Screening della libreria di shRNA in pool per identificare i fattori che modulano un fenotipo di resistenza ai farmaci
Summary
Lo screening dell’interferenza dell’RNA ad alto rendimento (RNAi) utilizzando un pool di shRNA lentivirali può essere uno strumento per rilevare bersagli letali sintetici terapeuticamente rilevanti nelle neoplasie maligne. Forniamo un approccio di screening dello shRNA aggregato per studiare gli effettori epigenetici nella leucemia mieloide acuta (LMA).
Abstract
Comprendere i meccanismi driver clinicamente rilevanti della chemio-resistenza acquisita è fondamentale per chiarire i modi per aggirare la resistenza e migliorare la sopravvivenza nei pazienti con leucemia mieloide acuta (LMA). Una piccola frazione di cellule leucemiche che sopravvivono alla chemioterapia hanno uno stato epigenetico pronto a tollerare l’insulto chemioterapico. Un’ulteriore esposizione alla chemioterapia consente a queste cellule persistenti di raggiungere uno stato epigenetico fisso, che porta a un’alterata espressione genica, con conseguente proliferazione di queste popolazioni resistenti ai farmaci e infine malattia recidivante o refrattaria. Pertanto, identificare le modulazioni epigenetiche che richiedono la sopravvivenza delle cellule leucemiche resistenti ai farmaci è fondamentale. Descriviamo in dettaglio un protocollo per identificare i modulatori epigenetici che mediano la resistenza all’analogo nucleosidico citarabina (AraC) utilizzando lo screening della libreria di shRNA aggregato in una linea cellulare AML resistente alla citarabina acquisita. La libreria è composta da 5.485 costrutti shRNA mirati a 407 fattori epigenetici umani, che consentono lo screening dei fattori epigenetici ad alto rendimento.
Introduction
Le opzioni terapeutiche nella leucemia mieloide acuta (LMA) sono rimaste invariate per quasi gli ultimi cinque decenni, con citarabina (AraC) e antracicline come pietra angolare per il trattamento della malattia. Una delle sfide per il successo della terapia AML è la resistenza delle cellule staminali leucemiche alla chemioterapia, che porta alla recidivadella malattia 1,2. La regolazione epigenetica svolge un ruolo vitale nella patogenesi del cancro e nella resistenza ai farmaci, e diversi fattori epigenetici sono emersi come promettenti bersagli terapeutici 3,4,5. I meccanismi di regolazione epigenetica influenzano la proliferazione e la sopravvivenza in caso di esposizione continua a farmaci chemioterapici. Studi su tumori maligni non ematologici hanno riportato che una piccola frazione di cellule che superano l’effetto del farmaco subisce varie modificazioni epigenetiche, con conseguente sopravvivenza di quelle cellule 6,7. Tuttavia, il ruolo dei fattori epigenetici nel mediare la resistenza acquisita alla citarabina nella LMA non è stato esplorato.
Lo screening ad alto rendimento è un approccio alla scoperta di farmaci che ha acquisito importanza globale nel tempo ed è diventato un metodo standard in diversi aspetti per identificare potenziali bersagli nei meccanismi cellulari, per la profilazione dei percorsi e a livello molecolare 8,9. Il concetto di letalità sintetica coinvolge l’interazione tra due geni in cui la perturbazione di uno dei due geni da solo è praticabile ma di entrambi i geni provoca contemporaneamente la perdita di vitalità10. Sfruttare la letalità sintetica nel trattamento del cancro potrebbe aiutare a identificare e caratterizzare meccanicamente robuste interazioni genetiche sintetiche letali11. Abbiamo adottato un approccio combinatorio di screening shRNA ad alto rendimento con letalità sintetica per identificare i fattori epigenetici responsabili della resistenza acquisita alla citarabina nella LMA.
