Summary
Hier wordt een methode gepresenteerd voor de analyse van eiwitaggregatiekinetiek in de nematode Caenorhabditis elegans. Dieren uit een leeftijdsgesynchroniseerde populatie worden op verschillende tijdstippen afgebeeld, gevolgd door semi-geautomatiseerde inclusietelling in CellProfiler en passend bij een wiskundig model in AmyloFit.
Abstract
Eiwitaggregatie in onoplosbare insluitsels is een kenmerk van een verscheidenheid aan menselijke ziekten, waarvan er vele leeftijdsgebonden zijn. De nematode Caenorhabditis elegans is een gerenommeerd modelorganisme dat op grote schaal in het veld is gebruikt om eiwitaggregatie en toxiciteit te bestuderen. De optische transparantie maakt de directe visualisatie van eiwitaggregatie door fluorescentiemicroscopie mogelijk. Bovendien maken de snelle voortplantingscyclus en korte levensduur de nematode een geschikt model om te screenen op genen en moleculen die dit proces moduleren.
De kwantificering van de totale belasting bij levende dieren is echter slecht gestandaardiseerd, meestal uitgevoerd door handmatige inclusietelling onder een fluorescentiedissectiemicroscoop op één tijdstip. Deze aanpak kan resulteren in een hoge variabiliteit tussen waarnemers en beperkt het begrip van het aggregatieproces. Daarentegen wordt amyloïde-achtige eiwitaggregatie in vitro routinematig gecontroleerd door thioflavine T-fluorescentie op een zeer kwantitatieve en tijdsgebonden manier.
Hier wordt een analoge methode gepresenteerd voor de onbevooroordeelde analyse van aggregatiekinetiek in levende C. elegans, met behulp van een confocale microscoop met hoge doorvoer in combinatie met op maat gemaakte beeldanalyse en data-fitting. De toepasbaarheid van deze methode wordt aangetoond door het monitoren van inclusievorming van een fluorescerend gelabeld polyglutamine (polyQ) eiwit in de lichaamswand spiercellen. De beeldanalyseworkflow maakt het mogelijk om het aantal insluitsels op verschillende tijdstippen te bepalen, die zijn aangepast aan een wiskundig model op basis van onafhankelijke nucleatiegebeurtenissen in individuele spiercellen. De hier beschreven methode kan nuttig zijn om de effecten van proteostasefactoren en potentiële therapieën voor eiwitaggregatieziekten bij een levend dier op een robuuste en kwantitatieve manier te beoordelen.
Introduction
De accumulatie van verkeerd gevouwen eiwitten in onoplosbare afzettingen komt voor bij een breed scala aan ziekten. Bekende voorbeelden zijn de aggregatie van amyloïde-β en tau bij de ziekte van Alzheimer, α-synucleïne bij de ziekte van Parkinson en huntingtine met geëxpandeerd polyQ bij de ziekte van Huntington 1,2. Het verkeerd vouwen van deze polypeptiden tot amyloïde fibrillen wordt geassocieerd met toxiciteit en celdood door mechanismen die nog grotendeels onduidelijk zijn. Het ophelderen van de mechanismen van amyloïde vorming zal cruciaal zijn voor het ontwikkelen van effectieve therapieën, die momenteel niet beschikbaar zijn.
Gedetailleerde onderzoeken naar amyloïdevorming zijn in vitro uitgevoerd op basis van thioflavine T-fluorescentiemetingen, wat heeft geleid tot een mechanistisch begrip van het aggregatieproces en het effect van remmende moleculen 3,4,5. Het is echter niet duidelijk of dezelfde aggregatiemechanismen gelden in de complexe omgeving van levende cellen en organismen. De nematodenworm Caenorhabditis elegans is een geschikt modelorganisme om eiwitaggregatie in vivo te bestuderen. Het heeft een relatief eenvoudige anatomie, maar bestaat uit meerdere weefsels, waaronder spieren, darmen en een zenuwstelsel. Het is genetisch goed gekarakteriseerd en hulpmiddelen voor genetische modificatie zijn direct beschikbaar. Bovendien heeft het een korte generatietijd van ~ 3 dagen en een totale levensduur van 2-3 weken. Als zodanig kan eiwitaggregatie worden onderzocht gedurende de levensduur van het dier op een experimenteel geschikte tijdschaal. Ten slotte is de nematode optisch transparant, waardoor de aggregatie van fluorescerend gelabelde eiwitten in levende dieren kan worden gevolgd.
