Summary
Lægemiddelinduceret leverskade (DILI) er en væsentlig årsag til lægemiddelsvigt. En protokol er udviklet til nøjagtigt at forudsige DILI-ansvaret for en forbindelse ved hjælp af et levermikrofysiologisk system (MPS). Levermodellen bruger kokultur af primære leverceller og translationelt relevante endepunkter til at vurdere cellulære reaktioner på behandlingen.
Abstract
DILI er en væsentlig årsag til slid i lægemiddeludvikling med over 1000 FDA-godkendte lægemidler, der vides at potentielt forårsage DILI hos mennesker. Desværre opdages DILI ofte ikke, før lægemidlerne har nået kliniske stadier, hvilket risikerer patienternes sikkerhed og fører til betydelige tab for medicinalindustrien. I betragtning af at standard 2D-modeller har begrænsninger med hensyn til at detektere DILI, er det vigtigt at udvikle in vitro-modeller, der er mere forudsigelige for at forbedre dataoversættelsen. For at forstå kausalitet og mekanistiske aspekter af DILI i detaljer er der udviklet en human lever MPS bestående af humane primære leverparenkymale og ikke-parenkymale celler (NPC'er) og dyrket i 3D-mikrovæv på et konstrueret stillads under perfusion. Kryopræserverede primære humane hepatocytter (PHH'er) og Kupffer-celler (HKC'er) blev samdyrket som mikrovæv i MPS-platformen i op til to uger, og hver forbindelse af interesse blev gentagne gange doseret på levermikrovæv ved syv testkoncentrationer i op til fire dage. Funktionelle leverspecifikke endepunkter blev analyseret (herunder kliniske biomarkører såsom alaninaminotransferase, ALT) for at evaluere leverfunktionen. Akut og kronisk eksponering for forbindelser af forskellig DILI-sværhedsgrad kan vurderes ved at sammenligne respons på enkelt- og flerdoseret mikrovæv. Metoden er blevet valideret med et bredt sæt alvorlige og mildt hepatotoksiske forbindelser. Her viser vi dataene for pioglitazon og troglitazon, velkendte hepatotoksiske forbindelser, der er trukket tilbage fra markedet for at forårsage leversvigt. Samlet set har det vist sig, at lever-MPS-modellen kan være et nyttigt værktøj til at vurdere DILI og dets tilknytning til ændringer i leverfunktionen. Modellen kan desuden bruges til at vurdere, hvordan nye forbindelser opfører sig i forskellige patientundergrupper, og hvordan toksicitetsprofiler kan påvirkes af leversygdomstilstande (f.eks. viral hepatitis, fedtleversygdom).
Introduction
DILI er fortsat den hyppigste årsag til akut leversvigt i USA og Europa og er en førende årsag til nedslidning af forbindelser i lægemiddeludviklingsprocessen1. Næsten alle klasser af medicin kan forårsage hepatotoksicitet, hvor centralnervesystemet agenter og antibiotika er langt de mest almindelige behandlinger, der forårsager DILI hos patienter2. Lægemiddelinduceret hepatotoksicitet er forårsaget af en kompleks interaktion mellem genetiske, ikke-genetiske og miljømæssige faktorer, hvilket fører til død af hepatocytter og andre levercelletyper, herunder cholangiocytter og endotelceller 1,3.
DILI-fremkaldende midler kan klassificeres på to måder: dem, der forårsager forudsigelig dosisafhængig leverskade eller dem, der forårsager idiosynkratisk DILI, der er sjælden og udvikler sig uafhængigt af lægemiddeldosis eller indgivelsesvej, men er ansvarlig for op til en sjettedel af alle akutte leversvigt i USA kun4. Desværre opdages DILI ofte ikke, før lægemidlerne har nået de kliniske stadier af lægemiddeludviklingsprocessen. Lægemiddelinduceret leverskade rang (eller DILIrank) består af mere end tusind FDA-godkendte lægemidler, der er opdelt i fire klasser i henhold til deres potentiale for at forårsage DILI, og deres anvendelse hos patienter skal overvåges nøje5.
At studere mekanismer for lægemiddelhepatotoksicitet er fortsat meget udfordrende, og derfor er der udviklet mange prækliniske modeller til at udforske mekanismer for DILI. Nuværende in vitro- og in vivo-modeller, der bruges til at forudsige DILI i præklinisk udvikling, har flere begrænsninger for at give indsigt i de komplekse, mangesidede interaktioner i en levende menneskekrop. Kræftformede levercellelinjer (dvs. HepG2, HepaRG) dyrket i 2D anvendes stadig i de tidlige stadier af lægemiddeludvikling til evaluering af toksiciteten af kandidatforbindelser6. Alligevel kommer disse cellelinjer fra enkeltdonorer og viser unormale niveauer af leverfunktion og udviser ikke altid høj følsomhed til påvisning af DILI 7,8. Som et alternativ til kræftformede levercellelinjer repræsenterer PHH'er bedre human leverfysiologi, hvis de dyrkes korrekt in vitro, selvom der findes flere begrænsninger med deres kultur, som kort inkubationstid med lægemidler, relativt kort levetid, tab af levergenekspression og ændringer i lægemiddelmetaboliske funktioner 9,10,11 . PHH'er kan dyrkes på ekstracellulære matrixproteiner i standard 2D-cellekulturplader, men som en ulempe betyder det hurtige fald i deres funktion, at de har lav følsomhed (<50%) for DILI-forudsigelse12.
På den anden side er test på dyremodeller langsomme, dyre og har brug for en oversættelse på tværs af arter for at ekstrapolere forudsigelse til mennesker. De fleste nyudviklede lægemidler får ikke godkendelse, hvilket gør denne proces dyr og risikabel5. Desuden er dyremodeller mindre egnede til test af nye menneskespecifikke modaliteter på grund af gensekvenser eller immunologiske responsforskelle i forhold til mennesker13.
