כאן מתוארות שיטות לא פולשניות ללוקליזציה של חלבוני קרום פוטורצפטור ולהערכת ניוון הרשתית בעין המורכבת דרוזופילה באמצעות פלואורסצנציה eGFP.
סחר בחלבון ממברנה מווסת את השילוב וההסרה של קולטנים ותעלות יונים בקרום הפלזמה. תהליך זה חשוב ביסודו לתפקוד התא ולשלמות התאים של תאי העצב. תאי דרוזופילה פוטורצפטורים הפכו למודל לחקר סחר בחלבון ממברנה. מלבד רודופסין, אשר עם ההארה מופנם מממברנת הפוטורצפטור ומתפרק, תעלת היונים דמוית פוטנציאל הקולטן הארעי (TRPL) בדרוזופילה מציגה טרנסלוקציה תלוית אור בין קרום הפוטורצפטור הרבדומרלי (שם הוא ממוקם בחושך) לבין גוף התא הפוטורצפטור (שאליו הוא מועבר עם ההארה). ניתן לחקור את ההובלה התוך-תאית הזו של TRPL בצורה פשוטה ולא פולשנית על ידי ביטוי TRPL המתויג על ידי eGFP בתאים פוטורצפטורים. לאחר מכן ניתן לראות את הפלואורסצנציה eGFP בפסאודו-פופיל העמוק או על ידי מיקרוסקופיה של טבילת מים. שיטות אלה מאפשרות זיהוי של פלואורסצנציה בעין שלמה ולכן הן שימושיות לבדיקות בתפוקה גבוהה ולמסכים גנטיים עבור מוטציות דרוזופילה הפגומות בטרנסלוקציה של TRPL. כאן, הכנת זבובים, הטכניקות המיקרוסקופיות, כמו גם שיטות כימות המשמשות לחקר טרנסלוקציה המופעלת על ידי אור זה של TRPL מוסברים בפירוט. שיטות אלה יכולות להיות מיושמות גם עבור מחקרי סחר בבני אדם על חלבונים אחרים של Drosophila photoreceptor, למשל, רודופסין. בנוסף, על ידי שימוש בחלבונים rhabdomeral המתויגים על ידי eGFP, ניתן להשתמש בשיטות אלה כדי להעריך את התנוונותם של תאים פוטורצפטורים.
על ידי אספקה והסרה של חלבונים אל קרום הפלזמה וממנו, סחר בחלבון ממברנה בתאי עצב שולט בציוד קרום הפלזמה באמצעות קולטנים כמו גם תעלות יונים, וכתוצאה מכך מווסת את תפקוד העצבים. לרגולציה שגויה או פגמים בסחר בחלבונים יש בדרך כלל השפעות מזיקות על התאים וגורמות לניוון עצבי. בבני אדם, זה עלול לגרום למחלות נוירודגנרטיביות כגון מחלת אלצהיימר ופרקינסון או רטיניטיס פיגמנטוזה1. פוטורצפטורים בעין המורכבת של Drosophila melanogaster הפכו למערכת מודל in vivo לחקר סחר בחלבון ממברנה2. זה לא רק בגלל הרבגוניות הגנטית של Drosophila המאפשרת מסכים גנטיים יעילים, אלא גם משום שכל המרכיבים החיוניים של קרום הפוטורצפטור סופג האור מאופיינים בפירוט רב וטכניקות מיקרוסקופיות יעילות זמינות שניתן ליישם על עין הזבוב. טכניקות אלה הן המוקד של מאמר זה.
