Summary
Her præsenteres en metode til analyse af proteinaggregeringskinetik i nematoden Caenorhabditis elegans. Dyr fra en alderssynkroniseret population afbildes på forskellige tidspunkter, efterfulgt af semiautomatiseret inklusionstælling i CellProfiler og tilpasning til en matematisk model i AmyloFit.
Abstract
Proteinaggregering i uopløselige indeslutninger er et kendetegn for en række menneskelige sygdomme, hvoraf mange er aldersrelaterede. Nematoden Caenorhabditis elegans er en veletableret modelorganisme, der er blevet anvendt i vid udstrækning på området til at studere proteinaggregering og toksicitet. Dens optiske gennemsigtighed muliggør direkte visualisering af proteinaggregering ved fluorescensmikroskopi. Desuden gør den hurtige reproduktive cyklus og korte levetid nematoden til en passende model til at screene for gener og molekyler, der modulerer denne proces.
Kvantificeringen af den samlede belastning hos levende dyr er imidlertid dårligt standardiseret, typisk udført ved manuel inklusionstælling under et fluorescensdissektionsmikroskop på et enkelt tidspunkt. Denne tilgang kan resultere i stor variation mellem observatører og begrænser forståelsen af aggregeringsprocessen. I modsætning hertil overvåges amyloidlignende proteinaggregering in vitro rutinemæssigt af thioflavin T-fluorescens på en meget kvantitativ og tidsopløst måde.
Her præsenteres en analog metode til den upartiske analyse af aggregeringskinetik i levende C. elegans ved hjælp af et konfokalmikroskop med høj gennemstrømning kombineret med skræddersyet billedanalyse og datatilpasning. Anvendeligheden af denne metode demonstreres ved at overvåge inklusionsdannelsen af et fluorescerende mærket polyglutamin (polyQ) protein i kropsvæggens muskelceller. Billedanalysearbejdsgangen gør det muligt at bestemme antallet af indeslutninger på forskellige tidspunkter, som er tilpasset en matematisk model baseret på uafhængige nukleationshændelser i individuelle muskelceller. Den metode, der er beskrevet her, kan vise sig nyttig til at vurdere virkningerne af proteostasefaktorer og potentielle terapeutiske lægemidler til proteinaggregeringssygdomme hos et levende dyr på en robust og kvantitativ måde.
Introduction
Akkumuleringen af misfoldede proteiner i uopløselige aflejringer forekommer i en lang række sygdomme. Velkendte eksempler er aggregeringen af amyloid-β og tau i Alzheimers sygdom, α-synuclein i Parkinsons sygdom og huntingtin med udvidet polyQ ved Huntingtons Sygdom 1,2. Misfoldningen af disse polypeptider i amyloidfibriller er forbundet med toksicitet og celledød ved mekanismer, der stadig stort set er uklare. Belysning af mekanismerne for amyloiddannelse vil være afgørende for at udvikle effektive terapier, som i øjeblikket ikke er tilgængelige.
Detaljerede undersøgelser af amyloiddannelse er blevet udført in vitro baseret på thioflavin T-fluorescensmålinger, hvilket har ført til en mekanistisk forståelse af aggregeringsprocessen og effekten af hæmmende molekyler 3,4,5. Det er imidlertid ikke klart, om de samme aggregeringsmekanismer gælder i det komplekse miljø af levende celler og organismer. Nematodeormen Caenorhabditis elegans er en egnet modelorganisme til at studere proteinaggregering in vivo. Det har en relativt simpel anatomi, men består af flere væv, herunder muskler, tarm og et nervesystem. Det er genetisk velkarakterieret, og værktøjer til genetisk modifikation er let tilgængelige. Desuden har den en kort generationstid på ~ 3 dage og en samlet levetid på 2-3 uger. Som sådan kan proteinaggregering undersøges i hele dyrets levetid på en eksperimentelt bekvem tidsskala. Endelig er nematoden optisk gennemsigtig, hvilket gør det muligt at spore aggregeringen af fluorescerende mærkede proteiner i levende dyr.
Disse egenskaber ved C. elegans er tidligere blevet udnyttet til at undersøge aggregeringen af polyQ-proteiner som en model for Huntingtons Sygdom og andre polyQ-ekspansionssygdomme. Over den patogene tærskel på 35-40 glutaminrester kan polyQ-proteinerne mærket med gult fluorescerende protein (YFP) observeres for at danne uopløselige indeslutninger i muskelvævet 6,7, neuroner8 og tarmen 9,10. Disse funktioner er blevet brugt i vid udstrækning til at screene for gener 11,12,13 og småmolekylemodifikatorer 14 af proteinaggregering og toksicitet.
