de aplicar este protocolo, las membranas se pierden para un análisis posterior de Western Blot. La tinción de Ponceau S da una tinción más débil, pero se puede usar si se van a volver a sondear las membranas.
    1. Prepare pequeñas bandejas que contengan las soluciones de tinción (Coomassie o Ponceau S) y desmanchas.
    2. Usando pinzas, coloque la membrana en la solución de tinción y agite suavemente hasta que la membrana se tiñe bien (5-10 min).
    3. Transfiera la membrana a la solución de retención y agite hasta que la solución esté saturada (5-10 min). Repita el paso de detención hasta que se puedan observar las bandas de proteínas en la membrana; si no se observan bandas, repita la tinción con un tiempo de incubación más largo. Seque la membrana colocándola en una placa de vidrio con pinzas.

4. Pruebas: Precipitación de sulfato de amonio

NOTA: La precipitación de sulfato de amonio es un método de purificación de proteínas al alterar la solubilidad de la proteína. En un experimento preliminar, la concentración de sulfato de amonio se incrementa secuencialmente a un valor que precipita una cantidad máxima de contaminantes proteicos, mientras se deja FAHD1 en solución. La solubilidad de la proteína se investiga nuevamente a través del análisis de western blot.

  1. Proceda a partir de la etapa 2.3: descongele una alícuota de la muestra o proceda directamente después de la extracción de proteínas (es decir, sin congelar la muestra). Filtre la muestra utilizando una unidad de filtro de 0,22 μm para excluir posibles precipitados después de la descongelación. Prepare seis tubos de 1,5 ml sobre hielo y transfiera 250 μL de muestra a cada tubo.
  2. Prepare una serie de dilución de 5%, 10%, 15%, 20%, 25% y 30% de sulfato de amonio en los tubos preparados anteriormente, y componga el volumen final a 1000 μL con tampón de lisis de proteínas. Incubar las muestras a 4 °C durante la noche en un rotador de tubo (ver Tabla de Materiales).
  3. Usando una centrífuga de mesa, centrífuga a 10,000 x g durante 30 min a 4 ° C y transfiera cuidadosamente todos los sobrenadantes en tubos separados. Seque al aire los gránulos resultantes y vuelva a suspender cada uno de ellos en 1000 μL de ddH2O.
  4. Para cada par de pellets y sobrenadantes resuspendidos del paso anterior, mezcle 40 μL con 10 μL de tampón de muestra 5x SDS y hierva a 95 ° C con tapas abiertas hasta que la mayor parte del líquido se haya vaporizado. Luego, vuelva a suspender el pellet en una mezcla de 50% DMSO en ddH2O.
  5. Realice SDS-PAGE (paso 3) pero ejecute los geles a 80 V durante 3 h. Para cada concentración de sulfato de amonio, cargue las muestras derivadas del pellet resuspendido y el sobrenadante (paso 4.3) en pares. Realice un análisis de western blot (paso 3).
  6. Compruebe si la concentración más alta de sulfato de amonio, a la que la proteína a purificar (es decir, FAHD1) permanece en la muestra derivada del sobrenadante. En base a los resultados, definir un protocolo de precipitación de sulfato de amonio para la proteína de interés, para ser utilizado en futuros experimentos.
    NOTA: El sulfato de amonio es bien conocido por distorsionar SDS-PAGE y western blot. A medida que aumenta la concentración de sulfato de amonio, la calidad del análisis de western blot se verá comprometida. Sin embargo, al igual que con el paso 3 anterior, este análisis se utiliza para verificar la solubilidad de la proteína de interés a concentraciones dadas de sulfato de amonio. Este protocolo tiene como objetivo precipitar otras proteínas, mientras que la proteína a purificar debe permanecer soluble.

5. Pruebas: cromatografía de intercambio iónico con FPLC

NOTA: Las moléculas con grupos funcionales cargados se unen a una columna de partículas de sílice para FPLC, lo que permite la diferenciación de proteínas de acuerdo con su carga superficial. Realice este paso dos veces, utilizando la columna de intercambio catiónico y la columna de intercambio aniónico (consulte tabla de materiales). Los pasos del protocolo son los mismos para la cromatografía de intercambio catiónico o aniónico, pero los tampones que se utilizarán son diferentes (véase la Tabla 1); ambos con condiciones de "bajo contenido de sal" 15 mM NaCl y "alto contenido de sal" de 1 M NaCl. Para las columnas utilizadas, se recomienda un caudal de 1 ml/min.