Deze kenmerken van C. elegans zijn eerder gebruikt om de aggregatie van polyQ-eiwitten te onderzoeken als een model voor Huntington en andere polyQ-expansieziekten. Boven de pathogene drempel van 35-40 glutamineresiduen kunnen de polyQ-eiwitten gelabeld met geel fluorescerend eiwit (YFP) worden waargenomen om onoplosbare insluitsels te vormen in het spierweefsel 6,7, neuronen8 en de darm 9,10. Deze kenmerken zijn op grote schaal gebruikt om te screenen op genen 11,12,13 en klein-molecuul modifiers 14 van eiwitaggregatie en toxiciteit.
C. elegans heeft het potentieel om een belangrijke rol te spelen bij het overbruggen van de kloof tussen in vitro studies van eiwitaggregatie en complexere ziektemodellen zoals muizen15. C. elegans is vatbaar voor geneesmiddelenscreening16 , maar kan ook worden gebruikt om een fundamenteel begrip te verkrijgen van de moleculaire mechanismen van eiwitaggregatie in vivo, zoals onlangs is aangetoond17. Voor beide toepassingen is het echter van het grootste belang om een kwantitatieve en reproduceerbare maat voor eiwitaggregatie te extraheren. Hier wordt dit bereikt met behulp van een confocale microscoop met hoge doorvoer in combinatie met een speciale beeldanalysepijplijn (figuur 1).
Protocol
1. Groei van een leeftijdsgesynchroniseerde populatie van C. elegans
- Onderhoud de C. elegans-stammen op nematodengroeimedium (NGM)-platen gezaaid met Escherichia coli OP50 bij 20 °C volgens standaardprocedures18.
- Voer een gesynchroniseerde eierlegging uit door 10 volwassen nematoden op een 6 cm gezaaide NGM-plaat te plaatsen met een platina wormenprik. Laat de volwassenen eieren leggen gedurende ~ 2 uur bij 20 °C voordat u ze verwijdert. Bereid 1-4 platen per stam voor, afhankelijk van de vruchtbaarheid van de stam en het aantal tijdspunten dat moet worden ingenomen.
- Plaats de borden met eieren in de broedmachine bij 20 °C. Monitor de ontwikkeling van de dieren totdat ze volwassen zijn.
OPMERKING: De dag waarop de dieren volwassen zijn, wordt hier gedefinieerd als dag 1. Meestal is dit drie dagen na de leg van het ei. - Breng vanaf dag 1 de dieren dagelijks over naar nieuwe gezaaide NGM-platen om ze van hun nakomelingen te scheiden. Om te compenseren voor dieren die sterven of verloren gaan tijdens de overdracht, brengt u ~ 40 dieren per stam over maal het aantal in beeld te brengen punten (zie stap 2). Ga door totdat de dieren zijn opgehouden bevruchte eieren te leggen (~ dag 6 van volwassenheid).
OPMERKING: Sluit dieren uit met zakken of andere ontwikkelingsfenotypen. Bagging wordt vaak waargenomen in stammen die aggregatiegevoelige eiwitten tot expressie brengen.
2. Monstervoorbereiding van C. elegans in een meerwellplaat
OPMERKING: Omdat de beeldvormingsprocedure anesthetica vereist die de dieren uiteindelijk zullen doden, kunnen dezelfde dieren niet worden hergebruikt voor volgende tijdstippen. In plaats daarvan worden verschillende dieren uit dezelfde leeftijdsgesynchroniseerde batch op verschillende dagen afgebeeld. Hoewel de meeste soorten op dag 1 weinig insluitsels zullen hebben, wordt het aanbevolen om dit tijdstip als basislijn op te nemen.
- Bereid de 384-putplaat voor door het vereiste aantal putten te vullen met 100 μL M9-buffer aangevuld met 25 mM NaN3 als verdovingsmiddel. Vul één put per soort om in beeld te brengen.