C. elegans har potentiale til at spille en vigtig rolle i at bygge bro mellem in vitro-studier af proteinaggregering og mere komplekse sygdomsmodeller som mus15. C. elegans kan anvendes til lægemiddelscreening16 , men kan også udnyttes til at opnå en grundlæggende forståelse af de molekylære mekanismer for proteinaggregering in vivo, som det for nylig blev påvist17. For begge anvendelser er det imidlertid af største betydning at udtrække et kvantitativt og reproducerbart mål for proteinaggregering. Her opnås dette ved hjælp af et konfokalmikroskop med høj gennemstrømning kombineret med en dedikeret billedanalysepipeline (figur 1).
Protocol
1. Vækst af en alderssynkroneret befolkning af C. elegans
- C. elegans-stammerne på NGM-plader (nematode growth medium) tilsået med Escherichia coli OP50 ved 20 °C i henhold tilstandardprocedurerne 18.
- Udfør et synkroniseret æglægning ved at placere 10 voksne nematoder på en 6 cm frøet NGM-plade med en platinormplukker. Lad de voksne lægge æg i ~ 2 timer ved 20 ° C, før de fjernes. Forbered 1-4 plader pr. Stamme afhængigt af stammens frugtbarhed og antallet af tidspunkter, der skal tages.
- Læg pladerne med æg i inkubatoren ved 20 °C. Overvåg dyrenes udvikling, indtil de når voksenalderen.
BEMÆRK: Den dag, hvor dyrene er blevet voksne, defineres her som dag 1. Typisk er dette tre dage efter æglægningen. - Fra dag 1 skal du overføre dyrene til nye frøede NGM-plader dagligt for at adskille dem fra deres afkom. For at kompensere for dyr, der dør eller går tabt under overførslen, skal du overføre ~40 dyr pr. stamme gange antallet af punkter, der skal afbildes (se trin 2). Fortsæt, indtil dyrene er ophørt med at lægge befrugtede æg (~ dag 6 i voksenalderen).
BEMÆRK: Ekskluder dyr med sække eller andre udviklingsfænotyper. Bagning observeres almindeligvis i stammer, der udtrykker aggregeringsudsatte proteiner.
2. Prøveforberedelse af C. elegans i en flerbrøndsplade
BEMÆRK: Da billeddannelsesproceduren kræver bedøvelsesmidler, der i sidste ende vil dræbe dyrene, kan de samme dyr ikke genbruges til efterfølgende tidspunkter. I stedet afbildes forskellige dyr fra det samme alderssynkronerede parti på forskellige dage. Selvom de fleste stammer vil have få indeslutninger på dag 1, anbefales det at medtage dette tidspunkt som en baseline.
- Forbered pladen med 384 brønde ved at fylde det krævede antal brønde med 100 μL M9-buffer suppleret med 25 mM NaN3 som bedøvelsesmiddel. Fyld en brønd pr. stamme, der skal afbildes.
BEMÆRK: Natriumazid (NaN3) er giftigt og bør håndteres med omhu. - For hver stamme overføres 20 dyr til en brønd ved hjælp af en platinormplukker.
BEMÆRK: Ormene skal placeres uden for bakterieplænen, inden de placeres i brønden. Bakterier får dyrene til at klæbe til ormepluk, hvilket kan forhindre deres frigivelse og vil skyde brøndindholdet. Generelt er 20 det optimale antal dyr pr. brønd for at forhindre overlapning mellem ormene og samtidig begrænse unødvendig billeddannelse af tom brøndplads. - Dæk pladen med låget for at forhindre fordampning, og forestil dig pladen inden for 1 time efter tilberedning.
- Gentag trin 2.1-2.3 dagligt, indtil et stabilt plateau i inklusionstallene er nået, eller indtil de fleste dyr er døde. Udfør prøveforberedelsen og billeddannelsen på samme tid hver dag for at sikre intervaller på 24 timer.