  1. Configure el sistema FPLC con la columna de intercambio aniónico o catiónico. Lave la columna con 5 volúmenes de columna (CV) de 20% de EtOH (en H2O), seguido de 5 CV de ddH2O. Alternativamente, lave la columna con 1 CV de tampón de sal baja, tampón de sal alta y nuevamente tampón de sal baja en el orden hasta que no se observen más picos en el cromatograma, pero lave al menos una vez.
  2. Después de determinar el protocolo óptimo para la precipitación de sulfato de amonio a pequeña escala (paso 4), aplique el protocolo de precipitación a 10 ml de homogeneizado de tejido original (paso 2). Opcionalmente, dialice la muestra contra el tampón bajo en sal.
    1. Aplique la muestra sobre la columna (por ejemplo, mediante inyección o mediante el uso de una bomba de muestra) y recoja el flujo. Lave la columna con 1 CV del tampón bajo en sal.
  3. Configure una elución de gradiente lineal de 100% de tampón de sal baja / tampón de sal alta al 0% de tampón de sal baja / tampón de sal 100% alto dentro de 3 CV. Recolecte continuamente fracciones de 1 ml. Una vez finalizado el gradiente, continúe funcionando con el tampón de sal alta hasta que no se detecten más picos asociados a proteínas (absorción UV a 280/255 nm) en el cromatograma en el rango de 1 CV.
  4. Aplicar 1 mL de SDS al 25% disuelto en 0,5 M NaOH (en ddH2O) para limpiar la columna. Consecutivamente, lavar la columna con 3 CV de ddH2O y 3 CV de 20% EtOH (en ddH2O).
  5. Recolectar muestras SDS-PAGE de todas las fracciones pico y el flujo a través, y sondearlas a través de Western Blot para detectar la presencia de la proteína de interés (paso 3). Congele las fracciones recogidas en nitrógeno líquido y guárdelas a -80 °C.
  6. Una vez finalizado el análisis de western blot, descongele y agrupe las fracciones que contienen la proteína de interés y descarte las demás. Repita los pasos 5.1-5.5 con la columna alternativa (es decir, columna de intercambio catiónico o aniónico).
  7. Después de que ambas columnas hayan sido sondeadas, defina un protocolo FPLC para la proteína de interés, que se utilizará en futuros experimentos. Reduzca el volumen de la solución proteica utilizando unidades de filtro de ultracentrugación (10 kDa, consulte la Tabla de materiales) hasta 2 ml.
    NOTA: Hay dos resultados esperados de esta serie de experimentos. O bien la proteína de interés se ha unido a una de las columnas, y la solución proteica ya es bastante pura después de la elución, o la proteína permanece en el flujo en ambos casos. En este último escenario, aunque la proteína está en el flujo, el efecto de limpieza de este paso aún podría ser significativo. En tal caso, como para FAHD1 en riñón porcino e hígado de ratón, este paso de intercambio iónico aún se realizará. Si ni la columna de intercambio catiónico o aniónico puede proporcionar un efecto de limpieza adecuado, se puede intentar modificar el pH del lisado y el tampón, y dializar la muestra contra el búfer en ejecución antes de la aplicación a FPLC.

6. Extracción de proteínas utilizando subprotocolos definidos para la precipitación de sulfato de amonio y FPLC

NOTA: Las partículas porosas en una columna de gel de sílice para FPLC (Ver Tabla de Materiales) permiten la diferenciación de proteínas según su radio hidrodinámico. Los pasos descritos deben realizarse con un sistema FPLC, utilizando cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). Para la columna SEC utilizada (ver Tabla de Materiales), se recomienda un caudal de 0,3 mL/min.

  1. Prepare todos los materiales necesarios (consulte el paso 1) y extraiga la proteína total del tejido (consulte el paso 2). Realice una precipitación de sulfato de amonio con todo el homogeneizado tisular que no se utilizó para la prueba (ver paso 4). Para volúmenes más grandes, concentre el lisado utilizando unidades de filtro de ultracentrugación (10 kDa; consulte la Tabla de materiales) hasta un volumen más pequeño de 50 ml o menos.
  2. Realice un primer paso de purificación mediante cromatografía de intercambio iónico (ver paso 5).
    1. Prepare muestras para Western Blot, como se describe en los pasos anteriores. Realice análisis de western blot y agrupte todas las fracciones que contienen FAHD1 de la cromatografía de intercambio iónico.
    2. Reduzca el volumen de la solución proteica hasta 2 ml utilizando unidades de filtro de ultracentrugación (10 kDa). Filtre secuencialmente la solución con unidades de filtro de jeringa de 0,45 μm y 0,22 μm para eliminar cualquier microprecipitación.
  3. Equilibrar la columna SEC con 1 CV de búfer de ejecución SEC (ver Tabla 1), que contiene 1 mM TDT. Cargue la muestra en la columna y ejecute la cromatografía hasta que se eluyan todas las proteínas (1-2 CV).
    1. Recoger fracciones de 1 mL del flujo a través que corresponda a picos significativos en el cromatograma (absorción UV a 280/255 nm) y preparar muestras de 50 μL de cada fracción recogida para el análisis SDS-PAGE y western blot, como se describe en los pasos anteriores. Congele todas las fracciones con nitrógeno líquido y guárdelas a -80 °C.
  4. Lavar consecutivamente la columna SEC con 1 CV de ddH2O y 1 CV de 20% EtOH (en ddH2O). Realice análisis de western-Blot y agrupe todas las fracciones que contienen FAHD1. Reduzca el volumen de la solución proteica hasta 2 ml utilizando unidades de filtro de ultracentrugación (10 kDa, consulte la Tabla de materiales).
  5. Evalúe la concentración de proteínas utilizando un kit de ensayo comercial de BCA (consulte la Tabla de materiales).
    NOTA: El pH y el contenido de sal de la fase móvil pueden influir en el perfil de elución de las proteínas globulares20. Las condiciones ácidas o básicas pueden dar lugar a picos menos definidos y un aumento de las interacciones proteína-matriz que conducen a la retención parcial de proteínas en la columna20. Este efecto puede ser explotado para una mayor purificación de proteínas. Una repetición del paso 6 con diferentes caudales, pH y concentraciones de sal puede mejorar la pureza de la proteína20.

7. Tinción de plata

NOTA: Se requiere un análisis de tinción de plata de los geles SDS-PAGE para verificar si hay contaminaciones de proteínas que pueden no verse con la tinción de Coomassie. El siguiente protocolo es una de las muchas versiones que se pueden encontrar en la literatura21. Realice todos los pasos de incubación agitando en una bandeja de vidrio limpia. Recoja todos los líquidos que contengan plata y formaldehído en un contenedor de desechos especial y deséchelos adecuadamente.