Derfor er interessen for mere avancerede tredimensionelle (3D) in vitro-levermodeller vokset eksponentielt. Dyrkning af PHH'er som sfæriske strukturer genereret af gravitationsaggregering i hængende dråber eller på ultralave fastgørelsesoverflader repræsenterer en metode med høj kapacitet til vurdering af sammensatte forpligtelser14. PHH sfæroider er blevet brugt til at vurdere DILI i en syg baggrund (fx steatose og kolestase)15. En bred vifte af modeller er blevet udviklet til at omfatte belagte mikromønstrede kokulturer af hepatocytter med stromale fibroblaster16, 3D bioprintet levervæv17, 3D sfæroidkulturer med eller uden hepatiske ikke-parenkymale celler15. Alle disse metoder har dog stadig ulemper, og dyrkning af PHH'er i et mere fysiologisk relevant mikromiljø kan give dem højere funktionalitetsniveauer i længere tid for at muliggøre undersøgelse af langvarig eksponering for potentielle hepatotoksiske stoffer. For at forbedre den translationelle relevans af enhver avanceret in vitro-PHH-kultur skal klinisk relevante funktionelle endepunkter eller biomarkører for toksicitetsoutput desuden anvendes til at gøre det muligt at sammenligne data in vivo eller kliniske scenarier18.
I denne undersøgelse vurderede vi, om en MPS, også kendt som en Organ-on-a-Chip (OOC), in vitro levermodel kunne bruges til at forstå de detaljerede mekanistiske aspekter af levertoksicitet. MPS har tidligere vist sig at opretholde yderst funktionelle 3D-levermikrovæv under flow i op til 4 uger19. Systemet er for nylig blevet testet af FDA og vist sig at have høj reproducerbarhed, når der udføres lægemiddeltoksicitet, metabolisme og intracellulær akkumulering20. Desuden havde systemet sammenlignet med sfæroider og sandwichkulturer en mere stabil funktion og højere følsomhed ved påvisning af toksiciteten af flere lægemidler20. Til dato er MPS blevet brugt i en lang række applikationer, der dækker ADME 21, sygdomsmodellering (HBV 22, NAFLD 23,24,25) og lægemiddelinteraktioner 26, hvilket potentielt gør det meget velegnet til vurdering af akut og kronisk DILI. Den teknologi, der præsenteres her, tilbyder et alternativ til at lukke kløften mellem mere traditionelle cellekulturer og dyremodeller og kliniske forsøg på mennesker og går videre mod simulering af humane biologiske tilstande for at understøtte vurderingen af kandidatforbindelsers levertoksicitet i prækliniske stadier af lægemiddeludviklingsprocessen.
Protocol
Alt arbejdet blev udført i laboratoriet efter strenge sundheds- og sikkerhedsprocedurer og i overensstemmelse med dets egne laboratorierisikovurderinger og SOP'er. Alt anvendt udstyr serviceres i henhold til producentens retningslinjer. Mikrobiologiske sikkerhedsskabe (MBSC'er) serviceres årligt, og Ki-Discus (kaliumiodid) testes efter britiske standarder. Protokollen følger Det Forenede Kongeriges Human Tissue Authority (MTV) adfærdskodeks og direktiver og anvender etisk fremskaffede primære humane celler leveret af leverandører, der fuldt ud overholder de generelle krav til informeret samtykke (45 CFR §46.116 og §46.117) og god klinisk praksis (GLP) (ICH E6) og lovgivningsmæssige og etiske komitéer.
1. Forberedelse af cellekulturmedier
BEMÆRK: Forbered såning avanceret DMEM-medium på dag -1 og opbevares ved 4 ° C. Forbered vedligeholdelse avanceret DMEM-medium på dag 1 og opbevar ved 4 °C i op til 1 uge.
- Såning Avanceret DMEM-medium til PHH'er og HKC'er samkultur: Suppler en flaske 500 ml Advanced DMEM-medium (materialetabel) med 18 ml Cocktail A (endelig koncentration på 3,6%) og med 25 ml FBS (endelig koncentration 5%).
- Vedligeholdelse Avanceret DMEM-medium til PHH'er og HKC'er samkultur: Suppler en flaske 500 ml Advanced DMEM-medium (materialetabel) med 20 ml Cocktail B (endelig koncentration på 4%) og 500 nM hydrocortison.
BEMÆRK: Hydrocortison vil blive gjort frisk på brugsdagen, og trinene til, hvordan man forbereder stamopløsningen og de nødvendige fortyndinger, er nævnt nedenfor. - Forberedelse af 500 nM hydrocortison i vedligeholdelse avanceret DMEM medium
- Fremstilling af udgangsstamopløsningen (20 mM): 7,24 mg hydrocortison (materialebord) vejes i et hætteglas af 1 ml glas. Den nøjagtige mængde hydrocortison, der vejes, registreres, og volumen af dimethylsulfoxid (DMSO) bestemmes ved hjælp af følgende beregning:
- Fremstilling af den fungerende 100 μM hydrocortisonstamopløsning: Tilsæt 5 μL af startstamopløsningen på 20 mM til 995 μL avanceret DMEM.
BEMÆRK: Fortynding af 25 μL af DMSO-opløsningen fra trin 1 i vand eller medier resulterer i 0,5% DMSO-koncentration. I den endelige løsning vil DMSO-koncentrationen være 0, 0025%. I dette tilfælde resulterer det ekstra volumen på 5 μL i en ubetydelig ændring i det samlede volumen. - Forberedelse af den fungerende 500 nM hydrocortisonopløsning i Advanced DMEM: For at forberede 1 ml 500 nM hydrocortisonopløsning i Advanced DMEM tilsættes 5 μL af stamopløsningen af 100 μM hydrocortison til 995 μL af vedligeholdelsesavanceret DMEM-medium.
- Fremstilling af udgangsstamopløsningen (20 mM): 7,24 mg hydrocortison (materialebord) vejes i et hætteglas af 1 ml glas. Den nøjagtige mængde hydrocortison, der vejes, registreres, og volumen af dimethylsulfoxid (DMSO) bestemmes ved hjælp af følgende beregning:
2. MPS opsætning og priming (dag -1)
- Tilslut controlleren til dens dockingstationshus i en cellekulturinkubator, og sørg for, at frisk tørremiddel (materialetabel) tilsættes i tørremiddelbeholderen placeret bag på controlleren.
BEMÆRK: Controllerenheden trækker fugt fra inkubatoren over tid og holdes tør ved hjælp af frisk tørremiddel. - Tænd for controlleren ved at trykke på bådens vippekontakt bag den, og vent i 5 minutter på, at systemet stabiliserer sig og når tryk. Kontroller derefter skærmen for den pneumatiske rapport for at sikre: (i) Trykbeholderudgangen nåede ~ 2000 mBar og (ii) vakuumreservoirudgangen nåede ~ 850 mBar.