3. Billedoptagelse på det konfokale mikroskop med høj gennemstrømning
BEMÆRK: Dette eksperiment kan også opsættes på et almindeligt roterende diskkonfokalmikroskop med en multiwell pladeholder. Et kamera med et stort synsfelt er gavnligt for at begrænse antallet af fliser, der skal afbildes for at spænde over hele brønden. Se tabellen over materialer for detaljer om mikroskopet og softwaren, der bruges i denne protokol.
- Tænd for instrumentet, og åbn softwaren.
- Start en ny protokol ved at gå til | Nyhed. Vælg den korrekte flerbrøndspladetype, og klik på Opret en ny måleindstilling.
- Konfigurer kanalen til fluorescens ved at gå til Ch 1. Indstil målet til 10x. Vælg 488 nm som lyskilde og BP525/25 som emissionsfilter til billede YFP. Indstil binning til 2x2 for at reducere filstørrelsen.
- Klik på Tilføj kanal, og vælg Brightfield som metode.
- Hvis du vil føje et z-stack konfokalt fluorescensbillede til målingen, skal du vælge 3D-fluorescensanskaffelse under Handlingsliste. Gå til Vælg , og vælg Ch 1. Hvis du vil minimere filstørrelser, skal du indstille Billedbehandling til Maksimum , så det maksimale projektionsbillede gemmes i stedet for den fulde z-stak.
- Klik på BF / Ph Acquisition | Vælg | Ch 2 til brightfield-kanalen.
- Klik på play-knappen (se efter det højrepegende trekantsymbol) ved siden af Unload Well Plates og placer 384-brøndspladen i mikroskopet.
- Under 3D Fluorescence Acquisition skal du klikke på Test og vælge en brønd, der indeholder orme for at bestemme den optimale skifteafstand, hvor ormene er centreret korrekt. Indstil Stigende Afstand til 50 μm, Faldende Afstand til -50 μm og Slicing Interval til 2 μm for at fange hele tykkelsen af dyrene i z-stakken.
- Optimer eksponeringstiden for at få en god signalintensitet for alle fire stammer, samtidig med at mætning undgås. Brug den samme eksponeringstid for alle stammer og tidspunkter.
- Vælg de brønde, der skal afbildes, under Indstilling for scanning af brøndplade. Vælg Flise og Erhverv hele brønden.
- Gem indstillingen Måling, og start eksperimentet ved at klikke på Start måling. For efterfølgende tidspunkter skal du åbne den samme måleindstilling og justere skifteafstanden og de brønde, der skal afbildes.
4. Syning af flisebelagte billeder i ImageJ
BEMÆRK: Dette trin er kun påkrævet, når du bruger et mål, der er større end 4x, for hvilket billedet af hver brønd erhverves som flere fliser. I denne analysearbejdsgang udføres syning af fliserne ved hjælp af den frie software FIJI/ImageJ19 (figur 2). Afhængigt af det instrument, der anvendes i trin 3, kan det også være muligt at udføre syninger direkte i den medfølgende software.
- Download FIJI20 og åbn den.
- Gå til Plugins | Syning | Gitter-/samlingssyninger21.
- I popup-vinduet, Grid/Collection Stitching, skal du vælge den type og rækkefølge , som fliserne blev indsamlet efter. Vælg Gitter: række for række og Højre og Ned.
- I det næste vindue, Grid syning: Gitter: række-for-række, Højre & Ned, indsæt antallet af fliser i x og y retninger. For den 10x-målsætning, der bruges her, skal du vælge 2 som gitterstørrelse x, 3 som gitterstørrelse y og 0 som feltet overlapper hinanden.
- Klik på Gennemse , og vælg den mappe, der indeholder de TIFF-billeder, der skal sys.
- Indsæt det almindelige filnavn under Filnavne til felter ved hjælp af {i} ved placeringen af feltnummeret i hvert filnavn.
- Fjern markeringen i alle felter nedenfor.
- Kør pluginet.
- Gem de resulterende billeder som TIFF-filer til analyse i næste trin.
5. Automatiseret inklusionstælling ved hjælp af CellProfiler22
- Download og installer open source-billedanalysesoftwaren, CellProfiler23. Download InclusionCounting.cpproj-pipelinen fra github.com/sinnigelab/aggregate-quantification.
- Åbn CellProfiler, og træk pipelinen ind i vinduet Slip en pipelinefil her. Klik på Ja for at indlæse projektet.
- Klik på billedinputmodulet , og træk de syede billeder ind i vinduet Slip filer og mappe her.
