Summary
קצב צריכת חמצן (OCR) הוא פרוקסי נפוץ לתפקוד המיטוכונדריה וניתן להשתמש בו כדי לחקור מודלים שונים של מחלות. פיתחנו שיטה חדשה באמצעות מנתח XF של סוסון ים כדי למדוד ישירות את ה-OCR בפרוסות סטריאליות חריפות מעכברים בוגרים, שהיא רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית משיטות אחרות.
Abstract
המיטוכונדריה ממלאת תפקיד חשוב בייצור ATP תאי, בוויסות מיני חמצן תגובתי ובקרת ריכוז Ca2+ . תפקוד לקוי של המיטוכונדריה היה מעורב בפתוגנזה של מחלות נוירודגנרטיביות מרובות, כולל מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון ומחלת אלצהיימר. כדי לחקור את תפקידה של המיטוכונדריה במודלים של מחלות אלה, אנו יכולים למדוד את הנשימה המיטוכונדרית באמצעות קצב צריכת חמצן (OCR) כמייצג לתפקוד המיטוכונדריה. זיהוי תווים אופטי (OCR) כבר נמדד בהצלחה בתרביות תאים, כמו גם במיטוכונדריה מבודדת. עם זאת, טכניקות אלה רלוונטיות פחות מבחינה פיזיולוגית ממדידת זיהוי תווים אופטי (OCR) בפרוסות מוח חריפות. כדי להתגבר על מגבלה זו, המחברים פיתחו שיטה חדשה באמצעות מנתח XF של סוסון ים כדי למדוד ישירות את ה-OCR בפרוסות סטריאליות חריפות מעכברים בוגרים. הטכניקה מותאמת תוך התמקדות בסטריאטום, אזור במוח המעורב בפרקינסון ובמחלת הנטינגטון. המנתח מבצע בדיקת תאים חיים באמצעות לוחית של 24 בארות, המאפשרת מדידה קינטית סימולטנית של 24 דגימות. השיטה משתמשת בפיסות מנוקבות עגולות של פרוסות מוח סטריאליות כדגימות. אנו מדגימים את היעילות של טכניקה זו על ידי זיהוי OCR בסיסי נמוך יותר בפרוסות סטריאליות של מודל עכבר של PD. שיטה זו תעניין חוקרים העוסקים בתחום מחלת הפרקינסון והמחלת הנטינגטון.
Introduction
תפקוד לקוי של המיטוכונדריה היה מעורב במספר מחלות נוירולוגיות, כולל מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון ומחלת אלצהיימר 1,2,3. דגמי PD כגון עכברי נוקאאוט PINK1 (KO) וחולדות מציגים תפקוד מיטוכונדריאלי לקוי 4,5,6,7,8,9,10,11. מיטוכונדריה מבודדת מהסטריאטום (STR) או המוח השלם של עכבר PINK1 KO הזקן מפגינה פגמים בקומפלקס I 7,10,12,13. מדידה ישירה של קצב צריכת החמצן (OCR) היא אחת השיטות הנפוצות ביותר להערכת תפקוד המיטוכונדריה מכיוון ש-OCR משולב עם ייצור ATP, הפונקציה העיקרית של המיטוכונדריה14. לכן, מדידת זיהוי תווים אופטי (OCR) במודלים של מחלות או בדגימות/רקמות שמקורן בחולה יכולה לסייע בחקר האופן שבו תפקוד לקוי של המיטוכונדריה מוביל למחלות.
נכון לעכשיו, ישנן מספר דרכים למדוד OCR מיטוכונדריאלי, כולל אלקטרודת קלארק ואלקטרודות O2 אחרות, צבע פלואורסצנטי O2, ומנתח השטף החוץ-תאי 15,16,17,18,19. כיתרון, שיטות מבוססות אלקטרודות O2 מאפשרות להוסיף בקלות מצעים שונים. עם זאת, הם אינם מספיקים למדידה בו זמנית של מספר דגימות. בהשוואה לשיטות מסורתיות המבוססות על אלקטרודות O2, מנתח השטף החוץ-תאי, כלי נפוץ ל-OCR בתרביות תאים או מיטוכונדריה מטוהרת, מציע תפוקה משופרתשל 15,18,20. עם זאת, כל השיטות הללו מיושמות בדרך כלל למדידת זיהוי תווים אופטי (OCR) במיטוכונדריה מבודדת או בתרביות תאים 6,16,17,19,20,21. הבידוד של המיטוכונדריה גורם לנזק לא מכוון, ומיטוכונדריה מופקת או תרביות תאים פחות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית מאשר פרוסות מוח שלמות22. גם כאשר משתמשים במיקרו-אלקטרוניקה בפרוסות, הן פחות רגישות וקשות יותר לתפעול מאשר בתאים בתרבית23.