- Fjern hver plade fra emballagen, og inspicer visuelt hver brønd for at kontrollere, om der er mulige defekter (manglende stilladser, revner osv.).
- Indsæt en fører (med en plade på) på dockingstationen for at kontrollere, at føreren genkendes af dockingstationen og controlleren. Kontroller, at trykbeholderens udgang er faldet med mindre end 100 mBar, og vakuumbeholderens udgang er steget med mindre end 500 mBar.
- Prime hver brønd ved at tilføje 500 μL Seeding Advanced DMEM-medium (forvarmet til 37 ° C) til reservoirsiden.
- Vælg Prime-programmet på controllerskærmen (opgang i 3 minutter ved 2,5 μL/s), indtil væsken kommer gennem filterstøtterne. BEMÆRK: 'Up flow' er en indstilling på controlleren, der gør det muligt for medier at strømme fra reservoiret opad gennem stilladserne i LC12-pladen.
- Fyld alle brønde med yderligere 1,1 ml Seeding Advanced DMEM-medium for at dække overfladekanalen. Alle brønde vil derefter være på deres fulde arbejdsvolumen på 1,6 ml.
- Placer driverne med plader i en 37 °C og 5% CO2 inkubator, tilslut til dockingstationen og kør Incubate-programmet .
BEMÆRK: Alle programmer, der bruges i eksperimentet (Prime, Incubate, Seed, Media Change), er forudindstillet i MPS-systemet. Prime pladerne i inkubatoren, indtil de er klar til frø.
3. Såning af leverceller i MPS (dag 0)
- Prevalidate alle PHHS og HKC'er. Alle PHH'er og HKC'er er prævalideret internt, inden cellekultureksperimentet udføres (se supplerende materiale).
- Optø hætteglas med PHH'er og HKC-celler (materialetabel) ved at holde hætteglassene støt i et 37 ° C vandbad, indtil der kun er en lille isskive tilbage.
- Pipetter PHH'er direkte ind i et rør med forvarmet (37 °C) kryopræserveret hepatocytgendannelsesmedium CHRM-medie (maks. to hætteglas pr. rør).
- Pipetter cellerne forsigtigt, og brug derefter 1 ml CHRM til at vaske eventuelle resterende celler fra kryotubet. Vær meget forsigtig med celler, når du optøer og overfører til et konisk rør.
FORSIGTIG Rør ikke hætteglassene under optøning, og pipetter ikke deres indhold op og ned. - Pipetter HKCs celler forsigtigt fra kryotuben til 10 ml iskold Seeding Advanced DMEM-medium i et 15 ml centrifugerør.
BEMÆRK: Op til 2 hætteglas med HKC'er kan kombineres. - Centrifuge begge celletyper ved stuetemperatur (RT) ved 100 x g i 10 min. Fjern supernatanten.
- Resuspender PHH'erne i varmt såning Avanceret DMEM-medium og HKC'er i iskold Seeding Advanced DMEM-medium (for at hjælpe med at reducere celleklumpning) ved hjælp af 1 ml pr. hætteglas med celler, der tilsættes røret, og placer cellerne på is. Brug en blid vuggende handling til at resuspendere cellerne.
FORSIGTIG: Phh'er må ikke genoptages ved pipettevirkning, da det kan føre til celledød. - Kombiner cellesuspensionerne fra flere rør (hvis relevant - dvs. hvis alle PHH'er er fra samme donor), men bland ikke celletyper.
- Tæl celler. Registrer levedygtigheden (skal være over 85% for både celletyper, PHH'er og HKC'er) og det samlede antal celler. Hvis cellelevedygtigheden falder til under 85 %, optøes et nyt hætteglas med celler, og cellelevedygtigheden revurderes.
- Beregn cellelevedygtighed ved hjælp af følgende formel:
- Beregn det ønskede volumen af cellesuspensionen til frø i hver brønd og yderligere volumen af Seeding Advanced DMEM-medium, der er nødvendigt for at tage det samlede såvolumen til 400 μL. Celletal pr. brønd: 0,4 x 10 6 PHH'er og 0,04 x 10 6 HKC'er pr. brønd og celletæthed på 0,25 x 106 PHH'er / ml, henholdsvis 0,025 x 106 HKC'er/ml.
- Frakobl føreren fra dockingstationen, og placer den i MBSC.
- Aspirer medierne fra ovenstående stillads til stoppunktet (går ned i det dybe hak på fastholdelsesringen), kanalen og reservoiret. Efterlad et "dødt volumen" på 0,2 ml i kulturbrønden og når lige over stilladset. Der skal udvises forsigtighed med ikke at fjerne det samlede medium over stilladset for at undgå, at der dannes luftbobler.
- Tilføj 400 μL Seeding Advanced DMEM-medium i brøndkammeret, sæt føreren tilbage på dockingstationen i inkubatoren, og kør Media Change-programmet i 3 minutter. Programmet holder automatisk pause efter 3 min.
- Når du er færdig, skal du frakoble føreren fra dockingstationen og placere den tilbage i MBSC.
- Aspirer medierne fra ovenstående stillads ned til stoppestedet og ved reservoirets ende af hver brønd.
- Resuspender forsigtigt PHH'erne ved forsigtigt at vippe røret, og tilsæt derefter det krævede volumen af cellesuspensionen til hver kulturbrønd. Pipetter forsigtigt cellesuspensionen, sørg for, at cellerne spredes jævnt over pladens stillads.
BEMÆRK: For at sikre god dækning i hele stilladset skal du bruge en langsom hvirvlende bevægelse til at pipettere celler ned på stilladset. - På samme måde skal du omhyggeligt suspendere HKC'er og tilføje cellesuspensionerne til hver kulturbrønd.
BEMÆRK: Brug en langsom hvirvlende bevægelse til at så HKC'er for at sikre god dækning i hele stilladset. De to såningsundertrin kan adskilles, eller de to celletyper kan forblandes med en passende tæthed og sås samtidigt. - Når alle brønde indeholder begge celletyper, skal du placere MPS-driveren på dockingstationen i inkubatoren uden fysisk at forbinde den og lade den stå i 1 time.
