Summary
Her presenteres en metode for analyse av proteinaggregeringskinetikk i nematoden Caenorhabditis elegans. Dyr fra en alderssynkronisert populasjon er avbildet på forskjellige tidspunkter, etterfulgt av halvautomatisert inkluderingstelling i CellProfiler og tilpasning til en matematisk modell i AmyloFit.
Abstract
Proteinaggregering i uoppløselige inneslutninger er et kjennetegn på en rekke menneskelige sykdommer, hvorav mange er aldersrelaterte. Nematoden Caenorhabditis elegans er en veletablert modellorganisme som har blitt mye brukt i feltet for å studere proteinaggregering og toksisitet. Den optiske gjennomsiktigheten muliggjør direkte visualisering av proteinaggregering ved fluorescensmikroskopi. Videre gjør den raske reproduktive syklusen og kort levetid nematoden til en passende modell for å screene for gener og molekyler som modulerer denne prosessen.
Kvantifiseringen av aggregert belastning hos levende dyr er imidlertid dårlig standardisert, vanligvis utført ved manuell inkluderingstelling under et fluorescens disseksjonsmikroskop på et enkelt tidspunkt. Denne tilnærmingen kan føre til høy variasjon mellom observatører og begrenser forståelsen av aggregasjonsprosessen. I motsetning overvåkes amyloidlignende proteinaggregering in vitro rutinemessig av thioflavin T fluorescens på en svært kvantitativ og tidsbestemt måte.
Her presenteres en analog metode for den objektive analysen av aggregasjonskinetikk i levende C. elegans, ved hjelp av et konfokalt mikroskop med høy gjennomstrømning kombinert med skreddersydd bildeanalyse og datatilpasning. Anvendelsen av denne metoden er demonstrert ved å overvåke inkluderingsdannelse av et fluorescerende merket polyglutamin (polyQ) protein i kroppsveggens muskelceller. Bildeanalysearbeidsflyten gjør det mulig å bestemme antall inneslutninger på forskjellige tidspunkter, som er tilpasset en matematisk modell basert på uavhengige kjernehendelser i individuelle muskelceller. Metoden beskrevet her kan være nyttig for å vurdere effekten av proteostasefaktorer og potensielle terapeutiske for proteinaggregeringssykdommer hos et levende dyr på en robust og kvantitativ måte.
Introduction
Akkumuleringen av feilfoldede proteiner i uoppløselige avsetninger forekommer i et bredt spekter av sykdommer. Kjente eksempler er aggregering av amyloid-β og tau i Alzheimers sykdom, α-synuklein ved Parkinsons sykdom, og huntingtin med utvidet polyQ ved Huntingtons sykdom 1,2. Feilfoldingen av disse polypeptider i amyloidfibriler er forbundet med toksisitet og celledød av mekanismer som fortsatt i stor grad er uklare. Belyse mekanismene for amyloiddannelse vil være avgjørende for å utvikle effektive terapier, som for tiden ikke er tilgjengelige.
Detaljerte undersøkelser av amyloiddannelse har blitt utført in vitro basert på thioflavin T fluorescensmålinger, noe som fører til en mekanistisk forståelse av aggregasjonsprosessen og effekten av hemmende molekyler 3,4,5. Det er imidlertid ikke klart om de samme aggregeringsmekanismene gjelder i det komplekse miljøet av levende celler og organismer. Nematode ormen Caenorhabditis elegans er en egnet modellorganisme for å studere proteinaggregering in vivo. Den har en relativt enkel anatomi, men består av flere vev, inkludert muskler, tarm og et nervesystem. Det er genetisk godt karakterisert, og verktøy for genetisk modifikasjon er lett tilgjengelige. Videre har den en kort generasjonstid på ~ 3 dager og en total levetid på 2-3 uker. Som sådan kan proteinaggregering undersøkes gjennom dyrets levetid på en eksperimentelt praktisk tidsskala. Til slutt er nematoden optisk gjennomsiktig, noe som muliggjør sporing av aggregering av fluorescerende merkede proteiner hos levende dyr.