  1. Incubar los geles SDS-PAGE en solución fijadora de tinción de plata (ver Tabla 1) durante la noche en la cámara frigorífica. Incubar los geles en solución de incubación de tinción de plata (ver Tabla 1) durante 3 h a temperatura ambiente. Opcionalmente, agregue glutaraldehído (ver Tabla 1) para mejorar la detección de bandas débiles. Lave los geles cuatro veces en ddH2O durante 10 min cada uno.
  2. Incubar los geles en solución de plata tintineante de plata (ver Tabla 1) durante 1 h.
    NOTA: Tenga en cuenta que a partir de ahora todos los líquidos y el gel en sí contienen plata y formaldehído que son tóxicos.
  3. Incubar los geles en solución reveladora de tinción de plata (ver Tabla 1) con agitación vigorosa hasta que las bandas sean claramente visibles. Para detener la reacción, deseche la solución reveladora e incube inmediatamente los geles en solución de parada de tinción de plata (ver Tabla 1) durante un mínimo de 10 min.
    NOTA: Las bandas teñidas en los pasos 7.2 y 7.3 se desarrollarán constantemente. Agregar más formaldehído a la solución de lo indicado puede ser necesario si la tinción es débil.

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Representative Results

La proteína FAHD1 se extrajo del riñón porcino y del hígado de ratón utilizando el protocolo presentado. Para el tejido de ratón, se requieren múltiples órganos para obtener varios μg después de la etapa final de purificación. Por esta razón, este artículo se centra en la extracción de FAHD1 de los riñones porcinos, que es un experimento mucho más ejemplar. La extracción de FAHD1 del hígado de ratón se realiza para presentar las dificultades y posibles escollos de este protocolo. En general, se recomienda utilizar órganos que muestren un alto nivel de expresión de la proteína que se desea purificar. El Atlas de Proteínas Humanas22 puede ser de ayuda para estimar la expresión en el sistema modelo, o se pueden realizar experimentos preliminares de western blot con diferentes lisados de tejido crudo para evaluar estos niveles. El control positivo utilizado en todos los análisis de Western Blot fue una proteína recombinante marcada, que se ejecuta a un peso molecular ligeramente mayor.

Como primer experimento, se presenta la extracción de FAHD1 del riñón porcino. El proceso de homogeneización de tejidos (paso 1) y extracción total de proteínas (paso 2) se presenta en la Figura suplementaria 1 (consulte la leyenda para obtener una descripción de los pasos individuales). Se utilizó una décima parte del lisado total para los siguientes experimentos.

La precipitación de sulfato de amonio se probó una vez para este lisado, agregando sulfato de amonio al lisado en diferentes concentraciones (paso 4) (Figura 2). Después de la centrifugación, se tomaron muestras de gránulos y sobrenadantes y se analizaron con western blot utilizando un anticuerpo policlonaldefinido 2 criado contra FAHD1 humano. 200 ng de FAHD1 humana recombinante marcada con His/S obtenida de E. coli12 se cargó como control positivo. La banda de proteína FAHD1 se puede ver a 25 kDa, mientras que el control positivo marcado funciona a 34 kDa. Sobre la base de estos datos, se definió un protocolo donde el lisado se trata con sulfato de amonio al 25%, es decir, condiciones en las que FAHD1 todavía está en el sobrenadante, mientras que la mayoría de las otras proteínas se precipitan. Este es un paso importante en la estrategia de purificación. La precipitación de sulfato de amonio es un paso de limpieza eficaz antes de proceder con otros métodos. Cabe destacar que no se utilizarán cantidades de sulfato de amonio superiores al 30%, porque el sulfato de amonio distorsiona gradualmente la calidad de SDS-PAGE y western blot.

Figure 2
Figura 2: Precipitación de sulfato de amonio y detección de western blot para FAHD1 porcino. (A) Se agregó sulfato de amonio al lisado en diferentes concentraciones (5% a 25% máximo) para precipitar proteínas de la solución. (B) Se determinó la presencia de FAHD1 porcino (25 kDa) en los pares individuales de gránulos y sobrenadante correspondientes a concentraciones variables de sulfato de amonio a través de western blot utilizando un anticuerpo policlonal criado contra FAHD1 humano. El sobrenadante correspondiente a la precipitación de sulfato de amonio al 25% todavía muestra la presencia de FAHD1 porcino en el sobrenadante, al mismo tiempo que precipita una buena cantidad de otras proteínas. Se cargaron 200 ng de proteína recombinante marcada con His/S como control positivo (34 kDa). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Después de probar columnas de intercambio iónico con FPLC, se definió una estrategia en la que FAHD1 porcino permanece en el flujo de una cromatografía de intercambio aniónico a pH 9 (paso 5). Comenzando con el lisado obtenido por precipitación de sulfato de amonio al 25% (como se definió en experimentos de prueba anteriores), se utilizó cromatografía de intercambio aniónico para eliminar más proteínas de la solución (Figura 3A). Las proteínas de unión se eliminaron por elución de la columna, mientras que el flujo se purificó aún más a través de SEC a pH 7.4 (Figura 3B). Siguiendo ambos pasos, el análisis de western blot identificó todas las fracciones que contenían FAHD1 porcino, que se agruparon y concentraron a 2 ml.

Figure 3
Figura 3: Purificación de cerdos FAHD1 con FPLC - parte 1. Las flechas rojas en el cromatograma y las manchas indican la presencia de FAHD1. En el cromatograma, "UV" denota la absorción de UV a 280 nm, "Cond" denota la conductividad (relacionada con la concentración de sal en el tampón) y "Conc B" denota el porcentaje de tampón de sal alta en el gradiente de tampón (0% de tampón de sal baja pura; tampón de sal alta pura 100% pura). (A) Purificación de FAHD1 porcino a partir de lisado obtenido por precipitación de sulfato de amonio al 25% con una columna de intercambio aniónico (FPLC). Mientras que muchas proteínas se unen a la columna, FAHD1 porcino se encuentra en el flujo. La suciedad y los contaminantes no proteicos se eliminan por elución de la columna, mientras que el flujo se procesa aún más. (B) El flujo a través de la cromatografía de intercambio aniónico anterior en (A) se purifica aún más a través de la cromatografía de exclusión de tamaño (FPLC) a pH 7.4. (A,B) El análisis de Western blot (blots recortados en la parte inferior) identificó fracciones que contienen FAHD1 porcino, que se agrupan y concentran. Las manchas completas representan la membrana teñida de Coomassie después del análisis de western blot. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La muestra filtrada se aplicó de nuevo a SEC pero en condiciones tampón a pH 9 (ver Tabla 1) (Figura 4). La razón detrás de este enfoque es que el pH y el contenido de sal de la fase móvil pueden influir en el perfil de elución de las proteínas globulares20, y se encontró un perfil de elución mejorado para FAHD1 en estas condiciones tampón. Una fracción contenía proteína de niveles de pureza adecuados para los ensayos básicos de actividadenzimática 12 para confirmar finalmente la identidad de la proteína.