כדי לעמוד באתגרים אלה, פיתחנו שיטה באמצעות מנתח השטף החוץ-תאי XF24, המאפשרת ניתוח של פרמטרים מטבוליים מרובים מפרוסות מוח סטריאליות חריפות של עכברים24. טכניקה זו מספקת כימות ישיר רציף של נשימה מיטוכונדריאלית באמצעות OCR. בקצרה, חלקים קטנים של פרוסות מוח סטריאליות מוכנסים לבארות של צלחת האי, והמנתח משתמש בביו-סנסורים מבוססי חמצן ופרוטונים פלואורסצנטיים כדי למדוד את ה-OCR ואת קצב ההחמצה החוץ-תאית, בהתאמה 17,21,25.
אחד המאפיינים הייחודיים של המנתח הוא ארבע בארות ההזרקה, המאפשרות את המשך המדידה של זיהוי תווים אופטי (OCR) תוך הזרקה רציפה של עד ארבע תרכובות או ריאגנטים; זה מאפשר מדידה של מספר פרמטרים של נשימה תאית, כגון OCR מיטוכונדריאלי בסיסי, OCR המקושר ל-ATP ו-OCR מיטוכונדריאלי מקסימלי. התרכובות שהוזרקו במהלך המדידות עבור הפרוטוקול המוצג כאן היו ריכוזי עבודה של 10 mM pyruvate בבאר התמיסה הראשונה (יציאה A), 20 μM אוליגומיצין בבאר התמיסה השנייה (יציאה B), 10 μM קרבוניל ציאניד 4-(trifluoromethoxy) פניל-הידרזון (FCCP) בבאר השלישית (יציאה C), ו-20 μM אנטימיצין A בבאר הרביעית (יציאה D), מבוסס על פריד ואח' 25. יש לציין כי ריכוזים אלה היו ריכוזי עבודה, ותמיסות מלאי של 10x, 11x, 12x ו- 13x הוזרקו ליציאות התמיסה A עד D, בהתאמה. מטרת השימוש בכל פתרון הייתה כדלקמן: 1) פירובט היה נחוץ שכן, בלעדיו, הוספת FCCP תהיה תגובת OCR מופחתת הנגרמת על ידי הגבלה של מצעים זמינים; 2) אוליגומיצין מעכב ATP סינתאז ומאפשר מדידה של נשימה מקושרת ATP; 3) FCCP משחרר את החמצון מזרחון ומאפשר מדידה של קיבולת מיטוכונדריאלית מקסימלית; 4) אנטימיצין A מעכב קומפלקס III בשרשרת הובלת האלקטרונים, ולכן מאפשר מדידה של OCR שאינו קשור למיטוכונדריה.
ריכוז האוליגומיצין שבו נעשה שימוש נקבע על סמך הסיבות הבאות: 1) המינון המומלץ של אוליגומיצין עבור רוב סוגי התאים (מיטוכונדריה מבודדת או תרביות תאים) הוא 1.5 מיקרומטר. מניסיון, בדרך כלל פי 3-10 ממינון התאים המנותקים משמש לניסויים בפרוסה מכיוון שייתכן שיש שיפוע, והחדירה של התמיסה לפרוסות לוקחת זמן. לכן, הריכוז צריך להיות בטווח של 5 μM עד 25 μM. 2) ריכוז 20 μM נבחר על סמך Fried et al.25. ריכוזים גבוהים יותר לא נוסו בשל הרעילות הלא ספציפית של אוליגומיצין. 3) בדו"ח של Underwood et al.26, החוקרים ערכו ניסוי טיטרציה עבור אוליגומיצין ומצאו כי מינונים של 6.25, 12.5, 25 ו-50 מיקרוגרם/מ"ל גרמו לעיכוב דומה. הריכוז הגבוה יותר של אוליגומיצין (50 מיקרוגרם/מ"ל) לא עיכב יותר, אך הייתה לו שונות גדולה יותר. 4) בתצפית שלנו, נראה שהגורם הקובע הוא היכולת החודרת של אוליגומיצין. קשה לאוליגומיצין לחדור לרקמה, ולכן לוקח לפחות 7 עד 8 מחזורים להגיע למישור, התגובה המקסימלית. כל עוד הוא מגיע למישור, מניחים שהעיכוב הוא מקסימלי.
אתגר טכני מרכזי בהתאמת מנתח השטף החוץ-תאי למדידת זיהוי תווים אופטי (OCR) בפרוסות סטריאליות הוא למנוע היפוקסיה של רקמות. מכיוון שהמאגר לא היה מחומצן במשך כל משך המדידות (כ-4 שעות), היפוקסיה הייתה בעיה מרכזית. זה נכון במיוחד עבור דגימות רקמה עבות יותר, שבהן חמצן לא יכול להתפזר לאורך הדגימות. כדי להתגבר על בעיה זו, פרוסות נחתכו בעובי של 150 מיקרומטר, כך שחמצן הסביבה יכול היה לחדור לאמצע פרוסות המוח. בנוסף, נוספו 4 מ"ג/מ"ל אלבומין בסרום בקר (BSA) למאגר הנוזלים השדרתיים המלאכותיים (ACSF) שהתחמצן מראש, מה שאיפשר את קביעתו של זיהוי תווים אופטי (OCR) מקסימלי, כפי שהוצע בעבר23. בדקנו אם התאים חיים. ראשית, Hoechst 33258 (10 μM) ו- propidium iodide (10 μM) שימשו כדי לבחון אם התאים היו בריאים בתנאים אלה. לאחר מכן בחנו אם נוירונים קוצניים בינוניים היו בריאים מבחינה תפקודית באמצעות רישום מהדק טלאי. הערכנו עוד אם מסופי דופמין (DA) בפרוסות הסטריאטליות היו בריאים מבחינה תפקודית על ידי מדידת שחרור DA באמצעות וולטמטריה בסריקה מהירה. התוצאות הראו כי פרוסות סטריאליות שלא היו מחומצנות (קבוצת ACSF/BSA) היו בריאות כמו קבוצת הביקורת המחומצנת24.