- Klik på metadatainputmodulet . Juster Regulært udtryk for at udtrække fra filnavnet i henhold til navnene på de syede billeder.
- Klik på inputmodulet NamesandTypes, og juster Vælg regelkriterierne, så de passer til kanalerne i filnavnene.
BEMÆRK: I standardindstillingerne for rørledningen genkendes filnavne, der indeholder BF , som brightfield-billeder og kaldes Worms. Filnavne, der indeholder YFP , genkendes som fluorescensbilleder og kaldes fluorescens. - Klik på Vis outputindstillinger for at vælge en standardmappe for at gemme output fra CellProfiler.
- Klik på Start testtilstand for at kontrollere indstillingerne for pipelinen ved hjælp af det første billeddatasæt. Klik på Kør for at køre gennem alle moduler i pipelinen eller Trin for at køre gennem pipelinen et modul ad gangen. For at justere ormkonturerne i modulet EditObjectsManually skal du klikke på Hjælp for at se instruktionerne og klikke på Udført for at fortsætte med at køre pipelinen.
BEMÆRK: De ekstraherede målinger eksporteres ikke, mens de er i testtilstand. Det kan være nødvendigt at justere tærskelparametrene til påvisning af orme og indeslutninger på grundlag af de anvendte stammer og forstørrelser. - Klik på Afslut testtilstand og analyser billeder.
- Åbn outputmappen for at se outputfilerne. Åbn billederne med det originale filnavn efterfulgt af konturer for at kontrollere, om ormene og indeslutningerne var korrekt overlejret.
BEMÆRK: Antallet af indeslutninger pr. orm kan findes i filen med navnet ExpandedWormObjects. Flere oplysninger om inputbillederne findes i filen med navnet Image. Yderligere output kan vælges i modulet ExportToSpreadsheet i pipelinen.
6. Global tilpasning af inklusionstællingsdata ved hjælp af AmyloFit5
BEMÆRK: Dette trin kan kun udføres, når data for flere proteinkoncentrationer er tilgængelige. For Q40-YFP er der tidligere skabt et sæt af fire stammer med forskellige niveauer af overekspression i muskelcellerne i kropsvæggen17. I andre tilfælde bør der genereres nye stammer ved hjælp af plasmidmikroinjektion og genomisk integration24.
- Gå til den gratis online tilpasningsplatform for aggregeringskinetik AmyloFit25. Du kan enten registrere eller logge ind med en eksisterende konto.
BEMÆRK: En omfattende manual om, hvordan du bruger AmyloFit, kan tilgås for yderligere hjælp. Se linket øverst til venstre på websiden (efter login) for mere information. - For at begynde at bruge AmyloFit skal du navngive projektet og klikke på Opret projekt. Åbn projektet ved at klikke på Åbn og opret en session ved at give det et navn og klikke på Opret og indlæs session.
- Klik på Tilføj data, og upload filen, der indeholder det gennemsnitlige antal inklusioner pr. dyr, i idet du følger kravene til dataformat, der vises i panelet til venstre. Klik på Indlæs nye data.
- Spring over forbehandlingstrinnene, som ikke er nødvendige for inklusionstællingsdata, ved at indstille antallet af point til gennemsnit over for nulpunktsforskydning og antallet af point til gennemsnit over for plateau til 0. Klik på Send. Gentag dette trin for hver proteinkoncentration (dvs. hver kolonne i den uploadede fil).
- Vælg Brugerdefineret i modelpanelet, indtast Ncells*(1-exp(-Kcell*m**(n)*(t-1))) i ligningsfeltet , og klik på Indlæs model.
BEMÆRK: Da AmyloFit oprindeligt blev designet til analyse af kinetiske data fra in vitro-assays, skal der indlæses en skræddersyet model for at analysere inklusionstællingsdataene for C. elegans. I ligningen, der anvendes her, er N-celler antallet af celler, hvor inklusionsdannelse finder sted, K-celle er nukleationshastighedskonstanten, m den intracellulære proteinkoncentration og n reaktionsrækkefølgen for nukleation. - Angiv parametertyperne til Global Const for N-celler, Global tilpasning til K-celle og n og Const til m. Indstil værdien af N-celler til 95 for muskelceller i kropsvæggen og Indledende gæt for K-celle og n til 1. Indtast værdierne m for de forskellige stammer i venstre panel.
