Здесь представлен метод анализа кинетики агрегации белка у нематоды Caenorhabditis elegans. Животные из популяции, синхронизированной по возрасту, визуализируются в разные моменты времени, за которыми следует полуавтоматический подсчет включения в CellProfiler и соответствие математической модели в AmyloFit.
Агрегация белка в нерастворимые включения является отличительной чертой разнообразных заболеваний человека, многие из которых связаны с возрастом. Нематода Caenorhabditis elegans является хорошо зарекомендовавшим себя модельным организмом, который широко используется в этой области для изучения агрегации и токсичности белка. Его оптическая прозрачность позволяет непосредственно визуализировать агрегацию белка с помощью флуоресцентной микроскопии. Более того, быстрый репродуктивный цикл и короткая продолжительность жизни делают нематоду подходящей моделью для скрининга генов и молекул, которые модулируют этот процесс.
Однако количественная оценка совокупной нагрузки у живых животных плохо стандартизирована, обычно выполняется ручным подсчетом включения под флуоресцентным рассеченным микроскопом в одну точку времени. Такой подход может привести к высокой изменчивости между наблюдателями и ограничить понимание процесса агрегирования. Напротив, агрегация амилоидоподобных белков in vitro обычно контролируется флуоресценцией тиофлавина Т с высоким количественным и временным разрешением.
Здесь представлен аналогичный метод для непредвзятого анализа кинетики агрегации у живых C. elegans с использованием высокопроизводительного конфокального микроскопа в сочетании с индивидуальным анализом изображений и подгонкой данных. Применимость данного метода демонстрируется путем мониторинга включения образования флуоресцентно меченого белка полиглутамина (polyQ) в мышечных клетках стенки организма. Рабочий процесс анализа изображений позволяет определять количество включений в разных точках времени, которые подогнаны к математической модели, основанной на независимых событиях нуклеации в отдельных мышечных клетках. Метод, описанный здесь, может оказаться полезным для оценки воздействия факторов протеостаза и потенциальных терапевтических средств для лечения заболеваний агрегации белка у живого животного надежным и количественным образом.
Накопление неправильно свернутых белков в нерастворимые отложения происходит при широком спектре заболеваний. Известными примерами являются агрегация амилоид-β и тау при болезни Альцгеймера, α-синуклеина при болезни Паркинсона и гентингтина с вспененным полиQ при болезни Гентингтона 1,2. Неправильное сворачивание этих полипептидов в амилоидные фибриллы связано с токсичностью и гибелью клеток механизмами, которые до сих пор в значительной степени неясны. Выяснение механизмов образования амилоида будет иметь решающее значение для разработки эффективных методов лечения, которые в настоящее время недоступны.
Детальные исследования образования амилоида были выполнены in vitro на основе измерений флуоресценции тиофлавина Т, что привело к механистическому пониманию процесса агрегации и влияния ингибирующих молекул 3,4,5. Однако неясно, справедливы ли те же механизмы агрегации в сложной среде живых клеток и организмов. Червь-нематода Caenorhabditis elegans является подходящим модельным организмом для изучения агрегации белка in vivo. Он имеет относительно простую анатомию, но состоит из нескольких тканей, включая мышцы, кишечник и нервную систему. Он генетически хорошо характеризуется, и инструменты для генетической модификации легко доступны. Кроме того, он имеет короткое время генерации ~ 3 дня и общую продолжительность жизни 2-3 недели. Таким образом, агрегация белка может быть исследована на протяжении всей жизни животного в экспериментально удобной временной шкале. Наконец, нематода оптически прозрачна, что позволяет отслеживать агрегацию флуоресцентно меченых белков у живых животных.
Эти особенности C. elegans ранее использовались для исследования агрегации белков polyQ в качестве модели для гентингтона и других заболеваний расширения polyQ. Выше патогенного порога в 35-40 остатков глутамина можно наблюдать, что белки polyQ, помеченные желтым флуоресцентным белком (YFP), образуют нерастворимые включения в мышечной ткани 6,7, нейронах8 и кишечнике 9,10. Эти особенности были широко использованы для скрининга генов 11,12,13 и низкомолекулярных модификаторов 14 агрегации и токсичности белка.
C. elegans может сыграть важную роль в преодолении разрыва между исследованиями агрегации белка in vitro и более сложными моделями заболеваний, такими как мыши15. C. elegans поддается скринингу лекарств16 , но также может быть использован для получения фундаментального понимания молекулярных механизмов агрегации белка in vivo, как было продемонстрировано недавно17. Однако для обоих применений первостепенное значение имеет извлечение количественной и воспроизводимой меры агрегации белка. Здесь это достигается за счет использования высокопроизводительного конфокального микроскопа в сочетании с выделенным конвейером анализа изображений (рисунок 1).