Disse egenskapene til C. elegans har tidligere blitt utnyttet til å undersøke aggregering av polyQ-proteiner som modell for Huntingtons og andre polyQ-ekspansjonssykdommer. Over den patogene terskelen på 35-40 glutaminrester, kan polyQ-proteinene merket med gult fluorescerende protein (YFP) observeres for å danne uoppløselige inneslutninger i muskelvevet 6,7, nevroner8 og tarmen 9,10. Disse funksjonene har blitt mye brukt til å screene for gener 11,12,13 og småmolekyl modifikatorer14 av proteinaggregasjon og toksisitet.
C. elegans har potensial til å spille en viktig rolle i å bygge bro mellom in vitro-studier av proteinaggregering og mer komplekse sykdomsmodeller som mus15. C. elegans er egnet til legemiddelscreening16 , men kan også utnyttes for å oppnå en grunnleggende forståelse av molekylære mekanismer for proteinaggregering in vivo, som vist nylig17. For begge bruksområdene er det imidlertid av største betydning å trekke ut et kvantitativt og reproduserbart mål på proteinaggregering. Her oppnås dette ved bruk av et konfokalt mikroskop med høy gjennomstrømning kombinert med en dedikert bildeanalyserørledning (figur 1).
Protocol
1. Vekst av en alderssynkronisert befolkning på C. elegans
- Oppretthold C. elegans stammer på nematode vekstmedium (NGM) plater frøet med Escherichia coli OP50 ved 20 °C i henhold til standardprosedyrer18.
- Utfør et synkronisert egglegging ved å plassere 10 voksne nematoder på en 6 cm frø NGM-plate med platina ormplukk. La de voksne legge egg i ~ 2 timer ved 20 °C før du fjerner dem. Forbered 1-4 plater per belastning, avhengig av belastningens fruktbarhet og antall tidspunkter som skal tas.
- Plasser platene med egg i inkubatoren ved 20 °C. Overvåk utviklingen av dyrene til de når voksen alder.
MERK: Dagen da dyrene har nådd voksen alder er definert her som dag 1. Vanligvis er dette tre dager etter eggleggingen. - Fra dag 1, overfør dyrene til nye frø NGM-plater daglig for å skille dem fra sine avkom. For å kompensere for dyr som dør eller går tapt under overføring, overfør ~ 40 dyr per belastning ganger antall punkter som skal avbildes (se trinn 2). Fortsett til dyrene har sluttet å legge befruktede egg (~ dag 6 i voksen alder).
MERK: Utelat dyr med posering eller andre utviklingsfenotyper. Posering observeres ofte i stammer som uttrykker aggregasjonsutsatte proteiner.
2. Prøvepreparering av C. elegans i en multiwell plate
MERK: Ettersom avbildningsprosedyren krever bedøvelse som til slutt vil drepe dyrene, kan de samme dyrene ikke gjenbrukes for påfølgende tidspunkter. I stedet er forskjellige dyr fra samme alderssynkroniserte batch avbildet på forskjellige dager. Selv om de fleste stammer vil ha få inneslutninger på dag 1, anbefales det å inkludere dette tidspunktet som en basislinje.
- Forbered 384-brønnsplaten ved å fylle det nødvendige antall brønner med 100 μL M9 buffer supplert med 25 mM NaN3 som bedøvelsesmiddel. Fyll en brønn per stamme som skal avbildes.
MERK: Natriumazid (NaN3) er giftig og bør håndteres med forsiktighet. - For hver stamme, overfør 20 dyr til en brønn ved hjelp av en platina orm plukke.
MERK: Ormene må plasseres utenfor bakteriell plen før de plasseres i brønnen. Bakterier gjør at dyrene holder seg til ormplukkingen, noe som kan forhindre frigjøring og vil overskygge brønninnholdet. Vanligvis er 20 det optimale antall dyr per brønn for å forhindre overlapping mellom ormene samtidig som unødvendig avbildning av tom brønnplass begrenses. - Dekk platen med lokket for å forhindre fordampning, og bilde platen innen 1 time etter tilberedning.
- Gjenta trinn 2.1-2.3 daglig til et jevnt platå i inklusjonstallene er nådd eller til de fleste dyr er døde. Utfør prøvepreparering og avbildning til samme tid hver dag for å sikre intervaller på 24 timer.
3. Bildeoppkjøp på det konfiskeringsmikroskopet med høy gjennomstrømning
MERK: Dette eksperimentet kan også settes opp på et vanlig roterende diskkonfokalt mikroskop med en multiwell plateholder. Et kamera med et stort synsfelt er gunstig for å begrense antall fliser som må avbildes for å spenne over hele brønnen. Se materialtabellen for detaljer om mikroskopet og programvaren som brukes i denne protokollen.