BEMÆRK: Indledende gæt er ikke relevante for den relativt enkle model, der bruges her. For mere komplekse modeller er det fordelagtigt at indtaste et skøn over de forventede værdier for at forkorte beregningstiden. - Lad antallet af bassinhumle være uændret, og klik på Tilpas i monteringspanelet.
- Uddrag pasformen ved at klikke på Download data og tilpas.
BEMÆRK: De parametre, der ekstraheres af modellens globale pasform, vises i nederste højre hjørne. Et plot af data og pasform genereres automatisk i øverste højre panel. Dette plot kan udtrækkes ved at klikke på Download pdf og tilpasses ved at gå til Vis plotindstillinger. K-celle har enheder af molekyler koncentration-n tid-1 celle-1. For at sammenligne værdier med forskellige n kan K-celle konverteres til nukleationshastigheden ved en given proteinkoncentration ved at multiplicere den med mn.
Representative Results
Metoden beskrevet her (figur 1) blev brugt til at analysere aggregeringskinetikken af en konstruktion bestående af 40 glutaminer smeltet sammen med YFP (Q40-YFP). Proteinet udtrykkes under kontrol af unc-54-promotoren , der driver ekspression i kropsvæggens muskelceller. Da disse er relativt store og lette at visualisere, er brugen af et 10x mål tilstrækkeligt til at løse de indeslutninger, der dannes af Q40-YFP i dette væv. Fire stammer (linjer A-D) blev tidligere udviklet, der udtrykte proteinet i forskellig grad for at vurdere koncentrationsafhængigheden af polyQ-aggregering in vivo17.
Alderssynkroniserede populationer af linjer A-D blev genereret af en 2 timers æglægning efterfulgt af daglig overførsel, når afkomene nåede voksenalderen. Fra dag 1 til dag 10 i voksenalderen blev 20 dyr fra hver af de fire stammer afbildet i en plade med 384 brønde ved hjælp af et konfokalmikroskop med høj gennemstrømning. Billederne af brøndene blev erhvervet som 6 fliser, som blev syet sammen ved hjælp af et plugin i ImageJ21 (figur 2). De syede billeder blev efterfølgende analyseret ved hjælp af en specialfremstillet CellProfiler22-rørledning (figur 3) for at kvantificere det gennemsnitlige inklusionstal pr. Dyr for hver stamme og hvert tidspunkt.
Dataene blev derefter monteret på en matematisk model i AmyloFit5 (figur 4). Modellen er baseret på den antagelse, at hver af de 95 muskelceller i kropsvæggen uafhængigt af hinanden opnår én inklusion ved en hastighedsbegrænsende nukleationshændelse efterfulgt af hurtig samlet vækst17. Pasformen gav en nukleationshastighedskonstant på 9,9 × 105 molekyler M-2,1 d-1 celle-1 og en reaktionsrækkefølge på 2,1, svarende til en nukleationshastighed på 0,38 molekyler d-1 celle-1 ved en intracellulær proteinkoncentration på 1 mM. To uafhængige biologiske replikater førte til nøje tilsvarende værdier for nukleationshastigheden og reaktionsrækkefølgen, som er i overensstemmelse med en tidligere undersøgelse under anvendelse af en lignende protokol17 (tabel 1).
Figur 1: Skematisk oversigt over metoden. (A) Alderssynkroniserede C. elegans populationer genereres af en tidsslukket æglægning. (B) Dyr fra samme population afbildes i en plade med 384 brønde på forskellige tidspunkter. (C) Fliserne er syet sammen for at danne billeder af hele brøndene, som analyseres i CellProfiler for at kvantificere inklusionstallene pr. Dyr. D) Dataene er tilpasset en matematisk model ved hjælp af AmyloFit. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skærmbilleder af syningsproceduren i ImageJ ved hjælp af pluginet Grid/Collection-syning21. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Skematisk oversigt over CellProfiler-rørledningen til kvantificering af inklusionstal. (A-C) Lysfeltbilledet (A) bruges til at identificere ormene (B, nærbillede i C). (D-G) Fluorescensbilledet (D, nærbillede i E) bruges til at identificere indeslutningerne (F). Ormene og indeslutningerne er relateret til at give antallet af indeslutninger for hver orm i brønden (G). De viste billeder er af Q40 linje A dyr på dag 3 i voksenalderen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Tilpasning af dataene til en matematisk model i AmyloFit. (A) Data uploades til AmyloFit. (B) En brugerdefineret ligning indtastes for at modellere inklusionsdannelse, idet der antages uafhængige nukleationshændelser i hver celle. C) Tilpasning af aggregeringskinetik for C. elegans-linjerne A-D, der udtrykker forskellige niveauer af Q40-YFP. Dataene er repræsentative for to uafhængige biologiske replikater. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Datasæt 1 | Datasæt 2 | Sinnige et al.17 | |
| n | 2.1 | 1.9 | 1.6 |
| K-celle (molekyler M-n d-1 celle-1) | 9,9 x 105 | 1,4 x 105 | 3,1 x 104 |
| Nukleationshastighed ved 1 mM (molekyler d-1 celle-1) | 0.38 | 0.21 | 0.35 |
Tabel 1: Værdier af nukleationshastigheden og reaktionsrækkefølgen for Q40-YFP-aggregering. Data for to uafhængige biologiske replikater af protokollen og sammenligning med tidligere offentliggjorte data17.