לאחר מכן בדקנו שילובים שונים של עובי פרוסה וגודל האגרוף כדי לקבוע את תנאי הפרוסה הסטריאלית האופטימליים למבחן הנשימה של השטף. פרוסות סטריאליות דורסליות בעוביים שונים (150 מיקרומטר ו-200 מיקרומטר) וגדלי אגרוף (1.0 מ"מ, 1.5 מ"מ וקוטר 2.0 מ"מ) שימשו לניתוח OCR באמצעות המנתח. פרוסות סטריאטליות בעובי של 150 מיקרומטר עם גודל אגרוף של 1.5 מ"מ קוטר היו בעלות יעילות הצימוד הגבוהה ביותר ו- OCRs בטווח אופטימלי עבור המנתח24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים, כולל עבודה בבעלי חיים, נערכו על פי הנחיות לאומיות ובינלאומיות ואושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת תומאס ג'פרסון. נעשה שימוש בעכברי FVB/NTac זכרים בגיל 3 עד 14 חודשים. הצעדים הבאים בוצעו בסביבה לא סטרילית, אך יש להיזהר כדי לשמור על הכל נקי ככל האפשר.
הערה: השיטה המוצגת כאן הוקמה ונעשה בה שימוש במחקר שדווח על ידי Zhi et al.24. הניסויים המתוארים כאן השתמשו בניתוח שטף חוץ-תאי של סוסון ים XF24 (ראו טבלת חומרים). ניתן להתאים שיטות אלה עבור מנתח XFe24, וכמה תוצאות אושרו באמצעות מנתח זה.
1. הידרציה של חיישני מחסניות (יום אחד לפני הבדיקה)
- פתח את ערכת בדיקת השטף החוץ-תאי (ראה טבלת חומרים) והסר הן את מחסנית החיישן (ירוקה) והן את לוחית השירות (ברורה; איור 1A). הניחו את מחסנית החיישן בצד (חיישנים למעלה) ואל תיגעו בחיישנים.
- הוסף 600 μL של תמיסת calibrant (pH 7.4) לכל באר של לוח השירות. הניחו את מחסנית החיישן על גבי לוחית השירות והטביעו את החיישנים בתמיסת הקליברנט. ודא שהחריץ המשולש של לוחית כלי השירות ולוחית מחסנית החיישן מיושרים כהלכה (איור 1B).
- אטמו את ערכת בדיקת השטף החוץ-תאי עם סרט איטום כדי למנוע אידוי של תמיסת הקליפרנט, ולאחר מכן הניחו אותה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ללא תוספת של CO2 או חמצן במהלך הלילה.
2. מכינים את צלחת הרקמות (ביום הבדיקה)
- פתחו את המיקרו-פלטה ללכידת האיים והוציאו את צלחת האיון לישיבת רקמות.
- יש לחמם נפח מתאים (625 μL לבאר) של נוזל מוחי מלאכותי מעובד שעבר חיטוי מראש (ACSF, הרכב של 140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2.4 mM CaCl2, 1.3 mM MgSO4, 0.3 mM KH2PO4, 25 mM גלוקוז, 10 mM HEPES, pH 7.2) חיץ עד 37 °C בצינור 50 מ"ל. לאחר מכן הוסיפו BSA לריכוז סופי של 4 מ"ג/מ"ל כדי להכין את מאגר הנשימה. באופן כללי, 50 מ"ל מספיק לצלחת אחת.
- הוסיפו 625 μL של מאגר נשימה (חיץ ACSF מחומצן מראש עם 25 מ"מ גלוקוז ו-4 מ"ג/מ"ל BSA) לכל באר של צלחת האיון בזהירות והימנעו מניעור הצלחת. ודא שאין טיפות שיוריות על גבי מחסנית החיישן ולא קיימות בועות אוויר במאגר של כל באר.
3. הכנת פרוסות סטריאליות חריפות ומיקום פרוסה נכרת
- ערפו את העכבר לאחר נקע צוואר הרחם ומיד נתחו את המוח ב-10 מ"ל של תמיסת חיתוך טרום-מחומצנת של קר כקרח (125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 3.7 mM MgSO4, 0.3 mM KH2PO4, 10 mM גלוקוז, pH 7.4).
- חתך פרוסות סטריאליות קורונליות עם ויברטום בהתאם להוראת היצרן (ראו טבלת חומרים) בעובי של 150 מיקרומטר בתמיסת חיתוך קרה כקרח ומחומצנת מראש.