OPMERKING: Natriumazide (NaN3) is giftig en moet met zorg worden behandeld. - Breng voor elke stam 20 dieren over in één put met behulp van een platina wormenprik.
OPMERKING: De wormen moeten buiten het bacteriële gazon worden geplaatst voordat ze in de put worden geplaatst. Bacteriën zorgen ervoor dat de dieren zich hechten aan de wormenpluk, wat hun afgifte kan voorkomen en de inhoud van de put zal vertroebelen. Over het algemeen is 20 het optimale aantal dieren per put om overlap tussen de wormen te voorkomen en onnodige beeldvorming van lege putruimte te beperken. - Bedek de plaat met het deksel om verdamping te voorkomen en breng de plaat binnen 1 uur na bereiding in beeld.
- Herhaal stap 2.1-2.3 dagelijks totdat een stabiel plateau in de inclusiegetallen is bereikt of totdat de meeste dieren zijn gestorven. Voer de monstervoorbereiding en beeldvorming elke dag op hetzelfde tijdstip uit om intervallen van 24 uur te garanderen.
3. Beeldverwerving op de confocale microscoop met hoge doorvoer
OPMERKING: Dit experiment kan ook worden opgezet op een gewone confocale microscoop met draaiende schijf met een multiwell-plaathouder. Een camera met een groot gezichtsveld is gunstig om het aantal tegels dat in beeld moet worden gebracht te beperken om de hele put te overspannen. Zie de tabel met materialen voor meer informatie over de microscoop en software die in dit protocol wordt gebruikt.
- Schakel het instrument in en open de software.
- Start een nieuw protocol door naar Measurement Settings | Nieuw. Selecteer het juiste type multiwellplaat en klik op Een nieuwe meetinstelling maken.
- Stel het kanaal in voor fluorescentie door naar Ch 1 te gaan. Stel het doel in op 10x. Selecteer 488 nm als lichtbron en BP525/25 als emissiefilter om YFP in beeld te brengen. Stel binning in op 2x2 om de bestandsgrootte te verkleinen.
- Klik op Kanaal toevoegen en selecteer Brightfield als methode.
- Als u een z-stack confocale fluorescentieafbeelding aan de meting wilt toevoegen, kiest u 3D-fluorescentieacquisitie onder Actielijst. Ga naar Selecteren en kies Ch 1. Als u de bestandsgrootte wilt minimaliseren, stelt u Beeldverwerking in op Maximum , zodat de maximale projectieafbeelding wordt opgeslagen in plaats van de volledige z-stack.
- Klik op BF/Ph Acquisition | Selecteer | Hoofdstuk 2 voor het brightfield kanaal.
- Klik op de afspeelknop (zoek naar het naar rechts wijzende driehoekssymbool) naast Putplaten lossen en plaats de 384-putplaat in de microscoop.
- Klik onder 3D Fluorescence Acquisition op Testen en selecteer een put met wormen om de optimale schakelafstand te bepalen waarop de wormen correct zijn gecentreerd. Stel de oplopende afstand in op 50 μm, de aflopende afstand op -50 μm en het snij-interval op 2 μm om de volledige dikte van de dieren in de z-stack vast te leggen.
- Optimaliseer de belichtingstijd om een goede signaalintensiteit te krijgen voor alle vier de stammen en vermijd verzadiging. Gebruik dezelfde belichtingstijd voor alle soorten en tijdstippen.
- Selecteer de putjes die moeten worden afgebeeld onder Well Plate Scan Setting. Selecteer Tegel en Verkrijg hele put.
- Sla de metingsinstelling op en start het experiment door op Meting starten te klikken. Voor volgende tijdspunten opent u dezelfde metingsinstelling en past u de schakelafstand en de in beeld te brengen putjes aan.
4. Tegelafbeeldingen naaien in ImageJ
OPMERKING: Deze stap is alleen vereist bij gebruik van een objectief groter dan 4x, waarvoor de afbeelding van elke put als meerdere tegels wordt verkregen. In deze analyseworkflow wordt het naaien van de tegels uitgevoerd met behulp van de gratis software FIJI / ImageJ19 (Figuur 2). Afhankelijk van het instrument dat in stap 3 wordt gebruikt, kan het ook mogelijk zijn om stiksels rechtstreeks in de bijbehorende software uit te voeren.