Discussion
Metoden, der præsenteres heri, letter en upartisk og kvantitativ analyse af proteinaggregeringskinetik i modelorganismen C. elegans. Det afhænger af fire nøgleelementer (figur 1): 1) opretholdelse af en alderssynkroniseringspopulation af nematoder; 2) fluorescensmikroskopi i flerbrøndsplader; 3) automatiseret inklusionstælling i CellProfiler; 4) datatilpasning i AmyloFit. Sammenlignet med manuel optælling af indeslutninger i frit bevægelige dyr eller fra gemte billeder26 er kvantificering i CellProfiler både hurtigere og mere upartisk. Den anden vigtige udvikling af protokollen er erhvervelsen af kinetiske data, snarere end enkelte tidspunkter, som giver kvantitativ indsigt i aggregeringsmekanismen ved tilpasning af dataene til en matematisk model.
De fire elementer i protokollen kan bruges som uafhængige moduler, der kan ændres afhængigt af applikationen. Alderssynkroniserede populationer kan også opretholdes ved hjælp af 5-fluor-2′-deoxyuridin (FUDR) til sterilisering af dyrene. Denne forbindelse påvirker levetiden og proteostase 24,25 og er meget kræftfremkaldende for eksperimentatoren; Det udelukker dog manuel overførsel af ormene, som kan være arbejdskrævende, når et stort antal håndteres. Andre alternativer er brugen af sterile mutanter29 eller filtreringsanordninger til at adskille afkom30.
Fluorescensmikroskopitrinnet kan også justeres, for eksempel ved hjælp af højere forstørrelser til at overvåge proteinaggregering i neuroner. Widefield-mikroskopi kan være tilstrækkelig til at overvåge polyQ-aggregering i muskelceller, når den relative forskel mellem betingelserne er vigtigere end det absolutte antal indeslutninger. CellProfiler-rørledningen kan stadig bruges i disse tilfælde, selvom indstillingerne til at genkende orme og indeslutninger skal justeres af brugeren. Teknikkens gennemstrømning er i øjeblikket begrænset af behovet for manuel plukning af dyrene i 384-brøndspladen. Dette kan potentielt afhjælpes ved brug af mikrofluidiske enheder16. Natriumazid er et relativt hårdt bedøvelsesmiddel, som kan erstattes af fysisk immobilisering med hydrogeler eller perler28,29.
Analysen i AmyloFit præsenteret her er baseret på en aggregeringsmekanisme bestående af uafhængige nukleationshændelser i individuelle celler. I tilfælde, hvor denne model ikke passer, bør brugeren overveje et alternativ såsom den kooperative aggregeringsmodel, der er udviklet tidligere17. En begrænsning af denne tilgang er, at stammer, der udtrykker proteinet af interesse i forskellige koncentrationer, skal være tilgængelige, selv om disse kan genereres ved hjælp af rutinemæssige C. elegans metoder24.