בתאי דרוזופילה פוטורצפטורים, קרום הפלזמה האפית יוצר ערימה צפופה של מיקרוווילי לאורך צד אחד של התא, המכונה rhabdomere. הרבדומרים של תאי הפוטורצפטור R1-6 מסודרים בתבנית טרפזית אופיינית בעוד שתאי הפוטורצפטור R7 ו-R8 יוצרים רבדומר יחיד במרכז הטרפז3. יש צורך בסחר בחלבוני ממברנה לצורך תחלופה מוסדרת של חלבוני ממברנה רבדומרליים כגון רודופסין וה-TRP המופעל באור (פוטנציאל קולטן חולף) ותעלות יונים TRPL (דמויות TRP) כדי להבטיח את הכמות הנכונה של חלבוני פוטו-טרנסדוקציה אלה ברבדומר. חלבוני קרום פוטורצפטור מסונתזים ברשתית האנדופלסמית ומועברים דרך מנגנון גולג’י לרבדומר. לאחר הפעלת רודופסין על ידי אור, מולקולת רודופסין יכולה להיות מושתקת על ידי ספיגה של פוטון שני או להיות מוסרת מהרבדומר על ידי אנדוציטוזה בתיווך קלתרין. רודופסין אנדוציטוסי מתפרק בליזוזום או ממוחזר בחזרה לרבדומר 4,5. תעלת היונים TRPL מופנמת גם לאחר הפעלת מפל הפוטו-טרנסדוקציה ועוברת טרנסלוקציה תלוית אור בין הרבדומאר (שם הוא ממוקם כאשר זבובים מוחזקים בחושך) לבין תא אחסון מועשר ב-ER בגוף התא (שאליו הוא מועבר תוך מספר שעות עם ההארה)6,7,8,9,10 . בניגוד לרודופסין אנדוציטוסיטוס, רק כמויות קטנות של TRPL מתפרקות דרך המסלול האנדוליזוזומלי, והרוב מאוחסן במקום זאת תוך-תאי וממוחזר בחזרה לרהבדומר עם הסתגלות כהה6. לפיכך, TRPL יכול לשמש לניתוח סחר המופעל על ידי אור של חלבוני ממברנת פלזמה. תאים פוטורצפטורים של דרוזופילה משמשים גם לחקר ניוון עצבי. ניוון תאי פוטורצפטור נקבע לעתים קרובות על ידי הערכת המבנה של rhabdomeres, אשר מתפרקים כתוצאה מתהליכים ניווניים5.
על מנת לחקור את הלוקליזציה התת-תאית של TRPL ורודופסין בתאי פוטורצפטור או בניוון תאי פוטורצפטור, יושמו כאן שתי שיטות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות הנבדלות זו מזו ביחס למהירות הניתוח ולרזולוציה. שיטה מהירה מאוד, לא פולשנית, שיכולה לשמש למסכים גנטיים אך עם רזולוציה מרחבית מוגבלת היא זיהוי של פלואורסצנציה בפסאודו-פופיל עמוק (DPP). ה- DPP הוא תופעה אופטית של עיניים מורכבות פרוקי רגליים שמקורן הגיאומטרי הוסבר בפירוט על ידי פרנצ’סקיני וקירשפלד בשנת 197111. בקיצור, בכמה מישורים אופטיים מתחת לכיסוי הרשתית ניתן לראות תמונות-על של rhabdomeres מאומטידיה סמוכה. במישור מוקד דרך מרכז עקמומיות העין, הקרנות על-גביות אלה יוצרות תמונה המזכירה את הפריסה הטרפזית של הרבדומרים באומטידיום יחיד רק בסדרי גודל גדולים יותר. תופעה זו יכולה גם להיות נצפית ללא תלות בביטוי אקסוגני של חלבונים פלואורסצנטיים (למשל TRPL::eGFP8), אשר בכל זאת הופכים את ה-DPP לקל יותר לזיהוי (איור 1A-A”)12. שיטה לא פולשנית שנייה היא מיקרוסקופיית טבילה במים המסתמכת על הדמיה של חלבונים המתויגים באופן פלואורסצנטי לאחר נטרול אופטי של המנגנון הדיופטרי של העיניים באמצעות מים (איור 1B-C”)12. באמצעות שיטת טבילת המים, ניתן להעריך באופן כמותי את הכמות היחסית של TRPL::eGFP ברבדומרים או בגוף התא עבור תאים פוטורצפטורים בודדים. יתר על כן, ניתן להשתמש בחלבונים שאינם מתויגים בפלואורסצנציה כדי להעריך את שלמות הרבדומרל ולקבוע את מהלך הזמן של התנוונות פוטנציאלית באופן כמותי, כפי שמתואר כאן.