Figure 4
Figura 4: Purificación de cerdos FAHD1 con FPLC - parte 2. Las flechas rojas en el cromatograma y las manchas indican la presencia de FAHD1. Las muestras de proteínas previamente purificadas con intercambio aniónico y cromatografía de exclusión de tamaño se purifican aún más a través de cromatografía de exclusión de tamaño (FPLC) a pH 9 (panel superior). El análisis de Western blot representado en la parte inferior derecha identifica fracciones que contienen FAHD1 porcino, que se agrupan y concentran (paneles inferiores). La mancha en la parte inferior izquierda muestra la tinción de Coomassie de la membrana después de la mancha occidental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Se probó una estrategia alternativa (es decir, SEC seguida de cromatografía de intercambio iónico) con 2 ml del lisado obtenido después de la precipitación de sulfato de amonio (paso 4) (Figura suplementaria 2). La justificación de este experimento es que al usar primero SEC, las fracciones que contienen FAHD1 pueden separarse de la mayoría de las otras proteínas, mientras que una cromatografía de intercambio iónico posterior se puede usar para purificar aún más la proteína. En primer lugar, el lisado se fraccionó utilizando SEC a pH 7.4 (paso 6). El análisis de Western blot identificó todas las fracciones que contenían FAHD1 porcino. En segundo lugar, estas fracciones se concentraron y purificaron aún más utilizando una columna de intercambio aniónico a pH 9 (paso 5). Los cromatogramas y el análisis de Western Blot (Figura suplementaria 2) muestran que esta estrategia es alentadora porque el cromatograma de intercambio iónico muestra un pico estrecho definido que se asocia con niveles de proteínas enriquecidas en el western blot. Sin embargo, el inconveniente de esta estrategia es que está limitada por el volumen inicial a aplicar en el SEC (2 mL), por lo que el rendimiento de este método es muy bajo. Procesar un riñón porcino entero, por ejemplo, no es práctico.

Como otra modificación a este protocolo, se incluyó una columna de intercambio catiónico antes de la columna de intercambio aniónico cuando el FAHD1 porcino también estaba presente en el flujo. En cada paso del protocolo, se tomaron muestras de las fracciones que contenían FAHD1 porcino y se analizaron con un ensayo ODx, como se describe en otra parte12 (Figura suplementaria 3). La actividad enzimática específica aumenta junto con el nivel de pureza, es decir, junto con la creciente cantidad relativa de FAHD1 por proteína total.

Como segundo ejemplo, se presenta la extracción de FAHD1 del hígado de ratón, es decir, una colección de tejido hepático obtenido de 20 ratones. En comparación con la extracción de FAHD1 del riñón porcino presentada anteriormente, esta extracción resultó ser más tediosa. Se encontraron problemas en varios pasos del protocolo, que se presentarán a continuación. La proteína total se extrajo como se describe en el paso 2 (Figura suplementaria 4). Como el homogeneizado de hígado de ratón tiende a ser una entidad muy pegajosa y viscosa, se utilizaron papeles de filtro (similares a las unidades de filtro de café) para filtrar previamente el lisado, que se diluyó 1: 3 en el tampón de lisis después de la extracción, para hacer que la solución se pareciera más a un líquido. Esta dilución mejoró el procedimiento de filtración; sin embargo, hizo más tediosa la posterior detección de la proteína con western blot. Después de la filtración, el lisado preparado tuvo que ser concentrado antes de su uso posterior. Se utilizó una décima parte del lisado total para los siguientes experimentos.

Un primer paso de prueba para la precipitación de sulfato de amonio (Figura suplementaria 4I) mostró un posible problema que se puede encontrar. El sulfato de amonio en concentraciones más altas interrumpe los geles SDS-PAGE y causa un efecto de sonrisa cuando se ejecuta a 150 V (Figura suplementaria 5A; resultado negativo). La misma ejecución SDS-PAGE a 80 V muestra un resultado positivo (Figura suplementaria 5B). En este último caso, el efecto sonrisa se forma inicialmente, pero finalmente se resuelve debido al menor voltaje aplicado. Como la solución inicial tuvo que diluirse en gran medida para poder filtrar el lisado, el análisis inicial de western blot de estas muestras no tuvo éxito, es decir, el control positivo fue detectado por el anticuerpo, pero no por la proteína en las muestras aplicadas. Este problema se resolvió utilizando una mayor concentración tanto del lisado (concentrado utilizando unidades de filtro centrífugo) como del anticuerpo, y aplicando el anticuerpo durante la noche en la cámara frigorífica mientras se agitaba. En última instancia, el análisis de Western Blot proporcionó tanto la información de que la proteína estaba presente en el lisado, como que la proteína todavía estaba presente en el sobrenadante al 15% de sulfato de amonio (Figura suplementaria 5C). Cabe destacar que las muestras de SDS que contenían mayores cantidades de sulfato de amonio (>15%) precipitaron mientras se calentaban y la proteína se perdió. Esto también se puede ver en la tinción de Coomassie y la mancha occidental (Figura suplementaria 5C). Este efecto no se observó para el riñón porcino, por lo que puede ser específico del tejido.