Alt i alt giver denne protokol mulighed for at opnå data af høj kvalitet for proteinaggregeringskinetik i et in vivo-modelsystem , hvilket giver mulighed for detaljeret analyse af aggregeringsmekanismer17. Selvom metoden blev demonstreret for polyQ-aggregering i C. elegans muskelvæv, kan fremtidige anvendelser af protokollen omfatte andre proteiner og væv og virkningerne af proteostasefaktorer og små molekyler.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Morimoto-laboratoriet for C. elegans-stammer og Esmeralda Bosman for hjælp til det konfokale mikroskop med høj gennemstrømning. Dette arbejde blev finansieret af et opstartstilskud fra Utrecht Universitet til T.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384-well plate | Greiner | 781091 | Black with flat clear bottom |
| AmyloFit | Knowles lab | v2.0 | Access at www.amylofit.ch.cam.ac.uk |
| C. elegans Q40 line A | Morimoto lab | AM1228 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
| C. elegans Q40 line B | Morimoto lab | AM1229 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
| C. elegans Q40 line C | Morimoto lab | AM1230 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
| C. elegans Q40 line D | Morimoto lab | AM1231 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
| CellProfiler | Broad Institute | 4.1.3 | Downloaded from https://cellprofiler.org |
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
| FIJI | Open-source | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| High-throughput confocal microscope | Yokogawa | CellVoyager CV7000S | |
| M9 buffer | Home-made | 3 g/L KH2PO4, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 1 mM MgSO4 | |
| NGM plates | Home-made | 17 g/L agar, 2.5 g/L bacto-peptone, 3 g/L NaCl, 25 mM KPO4 buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 5 mg/L cholesterol | |
| Pasteur pipette | WU Mainz | 250 | To make worm pick, 150 mm length |
| Platinum iridium wire | Alfa Aesar | 39383 | To make worm pick, 0.25 mm diameter |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9 |
References
- Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (6), 384-396 (2014).
- Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, amyloid formation, and human disease: a summary of progress over the last decade. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 27-68 (2017).
- Knowles, T. P. J., et al. An analytical solution to the kinetics of breakable filament assembly. Science. 326 (5959), 1533-1537 (2009).
- Cohen, S. I. A., et al. Proliferation of amyloid-β42 aggregates occurs through a secondary nucleation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9758-9763 (2013).
- Meisl, G., et al. Molecular mechanisms of protein aggregation from global fitting of kinetic models. Nature Protocols. 11 (2), 252-272 (2016).
- Satyal, S. H., et al. Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5750-5755 (2000).
- Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
- Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
- Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).
- Prahlad, V., Morimoto, R. I. Neuronal circuitry regulates the response of Caenorhabditis elegans to misfolded proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14204-14209 (2011).
- Nollen, E. A. A. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).
- Silva, M. C., et al. A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network. PLoS Genetics. 7 (12), 1002438 (2011).
- Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9, 1-16 (2014).
- Calamini, B., et al. Small-molecule proteostasis regulators for protein conformational diseases. Nature Chemical Biology. 8 (2), 185-196 (2012).
- Sinnige, T., Stroobants, K., Dobson, C. M., Vendruscolo, M. Biophysical studies of protein misfolding and aggregation in in vivo models of Alzheimer's and Parkinson's diseases. Quarterly Reviews of Biophysics. 49, 22 (2020).
- Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nature Communications. 7, 13023 (2016).
- Sinnige, T., et al. Kinetic analysis reveals that independent nucleation events determine the progression of polyglutamine aggregation in C. elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 202188118 (2021).
- Brenner, S. Caenorhabditis elegans. Methods. 77 (1), 71-94 (1974).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- FIJI/ImageJ. , Available from: https://imagej.net/downloads (2012).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis. BioTechniques. 42 (1), 71-75 (2007).
- CellProfiler. Broad Institute. , Available from: https://cellprofiler.org/releases (2021).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).
- Knowles group, University of Cambridge. , Available from: https://amylofit.com/amylofitmain/login/ (2021).
- Lazaro-Pena, M. I., Cornwell, A. B., Samuelson, A. V. Quantifying tissue-specific proteostatic decline in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (175), (2021).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), 85964 (2014).
- Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing and Development. 141-142, 1-4 (2014).
- David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans. PLoS Biology. 8 (8), 47-48 (2010).
- Hunter, S., Maulik, M., Scerbak, C., Vayndorf, E., Taylor, B. E. Caenorhabditis sieve: A low-tech instrument and methodology for sorting small multicellular organisms. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), (2018).
- Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours. Communications Biology. 1, 73 (2018).
- Dong, L., et al. Reversible and long-term immobilization in a hydrogel-microbead matrix for high-resolution imaging of Caenorhabditis elegans and other small organisms. PLoS One. 13 (3), 0193989 (2018).
