فحص مكتبة shRNA المجمعة لتحديد العوامل التي تعدل النمط الظاهري لمقاومة الأدوية
Summary
يمكن أن يكون فحص تداخل الحمض النووي الريبي عالي الإنتاجية (RNAi) باستخدام مجموعة من الحمض النووي الريبوزي المرسال (shRNAs) الفيروسي الوراثي أداة للكشف عن الأهداف القاتلة الاصطناعية ذات الصلة علاجيا في الأورام الخبيثة. نحن نقدم نهج فحص shRNA مجمع للتحقيق في المؤثرات اللاجينية في سرطان الدم النخاعي الحاد (AML).
Abstract
يعد فهم آليات المحرك ذات الصلة سريريا للمقاومة الكيميائية المكتسبة أمرا بالغ الأهمية لتوضيح طرق التحايل على المقاومة وتحسين البقاء على قيد الحياة لدى المرضى الذين يعانون من سرطان الدم النخاعي الحاد (AML). جزء صغير من خلايا اللوكيميا التي تنجو من العلاج الكيميائي لديها حالة جينية متزنة لتحمل إهانة العلاج الكيميائي. يسمح التعرض الإضافي للعلاج الكيميائي لهذه الخلايا الثابتة للأدوية بالوصول إلى حالة جينية ثابتة ، مما يؤدي إلى تغيير التعبير الجيني ، مما يؤدي إلى انتشار هذه المجموعات السكانية المقاومة للأدوية وفي النهاية الانتكاس أو المرض الحراري. لذلك ، فإن تحديد التعديلات اللاجينية التي تتطلب بقاء خلايا اللوكيميا المقاومة للأدوية أمر بالغ الأهمية. نحن نفصل بروتوكولا لتحديد المعدلات اللاجينية التي تتوسط المقاومة للسيتارابين التناظري للنيوكليوزيد (AraC) باستخدام فحص مكتبة shRNA المجمعة في خط خلية AML مقاوم للسيتارابين مكتسب. تتكون المكتبة من 5,485 بنية shRNA تستهدف 407 عوامل جينية بشرية ، مما يسمح بفحص العوامل اللاجينية عالية الإنتاجية.
Introduction
ظلت الخيارات العلاجية في سرطان الدم النخاعي الحاد (AML) دون تغيير على مدى العقود الخمسة الماضية تقريبا ، مع السيتارابين (AraC) والجمرة الخبيثة كحجر الزاوية لعلاج المرض. أحد التحديات التي تواجه نجاح العلاج AML هو مقاومة الخلايا الجذعية الكروية البيض للعلاج الكيميائي ، مما يؤدي إلى انتكاس المرض 1,2. يلعب التنظيم اللاجيني دورا حيويا في التسبب في السرطان ومقاومة الأدوية ، وقد ظهرت العديد من العوامل اللاجينية كأهداف علاجية واعدة3،4،5. تؤثر الآليات التنظيمية اللاجينية على الانتشار والبقاء على قيد الحياة في ظل التعرض المستمر لعقاقير العلاج الكيميائي. وقد أفادت الدراسات التي أجريت على الأورام الخبيثة غير الدموية أن جزءا صغيرا من الخلايا التي تتغلب على تأثير الدواء تخضع لتعديلات جينية مختلفة ، مما يؤدي إلى بقاء تلك الخلايا على قيد الحياة 6,7. ومع ذلك ، لم يتم استكشاف دور العوامل اللاجينية في التوسط في المقاومة المكتسبة للسيتارابين في AML.
الفحص عالي الإنتاجية هو نهج لاكتشاف الأدوية اكتسب أهمية عالمية بمرور الوقت وأصبح طريقة قياسية في جوانب مختلفة لتحديد الأهداف المحتملة في الآليات الخلوية ، لتوصيف المسار ، وعلى المستوى الجزيئي 8,9. ينطوي مفهوم الفتك الاصطناعي على التفاعل بين جينين حيث يكون اضطراب أي من الجين وحده قابلا للتطبيق ولكن كلا الجينين في وقت واحد يؤدي إلى فقدان الجدوى10. يمكن أن يساعد استغلال الفتك الاصطناعي في علاج السرطان في تحديد التفاعلات الجينية القاتلة الاصطناعية القوية وتوصيفها ميكانيكيا11. لقد اعتمدنا نهجا توافقيا لفحص الحمض النووي الريبوزي المرسال عالي الإنتاجية مع الفتك الاصطناعي لتحديد العوامل اللاجينية المسؤولة عن مقاومة السيتارابين المكتسبة في AML.