- Slå på instrumentet og åpne programvaren.
- Start en ny protokoll ved å gå til Målingsinnstillinger | Nytt. Velg riktig flerbruksplatetype, og klikk opprett en ny målingsinnstilling.
- Sett opp kanalen for fluorescens ved å gå til Ch 1. Sett målsettingen til 10x. Velg 488 nm som lyskilde og BP525/25 som utslippsfilter til bilde YFP. Sett binning til 2x2 for å redusere filstørrelsen.
- Klikk legg til kanal , og velg Brightfield som metode.
- Hvis du vil legge til et z-stack konfokalt fluorescensbilde i målingen, velger du 3D Fluorescence-anskaffelse under Handlingsliste. Gå til Velg og velg Ch 1. Hvis du vil minimere filstørrelsene, setter du Bildebehandling til Maksimum slik at det maksimale projeksjonsbildet lagres i stedet for hele z-stakken.
- Klikk på BF/Ph Acquisition | Velg | Ch 2 for brightfield-kanalen.
- Klikk på avspillingsknappen (se etter det høyre trekantsymbolet) ved siden av Loss Well Plates og plasser 384-brønnsplaten i mikroskopet.
- Under 3D Fluorescence Acquisition klikker du test og velger en brønn som inneholder ormer for å bestemme den optimale forskyveravstanden som ormene er sentrert riktig på. Sett Stigende avstand til 50 μm, Synkende avstand til -50 μm, og Kuttingsintervall til 2 μm for å fange hele tykkelsen på dyrene i z-stabelen.
- Optimaliser eksponeringstiden for å få en god signalintensitet for alle fire stammene samtidig som du unngår metning. Bruk samme eksponeringstid for alle belastninger og tidspunkter.
- Velg brønnene som skal avbildes under Innstillingen for brønnplateskanning. Velg fliser og skaff deg hel brønn.
- Lagre målingsinnstillingen , og start eksperimentet ved å klikke Start måling. For etterfølgende tidspunkter åpner du den samme målingsinnstillingen og justerer forskyveravstanden og brønnene som skal avbildes.
4. Stitching flislagte bilder i ImageJ
MERK: Dette trinnet er bare nødvendig når du bruker en målsetting som er større enn 4x, som bildet av hver brønn er anskaffet som flere fliser. I denne analysearbeidsflyten utføres søm av flisene ved hjelp av gratisprogramvaren FIJI/ImageJ19 (figur 2). Avhengig av instrumentet som ble brukt i trinn 3, kan det også være mulig å utføre søm direkte i den medfølgende programvaren.
- Last ned FIJI20 og åpne den.
- Gå til plugins | Søm | Rutenett/oppsamlingssting21.
- I popup-vinduet, Grid/Collection Stitching, velger du typen og rekkefølgen flisene ble samlet inn etter. Velg Rutenett: rad-for-rad og Høyre og Ned.
- I det neste vinduet, Rutenettsting: Rutenett: rad-for-rad, Høyre & Ned, sett inn antall fliser i x- og y-retninger. For 10x-målet som brukes her, velger du 2 som rutenettstørrelse x, 3 som rutenettstørrelse y og 0 når flisen overlapper hverandre.
- Klikk Bla gjennom , og velg mappen som inneholder TIFF-bildene som skal syes sammen.
- Sett inn det vanlige filnavnet under Filnavn for fliser ved hjelp av {i} ved plasseringen av flisnummeret i hvert filnavn.
- Løsne alle boksene nedenfor.
- Kjør plugin-modulen.
- Lagre de resulterende bildene som TIFF-filer for analyse i neste trinn.
5. Automatisert inkluderingstelling ved hjelp av CellProfiler22
- Last ned og installer programvaren for bildeanalyse med åpen kildekode, CellProfiler23. Last ned inkluderingscounting.cpproj-datasamlebåndet fra github.com/sinnigelab/aggregate-quantification.
- Åpne CellProfiler, og dra rørledningen til vinduet Slipp en pipelinefil her. Klikk Ja for å laste inn prosjektet.
- Klikk på Bilder inndatamodulen og dra de sydde bildene inn i vinduet Slipp filer og mappe her.