Le leucemie acute guidate dalla traslocazione cromosomica del gene della leucemia a lignaggio misto (MLL o KMT2A) sono note per essere associate a scarsa sopravvivenza nei pazienti. I prodotti chimerici risultanti dei riarrangiamenti genici MLL , cioè le proteine di fusione MLL (MLL-FP), possono trasformare le cellule staminali / progenitrici ematopoietiche (HSPC) in blasti leucemici con il coinvolgimento di più fattori epigenetici. Questi regolatori epigenetici costituiscono una rete complicata che detta il mantenimento del programma di leucemia e, quindi, potrebbero formare potenziali bersagli terapeutici. In questo contesto, abbiamo utilizzato la linea cellulare MV4-11 (che ospita il gene di fusione MLL MLL-AF4 con la mutazione FLT3-ITD; definita come MV4-11 P) per sviluppare la linea cellulare resistente alla citarabina acquisita, definita come MV4-11 AraC R. La linea cellulare è stata esposta a dosi crescenti di citarabina con recupero intermittente dal trattamento farmacologico, noto come vacanza farmacologica. La concentrazione inibitoria semi-massimale (IC50) è stata valutata mediante test di citotossicità in vitro .
Abbiamo utilizzato la libreria di shRNA epigenetica aggregata (vedi Tabella dei materiali) guidata dal promotore hEF1a con una spina dorsale lentivirale pZIP. Questa libreria comprende shRNA mirati a 407 fattori epigenetici. Ogni fattore ha 5-24 shRNA, con un totale di 5.485 shRNA, tra cui cinque shRNA di controllo non mirati. L’impalcatura miR-30 “UltrmiR” modificata è stata ottimizzata per un’efficiente biogenesi ed espressionedello shRNA primario 12,13.
Lo schema di questo esperimento è illustrato nella Figura 1A. L’attuale protocollo si concentra sullo screening RNAi utilizzando la libreria shRNA del fattore epigenetico nella linea cellulare MV4-11 AraC R (Figura 1B), una linea cellulare in sospensione. Questo protocollo può essere utilizzato per lo screening di qualsiasi libreria mirata in qualsiasi linea cellulare resistente ai farmaci di propria scelta. Va notato che il protocollo di trasduzione sarà diverso per le cellule aderenti.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’interferenza dell’RNA (RNAi) è ampiamente utilizzata per gli studi di genomica funzionale, che includono lo screening di siRNA e shRNA. Il vantaggio dello shRNA è che possono essere incorporati in vettori plasmidici e integrati nel DNA genomico, con conseguente espressione stabile e, quindi, abbattimento più prolungato dell’mRNA bersaglio. Uno screening della libreria shRNA in pool è robusto ed economico rispetto agli schermi arrayed convenzionali (siRNA). Identificare l’essenzialità di una specifica classe di pro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è finanziato in parte da una sovvenzione del Dipartimento di Biotecnologie BT/PR8742/AGR/36/773/2013 a SRV; e Department of Biotechnology India BT/COE/34/SP13432/2015 e Department of Science and Technology, India: EMR/2017/003880 to P.B. RVS e P.B. sono supportati rispettivamente da Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 e IA/S/15/1/501842. S.D. è supportato dalla borsa di studio CSIR-UGC e S.I. è supportato da una borsa di ricerca senior ICMR. Ringraziamo Abhirup Bagchi, Sandya Rani e lo staff del CSCR Flow Cytometry Core Facility per il loro aiuto. Ringraziamo anche MedGenome Inc. per l’aiuto con il sequenziamento ad alto throughput e l’analisi dei dati.
Materials
| Reagents | |||
| 100 bp Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarose | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaine (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Boric Acid | Qualigens | 12005 | |
| Cell culture plasticware | Corning | as appicable | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | 91233354 | |
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethidium Bromide | Sigma | E1510-10 mL | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Gel/PCR Purification Kit | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HL60 cell line | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Hot Start Polymerase | Merck | 71086 | |
| Molm13 cell line | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | |
| MV4-11 cell line | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| psPAX2 and pMD2.G | Addgene | Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus | Mirus Catalog Number: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2 incubator | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III cell sorter | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation | Beckman coulter | ||
| Centrifuge | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Light Microscope | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Thermal Cycler | BioRad |
References
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