- Efter 1 time skal du fylde hver brønd med den nødvendige mængde ekstra Seeding Advanced DMEM-medium for at nå 400 μL og køre Seed-programmet .
- Efter 2 minutter stopper programmet automatisk, fjerner driveren fra inkubatoren og tilføjer langsomt 1000 μL af Seeding Advanced DMEM-mediet til kanalen (tættere på reservoirenden end brøndkammeret) for at opnå et samlet volumen på 1,4 ml (med yderligere 200 μL dødvolumen i kanalerne).
- Flyt pladerne til inkubatoren og kør resten af frøprogrammet i 8 timer.
BEMÆRK: Flow skifter automatisk til Incubate-programmet efter 8 timer.
4. Medieændring (dag 1)
- Frakobl føreren fra dockingstationen, og placer den i MBSC.
- Udfør medieændring ved at fjerne seeding Advanced DMEM-mediet i brøndkammeret ned til stoppunktet.
- Tilføj 400 μL af det avancerede vedligeholdelses-DMEM-medium i brøndkammeret, sæt føreren tilbage på dockingstationen i inkubatoren, og kør Media Change-programmet i 3 minutter. Programmet holder automatisk pause efter 3 min.
- Frakobl føreren fra dockingstationen, og i MBSC skal du suge medier væk fra reservoirkammeret, kanalen og stoppunktet over stilladset. På dette tidspunkt vil kulturbrønden blive returneret til det døde volumen.
- Tanken op reservoirkammeret med 1,4 ml frisk forvarmet (37 °C) Vedligeholdelse avanceret DMEM-medium.
- Returner føreren til dockingstationen i inkubatoren, og kør Incubate-programmet .
5. Kvalitetskontrol af levermikrovæv (QC), medieindsamling, medieændring og dosering af lægemidler (dag 4)
- På dag 4 udføres en medieændring ved hjælp af vedligeholdelsesavanceret DMEM-medium og QC-kontroller for at sikre, at såning har været vellykket.
BEMÆRK: QC er en proces, der bruges til at kontrollere sundheden for de dannede mikrovæv ved at måle lactatdehydrogenase (LDH) og urinstof. - Før QC køres, skal du forberede friske lageropløsninger for hver forbindelse, der skal testes (enten i Maintenance Advanced DMEM-medium eller Maintenance Advanced DMEM-medium, der indeholder 0,1% DMSO, afhængigt af opløseligheden af hver forbindelse). Fortyndinger fremstilles i overensstemmelse hermed for at give testkoncentrationer for hver forbindelse.
- Frakobl føreren og pladen fra dockingstationen, og overfør til en MBSC.
- Overfør 50 μL medier fra hver brønd ved hjælp af en pipette til en 96 brøndplade for at udføre et LDH-assay (materialetabel) før prøveudtagning og 25 μL for et urinstofassay (materialetabel).
BEMÆRK: LDH- og urinstofassays udføres efter producentens anvisninger. - Fortsæt forsøget efter QC, hvis LDH-aflæsningerne er lavere end 2 AU/10 6-celler, og urinstof er over 40 μg/dag/106 celler.
BEMÆRK: Albumin bruges ikke som QC, fordi det er et langt assay at køre på dagen og vil blive analyseret senere, når eksperimentet er afsluttet fra prøverne, der blev trukket tilbage på dag 4. - Hvis nogen brønde fejler QC, skal du fjerne dem fra det eksperimentelle design.
- Når det eksperimentelle layout er bekræftet, skal du prøve de resterende medier fra hver brønd og sørge for ikke at forstyrre cellekulturen ved at røre ved stilladset. Det indsamlede medie (mærket som prøver før dosis) opbevares ved -80 °C til senere analyser.
- Udfør medieændring i en MBSC ved at følge trin 4.3-4.5. Skift brøndene til Maintenance Advanced DMEM-medium med den rigtige lægemiddelkoncentration i henhold til det eksperimentelle design.
- Når du er færdig, skal du returnere føreren til dockingstationen i inkubatoren og køre Incubate-programmet .
6. Medieindsamling, medieændring og dosering af lægemidler (dag 6)
- Der fremstilles friske stamopløsninger for hver forbindelse, der skal testes (enten i Maintenance Advanced DMEM-medium eller Maintenance Advanced DMEM-medium indeholdende 0,1% DMSO, afhængigt af opløseligheden af hver forbindelse). Fortyndinger fremstilles i overensstemmelse hermed for at give testkoncentrationer for hver forbindelse i henhold til pladeplanen.
- Frakobl føreren og pladen fra dockingstationen, og overfør til en MBSC.
- Saml medier fra hver brønd (~ 1 ml) manuelt med en pipette, og sørg for ikke at forstyrre cellekulturen ved at røre ved stilladset, assay for LDH og urinstof. Resten af det indsamlede medie opbevares ved -80 °C til senere analyser, og mærk dem 48 timers prøver efter dosis.
- Gendoser hver brønd med samme lægemiddelkoncentration som på dag 4 og i henhold til pladeplanen ved at udføre medieændring ved at følge trin 4.3-4.5.
- Når du er færdig, skal du returnere føreren til dockingstationen i inkubatoren og køre Incubate-programmet .
7. Afslutning af eksperimentet (dag 8)
- Frakobl føreren og pladen fra dockingstationen, og overfør til en MBSC.
- Prøvemedier fra hver brønd manuelt ved hjælp af en pipette, og sørg for ikke at forstyrre cellekulturen ved at røre ved stilladset.
- Analysér de tilbagetrukne medier for LDH og Urea, og gem resten af de indsamlede medier ved -80 °C til senere analyser.
- Kører CYP3A4-glo assay.
- Mål virkningerne af de lægemidler, der er testet på cytokrom P450 CYP3A4-aktivitet i PHH'er i slutningen af eksperimentet ved hjælp af dette assay.
- Detektionsreagenset rekonstitueres (for CYP3A4-assay, se Materialetabel) efter fabrikantens anvisninger. Hvis detektionsreagenset tidligere er blevet rekonstitueret og frosset, fjernes det fra fryseren -20 °C, og det optøes ved RT.
- Forbered 20 mM lager D-luciferin standard efter producentens anvisninger.