- שחזרו את הפרוסות ב-50 מ"ל של ACSF מחומצן (125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2.4 mM CaCl2, 1.3 mM MgSO4, 0.3 mM KH2PO4, 10 mM גלוקוז, 2 mM HEPES, pH 7.4) ושמרו בתמיסה עד 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- לאחר ההתאוששות, מעבירים את הפרוסות לצלחת פטרי בגודל 35 מ"מ x 10 מ"מ עם 5 מ"ל של חיץ נשימה.
- השתמשו בביופסיה מפלדת אל-חלד (למשל, קוטר 1.5 מ"מ) כדי ליצור פיסת רקמה עגולה באזור הרצוי של המוח הפרוס. שמור את הפרוסה במאגר תוך כדי לחיצה עדינה כלפי מטה עם האגרוף. וודאו שהאגרוף נדחף חזק מספיק כלפי מטה כדי לחתוך את הרקמה. הסר את שאר הרקמה, הרם את האגרוף והסר את פיסת הרקמה העגולה לתוך המאגר.
- חותכים את הקצה של קצה פיפטה של 1 מ"ל כדי ליצור חור בקוטר 1.5-2.0 מ"מ ולהשתמש בו כדי להחזיק ולהעביר את הפרוסה המנוקבת לחלק העליון של מסך הלכידה. ינקו חתיכה אחת של רקמת מוח מנוקבת והניחו בזהירות את הרקמה על צד הרשת של מסך הלכידה (איור 2A). מסך הלכידה יהיה חתיכת פלסטיק עגולה עם הרשת המחוברת לצד אחד.
הערה: מסכי הלכידה כלולים בחבילת המיקרו-פלטות (ראה טבלת חומרים) והם דומים לאלה המשמשים ב- Schuh et al.23. - השתמשו בעדינות בטישו מנייר כדי לייבש את מסך הלכידה לזמן קצר. עם הסרת הלחות, הרקמה הופכת דביקה, מה שמאפשר לפרוסה להתחבר למרכז הרשת. אין לייבש את הפרוסה יותר מדי, אחרת היא תיפגע.
- החזיקו את פרוסת מסך הלכידה בצד עם פינצטה והניחו אותה באחת הבארות של צלחת האיים המדגרת (איור 2B). היזהרו לא להפיל את הפרוסה; אם כן, הוציאו את המסך והניחו עליו פרוסה חדשה.
הערה: אין למקם פרוסות מוח בשתי בארות תיקון הרקע (A1 ו- D6) בלוח האיי. - דגירה של צלחת האי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור למשך 30 דקות לפחות כדי לאפשר שיווי משקל טמפרטורה ו- pH לפני הפעלת הבדיקה.
4. טעינת מחסניות עם תרכובות רצויות
- דיללו את התרכובות הרצויות ב-ACSF מותאם (37 מעלות צלזיוס) לריכוז המלאי הסופי של 10x, 11x, 12x ו-13x מריכוז העבודה עבור יציאות A עד D, בהתאמה, והתאימו את עצמכם ל-pH 7.4. הבדיקה תיתן את התרכובות לפי הסדר מיציאה A עד D. לניסוי זה נעשה שימוש בתמיסות הבאות, כאשר ריכוז העבודה שלהן הוזכר לפניהן: 10 mM פירובט (יציאה A), 20 μM אוליגומיצין (יציאה B), 10 μM או ריכוזים אחרים של FCCP (יציאה C) ו-20 μM אנטימיצין A (יציאה D).
- טען מראש בעדינות 75 μL של התרכובות המדוללות לתוך יציאות ההזרקה המתאימות של מחסנית החיישן. מניחים את הקצוות באמצע הדרך לתוך יציאות ההזרקה בזווית של 45° עם הקצה על דופן יציאת ההזרקה. אין להכניס טיפים לחלוטין לתחתית יציאות ההזרקה מכיוון שהדבר עלול לגרום לדליפת תרכובת דרך היציאה.
- משכו את הקצוות מהיציאות בזהירות כדי להימנע מיצירת בועות אוויר. אין להקיש על חלק כלשהו במחסנית כדי להימנע מהקלה על בועות אוויר.
- בדוק חזותית את יציאות ההזרקה לטעינה אחידה. ודא שכל הנוזלים נמצאים ביציאה ואין טיפות שיוריות על גבי המחסנית.
- הניחו את מחסנית החיישן על לוחית השירות והכניסו אותה לחממה (שאינה CO2) למשך 30 דקות כדי לאפשר לה להתחמם שוב עד 37 מעלות צלזיוס. טפלו בזהירות על ידי החזקה בלבד בצלחת השירות. לזוז כמה שפחות.
5. כיול וביצוע הבדיקה
- טען את תבנית הבדיקה בתוכנה. לחץ על לחצן התחל הירוק.
- הקפד לטעון את הפרוטוקול הנכון. הפרוטוקול מכיל שילוב של מיקס של 3 דקות, המתנה של 3 דקות ורצפי מדידה של 2 דקות (שלושת השלבים האלה יוצרים מדידה אחת). שנה את המרחק של ראש הגשושית מ-26,600 ל-27,800 בהגדרות החומרה תחת הגדרות המכשיר25. אין צורך לשנות את ראש הבדיקה עבור מנתח XFe24. לחץ על התחל.