- Download FIJI20 en open het.
- Ga naar Plugins | Stiksels | Grid/Collectie Stitching21.
- Selecteer in het pop-upvenster Grid/Collection Stitching het type en de volgorde waarmee de tegels zijn verzameld. Kies Raster: rij voor rij en Rechts & Omlaag.
- In het volgende venster, Rasterstiksel: Raster: rij voor rij, Rechts & Omlaag, voegt u het aantal tegels in x- en y-richting in. Voor de doelstelling 10x die hier wordt gebruikt, kiest u 2 als rastergrootte x, 3 als rastergrootte y en 0 als tegeloverlapping.
- Klik op Bladeren en selecteer de map met de TIFF-afbeeldingen die u wilt naaien.
- Voeg de algemene bestandsnaam in onder Bestandsnamen voor tegels met {i} op de positie van het tegelnummer in elke bestandsnaam.
- Verwijder het vinkje uit alle onderstaande vakken.
- Voer de plug-in uit.
- Sla de resulterende afbeeldingen op als TIFF-bestanden voor analyse in de volgende stap.
5. Geautomatiseerde inclusietelling met CellProfiler22
- Download en installeer de open-source beeldanalysesoftware CellProfiler23. Download de Pipeline InclusionCounting.cpproj van github.com/sinnigelab/aggregate-quantification.
- Open CellProfiler en sleep de pijplijn naar het venster Een pijplijnbestand hier neerzetten. Klik op Ja om het project te laden.
- Klik op de invoermodule Afbeeldingen en sleep de gestikte afbeeldingen naar het venster Bestanden en map hier neerzetten.
- Klik op de metadata-invoermodule . Pas de reguliere expressie aan om uit de bestandsnaam te extraheren op basis van de namen van de samengevoegde afbeeldingen.
- Klik op de invoermodule NamesandTypes en pas de regelcriteria selecteren aan zodat deze overeenkomen met de kanalen in de bestandsnamen.
OPMERKING: In de standaardinstellingen van de pijplijn worden bestandsnamen met BF herkend als brightfield-afbeeldingen en krijgen ze de naam Worms. Bestandsnamen die YFP bevatten, worden herkend als fluorescentieafbeeldingen en hebben de naam Fluorescentie. - Klik op Uitvoerinstellingen weergeven om een standaardmap te selecteren om de uitvoer van CellProfiler op te slaan.
- Klik op Testmodus starten om de instellingen van de pijplijn te controleren met behulp van de eerste imaging-dataset. Klik op Uitvoeren om alle modules in de pijplijn te doorlopen of Stap om module voor module door de pijplijn te lopen. Als u de wormcontouren in de module EditObjectsManually wilt aanpassen, klikt u op Help om de instructies te bekijken en klikt u op Gereed om door te gaan met het uitvoeren van de pijplijn.
OPMERKING: De geëxtraheerde metingen worden niet geëxporteerd in de testmodus. De drempelparameters om wormen en insluitsels te detecteren, moeten mogelijk worden aangepast op basis van de gebruikte stammen en vergroting. - Klik op Testmodus afsluiten en Afbeeldingen analyseren.
- Open de uitvoermap om de uitvoerbestanden te bekijken. Open de afbeeldingen met de oorspronkelijke bestandsnaam gevolgd door contouren om te controleren of de wormen en insluitsels correct over elkaar zijn gelegd.
OPMERKING: Het aantal insluitsels per worm is te vinden in het bestand met de naam ExpandedWormObjects. Meer informatie over de invoerafbeeldingen is te vinden in het bestand met de naam Afbeelding. Extra uitvoer kan worden geselecteerd in de Module ExportToSpreadsheet in de pijplijn.