Después de la precipitación de sulfato de amonio al 15%, se aplicaron 10 ml de lisado a la cromatografía de intercambio catiónico a pH 6.8. El análisis de Western blot mostró que la proteína FAHD1 del ratón estaba en el flujo (Figura 5A). La fracción de proteína eluida parece ser menor; sin embargo, este ejemplo muestra un efecto secundario de la cromatografía de intercambio iónico. En este paso del protocolo, la solución aún puede contener muchos compuestos que podrían no ser proteínas. La cromatografía de intercambio iónico es una forma rápida y fácil de deshacerse de tales contaminaciones. Dado que la realización de cromatografía de intercambio iónico tarda unas horas en realizarse (incluidos todos los pasos de lavado, el experimento en sí toma media hora), proporciona un método simple para limpiar la muestra de contaminaciones no proteicas.

Figure 5
Figura 5: Purificación del ratón FAHD1 con FPLC. Las flechas rojas en el cromatograma y las manchas indican la presencia de FAHD1. (A) Después de la precipitación de sulfato de amonio al 15%, la muestra se centrifugaba, se filtraba (0,22 μm) y se aplicaba a una columna de intercambio catiónico. El análisis de Western blot muestra que la proteína está en el flujo y el cromatograma muestra que no se ha eliminado gran parte de las otras proteínas en este paso. Sin embargo, la comparación de la apariencia y la viscosidad de la entrada con el flujo a través muestra que el flujo de flujo recogido es mucho más claro (panel derecho que compara la entrada y el flujo a través). (B) El flujo de flujo recogido de la columna de intercambio catiónico se redujo a 2 ml a través de filtros de centrifugación y se aplicó a la cromatografía de exclusión de tamaño a pH 7.4. (C) Las fracciones que contenían FAHD1 se agruparon, concentraron y aplicaron a una segunda ronda de cromatografía de exclusión de tamaño a pH 9. (D) Las fracciones que contenían FAHD1 se agruparon nuevamente y se aplicaron a SDS-PAGE con tinción de plata, para ver las contaminaciones restantes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La muestra se aplicó además a la cromatografía de exclusión de tamaño a pH 7.4 (Figura 5B). El análisis de Western blot mostró fracciones que contenían la proteína FAHD1 del ratón, que se agruparon y concentraron a 2 ml. Este concentrado de 2 ml se congeló a -20 °C con 10 μL de β-mercaptoetanol y se descongeló al día siguiente. Se formó un precipitado que se filtró a través de unidades de filtro de jeringa (0,22 μm). Se tomaron muestras para el análisis SDS-PAGE y western blot para asegurar que la proteína FAHD1 del ratón todavía estaba en solución.

Las muestras que contenían la proteína (del análisis de western blot) se agruparon, se concentraron a través de filtros de centrifugación y se aplicaron a SDS-PAGE con tinción de plata para ver las contaminaciones restantes (Figura 5D). Esto reveló que la solución de proteína no es altamente pura y que las cantidades de proteína obtenidas a través de este método del hígado de ratón tampoco eran muy altas (unos pocos μg en total según lo determinado utilizando el kit de ensayo de BCA; ver Tabla de Materiales). El rendimiento proteico fue mucho mayor en el caso de los cerdos FAHD1 (aproximadamente 1 mg en este paso). El nivel de pureza de la proteína FAHD1 extraída del riñón porcino es de aproximadamente el 80% (estimado después de la tinción de plata; datos no mostrados). Esta pureza puede aumentarse aún más a través, por ejemplo, de la cromatografía de afinidad utilizando un anticuerpo definido. Tales y otras limitaciones de este protocolo se discutirán en detalle más adelante.

Nombre del búfer/solución/material Composición
Solución de detención de Coomassie 30% (v/v) EtOH; 5 % (v/v) HOAc; en ddH2O
Solución de tinción de coomassie 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250; 50 % (v/v) MeOH; 10 % (v/v) HOAc; en ddH2O
Tampón de sal alto Mono Q 20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % de glicerol; en ddH2O; ajustar el pH a 9.0 con NaOH
Tampón mono Q bajo en sal 20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; en ddH2O; ajustar el pH a 9.0 con NaOH
Tampón de sal alta Mono S 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1 M NaCl; en ddH2O; ajustar el pH a 6.8 con HCl
Tampón de sal baja mono S 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 15 mM NaCl; en ddH2O; ajustar el pH a 6.8 con HCl
Tampón de lisis de proteínas 1x PBS (250 ml); 50 mM NaF; 1mM PMSF; 2 μg/ml de aprotinina, 1 mM de ortovanadato activado; en ddH2O
Anticuerpo policlonal anti-hFAHD1 de conejo (aislado de afinidad) Hecho a medida; anticuerpo policlonal anti-hFAHD1 purificado a partir de suero de conejo y purificado con FPLC según referencia 12
Control de western blot de la proteína hFAHD1 recombinante Proteína de control de Western blot expresada en E. coli y purificada con FPLC según referencia 12.
Búfer de muestra SDS-PAGE 5x 300 mM Tris HCl; 500 mM DDT; 10% (p/v) SDS; 50% (v/v) glicerina; 0,05% (p/v) azul de bromofenol; en ddH2O; ajustar el pH a 6.8 con HCl
Gel resolutivo SDS-PAGE (12,5 %) para PAGE discontinuo ddH2O (9,5 ml); 3 M Tris HCl (2,2 mL); 5,5 ml de solución de acrilamida/bis al 40% (proporción 29:1); 20% SDS (175 μL); TEMED (17 μL); 10% de persulfato de amonio (175 μL); fundir antes del gel de apilamiento y dejar polimerizar; Echa el gel de apilamiento en la parte superior
Búfer de ejecución de SDS-PAGE 25 mM Tris HCl; 190 mM de glicina; 0,5 % (p/v) SDS; en ddH2O; ajustar el pH a 8.3 con NaOH
Gel de apilamiento SDS-PAGE (12,5 %) para PAGE discontinuo ddH2O (3,8 ml); 1 M Tris HCl (630 μL); 500 μL de solución de acrilamida/bis al 40% (ración 29:1); 20% SDS (25 μL); TEMED (5 μL); 10% de persulfato de amonio (50 μL); yeso después de que el gel de resolución se haya polimerizado; aplicar un peine de gel para crear pocillos
Búfer de ejecución SEC (G75) 15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; en ddH2O; ajustar el pH a 7.4 con NaOH
Solución de desarrollo de tinción de plata 250 mM Na2CO3 en ddH2O; añadir 12 μL de formaldehído al 37% (v/v) a 100 ml antes de su uso
Solución fijadora de tinción de plata 40% (v/v) EtOH; 10% (v/v) HOAc; en ddH2O
Solución de incubación de tinción de plata 30% (v/v) EtOH; NaOAc de 500 mM; 8 mM Na2S2O3; en ddH2O; opcional: añadir 600 μL de 50% (v/v) de glutaraldehído por 100 ml antes de su uso
Solución de plata para teñir la plata 0,1% (p/v) AgNO3; en ddH2O; añadir 25 μL de formaldehído al 37% (v/v) a 100 ml antes de su uso
Solución de parada de tinción de plata Solución de EDTA de 40 mM a pH 7.6; transferir 744 mg de EDTA a 40 ml de ddH2O y luego agregar NaOH para disolver y ajustar el pH a 7.6. Finalmente, ajuste el volumen total a 50 ml.
Búfer de bloqueo de Western blot PBS con 0.1% (v/v) Tween 20 y 5% (p/v) leche descremada en polvo; Filtrado
Búfer de transferencia de Western blot (10x) Tris-HCl 250 mM; glicina 1,92 M; en ddH2O; ajustar el pH a 8.3 con NaOH; almacenar a temperatura ambiente
Búfer de transferencia de Western blot (1x) Búfer de transferencia de western blot (10x) 100 mL; 800 ml de ddH2O; 100 ml de MeOH; conservar a 4 °C
Tampón de lavado de western blot (PBS-T) PBS con 0.1% (v/v) Tween 20