- Klikk på metadatainngangsmodulen . Juster Regulært uttrykk for å trekke ut fra filnavnet i henhold til navnene på de sydde bildene.
- Klikk inndatamodulen NamesandTypes , og juster Velg regelkriteriene slik at de samsvarer med kanalene i filnavnene.
MERK: I standardinnstillingene for rørledningen gjenkjennes filnavn som inneholder BF som brightfield-bilder og heter Worms. Filnavn som inneholder YFP gjenkjennes som fluorescensbilder og kalles Fluorescence. - Klikk på Vis utdatainnstillinger for å velge en standardmappe for å lagre utdataene fra CellProfiler.
- Klikk starttestmodus for å kontrollere innstillingene for datasamlebåndet ved hjelp av det første bildedatasettet. Klikk på Kjør for å gå gjennom alle modulene i rørledningen eller Trinn for å løpe gjennom rørledningen en modul om gangen. Hvis du vil justere ormeomrisset i EditObjectsManually-modulen , klikker du Hjelp for å se instruksjonene og klikker Ferdig for å fortsette å kjøre rørledningen.
MERK: De ekstraherte målingene eksporteres ikke i testmodus. Terningsparametrene for å oppdage ormer og inneslutninger må kanskje justeres basert på belastningene og forstørrelsen som brukes. - Klikk på Avslutt testmodus og analyser bilder.
- Åpne utdatamappen for å vise utdatafilene. Åpne bildene med det opprinnelige filnavnet etterfulgt av disposisjoner for å kontrollere om ormene og inkluderingene var riktig overlappet.
MERK: Antall inkluderinger per orm finner du i filen ExpandedWormObjects. Du finner mer informasjon om inndatabildene i filen Image. Du kan velge flere utdata i Modulen ExportToSpreadsheet i datasamlebåndet.
6. Global tilpasning av inkluderingstalldata ved hjelp av AmyloFit5
MERK: Dette trinnet kan bare utføres når data for flere proteinkonsentrasjoner er tilgjengelige. For Q40-YFP er det opprettet et sett med fire stammer med forskjellige nivåer av overekspression i kroppsveggmuskelcellene tidligere17. I andre tilfeller bør nye stammer genereres ved hjelp av plasmid mikroinjeksjon og genomisk integrasjon24.
- Gå til den gratis online tilpasningsplattformen for aggregeringskinetikk AmyloFit25. Registrer deg eller logg inn med en eksisterende konto.
MERK: Du får tilgang til en omfattende håndbok om hvordan du bruker AmyloFit for ytterligere hjelp. Se lenken øverst til venstre på nettsiden (etter innlogging) for mer informasjon. - For å begynne å bruke AmyloFit, gi prosjektet et navn og klikk på Opprett prosjekt. Åpne prosjektet ved å klikke på Åpne og opprette en økt ved å gi det et navn og klikke på Opprett og last inn økt.
- Klikk på Legg til data og last opp filen som inneholder gjennomsnittlig antall inkluderinger per dyr, etter dataformatkravene som vises i panelet til venstre. Klikk Last inn nye data.
- Hopp over forhåndsbehandlingstrinnene, som ikke kreves for inkluderingstalldata, ved å angi antall punkt som skal beregnes som gjennomsnitt over for nullpunktsforskyvning og antall punkt til gjennomsnittet over for platå til 0. Klikk Send. Gjenta dette trinnet for hver proteinkonsentrasjon (dvs. hver kolonne i den opplastede filen).
- Velg Egendefinert i modellpanelet, skriv inn Ncells*(1-exp(-Kcell*m**(n)*(t-1))) i formelboksen og klikk Last inn modell.
MERK: Ettersom AmyloFit opprinnelig ble designet for analyse av kinetiske data fra in vitro-analyser, må en skreddersydd modell lastes inn for å analysere inkluderingstalldataene til C. elegans. I ligningen som brukes her, er N-celler antall celler der inkluderingsdannelse finner sted, K-cellen er nukleasjonshastigheten konstant, m den intracellulære proteinkonsentrasjonen og n reaksjonsrekkefølgen for kjernedannelse. - Sett parametertypene til Global Const for N-celler, Global tilpasning for K-cellen og n og Const for m. Sett Verdien av N-celler til 95 for muskelceller i kroppsvegg og Første gjetning for K-cellen og n til 1. Angi verdiene for m for de forskjellige stammene i venstre panel.