6. Wereldwijde aanpassing van inclusietellingsgegevens met AmyloFit5
OPMERKING: Deze stap kan alleen worden uitgevoerd als er gegevens voor meerdere eiwitconcentraties beschikbaar zijn. Voor Q40-YFP is eerder een set van vier stammen met verschillende niveaus van overexpressie in de lichaamswandspiercellen gemaakt17. In andere gevallen moeten nieuwe stammen worden gegenereerd met behulp van plasmide micro-injectie en genomische integratie24.
- Ga naar het gratis online aanpasplatform voor aggregatiekinetiek AmyloFit25. Registreer of log in met een bestaand account.
OPMERKING: Een uitgebreide handleiding over het gebruik van AmyloFit is toegankelijk voor extra hulp. Zie de link linksboven op de webpagina (na inloggen) voor meer informatie. - Om AmyloFit te gaan gebruiken, geeft u het project een naam en klikt u op Project maken. Open het project door op Openen te klikken en maak een sessie aan door het een naam te geven en op Sessie maken en laden te klikken.
- Klik op Gegevens toevoegen en upload het bestand met het gemiddelde aantal insluitsels per dier, volgens de vereisten voor gegevensindelingen in het linkerdeelvenster. Klik op Nieuwe gegevens laden.
- Sla de voorbewerkingsstappen over, die niet vereist zijn voor gegevens over het aantal inclusies, door het aantal punten in te stellen op gemiddeld over voor nulpuntsverschuiving en het aantal punten op gemiddeld voor plateau op 0. Klik op Verzenden. Herhaal deze stap voor elke eiwitconcentratie (d.w.z. elke kolom in het geüploade bestand).
- Selecteer Aangepast in het modelpaneel, voer Ncells*(1-exp(-Kcell*m**(n)*(t-1))) in het vergelijkingsvak in en klik op Model laden.
OPMERKING: Aangezien AmyloFit oorspronkelijk is ontworpen voor de analyse van kinetische gegevens van in vitro assays, moet een op maat gemaakt model worden geladen om de inclusietellingsgegevens van C. elegans te analyseren. In de vergelijking die hier wordt gebruikt, is N-cellen het aantal cellen waarin inclusievorming plaatsvindt, K-cel is de nucleatiesnelheidsconstante, m de intracellulaire eiwitconcentratie en n de reactievolgorde van nucleatie. - Stel de parametertypen in op Globale const voor N-cellen, Globaal geschikt voor K-cel en n en Const voor m. Stel de waarde van N-cellen in op 95 voor lichaamswandspiercellen en de eerste schatting voor K-cel en n op 1. Voer de waarden van m in voor de verschillende stammen in het linkerdeelvenster.
OPMERKING: De eerste gissingen zijn niet relevant voor het relatief eenvoudige model dat hier wordt gebruikt. Voor complexere modellen is het nuttig om een schatting van de verwachte waarden in te voeren om de berekeningstijd te verkorten. - Laat het aantal bassinhopen ongewijzigd en klik op Passen in het montagepaneel.
- Pak de pasvorm uit door op Gegevens downloaden en aanpassen te klikken.
OPMERKING: De parameters die worden geëxtraheerd door de globale pasvorm van het model worden in de rechterbenedenhoek weergegeven. Een plot van de gegevens en de pasvorm wordt automatisch gegenereerd in het deelvenster rechtsboven. Dit plot kan worden geëxtraheerd door op Pdf downloaden te klikken en aan te passen door naar Plotopties weergeven te gaan. K-cel heeft eenheden van moleculen concentratie-n tijd-1 cel-1. Om waarden met verschillende n te vergelijken, kan deK-cel worden omgezet in de nucleatiesnelheid bij een bepaalde eiwitconcentratie door deze te vermenigvuldigen met mn.
Representative Results
De hier beschreven methode (figuur 1) werd gebruikt om de aggregatiekinetiek te analyseren van een construct bestaande uit 40 glutamines gefuseerd met YFP (Q40-YFP). Het eiwit wordt tot expressie gebracht onder controle van de unc-54 promotor , die de expressie in de lichaamswandspiercellen aandrijft. Omdat deze relatief groot en gemakkelijk te visualiseren zijn, is het gebruik van een 10x objectief voldoende om de insluitsels gevormd door Q40-YFP in dit weefsel op te lossen. Vier stammen (lijnen A-D) werden eerder ontwikkeld die het eiwit in verschillende mate tot expressie brachten om de concentratie-afhankelijkheid van polyQ-aggregatie in vivo17 te beoordelen.