من المعروف أن سرطان الدم الحاد الناجم عن نقل الكروموسومات لجين سرطان الدم المختلط السلالة (MLL أو KMT2A) يرتبط بضعف البقاء على قيد الحياة لدى المرضى. يمكن للمنتجات الخيمرية الناتجة عن إعادة ترتيب جين MLL ، أي بروتينات اندماج MLL (MLL-FPs) ، تحويل الخلايا الجذعية / السلفية المكونة للدم (HSPCs) إلى انفجارات اللوكيميا بمشاركة عوامل جينية متعددة. تشكل هذه المنظمين اللاجينيين شبكة معقدة تملي الحفاظ على برنامج سرطان الدم ، وبالتالي ، يمكن أن تشكل أهدافا علاجية محتملة. في هذا السياق ، استخدمنا خط الخلايا MV4-11 (الذي يؤوي جين الاندماج MLL MLL-AF4 مع طفرة FLT3-ITD ؛ يطلق عليه MV4-11 P) لتطوير خط الخلايا المقاوم للسيتارابين المكتسب ، والذي يطلق عليه MV4-11 AraC R. تعرض خط الخلية لجرعات متزايدة من السيتارابين مع الشفاء المتقطع من العلاج الدوائي ، والمعروف باسم عطلة المخدرات. تم تقييم التركيز المثبط نصف الأقصى (IC50) عن طريق فحص السمية الخلوية في المختبر .
استخدمنا مكتبة shRNA اللاجينية المجمعة (انظر جدول المواد) التي يقودها مروج hEF1a مع العمود الفقري pZIP lentivirus. تضم هذه المكتبة الحمض النووي الريبوزي المرسال الذي يستهدف 407 عوامل جينية. يحتوي كل عامل على 5-24 shRNAs ، مع ما مجموعه 5,485 shRNAs ، بما في ذلك خمسة shRNAs غير مستهدفة. تم تحسين سقالة “UltrmiR” المعدلة miR-30 من أجل التكوين الحيوي الأولي الفعال ل shRNA والتعبير12,13.
ويوضح الشكل 1 ألف الخطوط العريضة لهذه التجربة. يركز البروتوكول الحالي على فحص الحمض النووي الريبي باستخدام مكتبة العامل اللاجيني shRNA في خط خلية MV4-11 AraC R (الشكل 1B) ، وهو خط خلية معلقة. يمكن استخدام هذا البروتوكول لفحص أي مكتبة مستهدفة في أي خط خلية مقاوم للأدوية من اختياره. تجدر الإشارة إلى أن بروتوكول النقل سيكون مختلفا بالنسبة للخلايا الملتصقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يستخدم تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) على نطاق واسع في دراسات الجينوم الوظيفية، والتي تشمل فحص الحمض النووي الريبوزي المرسال والحمض النووي الريبوزي المرسال. تتمثل فائدة shRNA في أنه يمكن دمجها في ناقلات البلازميد ودمجها في الحمض النووي الجيني ، مما يؤدي إلى تعبير مستقر ، وبالتالي ، ضربة قاض?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم تمويل هذه الدراسة جزئيا من خلال منحة من إدارة التكنولوجيا الحيوية BT/PR8742/AGR/36/773/2013 إلى SRV ؛ وإدارة التكنولوجيا الحيوية في الهند BT/COE/34/SP13432/2015 ووزارة العلوم والتكنولوجيا في الهند: EMR/2017/003880 إلى P.B. يتم دعم RVS و P.B. من قبل Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 و IA/S/15/1/501842 ، على التوالي. يتم دعم S.D. من قبل زمالة CSIR-UGC ، ويتم دعم S.I. من قبل زمالة أبحاث ICMR العليا. نشكر Abhirup Bagchi و Sandya Rani وموظفي المرفق الأساسي لقياس التدفق الخلوي CSCR على مساعدتهم. كما نشكر MedGenome Inc. على المساعدة في تسلسل الإنتاجية العالية وتحليل البيانات.
Materials
| Reagents | |||
| 100 bp Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarose | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaine (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Boric Acid | Qualigens | 12005 | |
| Cell culture plasticware | Corning | as appicable | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | 91233354 | |
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethidium Bromide | Sigma | E1510-10 mL | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Gel/PCR Purification Kit | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HL60 cell line | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Hot Start Polymerase | Merck | 71086 | |
| Molm13 cell line | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | |
| MV4-11 cell line | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| psPAX2 and pMD2.G | Addgene | Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus | Mirus Catalog Number: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2 incubator | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III cell sorter | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation | Beckman coulter | ||
| Centrifuge | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Light Microscope | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Thermal Cycler | BioRad |
References
- Döhner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer Journal. 6 (7), 441 (2016).
- Zuber, J., et al. RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia. Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).
- Shi, J., et al. The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia. Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).
- Chen, C. -. W., et al. DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia. Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).
- Li, F., et al. In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma. Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).
- Balch, C., Huang, T. H. -. M., Brown, R., Nephew, K. P. The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 191 (5), 1552-1572 (2004).
- Carnero, A. High throughput screening in drug discovery. Clinical and Translational Oncology. 8 (7), 482-490 (2006).
- Lal-Nag, M., et al. A high-throughput screening model of the tumor microenvironment for ovarian cancer cell growth. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 494-506 (2017).
- O’Neil, N. J., Bailey, M. L., Hieter, P. Synthetic lethality and cancer. Nature Reviews Genetics. 18 (10), 613-623 (2017).
- Hoffman, G. R., et al. Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).
- Fellmann, C., et al. An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi. Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).
- Knott, S. R. V., et al. A computational algorithm to predict shRNA potency. Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance. Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).
- Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