- טען את מחסנית החיישן על לוח השירות למגש המכשירים. החריץ הולך בפינה הקדמית, השמאלית. ודא שהצלחת יושבת כראוי ושטוחה. טען את מחסנית החיישן המלאה בתרופות לתוך המנתח לצורך כיול.
- בצע את ההוראות שעל המסך על מנת לכייל ולאזן את החיישנים. זה לוקח בערך 30 דקות.
- לאחר סיום שלב הכיול, הסר את לוחית הכיול והחלף אותה בפלטת האי (המכילה את פרוסות הרשת והרקמות).
- מדוד את צריכת החמצן בכל באר של הצלחת באמצעות פרוטוקולי הבדיקה. הפרוטוקול מכיל שילוב של תערובת של 3 דקות, המתנה של 3 דקות ורצפי מדידה של 2 דקות (שלושת השלבים האלה יוצרים מדידה אחת), ואז מחושב ה-OCR.
- עבור הניסוי כולו, לכלול 4x מדידות OCR כדי ליצור קו בסיס, ואחריו הזרקת יציאה A (פירובט) עם מדידות 4x, לאחר מכן הזרקת יציאה B (אוליגומיצין) עם 8x מדידות, לאחר מכן הזרקה של יציאה C (FCCP) עם 5x מדידות, ולבסוף, הזרקת יציאה D (אנטימיצין A) עם מדידות 6x.
הערה: מספר מדידות זה לאחר כל הזרקה מורכבת נקבע בהתאם למועד שבו המדידה מגיעה למישור. - נתח את נתוני מדידת ה-OCR ואת נתוני יעילות הצימוד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הצעד הראשון של המחקר הזה היה לייעל את עובי הפרוסה ואת גודל האגרוף ששימשו לכריתת קטע מהסטריאטום מהפרוסה (איור 3A). פרוסה בעובי של 150 מיקרומטר וגודל אגרוף של 1.5 מ"מ נתנו את התוצאות הטובות ביותר שנקבעו על ידי יעילות הצימוד (איור 3B-C). כפי שניתן לראות באיור 3B, זיהוי תווים אופטי (OCR) יציב יחסית במשך 5 שעות עם פחות מ-10% ריצה כלפי מטה. בנוסף, נעשה שימוש במדידות פונקציונליות, כמו גם ברישום מהדק טלאי של נוירונים בקליפת המוח ותאי עצב קוצניים בינוניים בסטריאטום, ומדידת וולטמטריה מחזורית בסריקה מהירה (FSCV) של שחרור DA, כדי להדגים שהנוירונים והטרמינלים היו פונקציונליים לחלוטין בהכנה זו, כפי שמוצג ב- Zhi et al.24. יחד עם זה, בדקנו ריכוזים שונים של FCCP כדי לגלות אילו יתנו את התגובה הטובה ביותר; 10 μM FCCP נתן את הקריאה הטובה ביותר (איור 3D1,D2) שנקבעה על ידי קיבולת הנשימה הרזרבית:
יכולת נשימה רזרבית = נשימה מקסימלית - נשימה בסיסית
תנאי פרוסה אלה שימשו למדידת ההבדלים ב-OCR של פרוסות סטריאליות מעכברי PINK1 KO ומחברי פסולת מסוג בר (WT). עבור התוצאות של עכברי PINK1 KO ו- WT, נעשה שימוש ב-3-4 עכברים וב-4-6 שכפולים לכל עכבר נעשה שימוש וממוצע כדי לקבל נקודת נתונים אחת. מאחר ש-PINK1 הוא מווסת מרכזי של תפקוד המיטוכונדריה, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה היה צפוי להימצא בעכברי KO, הנמדדים על ידי ירידה ב-OCR המיטוכונדריאלי. ואכן, ירידה תלוית גיל ב-OCR ניכרה בעכברי ה-KO בהשוואה לבקרות ה-WT שלהם (איור 4A,D). זיהוי תווים אופטי (OCR בסיסי) היה דומה הן בקבוצות KO והן בקבוצות WT עבור עכברים צעירים (3-4 חודשים); עם זאת, OCR בסיסי ירד עבור עכברי KO בקבוצה הישנה (10-14 חודשים; איור 4B,E). יעילות צימוד, שנקבעה כדלהלן,
יעילות צימוד = [קצב ייצור ATP] / [קצב נשימה בסיסי] × 100
עם זאת, ירידה בעכברי ה-KO הן עבור הקבוצות הצעירות והן עבור הקבוצות המבוגרות (איור 4C,F). נתונים אלה מראים כי בקטעי הרקמה הסטריטלית מעכברי PINK1 KO היו הפרעות בתפקוד המיטוכונדריה. תפקוד לקוי זה בעכברי KO החל גם מגיל צעיר, מה שמעיד על ירידה ביעילות הצימוד, אם כי ה- OCR הבסיסי רק ירד בקבוצה הישנה. ירידה תלוית גיל זו נבעה ככל הנראה מהצטברות מומים מיטוכונדריאליים שנגרמו כתוצאה מהנוקאאוט של PINK1.