Leeftijdsgesynchroniseerde populaties van lijnen A-D werden gegenereerd door een ei-leg van 2 uur, gevolgd door dagelijkse overdracht zodra de nakomelingen de volwassenheid bereikten. Van dag 1 tot dag 10 van de volwassenheid werden 20 dieren van elk van de vier stammen afgebeeld in een 384-well plaat, met behulp van een confocale microscoop met hoge doorvoer. De afbeeldingen van de putten werden verkregen als 6 tegels, die aan elkaar werden genaaid met behulp van een plug-in in ImageJ21 (figuur 2). De gestikte beelden werden vervolgens geanalyseerd met behulp van een op maat gemaakte CellProfiler22-pijplijn (figuur 3) om het gemiddelde inclusiegetal per dier voor elke stam en elk tijdstip te kwantificeren.
De gegevens werden vervolgens aangepast aan een wiskundig model in AmyloFit5 (figuur 4). Het model is gebaseerd op de veronderstelling dat elk van de 95 lichaamswandspiercellen onafhankelijk één inclusie verwerft door een snelheidsbeperkende nucleatiegebeurtenis, gevolgd door snelle geaggregeerde groei17. De fit leverde een nucleatiesnelheidsconstante op van 9,9 × 105 moleculen M-2,1 d-1 cel-1 en een reactievolgorde van 2,1, overeenkomend met een nucleatiesnelheid van 0,38 moleculen d-1 cel-1 bij een intracellulaire eiwitconcentratie van 1 mM. Twee onafhankelijke biologische replicaties leidden tot nauw overeenkomende waarden voor de nucleatiesnelheid en reactievolgorde, die in overeenstemming zijn met een eerdere studie met een vergelijkbaar protocol17 (tabel 1).
Figuur 1: Schematisch overzicht van de methode. (A) Leeftijdsgesynchroniseerde C. elegans-populaties worden gegenereerd door een getimede eierlegging. (B) Dieren uit dezelfde populatie worden afgebeeld in een plaat met 384 putten op verschillende tijdstippen. (C) De tegels worden aan elkaar genaaid om afbeeldingen van de hele putten te vormen, die in CellProfiler worden geanalyseerd om de inclusieaantallen per dier te kwantificeren. (D) De gegevens worden aangepast aan een wiskundig model met behulp van AmyloFit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Screenshots van de stikprocedure in ImageJ met behulp van de plug-in Grid/Collection stitching21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Schema van de CellProfiler-pijplijn om insluitsels te kwantificeren. (A-C) De brightfield-afbeelding (A) wordt gebruikt om de wormen te identificeren (B, close-up in C). (D-G) Het fluorescentiebeeld (D, close-up in E) wordt gebruikt om de insluitsels (F) te identificeren. De wormen en insluitsels zijn gerelateerd aan het aantal insluitsels voor elke worm in de put (G). De getoonde beelden zijn van Q40 lijn A dieren op dag 3 van volwassenheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: De gegevens aanpassen aan een wiskundig model in AmyloFit. (A) Gegevens worden geüpload naar AmyloFit. (B) Een aangepaste vergelijking wordt ingevoerd om inclusievorming te modelleren, uitgaande van onafhankelijke nucleatiegebeurtenissen in elke cel. (C) Aanpassing van de aggregatiekinetiek voor C. eleganslijnen A-D die verschillende niveaus van Q40-YFP uitdrukken. De gegevens zijn representatief voor twee onafhankelijke biologische replicaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Gegevensset 1 | Gegevensset 2 | Sinnige et al.17 | |
| n | 2.1 | 1.9 | 1.6 |
| K-cel (moleculen M-n d-1 cel-1) | 9,9 x 105 | 1,4 x 105 | 3,1 x 104 |
| Nucleatiesnelheid bij 1 mM (moleculen d-1 cel-1) | 0.38 | 0.21 | 0.35 |
Tabel 1: Waarden van de nucleatiesnelheid en reactievolgorde van de Q40-YFP-aggregatie. Gegevens voor twee onafhankelijke biologische replicaties van het protocol en vergelijking met eerder gepubliceerde gegevens17.