Tabla 1.

Figura suplementaria 1: Extracción total de proteínas del riñón porcino. (A) El tejido renal se cortó con un bisturí en una placa de vidrio preparada y debidamente limpiada, puesta en espuma de poliestireno para evitar el deslizamiento; (B) Se incuban en hielo tubos de 50 ml que contienen 20 ml de tampón de lisis helado con inhibidores de proteínas/proteasas; (C) las piezas de tejido renal se colocaron en el tampón hasta que el volumen alcanzó aproximadamente 30 ml; (D) el tejido renal se homogeneizó mediante ultrasonido (es decir, sonicación); E) el homogeneizado crudo se centrifuga en una centrífuga de mesa a velocidad media durante 30 min; F) se procesaron varias muestras simultáneamente; (G) después de la primera centrifugación, el sobrenadante se transfirió a tubos de centrífuga (en comparación con E) y se centrifuga a alta velocidad (10.000 x g) durante 30 min; (H) esta etapa de centrifugación produce otro pellet y sobrenadante, que se transfiere a tubos de 50 ml; (I/J) el prelisato se filtra secuencialmente mediante unidades de filtro de 0,45 μm y 0,2 μm, se alicita en lotes de 10 ml y se congela con nitrógeno líquido para su posterior almacenamiento a -80 °C. El análisis de Western blot se utiliza para verificar la presencia de la proteína en todas las muestras (pellets, sobrenadantes, lisado filtrado). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Purificación de FAHD1 porcino con FPLC; estrategia alternativa. Las flechas rojas en el cromatograma y las manchas indican la presencia de FAHD1. (A) Purificación de FAHD1 porcino a partir de lisado obtenido por precipitación de sulfato de amonio al 25% con cromatografía de exclusión de tamaño (FPLC) a pH 7.4. El análisis de Western blot identificó fracciones que contienen FAHD1 porcino, que se agruparon y concentraron. (B) Las muestras de proteínas previamente purificadas con cromatografía de exclusión de tamaño (panel A) se purificaron aún más mediante cromatografía de intercambio aniónico (FPLC). El análisis de Western blot identifica fracciones que contienen FAHD1 porcino, que se agruparon y concentraron. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: Actividad enzimática específica de la FAHD1 porcina. Se midió la actividad enzimática específica en función del aumento del nivel de pureza. La tabla compara la actividad enzimática relativa (nmol/min) con la actividad enzimática específica (μmol/min/mg). El ensayo muestra una actividad en constante aumento de FAHD1 porcino después de cada paso de purificación. En comparación con el FAHD1 humano recombinante His/S (verde) obtenido de E. coli. 12, faHD1 porcino mostró una actividad ligeramente mayor (rojo) (n = 3). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 4: Extracción total de proteínas del hígado de ratón. (A,B,C) El tejido hepático congelado a presión de 20 ratones y el tampón de lisis se prepararon en hielo en tubos de 50 ml; (D, E, F) el tejido hepático se homogeneizó mediante ultrasonido (es decir, sonicación); el homogeneizado crudo se centrifugaba en una centrífuga de mesa a velocidad media durante 30 min; el sobrenadante se transfirió a tubos de centrífuga y se centrifuga a alta velocidad (10.000 x g) durante 30 min; (G,H,I) el prelisato se filtra secuencialmente mediante filtros de papel, unidades de filtro de 0,45 μm y 0,2 μm, se alía en lotes de 10 ml y se congela a presión con nitrógeno líquido para su posterior almacenamiento a -80 °C; (J) se añadió sulfato de amonio al lisado en diferentes concentraciones (5% a 30% como máximo) para precipitar la proteína de la solución; (K) los gránulos obtenidos después de la precipitación de sulfato de amonio (panel J) se resuspendieron en H2O para tomar muestras para el análisis SDS-PAGE y western blot. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 5: Precipitación de sulfato de amonio y detección de western blot para ratón FAHD1. Las flechas rojas en las manchas indican la presencia de FAHD1. (A) SDS-PAGE con muestras obtenidas después de que la precipitación de sulfato de amonio se ejecutara a 125 V. Este gel mostró un efecto de sonrisa drástico, y tal gel no se puede evaluar. Este es un ejemplo de un resultado negativo. (B) SDS-PAGE con las mismas muestras (panel A) se ejecutó a 80 V hasta su finalización. No hay efecto sonrisa en este gel, y este es un ejemplo de un resultado positivo. C) Análisis SDS PAGE y western blot de las muestras obtenidas después de la precipitación de sulfato de amonio. Las muestras a concentraciones más altas de sulfato de amonio pueden precipitar dentro del tampón de la muestra, como se indica. Se pierden y ya no se pueden detectar, ya sea a través de la tinción de Coomassie (izquierda) o el análisis de western blot (derecha). La mejor concentración de sulfato de amonio, en este caso, se determinó que era del 15%. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Pasos críticos en el protocolo
Seguir pautas comunes para el manejo de proteínas es esencial, como trabajar en hielo y en condiciones moderadas de pH y sal. El uso de inhibidores de la proteasa es beneficioso para el método, mientras que el uso de inhibidores del proteasoma es muy recomendable. La congelación y descongelación de la muestra siempre puede dar lugar a la precipitación de proteínas (al menos parcialmente), por lo que cualquier alícuota descongelada de lisado proteico inicial (paso 2) debe procesarse continuamente sin interrupción. La centrifugación y la filtración después de la descongelación generalmente se recomiendan para eliminar la microprecipitación.