MERK: Innledende gjetninger er ikke relevante for den relativt enkle modellen som brukes her. For mer komplekse modeller er det gunstig å legge inn et estimat av forventede verdier for å forkorte beregningstiden. - La antall bassenghopp være uendret, og klikk Tilpass i monteringspanelet.
- Pakk ut tilpasningen ved å klikke Last ned data og tilpass.
MERK: Parametrene som trekkes ut av modellens globale passform, vises nederst til høyre. En tegning av dataene og passformen genereres automatisk i panelet øverst til høyre. Dette plottet kan trekkes ut ved å klikke på Last ned pdf og tilpasset ved å gå til Vis plottalternativer. Kcelle har enheter av molekyler konsentrasjon-n tid-1 celle-1. For å sammenligne verdier med forskjellige n, kan K-cellen konverteres til nukleasjonshastigheten ved en gitt proteinkonsentrasjon ved å multiplisere den med mn.
Representative Results
Metoden beskrevet her (figur 1) ble brukt til å analysere aggregasjonskinetikken til en konstruksjon som består av 40 glutaminer smeltet sammen til YFP (Q40-YFP). Proteinet uttrykkes under kontroll av unc-54 promotoren, drivende uttrykk i kroppsveggen muskelceller. Siden disse er relativt store og enkle å visualisere, er bruken av et 10x mål tilstrekkelig til å løse inneslutningene dannet av Q40-YFP i dette vevet. Fire stammer (linje A-D) ble tidligere utviklet for å uttrykke proteinet i forskjellige grad for å vurdere konsentrasjonsavhengigheten til polyQ-aggregasjon in vivo17.
Alderssynkroniserte populasjoner av linjer A-D ble generert av en 2 timers egg-lay, etterfulgt av daglig overføring når avkomene nådde voksen alder. Fra dag 1 til dag 10 av voksen alder ble 20 dyr fra hver av de fire stammene avbildet i en 384-brønns plate, ved hjelp av et konfokalt mikroskop med høy gjennomstrømning. Bildene av brønnene ble anskaffet som 6 fliser, som ble sydd sammen ved hjelp av en plugin i ImageJ21 (figur 2). De sydde bildene ble deretter analysert ved hjelp av en skreddersydd CellProfiler22-rørledning (figur 3) for å kvantifisere gjennomsnittlig inkluderingsnummer per dyr for hver belastning og hvert tidspunkt.
Dataene ble deretter montert på en matematisk modell i AmyloFit5 (figur 4). Modellen er basert på antagelsen om at hver av de 95 kroppsveggmuskelcellene uavhengig får en inkludering av en hastighetsbegrensende kjernehendelse, etterfulgt av rask aggregert vekst17. Passformen ga en kjernefrekvenskonstant på 9,9 × 105 molekyler M-2,1 d-1 celle-1 og en reaksjonsrekkefølge på 2,1, tilsvarende en kjernehastighet på 0,38 molekyler d-1 celle-1 ved en intracellulær proteinkonsentrasjon på 1 mM. To uavhengige biologiske replikasjoner førte til nært tilsvarende verdier for kjernefrekvensen og reaksjonsrekkefølgen, som er i samsvar med en tidligere studie ved hjelp av en lignende protokoll17 (tabell 1).