Discussion
De hierin gepresenteerde methode vergemakkelijkt een onbevooroordeelde en kwantitatieve analyse van eiwitaggregatiekinetiek in het modelorganisme C. elegans. Het hangt af van vier belangrijke elementen (figuur 1): 1) het handhaven van een leeftijdsgesynchroniseerde populatie van nematoden; 2) fluorescentiemicroscopie in multiwellplaten; 3) geautomatiseerde inclusietelling in CellProfiler; 4) data passend in AmyloFit. Vergeleken met het handmatig tellen van insluitsels in vrij bewegende dieren of van opgeslagen afbeeldingen26, is kwantificering in CellProfiler zowel sneller als onbevooroordeeld. De andere belangrijke vooruitgang van het protocol is de verwerving van kinetische gegevens, in plaats van afzonderlijke tijdspunten, die kwantitatieve inzichten bieden in het aggregatiemechanisme bij het aanpassen van de gegevens aan een wiskundig model.
De vier elementen van het protocol kunnen worden gebruikt als onafhankelijke modules die afhankelijk van de toepassing kunnen worden gewijzigd. Leeftijdsgesynchroniseerde populaties kunnen ook worden gehandhaafd met behulp van 5-fluoro-2′-deoxyuridine (FUDR) om de dieren te steriliseren. Deze verbinding beïnvloedt de levensduur en proteostase24,25 en is zeer kankerverwekkend voor de experimentator; het sluit echter handmatige overdracht van de wormen uit, wat arbeidsintensief kan zijn wanneer grote aantallen worden behandeld. Andere alternatieven zijn het gebruik van steriele mutanten29 of filtratie-apparaten om nakomelingen30 te scheiden.
De fluorescentiemicroscopiestap kan ook worden aangepast, bijvoorbeeld met behulp van hogere vergrotingen om de eiwitaggregatie in neuronen te controleren. Widefield-microscopie kan voldoende zijn om polyQ-aggregatie in spiercellen te controleren wanneer het relatieve verschil tussen de omstandigheden belangrijker is dan het absolute aantal insluitsels. De CellProfiler-pijplijn kan in deze gevallen nog steeds worden gebruikt, hoewel de instellingen om wormen en insluitsels te herkennen door de gebruiker moeten worden aangepast. De doorvoer van de techniek wordt momenteel beperkt door de noodzaak om de dieren handmatig in de 384-putplaat te plukken. Dit kan mogelijk worden verholpen door het gebruik van microfluïdische apparaten16. Natriumazide is een relatief hard verdovingsmiddel, dat kan worden vervangen door fysieke immobilisatie met hydrogels of kralen28,29.
De hier gepresenteerde analyse in AmyloFit is gebaseerd op een aggregatiemechanisme dat bestaat uit onafhankelijke nucleatiegebeurtenissen in individuele cellen. In gevallen waarin dit model niet past, moet de gebruiker een alternatief overwegen, zoals het eerder ontwikkelde coöperatieve aggregatiemodel17. Een beperking van deze benadering is dat stammen die het eiwit van belang in verschillende concentraties tot expressie brengen, beschikbaar moeten zijn, hoewel deze kunnen worden gegenereerd met behulp van routinematige C. elegans-methoden 24.