El lisado proteico inicial obtenido de un tejido todavía contiene muchas sustancias además de las proteínas. Las columnas de cromatografía de intercambio iónico se pueden utilizar para limpiar el lisado. Incluso si la proteína que se desea extraer no se une a la columna de intercambio iónico, el flujo puede ser mucho más claro que la solución de entrada, y más fácil de procesar en pasos posteriores. Esto se muestra para la extracción de FAHD1 de los riñones de ratón (ver Figura 5A).

Limitaciones y modificaciones del método
Este protocolo describe un protocolo para la extracción de FAHD1 del tejido. Sobre la base de esta estrategia, se puede derivar un enfoque general para la extracción de proteínas FAHD (FAHD1, FAHD2) de otros tejidos, mientras que se pueden requerir adaptaciones específicas para casos individuales. La limitación implícita de este método son los niveles relativos de expresión de FAHD1 (o proteínas FAHD) en un tejido dado y la disponibilidad de este tejido en cantidades adecuadas. El esquema general descrito en este protocolo requiere una alta expresión de la proteína en una cantidad adecuada de tejido para empezar. Se han proporcionado ejemplos para la extracción de FAHD1 del riñón porcino y el hígado de ratón, que son dos órganos que muestran altos niveles de expresión de la proteína. En cada paso descrito en este protocolo, hay una pérdida implícita de muestra, es decir, la baja cantidad inicial de proteína se reduce aún más. En última instancia, solo se pueden lograr bajas cantidades de proteína utilizando este protocolo. Debido a que el riñón porcino es un órgano grande, aproximadamente un gramo de proteína (aproximadamente el 80% de pureza; estimado) podría extraerse mediante este enfoque de dos riñones. La aplicación del mismo protocolo para la extracción de FAHD1 del hígado de ratón requirió la recolección de muestras de hígado de 20 ratones, para obtener solo unos pocos μg de proteína al final. Obtener una mayor pureza de la proteína utilizando los métodos descritos puede ser tedioso, y la tinción de plata revela que después de la cromatografía de exclusión de tamaño todavía podría haber muchas otras proteínas en solución. Se podría aumentar este protocolo a través de la cromatografía de afinidad (columnas activadas por el NHS), utilizando un anticuerpo monoclonal (por ejemplo, CAB025530).

Todos los protocolos enumerados aquí requieren que la proteína que se quiere extraer sea soluble. Las condiciones óptimas de precipitación de sulfato de amonio y los ajustes de pH/sal para la cromatografía deben probarse y definirse. En caso de que la cromatografía de intercambio iónico no proporcione buenos resultados de purificación, la diálisis contra un tampón de cromatografía antes de realizar FPLC puede ser una opción para mejorar la solubilidad de la proteína y la resolución de la cromatografía. Sin embargo, no se recomienda dializar el lisado crudo, ya que esto puede conducir a una precipitación masiva e incontrolada de proteínas dentro del tubo de diálisis. Pueden ocurrir problemas si la proteína tiende a ser hidrofóbica, y los protocolos pueden no ser aplicables si la proteína es altamente hidrofóbica (por ejemplo, proteínas de membrana). Si las proteínas FAHD son parcialmente insolubles como se encuentra para FAHD2 (datos no mostrados) en un lisado tisular dado, también se pueden explorar otros tipos de cromatografía, por ejemplo, la cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC)12.

Dos modificaciones del protocolo estándar se han mostrado en la sección de resultados. Para la purificación de FAHD1 a partir de un riñón porcino, se utilizó la cromatografía de exclusión de tamaño antes de la cromatografía de intercambio iónico (ver Figura suplementaria 2). Un problema con este método es que la cromatografía de exclusión de tamaño presenta pistas de carrera más grandes, y el volumen de muestra aumenta fuertemente durante la ejecución. El volumen de la muestra no debe exceder el 2% del volumen del lecho para lograr una alta resolución23, y el factor de dilución final también depende del volumen de elución recolectado. En el ejemplo proporcionado utilizando una columna de 120 ml, se recomienda un volumen inicial de 2 ml. La muestra inicial puede recogerse de varios ml del lisado después de la precipitación de sulfato de amonio, por concentración utilizando unidades de filtro centrífugo, sin agregación ni artefactos de precipitación. Un ejemplo para la purificación de FAHD1 de un riñón porcino se proporciona como resultado representativo (ver también Figura suplementaria 2). Sin embargo, la limitación a solo pequeños volúmenes de muestra puede hacer que este enfoque no sea práctico.