- Forbered arbejdende luminogent substratmedium med en 1:1000 fortynding af Luciferin IPA i vedligeholdelse avanceret DMEM-medium (2 ml luminogent substratmedium pr. Brønd).
- Udfør en medieændring som beskrevet i trin 4.3-4.5 med luminogent substratmedium. Gem 500 μL af det luminogene substratmedium i et 1,5 ml glashætteglas (materialetabel) som inputmateriale.
- Sæt føreren tilbage på dockingstationen i inkubatoren, og kør Incubate-programmet i 1,5 timer.
- D-luciferin standardkurve i dyrkningsmedium fremstilles i 1,5 ml rør efter producentens anvisninger og pipetterer 50 μL af hver standard i to eksemplarer på en hvid uigennemsigtig 96-brøndsplade (se Materialetabel) ved hjælp af kulturmedium som emne eller 0 μM.
- Når tiden er gået, skal du fjerne føreren fra dockingstationen og prøvemedier til CYP3A4-analyse ved at følge trin 7.4.9-7.4.13.
- Efter inkubation overføres 50 μL af prøvemediet fra hver brønd og inputmateriale til den 96-brønds uigennemsigtige hvide luminometerplade indeholdende standarder. Sørg for at efterlade mindst to tomme rækker på den uigennemsigtige plade mellem standarderne og prøverne for at undgå let overførsel mellem topstandarderne og prøveaflæsningerne.
- Tilsæt 50 μL Luciferindetektionsreagens til hver brønd for at starte en selvlysende reaktion.
- Inkuber pladen ved RT på en pladeryster i 20 minutter i mørke for at stabilisere det selvlysende signal.
- Optag luminescensen ved hjælp af et luminometer eller CCD-kamera.
- Plot standardkurven ved at tage gennemsnittet af hvert punkt og derefter trække gennemsnittet af emnerne. Brug linjens ligning til at beregne stofskiftet (pmol / min / 106 celler) i resten af prøverne, og husk at inkludere eventuelle fortyndinger.
- Fjern stilladserne fra pladerne ved hjælp af en pincet og læg dem i en 24 brøndplade indeholdende 500 μL D-PBS (uden Ca ++ og Mg ++) i hver brønd, og pas på ikke at forstyrre mikrovævet.
- Tag snapshots af hvert stillads ved hjælp af et omvendt lysmikroskop ved forstørrelse 10x.
- Kørsel af ATP-analysen (se Materialetabel) i henhold til producentens anvisninger:
- Optø reagenset ved RT.
- Stilladserne vaskes to gange med 500 μL D-PBS (uden Ca++ og Mg++) for hvert vasketrin.
- Der tilsættes 120 μL reagens og 120 μL PBS til hvert stillads og de samme volumener til en tom brønd (dette vil fungere som tomt). Placer pladen dækket af aluminiumsfolie på en ryster og ryst kraftigt (500 o / min) i 5 minutter efterfulgt af 30 minutters inkubation for at stabilisere luminescenssignalet.
- 100 μL af de lyserede prøver overføres i to eksemplarer til en klar fladbundet analyseplade med 96 brønde til måling. Sørg for, at de tomme brønde ikke er placeret ved siden af de andre målebrønde med høj luminescens.
- Optag luminescensen ved hjælp af en mikropladelæser.
- Sammenlign prøvernes luminescens med standardernes luminescens for at bestemme ATP detekteret af reagenset i prøverne.
Representative Results
Manuskriptet beskriver en lever MPS-model, der bruges til vurdering af DILI. MPS letter dannelsen af 3D-levermikrovæv, der opretholdes yderst funktionelt under flow i op til 4 uger. PHH'er / HKC'er podes på kollagenbelagte stilladser for at danne levermikrovæv, der perfunderes med et vækstmedium og efter at have bestået QC-kontrollen doseres med forbindelser. Her viser vi data for troglitazon og pioglitazon, to strukturelt ens forbindelser, men med forskellige DILI-sværhedsgrader.
På dag 4, før lægemiddeldosering, vurderes en QC-kontrol af dannede levermikrovæv og består af LDH-frigivelse og urinstofsyntese (figur 1A). QC sigter mod at bekræfte, at leveren MPS producerer meget konsistente og fungerende levermikrovæv. De data, der præsenteres her, er genereret fra tre eksperimenter og viser gode niveauer af reproducerbarhed med lav variation inden for og mellem studier. Efter en 8-dages kultur vurderes flere sundheds- og levermålinger (albumin, urinstof, CYP3A4, ATP), og kontrolmikrovæv viser høje niveauer af leverfunktionalitet og reproducerbarhed (figur 1B, C). Kontrastfasemikroskopi og IF-farvning af levermikrotissuet (se supplerende materiale) viser høj såkonsistens i hele stilladsets mikrokanaler og afslører fordelingen af HKC'er i PHH-mikrotissuet (figur 1D)
Figur 1: Lever MPS producerer meget reproducerbare data og konsistente mikrovæv. (A) 3D-levermikrovævs QC-målinger på dag 4 og funktionalitetsvurdering ved afslutningen af undersøgelsen på dag 8 -(B) albumin og urinstof, (C) CY3A4 og ATP). Data indsamles fra 3 eksperimenter; I hvert eksperiment var der 3 køretøjskontrolreplikater. De viste data er Middel ± SD, N = 9. (D) Fasekontrastmikroskopi (10x og 20x) og IF af 3D-levermikrotvæv genereret ved cokulturering af PHH'er og HKC'er i lever-MPS-platform til vurdering af DILI. For at visualisere HKC'erne blev HKC'er før såning transduceret med en adenoviral vektor, der udtrykker eGFP (se Supplerende materiale). Repræsentative fotomikrografer vises. Transduktionen og billeddannelsen blev udført som et selvstændigt eksperiment for at demonstrere cellelokalisering og ikke udført med den beskrevne DILI-protokol. HKC-celler er prævalideret internt inden brug i eksperimentel cellekultur og skal have lave niveauer af aktivering efter optøning; dette vurderes ved at måle biomarkører IL-6 og TNF-alpha. Klik her for at se en større version af denne figur.