Al met al biedt dit protocol de middelen om hoogwaardige gegevens te verkrijgen voor eiwitaggregatiekinetiek in een in vivo modelsysteem, waardoor gedetailleerde analyse van aggregatiemechanismenmogelijk is 17. Hoewel de methode werd gedemonstreerd voor polyQ-aggregatie in het C. elegans spierweefsel, kunnen toekomstige toepassingen van het protocol andere eiwitten en weefsels en de effecten van proteostasefactoren en kleine moleculen omvatten.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
We bedanken het Morimoto-lab voor C. elegans-stammen en Esmeralda Bosman voor hulp bij de confocale microscoop met hoge doorvoer. Dit werk werd gefinancierd met een start-up beurs van de Universiteit Utrecht aan T.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384-well plate | Greiner | 781091 | Black with flat clear bottom |
| AmyloFit | Knowles lab | v2.0 | Access at www.amylofit.ch.cam.ac.uk |
| C. elegans Q40 line A | Morimoto lab | AM1228 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
| C. elegans Q40 line B | Morimoto lab | AM1229 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
| C. elegans Q40 line C | Morimoto lab | AM1230 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
| C. elegans Q40 line D | Morimoto lab | AM1231 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
| CellProfiler | Broad Institute | 4.1.3 | Downloaded from https://cellprofiler.org |
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
| FIJI | Open-source | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| High-throughput confocal microscope | Yokogawa | CellVoyager CV7000S | |
| M9 buffer | Home-made | 3 g/L KH2PO4, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 1 mM MgSO4 | |
| NGM plates | Home-made | 17 g/L agar, 2.5 g/L bacto-peptone, 3 g/L NaCl, 25 mM KPO4 buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 5 mg/L cholesterol | |
| Pasteur pipette | WU Mainz | 250 | To make worm pick, 150 mm length |
| Platinum iridium wire | Alfa Aesar | 39383 | To make worm pick, 0.25 mm diameter |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9 |
References
- Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (6), 384-396 (2014).
- Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, amyloid formation, and human disease: a summary of progress over the last decade. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 27-68 (2017).
- Knowles, T. P. J., et al. An analytical solution to the kinetics of breakable filament assembly. Science. 326 (5959), 1533-1537 (2009).
- Cohen, S. I. A., et al. Proliferation of amyloid-β42 aggregates occurs through a secondary nucleation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9758-9763 (2013).
- Meisl, G., et al. Molecular mechanisms of protein aggregation from global fitting of kinetic models. Nature Protocols. 11 (2), 252-272 (2016).
- Satyal, S. H., et al. Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5750-5755 (2000).
- Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
- Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
- Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).
- Prahlad, V., Morimoto, R. I. Neuronal circuitry regulates the response of Caenorhabditis elegans to misfolded proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14204-14209 (2011).
- Nollen, E. A. A. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).
- Silva, M. C., et al. A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network. PLoS Genetics. 7 (12), 1002438 (2011).
- Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9, 1-16 (2014).
- Calamini, B., et al. Small-molecule proteostasis regulators for protein conformational diseases. Nature Chemical Biology. 8 (2), 185-196 (2012).
- Sinnige, T., Stroobants, K., Dobson, C. M., Vendruscolo, M. Biophysical studies of protein misfolding and aggregation in in vivo models of Alzheimer's and Parkinson's diseases. Quarterly Reviews of Biophysics. 49, 22 (2020).
- Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nature Communications. 7, 13023 (2016).
- Sinnige, T., et al. Kinetic analysis reveals that independent nucleation events determine the progression of polyglutamine aggregation in C. elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 202188118 (2021).
- Brenner, S. Caenorhabditis elegans. Methods. 77 (1), 71-94 (1974).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- FIJI/ImageJ. , Available from: https://imagej.net/downloads (2012).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis. BioTechniques. 42 (1), 71-75 (2007).
- CellProfiler. Broad Institute. , Available from: https://cellprofiler.org/releases (2021).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).
- Knowles group, University of Cambridge. , Available from: https://amylofit.com/amylofitmain/login/ (2021).
- Lazaro-Pena, M. I., Cornwell, A. B., Samuelson, A. V. Quantifying tissue-specific proteostatic decline in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (175), (2021).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), 85964 (2014).
- Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing and Development. 141-142, 1-4 (2014).
- David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans. PLoS Biology. 8 (8), 47-48 (2010).
- Hunter, S., Maulik, M., Scerbak, C., Vayndorf, E., Taylor, B. E. Caenorhabditis sieve: A low-tech instrument and methodology for sorting small multicellular organisms. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), (2018).
- Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours. Communications Biology. 1, 73 (2018).
- Dong, L., et al. Reversible and long-term immobilization in a hydrogel-microbead matrix for high-resolution imaging of Caenorhabditis elegans and other small organisms. PLoS One. 13 (3), 0193989 (2018).