איור 1: תמונות המציגות את מנתח השטף החוץ-תאי מעניקות לחות לחיישני מחסניות וצלחת. (A) מחסנית החיישן היושבת על גבי לוח כיול (לוחית שירות). (B) מבט מהצד של לוחית השירות ולוחית מחסנית החיישן. החריץ המשולש של לוחית מחסנית השירות והחיישן צריך להיות מיושר כראוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: חיבור ומיקום פרוסה מנוקבת. (A) פרוסה מנוקבת מחוברת לתוספת הרשת של מסך הלכידה, ולאחר מכן (B) ממוקמת באחת מבארות צלחת האיים המדגרת בזהירות כדי להבטיח שהפרוסה לא תתנתק או תזוז במהלך המדידה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: מצב פרוסת סטריאלי אופטימלי לבדיקת נשימת שטף. (A) דיאגרמה של גדלי ניקוב רקמות (1.0 מ"מ, 1.5 מ"מ וקוטר 2.0 מ"מ) עבור הסטריאטום (STR) עם עיגולים אדומים המייצגים את האזורים שהתקבלו לצורך הניתוח. (ב1) קצבי הצריכה של O2 (OCRs) בעוביים שונים ובגדלים שונים של פרוסות בקבוצת הביקורת הראו נשימה בסיסית יציבה לאורך כל המדידה (4 שעות), ו-OCR היה פרופורציונלי לנפח הפרוסה. OCRs נמדדו בפרוסות בעובי של 150 מיקרומטר ו-200 מיקרומטר המנוקבות באגרוף של 1.0 מ"מ, 1.5 מ"מ ו-2.0 מ"מ. הצירופים המשמשים מוזכרים באגדות כעובי * גודל אגרוף (למשל, 150 מיקרומטר * 1 מ"מ). (ב2) OCRs ממוצעים שנמדדו בפרוסות בעובי של 150 מיקרומטר המנוקבות באגרוף של 1.5 מ"מ; n = 7. (ג1) תגובות OCR מייצגות של פרוסות בעוביים ובקטרים שונים עם 10 mM פירובט (P), 20 μM אוליגומיצין (O), 10 μM FCCP (F) ו-20 μM אנטימיצין A (A) מוזרקות ברצף. החצים מציינים את נקודת הזמן של ההזרקה של תרכובות אלה. (ג2) יעילות הצימוד המיטוכונדריאלי הושוותה בין קבוצות שונות. לפרוסות של 150 מיקרומטר * 1.5 מ"מ הייתה יעילות צימוד גבוהה אך השונות הקטנה ביותר; n = 4. (ד1) ניסוי טיטרציה עבור FCCP בוצע, ו-10 μM FCCP נתן את הקיבולת הפנויה הגדולה ביותר; n = 4 עבור כל קבוצה. (ד2) ניסויי טיטרציה עבור FCCP בוצעו עם מנתח, ו-10 μM FCCP נתן את הקיבולת הפנויה הגדולה ביותר; n = 4 עבור כל קבוצה. הערכים המופיעים באיורים הם ממוצעים ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM). נתון זה שונה מ-Zhi et al.24. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: פרוסות PINK1 KO מהקבוצה הישנה המציגות זיהוי תווים אופטי (OCR) נמוך משמעותית. OCRs של פרוסות STR חריפות (150 מיקרומטר * 1.5 מ"מ) מעכברים בקבוצות הצעירות (A, B ו - C) ובקבוצות הישנות (D, E ו- F), שנחשפו לתוספות עוקבות של מודולטורים נשימתיים (המוצגים באמצעות חצים). ה-OCR של הקבוצה הצעירה לא היה שונה באופן משמעותי בין גנוטיפים שונים (B), בעוד שיעילות הצימוד (שנקבעה כערך באחוזים באמצעות הנוסחה שהוזכרה לעיל %) ירדה בפרוסות PINK1 KO (C). בקבוצה הישנה, ה-PINK1 KOslices הראו ירידה משמעותית ברמת הנשימה הבסיסית (E) ויעילות הצימוד (F). התמיסה הבאה, 10 mM פירובט (P), 20 μM אוליגומיצין (O), 10 μM FCCP (F) ו-20 μM אנטימיצין A (A), הוזרקה ברצף. n = 4 עבור כל גנוטיפ וגיל. הערכים המופיעים בנתונים הם ממוצעים ±-SEM. ההבדל נחשב משמעותי כאשר p < 0.05 (*). נתון זה שונה מ-Zhi et al.24. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה שפיתחנו אפשרה למנתח XF לשמש למדידת זיהוי תווים אופטי (OCR) בפרוסות סטריאליות מעכברים בוגרים על פני פרק זמן של 4 שעות. שיטה זו מספקת דרך חדשה למדוד ביו-אנרגיה תאית באגרופים שנלקחו ממבני מוח המוגדרים אנטומית. מאחר שדגימות הרקמה המנותחות קטנות למדי, ניתן לחקור את הפרמטרים המטבוליים של אזורי מוח ספציפיים המעורבים במחלה. בנוסף, שימוש בפרוסות חריפות מחקה באופן הדוק יותר את הסביבה התאית הפיזיולוגית, שלא ניתן להשיגה באמצעות מיטוכונדריה מבודדת או תאים בתרבית ופרוסות אורגנוטיפיות. יתר על כן, מדידת זיהוי תווים אופטי (OCR) באזורי מוח מרובים מבעל חיים יחיד או על פני מספר בעלי חיים בצלחת אחת בת 24 בארות מגדילה במידה ניכרת את העוצמה הסטטיסטית של מחקרים המיישמים טכניקה חדשה זו.