Troglitazon er kendt for at forårsage alvorlig DILI; efter sin licens til behandling af type 2-diabetes blev den trukket tilbage af FDA efter 3 år på markedet på grund af hyppigheden af leverskade forbundet med dens anvendelse. Til dato har offentliggjorte dyreforsøg ikke kunnet forudsige troglitazons potentiale til at forårsage alvorlig leverskade. Toksiciteten af denne forbindelse blev heller ikke påvist i standard in vitro 2D leverassays14.
Levermikrovæv i MPS blev doseret med troglitazon i 96 timer, og det forårsagede et akut toksisk respons,C-max-drevet , som blev påvist ved ALAT- og LDH-frigivelse og en hurtig reduktion i albumin- og urinstofproduktion på ca. 15 x Cmax efter akut eksponering for troglitazon (figur 2A). Cellulær endepunkt (ATP-indhold) og CYP3A4-aktivitet (til vurdering af metabolisk biotransformation), udtaget prøver efter 96 timers eksponering, yderligere bekræftet toksicitet forårsaget af troglitazon og EC:50-værdier var meget sammenlignelige med andre endepunkter (figur 2B). Brightfield-mikroskopibilleder taget efter 8-dages kultur i MPS afslører et sundt levermikrotissue, ensartet podet i hele stilladset (køretøjskontrol) i modsætning til generaliseret vævsdød / nedbrydning som det ses i replikaterne behandlet med positiv kontrol og troglitazon ved de to øverste testkoncentrationer (figur 2C).
Figur 2: Bestemmelse af DILI-risiko for troglitazon ved anvendelse af flere hepatotoksiske endepunkter. Levermikrovæv blev udsat for syv testkoncentrationer af troglitazon i 96 timer og sammenlignet med (A) LDH-frigivelse, ALAT-frigivelse, albuminproduktion, urinstofsyntese, CYP3A4-aktivitet og ATP-indhold. Blå linjer - 48 timers eksponering (kun medieendepunkter), røde linjer - 96 timers eksponering. Positiv kontrol var 100 μM chlorpromazin. Alle endepunkter måles fra de samme lever MPS-kulturer. De viste data er gennemsnitlige ± SD, N = 3. (B) Oversigt over E:50-numre genereret ud fra data. N.D. = data, der ikke kan afbildes. Line = ikke analyseret. (C) Repræsentativ brightfieldmikroskopi af levermikrotvæv efter 8-dages kultur (forstørrelse 10x). Klik her for at se en større version af denne figur.
Levertoksicitet efter eksponering for pioglitazon blev også undersøgt. Pioglitazon er en forbindelse, der vides at være af lav-DILI bekymring4 og ikke udøvede hepatotoksicitet i klassiske 2D primære hepatocytkulturer og endda i nogle mere avancerede 3D-modeller10,11. Mild hepatotoksisk effekt blev observeret på begge testede tidspunkter (figur 3). Der blev ikke fundet nogen LDH- eller ALT-frigivelse; Efter 48 timer blev der dog observeret en mild reduktion i albumin- og urinstofproduktionen ved ca. 25x Cmax (figur 3A). Der blev også observeret en meget lille reduktion i ATP-indholdet ved høje pioglitazonkoncentrationer, men dette var ikke signifikant. EC:50-værdier genereret fra dosis-respons-kurver er vist i figur 3B. Mikroskopi afslørede en lille ændring af mikrovævet efter 96 timers eksponering for pioglitazon ved de to højeste testede koncentrationer (figur 3C). Resultaterne viser leverens MPS's evne til at detektere toksiciteten af forbindelser med mild DILI-bekymring.
Figur 3: Bestemmelse af DILI-risiko for pioglitazon ved anvendelse af flere hepatotoksiske endepunkter. Levermikrovæv blev udsat for syv testkoncentrationer af pioglitazon i 96 timer og sammenlignet med (A) LDH-frigivelse, ALT-frigivelse, albuminproduktion, urinstofsyntese, CYP3A4-aktivitet og ATP-indhold. Blå linjer - 48 timers eksponering (kun medieendepunkter), røde linjer - 96 timers eksponering. Positiv kontrol var 100 μM chlorpromazin. Alle endepunkter måles fra de samme lever MPS-kulturer. De viste data er gennemsnitlige ± SD, N = 3. (B) Oversigt over EF:50-numre genereret på grundlag af data. N.D. = data, der ikke kan afbildes. Line = ikke analyseret. (C) Repræsentativ brightfieldmikroskopi af levermikrotvæv efter 8-dages kultur (forstørrelse 10x). Klik her for at se en større version af denne figur.
Ved at vurdere alle funktionelle endepunkter og biomarkører for toksicitetsoutput, der kan repræsentere in vivo eller kliniske scenarier (LDH-frigivelse, urinstofsyntese, albuminproduktion, CYP3A4-aktivitet, ATP-indhold, ALAT-frigivelse) og bekræfte de data, der genereres for begge testede forbindelser, der doseres ved et syvpunkts dosisinterval i 48 timer og 96 timer, er der genereret et varmekort for at give en "signatur af hepatotoksicitet", hjælpe med at identificere forbindelser med varierende grad af DILI-bekymring (figur 4).
Figur 4: Bestemmelse af "signatur af toksicitet" med lever-MPS. Heatmap, der viser troglitazon og pioglitazon fra seks funktionelle leverspecifikke endepunkter (LDH-frigivelse, ureasyntese, albuminproduktion, ALT-frigivelse, CYP3A4-aktivitet og ATP-indhold) efter 48 timer og 96 timers eksponering for syvpunkts dosisinterval. Hver værdi genereres som Middelværdi, N = 3 og normaliseres for at kontrollere prøver. Værdierne på farvelinjerne repræsenterer en stigning i foldning i forhold til elementelementerne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende materiale: Fluorescerende mikroskopbilleddannelse af mikrovæv og prækvalifikationsvurdering af celler. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
MPS er designet til at rekapitulere funktionelle enheder af menneskelige organer in vitro og er udviklet til at tackle begrænsningerne i konventionelle 3D-cellekulturmodeller27. Leveren er et af de mest modellerede organer ved hjælp af MPS, og der er udviklet en lang række systemer. Den menneskelige lever er ansvarlig for lægemiddelmetabolisme og generering af giftige lægemiddelmetabolitter, og dens funktion er et nøgleelement i modellen for lægemiddeludvikling, herunder vurdering af DILI-ansvaret for forbindelser28. Her har vi introduceret en ny metode til vurdering af DILI ved hjælp af en lever MPS; protokollen gør det muligt at søge mekanistisk indsigt for hver forbindelse, der analyseres for at bestemme, hvordan det kan forårsage DILI såvel som at være et meget følsomt og robust assay. Levermikrovæv dannes i MPS-pladerne, som er en kokultur af PHH- og HKC'er og er yderst funktionelle med høje niveauer af albumin- og urinstofproduktion samt høj CYP3A4-aktivitet sammenlignet med standard in vitro-levermodeller 20.