Aplicaciones o instrucciones del método
La expresión y purificación de proteínas recombinantes de bacterias es un método sencillo y bien establecido, para obtener cantidades factibles (en gramos) de proteína24,25. Esto se ha presentado para FAHD112. Sin embargo, hay varios inconvenientes posibles en el uso de estos métodos, como el posible crecimiento deficiente del huésped, la formación del cuerpo de inclusión, la pérdida o alteración de la actividad de la proteína y, por lo tanto, la posibilidad de no obtener ninguna proteína en absoluto, o dar lugar a una forma sesgada de la proteína (mal plegamiento, malas modificaciones post-traduccionales, etc.). El desarrollo de métodos que puedan extraer proteínas bien plegadas y modificadas adecuadamente del tejido directamente es, por lo tanto, atractivo. El principal problema, sin embargo, es que la mayoría de las proteínas no se expresan a niveles significativos, y en comparación con la inducción implícita y la posterior extracción de proteínas de las bacterias, la cantidad de proteína que se obtiene es típicamente varios órdenes de magnitud menor. Existe una compensación entre la extracción barata y fácil de proteína recombinante de bacterias y la extracción más costosa y tediosa de proteínas de tejidos. El mayor avance con este último es que se puede extraer la proteína en su forma fisiológica que está presente en el tejido, incluyendo todos los efectos mutuos que pueden afectar su plegamiento y / o actividad catalítica.

La proteína extraída y purificada por este protocolo ayudará a identificar inhibidores competentes de FAHD113, posibles socios de interacción deproteínas 9 y posibles funciones aún no descubiertas de la proteína9. El estudio de los inhibidores enzimáticos, el desarrollo de anticuerpos monoclonales y el estudio de la estructura de la proteína en primer lugar se apoyan en gran medida cuando se extrae proteína de alta pureza del tejido en lugar de extraerse de las bacterias.

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Disclosures

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.

Acknowledgments

Los autores están muy agradecidos por la asistencia técnica de Ayse Öztürk y Eva Albertini. Los ratones utilizados para la generación de tejido hepático se mantuvieron bajo la supervisión de la Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr (Instituto de Investigación Biomédica sobre el Envejecimiento de la Universidad de Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Austria).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm filter units MERCK SLGP033RS Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, not steril
0.45 µm filter units MERCK SLHP033NS Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, not steril
15 mL Falcon tubes VWR 734-0451 centrifugal tubes
50 mL Falcon tubes VWR 734-0448 centrifugal tubes
96-Well UV Microplate Thermo-Fischer 8404 UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates
Acrylamide/Bis Solution (40%, 29:1 ratio) BIO-RAD #1610147 40% acrylamide/bis-acrylamide, 29:1 (3.3% crosslinker) solution for casting polyacrylamide gels
ÄKTA FPLC system GE Healthcare Life Sciences / Cytiva - using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the "ÄKTA pure" system
Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa MERCK UFC901024 centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 15 mL
Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa MERCK UFC801024 centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 4 mL
Ammonium sulfate powder MERCK A4418 ammonium sulphate for molecular biology, ≥99.0%
Ammoniumpersulfat reagent grade, 98% MERCK 215589 Catalyst for acrylamide gel polymerization.
Coomassie Brilliant blue R 250 MERCK 1125530025 Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) for electrophoresis Trademark of Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g/l, H2O, 25 °C)
Dialysis tubing cellulose membrane MERCK D9277 Cellulose membranes for the exchange of buffers via dialysis.
Eppendof tubes 1.5 mL VWR 525-1042 microcentrifugal tubes; autoclaved
HiLoad 26/600 Superdex 75 pg GE Healthcare Life Sciences / Cytiva 28989334 HiLoad Superdex 75 pg prepacked columns are for high-resolution size exclusion chromatography of recombinant proteins
Immun-Blot PVDF Membrane BIO-RAD #1620177 PVDF membranes are protein blotting membranes optimized for fluorescent and multiplex fluorescent applications.
Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell BIO-RAD #1703930 Use the Mini Trans-Blot Cell for rapid blotting of Mini-PROTEAN precast and handcast gels.
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels BIO-RAD #1658004 4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam.
Mono Q 10/100 GL GE Healthcare Life Sciences / Cytiva 17516701 Mono Q columns are strong anion exchange chromatography columns for protein analysis or small scale, high resolution polishing of proteins.
Mono S 10/100 GL GE Healthcare Life Sciences / Cytiva 17516901 Mono S columns are strong cation exchange chromatography columns for protein analysis or small scale high resolution polishing of proteins.
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa Thermo-Fischer 26616 A mixture of 10 blue-, orange-, and green-stained proteins (10 to 180 kDa) for use as size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting.
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo-Fischer 23225 A two-component, high-precision, detergent-compatible protein assay for determination of protein concentration.
Sonifier 250; Ultrasonic Cell Disruptor w/ Converter Branson - New models at https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf
Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (affinity isolated) Agilent Dako P0399 The antibody used for horseradish peroxidase conjugation reacts with rabbit immunoglobulins of all classes.
TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethane, TMEDA MERCK T9281 TEMED (N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine) is molecule which allows rapid polymerization of polyacrylamide gels.
Tube Roller - - A general tube rotator roller; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71
Tube Rotator - - A general tube rotator wheel; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123
ULTRA-TURRAX; T 25 digital IKA 0003725000 New models at https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/

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References

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Bioquímica Número 180 FAHD FAHD1 oxaloacetato descarboxilasa ODx tejido FPLC cromatografía extracción de proteínas
Extracción y purificación de la proteína FAHD1 del riñón porcino y el hígado de ratón
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Andric, A., Wagner, E., Heberle, A., … More

Andric, A., Wagner, E., Heberle, A., Holzknecht, M., Weiss, A. K. H. Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver. J. Vis. Exp. (180), e63333, doi:10.3791/63333 (2022).

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