Figur 1: Skjematisk oversikt over metoden. (A) Alderssynkroniserte C. eleganspopulasjoner genereres av en tidsbetimet egglegging. (B) Dyr fra samme populasjon er avbildet i en 384-brønnsplate på ulike tidspunkter. (C) Flisene er sydd sammen for å danne bilder av hele brønnene, som analyseres i CellProfiler for å kvantifisere inklusjonstallene per dyr. (D) Dataene er montert på en matematisk modell ved hjelp av AmyloFit. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjermbilder av sømprosedyren i ImageJ ved hjelp av plugin Grid / Collection stitching21. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Skjematisk for CellProfiler-rørledningen for å kvantifisere inkluderingsnumre. (A-C) Brightfield-bildet (A) brukes til å identifisere ormene (B, nærbilde i C). (D-G) Fluorescensbildet (D, nærbilde i E) brukes til å identifisere inneslutningene (F). Ormene og inkluderingene er relatert til å gi antall inneslutninger for hver orm i brønnen (G). Bildene som vises er av Q40 linje A dyr på dag 3 av voksen alder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Tilpasning av dataene til en matematisk modell i AmyloFit. (A) Data lastes opp til AmyloFit. (B) En egendefinert ligning legges inn i modellinkluderingsformasjonen, forutsatt uavhengige kjernehendelser i hver celle. (C) Montering av aggregasjonskinetikken for C. elegans linjer A-D som uttrykker forskjellige nivåer av Q40-YFP. Dataene er representative for to uavhengige biologiske repliker. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Datasett 1 | Datasett 2 | Sinnige et al.17 | |
| n | 2.1 | 1.9 | 1.6 |
| Kcelle (molekyler M-n d-1 celle-1) | 9,9 x 105 | 1,4 x 105 | 3,1 x 104 |
| Kjernehastighet ved 1 mM (molekyler d-1 celle-1) | 0.38 | 0.21 | 0.35 |
Tabell 1: Verdier for kjernefrekvensen og reaksjonsrekkefølgen for Q40-YFP-aggregering. Data for to uavhengige biologiske replikeringer av protokollen og sammenligning med tidligere publiserte data17.
Discussion
Metoden som presenteres her, letter en objektiv og kvantitativ analyse av proteinaggregeringskinetikk i modellorganismen C. elegans. Det avhenger av fire nøkkelelementer (figur 1): 1) opprettholde en alderssynkronisert populasjon av nematoder; 2) fluorescensmikroskopi i multiwell plater; 3) automatisert inkluderingstelling i CellProfiler; 4) datatilpasning i AmyloFit. Sammenlignet med manuell telling av inneslutninger hos fritt bevegelige dyr eller fra lagrede bilder26, er kvantifisering i CellProfiler både raskere og mer objektivt. Den andre viktige utviklingen av protokollen er innsamling av kinetiske data, i stedet for enkelttidspunkter, som gir kvantitativ innsikt i aggregeringsmekanismen når dataene tilpasses en matematisk modell.
De fire elementene i protokollen kan brukes som uavhengige moduler som kan endres avhengig av programmet. Alderssynkroniserte populasjoner kan også opprettholdes ved hjelp av 5-fluoro-2′-deoksyuridin (FUDR) for å sterilisere dyrene. Denne forbindelsen påvirker levetiden og proteostase24,25 og er svært kreftfremkallende for eksperimentet; Det utelukker imidlertid manuell overføring av ormene, noe som kan være arbeidskrevende når store tall håndteres. Andre alternativer er bruk av sterile mutanter29 eller filtreringsenheter for å skille avkom30.
Fluorescensmikroskopitrinnet kan også justeres, for eksempel ved hjelp av høyere forstørrelser for å overvåke proteinaggregering hos nevroner. Widefield mikroskopi kan være tilstrekkelig til å overvåke polyQ aggregering i muskelceller når den relative forskjellen mellom forholdene er viktigere enn absolutt antall inneslutninger. CellProfiler-rørledningen kan fortsatt brukes i disse tilfellene, selv om innstillingene for å gjenkjenne ormer og inkluderinger må justeres av brukeren. Gjennomstrømningen av teknikken er for tiden begrenset av behovet for manuell plukking av dyrene i 384-brønnsplaten. Dette kan potensielt løses ved bruk av mikrofluidiske enheter16. Natriumazid er et relativt hardt bedøvelsesmiddel, som kan erstattes av fysisk immobilisering med hydrogeler eller perler28,29.
Analysen i AmyloFit presentert her er basert på en aggregasjonsmekanisme som består av uavhengige kjernehendelser i individuelle celler. I tilfeller der denne modellen ikke passer, bør brukeren vurdere et alternativ som samarbeids aggregeringsmodellen utviklet tidligere17. En begrensning av denne tilnærmingen er at stammer som uttrykker proteinet av interesse ved forskjellige konsentrasjoner, må være tilgjengelige, selv om disse kan genereres ved hjelp av rutinemessige C. elegans-metoder 24.