Selvom DILI-modellen, der er beskrevet her, kan tjene som et nyttigt værktøj i senere stadier af præklinisk test i lægemiddeludviklingsprocessen, har den også flere begrænsninger. Da størstedelen af MPS i øjeblikket er tilgængelig på markedet, er det en platform med lav kapacitet og derfor vanskeligere at bruge til storstilede lægemiddelscreeningsaktiviteter. Bestående af mikrovæv dannet ved cokulturering af PHH'er og HKC'er kan DILI-modellen heller ikke helt fange kompleksiteten af den menneskelige lever, og yderligere optimering ved at inkorporere forskellige typer celler (f.eks. Immunceller) ville være gavnligt for at tilføje værdi til den eksisterende model. Denne enkeltorgans MPS kan også kombineres med andre organplatforme, der kan dele et fælles medium og tillade organkrydstale på cellulært eller endokrin niveau, og det kan bidrage til bedre at forstå den mekanistiske indsigt i toksicitet, der ikke kun er begrænset til selve leveren. Desuden kan den som enhver relativt ny teknologi betragtes som dyr og dermed med begrænset tilgængelighed.
MPS er en platform, der bruges til at udvikle organotypiske modeller af enkelt- eller multihumant væv. Systemet består af en controller, navlestrengskabel og MPS-driver, hvori pladen indsættes (figur 5A). Hver lever MPS-plade har 12 uafhængige åbne brønde til dyrkning af primære leverceller i 3D på konstruerede stilladser. Sammenfattende er systemet QC-kontrolleret, og pladerne er primet på dag -1, PHH'erne og HKC'erne er podet på pladerne på dag nul (figur 5B, se 1). Indlejrede mikropumper letter cirkulationen af cellekulturmedier gennem stilladserne for at lette dannelsen af 3D-mikrovæv (figur 5B, se 2). Dannede mikrovæv QC's på dag 4, doseret med forskellige koncentrationer af hver forbindelse hver 48. time i 4 dage og analyseret for endepunktsbiomarkører på dag 8 (figur 5C). Den eksperimentelle tidslinje for DILI-analysen i MPS-pladen er afbildet i figur 5D.
Figur 5: Det mikrofysiologiske system og den eksperimentelle tidslinje for et standard DILI-assay. (A) Det mikrofysiologiske system med dets komponenter: controller (1), navlestrengskabel (2), dockingstation (3), MPS-driver (4) og LC12-plade (5). (B) Såning af PHH'er og HKC'er på LC12-pladen på dag 1 (1) og indlejrede mikropumper letter cirkulationen af cellekulturmedier med indstillelige strømningshastigheder gennem 3D-mikrovæv, der er podet på stilladserne (2). (C) Nedtagning af stilladserne ved undersøgelsens afslutning. (D) Eksperimentel tidslinje. Klik her for at se en større version af denne figur.
Når du udfører protokollen, er det vigtigt, at der udføres en robust system QC-kontrol inden start, kontrol af, at systemet fungerer pneumatisk korrekt, og forbrugspladerne inspiceres visuelt og grundes effektivt for at sikre jævn funktionalitet på tværs af alle brønde. At have primære humane celler af høj kvalitet er afgørende for denne protokol, med hepatocytter, der vides at klæbe konsekvent i cellekultureksperimenter og danne 3D-interaktioner. Optøning af disse celler er også et kritisk trin, da primære hepatocytter ikke bør resuspenderes ved pipetteringsvirkning, da dette hurtigt kan føre til celledød. At have cellelevedygtighed over 85% er afgørende for vellykket såning, da store mængder cellulært affald vil forstyrre dannelsen af 3D-mikrovæv. QC-kontrollen af dannet levermikrovæv på dag 4 er også vigtig, og brugeren skal sikre, at acceptable niveauer af LDH og Urea måles, da parametre uden for rækkevidde kan være tegn på vævsdannelse af dårlig kvalitet og muliggøre ligetil fejlfinding. Endelig skal hydrocortisonen, der anvendes i cellekulturmediet, fremstilles frisk på brugsdagen for at forhindre uønsket nedbrydning, der kan påvirke cellekulturens funktionalitet, da det er nødvendigt for at opretholde hepatocytternes metaboliske funktionalitet.
På trods af at den har betydelig kompleksitet, indeholder leveren MPS ikke alle celletyper i den menneskelige lever. Det er muligt at tilføje yderligere celletyper til model24,29 for at øge den fysiologiske relevans, men disse bør kun tilføjes med en klar begrundelse for anvendelseskonteksten. Til undersøgelse af DILI PHH er nøglecelletypen, og inkorporeringen af HKC'er i denne model gør det muligt at bestemme nogle immunologiske reaktioner. Det skal også bemærkes, at PHH'er isoleret fra menneskelige lever og kommercielt tilgængelige kryopræserverede PHH'er har tendens til at demonstrere nogle variationer fra parti til parti. Vi har her vist, at denne protokol giver reproducerbare resultater, når den anvendes sammen med præparater af høj kvalitet af celler. Der forventes dog en vis variation mellem partier og partier, og dette kan yderligere overvindes ved at bruge samlede masser af flere donorer. Disse begrænsninger kan overvindes ved at bruge hepatocytlignende celler differentieret fra iPSC, der rekapitulerer mange funktionelle egenskaber ved PHH'er, og som er blevet brugt i lægemiddeludviklingsprocessen30. HKC'er viser også meget til meget variation og et højt niveau af aktivering ved optøning; derfor er HKC-donorer prævalideret internt inden brug i eksperimentel cellekultur (samkultur med validerede PHH'er) og skal have lave niveauer af aktivering efter optøning; dette vurderes ved at måle biomarkører IL-6 og TNF-alpha (se Supplerende materiale).