זהו הפרוטוקול הראשון של מדידת OCR בפרוסות סטריאליות חריפות מעכברים בוגרים. ההתמקדות הייתה ב-STR מכיוון שהוא אחד מאזורי המוח המעורבים בעיקר בפרקינסון ובמחלת הנטינגטון. ה-OCR הבסיסי ויעילות הצימוד במחקר שלנו דומים למחקרים האחרים שמדדו OCR בפרוסות מוח חריפות באמצעות מנתח XF 25,26,27. עם זאת, יכולת הנשימה הרזרבית של פרוסות סטריאליות במחקר שלנו נראית קטנה יותר בהשוואה לדיווחים האחרים שמדדו אזורים אחרים במוח. עדיין לא ידוע אם הבדל זה משקף הבדלים אמיתיים ביכולת הנשימה הרזרבית בין אזורי המוח או הבדלים קלים בהכנת פרוסות, מיקום פרוסות שנכרתו או זן העכבר. הבדלים אלה מצדיקים חקירה נוספת.
ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה, כולל הכנת פרוסות מוח חריפות, העברת הפרוסה המנוקבת לחלק העליון של מסך הלכידה והנחת הפרוסה לתוך הבאר. יש לשמור את הפרוסות מחוברות למסך הלכידה במהלך המדידה. אחרת, אם הפרוסה מתנתקת מהמסך ויושבת בבאר של הצלחת, היא תהיה רחוקה מחיישן החמצן, וכתוצאה מכך קריאה נמוכה בהרבה של ה- OCR ותגובות לתרופות. אנו ממליצים על לפחות ארבעה שכפולים (ארבע פרוסות מוח שנכרתו באותו אזור) עבור כל מצב ולא כולל את התוצאות של הפרוסות המנותקות. זיהוי תווים אופטי (OCR) צריך להיות פרופורציונלי לתכולת הרקמה. מחקר זה לא מדד את כמות הרקמה מכיוון שהמוח נפרס באותו עובי, והפרוסה נוקבה באמצעות אותו אגרוף. לפיכך, כמות הרקמה הייתה קבועה, ולא היה צורך לקבוע את תכולת הרקמה. זה קריטי להשתמש אגרוף חדש עבור כל צלחת (24 פרוסות) כדי להבטיח את החדות, ובכך, את אותה כמות של רקמה. בנוסף, חתך, הכנת אגרופי רקמות וחיבור הפרוסות לכל עכבר לוקח בערך 30 דקות ולוקח בערך 2 שעות בסך הכל עבור שני זוגות עכברים. היציבות של פרוסות מוח חריפות טובה רק למשך 7-8 שעות לאחר חתך אפילו בתנאים אופטימליים (הוערך באמצעות הקלטה רגישה של מבחנים תפקודיים-טלאיים-מהדקים כדי להעריך את המצב הבריא של הנוירונים), ולכן, שימוש בהגדרה של 96 טובות עשוי שלא להיות מעשי.
כדי להמחיש את התועלת של הטכניקה, מדדנו את ה-OCR מפרוסות סטריאליות של עכברי PINK1 KO ומחבריהם להמלטת WT. ירידה משמעותית נמצאה בנשימה הבסיסית של עכברי PINK1 KO מזדקנים בהשוואה לבקרות WT תואמות גיל, התואמות לליקויים בשחרור DA תלויי גיל24. תצפית זו מתיישבת גם עם מחקרים שפורסמו בעבר, המאשרים את תקפותו של פרוטוקול זה. יש גם מגבלות של השיטות. לדוגמה, ה-OCR נמדד מפרוסת המוח הסטריאלית החריפה, שככל הנראה אינה תלויה בפעילות המוח ומציעה בעיקר נוירונים קוצניים בינוניים לא פעילים ומסופי דופמינרגיים, כמו גם אסטרוציטים. בנוסף, לשיטה אין רזולוציה ספציפית לסוג התא.