Til sammen gir denne protokollen midler til å skaffe data av høy kvalitet for proteinaggregeringskinetikk i et in vivo-modellsystem , noe som muliggjør detaljert analyse av aggregasjonsmekanismer17. Selv om metoden ble demonstrert for polyQ aggregering i C. elegans muskelvev, fremtidige anvendelser av protokollen kan omfatte andre proteiner og vev og effekten av proteostase faktorer og små molekyler.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Morimoto lab for C. elegans stammer og Esmeralda Bosman for hjelp på high-throughput confocal mikroskop. Dette arbeidet ble finansiert av et oppstartsstipend fra Utrecht University til T.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384-well plate | Greiner | 781091 | Black with flat clear bottom |
| AmyloFit | Knowles lab | v2.0 | Access at www.amylofit.ch.cam.ac.uk |
| C. elegans Q40 line A | Morimoto lab | AM1228 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
| C. elegans Q40 line B | Morimoto lab | AM1229 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
| C. elegans Q40 line C | Morimoto lab | AM1230 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
| C. elegans Q40 line D | Morimoto lab | AM1231 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
| CellProfiler | Broad Institute | 4.1.3 | Downloaded from https://cellprofiler.org |
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
| FIJI | Open-source | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| High-throughput confocal microscope | Yokogawa | CellVoyager CV7000S | |
| M9 buffer | Home-made | 3 g/L KH2PO4, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 1 mM MgSO4 | |
| NGM plates | Home-made | 17 g/L agar, 2.5 g/L bacto-peptone, 3 g/L NaCl, 25 mM KPO4 buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 5 mg/L cholesterol | |
| Pasteur pipette | WU Mainz | 250 | To make worm pick, 150 mm length |
| Platinum iridium wire | Alfa Aesar | 39383 | To make worm pick, 0.25 mm diameter |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9 |
References
- Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (6), 384-396 (2014).
- Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, amyloid formation, and human disease: a summary of progress over the last decade. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 27-68 (2017).
- Knowles, T. P. J., et al. An analytical solution to the kinetics of breakable filament assembly. Science. 326 (5959), 1533-1537 (2009).
- Cohen, S. I. A., et al. Proliferation of amyloid-β42 aggregates occurs through a secondary nucleation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9758-9763 (2013).
- Meisl, G., et al. Molecular mechanisms of protein aggregation from global fitting of kinetic models. Nature Protocols. 11 (2), 252-272 (2016).
- Satyal, S. H., et al. Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5750-5755 (2000).
- Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
- Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
- Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).
- Prahlad, V., Morimoto, R. I. Neuronal circuitry regulates the response of Caenorhabditis elegans to misfolded proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14204-14209 (2011).
- Nollen, E. A. A. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).
- Silva, M. C., et al. A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network. PLoS Genetics. 7 (12), 1002438 (2011).
- Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9, 1-16 (2014).
- Calamini, B., et al. Small-molecule proteostasis regulators for protein conformational diseases. Nature Chemical Biology. 8 (2), 185-196 (2012).
- Sinnige, T., Stroobants, K., Dobson, C. M., Vendruscolo, M. Biophysical studies of protein misfolding and aggregation in in vivo models of Alzheimer's and Parkinson's diseases. Quarterly Reviews of Biophysics. 49, 22 (2020).
- Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nature Communications. 7, 13023 (2016).
- Sinnige, T., et al. Kinetic analysis reveals that independent nucleation events determine the progression of polyglutamine aggregation in C. elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 202188118 (2021).
- Brenner, S. Caenorhabditis elegans. Methods. 77 (1), 71-94 (1974).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- FIJI/ImageJ. , Available from: https://imagej.net/downloads (2012).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis. BioTechniques. 42 (1), 71-75 (2007).
- CellProfiler. Broad Institute. , Available from: https://cellprofiler.org/releases (2021).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).
- Knowles group, University of Cambridge. , Available from: https://amylofit.com/amylofitmain/login/ (2021).
- Lazaro-Pena, M. I., Cornwell, A. B., Samuelson, A. V. Quantifying tissue-specific proteostatic decline in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (175), (2021).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), 85964 (2014).
- Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing and Development. 141-142, 1-4 (2014).
- David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans. PLoS Biology. 8 (8), 47-48 (2010).
- Hunter, S., Maulik, M., Scerbak, C., Vayndorf, E., Taylor, B. E. Caenorhabditis sieve: A low-tech instrument and methodology for sorting small multicellular organisms. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), (2018).
- Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours. Communications Biology. 1, 73 (2018).
- Dong, L., et al. Reversible and long-term immobilization in a hydrogel-microbead matrix for high-resolution imaging of Caenorhabditis elegans and other small organisms. PLoS One. 13 (3), 0193989 (2018).