בעוד שהקלטות של ה-DPP הן ללא ספק הקלות והמהירות ביותר מבין השיטות הללו לביצוע, הרזולוציה המרחבית של הנתונים שהן מייצרות מוגבלת. בנוסף, ישנן סיבות רבות מדוע DPP עשוי להיות נעדר, אשר אינם בהכרח ניתן להבחין על ידי הדמיית DPP עצמה. מכיוון שה- DPP מייצג סיכום של מספר אומטידיה, מידע על תאים בודדים הולך לאיבוד. לפיכך, הדמיית DPP ברזולוציה נמוכה משרתת תפקיד חשוב בסינון מספר רב של זבובים, אך בדרך כלל יש לעקוב אחריה הקלטות ברזולוציה גבוהה יותר בדרך של מיקרוסקופיה של טבילה במים. מיקרוגרפים של טבילה במים מאפשרים פרשנויות על תאים בודדים, פגמים התפתחותיים, מורפולוגיה של העיניים, אי-סלוקליזציה של חלבונים או ניוון רשתית, כמו גם כימות של השפעות אלה. פרוטוקול זה מתאר את שתי הטכניקות הללו בפירוט.
איור 1: סקירה כללית של וריאציות מיקרוסקופיה עבור עין הדרוזופילה המוצגות בפרוטוקול זה. ייצוגים סכמטיים ומיקרוגרפים למופת של הדמיית פסאודו-פופיל עמוק (DPP) פלואורסצנטית (A-A”), מיקרוסקופיית טבילת מים קטלנית (B-B”) של רבדומרים פלואורסצנטיים, ו-(C-C”) מיקרוסקופיית טיפת מים לא קטלנית של רהבדומרים פלואורסצנטיים. סרגל קנה מידה (A”): 100 מיקרומטר. סרגלי קנה מידה (B”–C”): 10 מיקרומטר. הנתון שונה מהפניה13. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
הישימות של חלבונים פלואורסצנטיים ופשטות ההקרנה על ידי הדמיית DPP ומיקרוסקופיה של טבילת מים ברשתית הוכחו כמוצלחות על ידי קבוצות רבות12. אסטרטגיות דומות לאלה שהוצגו כאן שימשו במספר בדיקות גנטיות כדי לזהות פגמים ברמות ביטוי רודופסין, הומאוסטזיס, ארגון רשתית או שלמות תאית בעזרת Rh1…
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות לחוקרים הסטודנטים שלנו לאורך השנים. בפרט, נינה מאייר, סיביל מאייר, ג’וליאן קאים ולורה ג’אגי, שנתוניהם שימשו בפרוטוקול זה כתוצאות מייצגות. המחקר של הקבוצה שלנו שהוצגה כאן מומן על ידי מענקים מ- Deutsche Forschungsgemeinschaft (Hu 839/2-4, Hu 839/7-1) לארמין הובר.
15 mL centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
CO2 anaesthesia fly pad | Flystuff | 59-172 | |
Cold light lamp (KL 1500 LCD) | Zeiss | ||
Fiji/ImageJ | NIH | ||
Fluorescence microscope with UV lamp, camera, filter set and software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition) | Zeiss | ||
Fluorescent tube (Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13) [1750 Lux, Ee470nm = 298 µW cm-2, Ee590nm = 215 µW cm-2] and [760 Lux, Ee470nm = 173 µW cm-2, Ee590nm = 147 µW cm-2] |
Osram | 4050300518039 | |
Laboratory pipette (20-200 µL) | Eppendorf | ||
Object slide | Roth | 0656.1 | |
Petri dish (94 mm) | Greiner Bio-One | 633102 | |
Pipette tips (200 µL) | Labsolute | 7695844 | |
Plasticine (Blu-Tack) | Bostik | 30811745 | |
Stereo microscope (SMZ445) | Nikon | ||
Stereo microscope with UV lamp, camera, filer set and software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12) | Leica |