Способ, представленный в настоящем описании, облегчает непредвзятый и количественный анализ кинетики агрегации белка в модельном организме C. elegans. Это зависит от четырех ключевых элементов (рисунок 1): 1) поддержание синхронизированной по возрасту популяции нематод; 2) флуоресцентная микроскопия в многоязычных пластинах; 3) автоматизированный подсчет включений в CellProfiler; 4) подгонка данных в AmyloFit. По сравнению с ручным подсчетом включений у свободно движущихся животных или из сохраненных изображений26, количественная оценка в CellProfiler является более быстрой и более объективной. Другим ключевым достижением протокола является получение кинетических данных, а не отдельных временных точек, что дает количественное представление о механизме агрегации при подгонке данных к математической модели.
Четыре элемента протокола могут быть использованы в качестве независимых модулей, которые могут быть изменены в зависимости от приложения. Популяции, синхронизированные по возрасту, также могут поддерживаться с использованием 5-фтор-2′-дезоксиуридина (FUDR) для стерилизации животных. Это соединение влияет на продолжительность жизни и протеостаз24,25 и является высококанцерогенным для экспериментатора; однако это исключает ручную передачу червей, которая может быть трудоемкой при обработке большого количества. Другими альтернативами являются использование стерильных мутантов29 или фильтрационных устройств для разделения потомства30.
Стадия флуоресцентной микроскопии также может быть скорректирована, например, с использованием более высоких увеличений для мониторинга агрегации белка в нейронах. Широкоугольной микроскопии может быть достаточно для мониторинга агрегации polyQ в мышечных клетках, когда относительная разница между состояниями более важна, чем абсолютное число включений. Конвейер CellProfiler по-прежнему можно использовать в этих случаях, хотя параметры для распознавания червей и включений должны быть скорректированы пользователем. Пропускная способность техники в настоящее время ограничена необходимостью ручного отбора животных в 384-луночную плиту. Это потенциально может быть исправлено путем использования микрофлюидных устройств16. Азид натрия является относительно жестким анестетиком, который может быть заменен физической иммобилизацией гидрогелями или бусинами28,29.
Анализ в AmyloFit, представленный здесь, основан на механизме агрегации, состоящем из независимых событий нуклеации в отдельных клетках. В тех случаях, когда эта модель не подходит, пользователю следует рассмотреть альтернативу, такую как модель кооперативной агрегации, разработанная ранее17. Ограничение этого подхода заключается в том, что штаммы, экспрессирующие интересующий белок в различных концентрациях, должны быть доступны, хотя они могут быть получены с использованием рутинных методов C. elegans 24.
В целом, этот протокол предоставляет средства для получения высококачественных данных для кинетики агрегации белка в модельной системе in vivo , что позволяет проводить детальный анализ механизмов агрегации17. Хотя метод был продемонстрирован для агрегации polyQ в мышечной ткани C. elegans , будущие применения протокола могут включать другие белки и ткани и эффекты факторов протеостаза и малых молекул.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим лабораторию Моримото за штаммы C. elegans и Esmeralda Bosman за помощь в работе с высокопроизводительным конфокальным микроскопом. Эта работа финансировалась за счет стартового гранта Утрехтского университета T.S.
384-well plate | Greiner | 781091 | Black with flat clear bottom |
AmyloFit | Knowles lab | v2.0 | Access at www.amylofit.ch.cam.ac.uk |
C. elegans Q40 line A | Morimoto lab | AM1228 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line B | Morimoto lab | AM1229 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line C | Morimoto lab | AM1230 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line D | Morimoto lab | AM1231 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
CellProfiler | Broad Institute | 4.1.3 | Downloaded from https://cellprofiler.org |
E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
FIJI | Open-source | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
High-throughput confocal microscope | Yokogawa | CellVoyager CV8000 | |
M9 buffer | Home-made | 3 g/L KH2PO4, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 1 mM MgSO4 | |
NGM plates | Home-made | 17 g/L agar, 2.5 g/L bacto-peptone, 3 g/L NaCl, 25 mM KPO4 buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 5 mg/L cholesterol | |
Pasteur pipette | WU Mainz | 250 | To make worm pick, 150 mm length |
Platinum iridium wire | Alfa Aesar | 39383 | To make worm pick, 0.25 mm diameter |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Stereomicroscope | Leica | S9 |