לסיכום, שיטה חדשנית זו מודדת OCR בפרוסות מוח חריפות מעכברים בוגרים ומדגימה כיצד PINK1, גן הקשור לפרקינסון, משפיע על תפקוד המיטוכונדריה בעכברים. שיטה זו קלה ליישום וישימה באופן נרחב לחוקרים העובדים בתחום מחלת הפרקינסון והנטינגטון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לוואנגצ'ן צרינג ולפמלה וולטר על הקריאה הביקורתית והעריכה של כתב יד זה. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ (NINDS) (NS054773 ל- C.J. L. ו- NS098393 ל- H.Z.) והמחלקה למדעי המוח באוניברסיטת תומאס ג'פרסון (קרנות סטארט-אפ ל- H.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumet AB150 pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | 13-636-AB150 | To measure pH |
| Antimycin A from streptomyces sp. | SIGMA | A8674 | To inhibit complex III of the mitochondria |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | A6003 | To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF) |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | SIGMA | C2920 | To uncouple mitochondrial respiration |
| D-Glucose | SIGMA | G8270 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| DMSO | SIGMA | D8418 | To dissovle compounds |
| HEPES | SIGMA | H3375 | To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF) |
| Humidified non-CO2 incubator | Fisher Scientific | 11-683-230D | To hydrate plates at 37 °C |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | SIGMA | O4876 | To inhibit mitochondrial ATP synthase |
| Parafilm | SIGMA-ALDRICH | sealing film | |
| Rotenone | Tocris | 3616 | To inhibit complex I of the mitochondria |
| Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL | Seahorse Bioscience | 103681-100 | Solution for seahorse calibration |
| Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation | |
| Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation | |
| Seahorse XF24 FluxPaks | Seahorse Bioscience | 101174-100 | Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens, calibrant solution and calibration plates; assay kit. |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply |
| Stainless steel biopsy punches | Miltex | Device used to punch slices | |
| Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm | Eppendrof | 0030700102 | Used for slice punch |
| Vibratome | Leica | VT1200 | To slice brain tissue |
| Water bath | Thermo Scientific Precision | 282-115 | To heat buffer and solutions |
References
- Hauser, D. N., Hastings, T. G. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in Parkinson's disease and monogenic parkinsonism. Neurobiology of Disease. 51, 35-42 (2013).
- Swerdlow, R. H. Mitochondria and mitochondrial cascades in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 62 (3), 1403-1416 (2018).
- Lou, S., et al. Oxygen consumption deficit in Huntington disease mouse brain under metabolic stress. Human Molecular Genetics. 25 (13), 2813-2826 (2016).
- Amo, T., et al. Mitochondrial membrane potential decrease caused by loss of PINK1 is not due to proton leak, but to respiratory chain defects. Neurobiology of Disease. 41 (1), 111-118 (2011).
- Clark, I. E., et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).
- Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease. Science Translational Medicine. 4 (141), (2012).
- Gautier, C. A., Kitada, T., Shen, J. Loss of PINK1 causes mitochondrial functional defects and increased sensitivity to oxidative stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11364-11369 (2008).
- Gispert, S., et al. Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration. PLoS One. 4 (6), 5777 (2009).
- Heeman, B., et al. Depletion of PINK1 affects mitochondrial metabolism, calcium homeostasis and energy maintenance. Journal of Cell Science. 124, Pt 7 1115-1125 (2011).
- Liu, W., et al. Pink1 regulates the oxidative phosphorylation machinery via mitochondrial fission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12920-12924 (2011).
- Villeneuve, L. M., Purnell, P. R., Boska, M. D., Fox, H. S. Early expression of Parkinson's disease-related mitochondrial abnormalities in PINK1 knockout rats. Molecular Neurobiology. 53 (1), 171-186 (2016).
- Morais, V. A., et al. PINK1 loss-of-function mutations affect mitochondrial complex I activity via NdufA10 ubiquinone uncoupling. Science. 344 (6180), 203-207 (2014).
- Morais, V. A., et al. Parkinson's disease mutations in PINK1 result in decreased Complex I activity and deficient synaptic function. EMBO Molecular Medicine. 1 (2), 99-111 (2009).
- Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. The Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
- Ferrick, D. A., Neilson, A., Beeson, C. Advances in measuring cellular bioenergetics using extracellular flux. Drug Discovery Today. 13 (5-6), 268-274 (2008).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. In situ respiration and bioenergetic status of mitochondria in primary cerebellar granule neuronal cultures exposed continuously to glutamate. The Journal of Biological Chemistry. 279 (31), 32989-33000 (2004).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7 (6), 1068-1085 (2012).
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Land, S. C., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Smith, P. J. The self-referencing oxygen-selective microelectrode: detection of transmembrane oxygen flux from single cells. TheJournal of Experimental Biology. 202, Pt 2 211-218 (1999).
- Sure, V. N., et al. A novel high-throughput assay for respiration in isolated brain microvessels reveals impaired mitochondrial function in the aged mice. Geroscience. 40 (4), 365-375 (2018).
- Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
- Schuh, R. A., et al. Adaptation of microplate-based respirometry for hippocampal slices and analysis of respiratory capacity. Journal of Neuroscience Research. 89 (12), 1979-1988 (2011).
- Zhi, L., et al. Loss of PINK1 causes age-dependent decrease of dopamine release and mitochondrial dysfunction. Neurobiology of Aging. 75, 1-10 (2019).
- Fried, N. T., Moffat, C., Seifert, E. L., Oshinsky, M. L. Functional mitochondrial analysis in acute brain sections from adult rats reveals mitochondrial dysfunction in a rat model of migraine. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (11), 1017-1030 (2014).
- Qi, G., Mi, Y., Yin, F. Characterizing brain metabolic function ex vivo with acute mouse slice punches. STAR Protocols. 2 (2), 100559 (2021).
- Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions. Scientific Reports. 10 (1), 13179 (2020).