De data, der præsenteres her, bekræfter, at analysen kan detektere DILI nøjagtigt, hvilket hjælper med at identificere hepatotoksiske stoffer, der muligvis ikke opdages af 2D10,11 og endda nogle 3D-modeller. Data genereret fra MPS anvendes stadig ikke som standard af medicinalindustrien til lovgivningsmæssige indsendelser eller lægemiddelscreeningsformål på grund af manglende processtandardisering og harmonisering, herunder reproducerbarhed mellem steder20. De data og eksperimentelle tilgange, der er demonstreret her, adresserer dette og viser, at levermodellen kan bruges rutinemæssigt og robust i DILI-skærme til nøjagtigt at forudsige ansvaret for nye forbindelser.
Ved at måle en række endepunkter for at producere en "signatur af hepatotoksicitet", hjælpe med at identificere forbindelser med forskellige niveauer af DILI-bekymring (herunder forbindelser, der ikke kan påvises ved andre in vitro-metoder) og deres toksicitetsmekanismer afsløret. Denne teknologi kan lukke kløften mellem traditionelle cellekultur- og dyremodeller på den ene side og humane kliniske forsøg og gå videre mod simulering af humane biologiske tilstande til præklinisk vurdering af levertoksicitet som en del af lægemiddeludviklingsprocessen.
Disclosures
Alle forfattere er ansatte hos CN Bio Innovations Limited.
Acknowledgments
CN Bio Innovations Ltd. finansierede denne undersøgelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well cell culture cluster plates flat bottom | Corning | 3524 | |
| 96 well clear assay plates, flat bottom clear plastic | Greiner | 655101 | |
| 96 well plates black flat bottom | Corning | 3915 | |
| 96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | ThermoScientific | 165306 | |
| Advanced DMEM (1x) | Gibco | 12491015 | Cell culture media. |
| AssayMax Albumin ELISA Kit | AssayPro | EA3201-1 | Dilution 1:250. Time point Day 4, 6, and 8. |
| Cell Maintenance Cocktail B, (Primary Hepatocyte Maintenance Supplements) | Gibco | CM4000 | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9682 | Dilution 1:1. Time point Day 8. |
| Chlorpromazine HCl | Sigma Aldrich | C8138 | |
| Chromacol blue lids, 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps | ThermoScientific | 9-SCK(B)-ST1 | glass vial |
| Chromacol vials, 9 mm Clear Glass Screw Thread Vials | ThermoScientific | 2-SVW | |
| Class 2 Microbiological Safety Cabinets - Trimat2 1500 exhaust | Contained Air Solutions | ||
| Conical tubes 50 mL | Greiner | 227261 | |
| Cryopreserved Hepatocyte Recovery Medium (CHRM) | ThermoFisher Scientific | Gibco CM7000 | |
| Cryopreserved primary human hepatocytes | BioIVT Europe | Lot. RAS | |
| CytoTox 96 Cytotoxicty (LDH) Assay Kit | Promega | G1781 | Dilution - none. Time point Day 4, 6 and 8 |
| >Data analysis model used to generate the graph and EC:50 curves was nonlinear regression (curve fit) asymmetric sigmoidal, 5PL, where X is log(concentration | GraphPad Prism 9 | ||
| Disposable PES Filter Units 500mL | Fisher Scientific | 15913307 | |
| Disposable Pipette Basins 50ml | Fisher Scientific | 12369175 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich | Sigma D2650 | |
| Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (D-PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | |
| Easy Reader Conical Polypropylene Centrifuge Tubes 15 mL | Fisher Scientific | 11889640 | |
| Foetal bovine serum | Gibco | 10500064 | |
| Human ALT ELISA Kit | Abcam | ab 234578 | Dilution 1:5. Time point Day 6 and 8. |
| Human Cryopreserved Kupffer Cells | Lonza Europe | Lot. 190088KC | |
| hydrocortisone | Merck | H0888-1G | |
| Incubators models: New Brunswick Galaxy 170 S, New Brunswick Galaxy 170 R and CellXpert® C170. | Eppendorf | All serviced yearly; paperwork available upon request. | |
| Inverted Microscope | Leica DMIL LED | ||
| MPS know as Organ-on-a-Chip (OOC) | CN Bio Innovations Ltd. | ||
| MPS LC-12 plate | CN Bio Innovations Ltd. | ||
| Neubauer Improved C-Chip Disposable Haemocytometer (2 channel) | Cambridge Bioscience | DHC-N01-50 | |
| P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V9002 | Dilution - none. Time point Day 8 |
| PhysioMimix MPS platform | CN Bio Innovations Ltd. | ||
| Pioglitazone | MedChemExpress Tocris | HY-13956/CS-1700 | |
| Quantichrom Urea Assay Kit – Bioassay systems | Bioassay Systems | DY970-05 | Dilution 1:2 if initial reading is too high. Time point Day 4, 6 and 8. |
| Silica gel | Sigma-Aldrich | S7625 | |
| Software used to analyse and generate all the graphs was | GraphPad Prism 9 | ||
| Stripettes 10 mL | Fisher Scientific | 11839660 | |
| Stripettes 25 mL | Fisher Scientific | 11839181 | |
| Thawing plate Cocktail A, (Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements) | Gibco | CM3000 | |
| Troglitazone | MedChemExpress Tocris | 97322-87-7 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Tubes 1.5 mL | Greiner | 616201 | |
| Weighing balance - model PA214C and AV213C | Ohaus Corp |
References
- Lisi, D. M. Drug-induced liver injury: An overview. US Pharmacist. 41 (12), 30-34 (2016).
- Kuna, L., et al. Models of drug induced liver injury (DILI)-current issues and future perspectives. Current Drug Metabolism. 19 (10), 830-838 (2018).
- Katarey, D., Verma, S. Drug-induced liver injury. Clinical Medicine. 16 (6), London, England. 104-109 (2016).
- Kullak-Ublick, G. A., et al. Drug-induced liver injury: recent advances in diagnosis and risk assessment Recent advances in clinical practice. Gut. 66, 1154-1164 (2017).
- Dirven, H., et al. Performance of pre-clinical models in predicting drug-induced liver injury in humans: a systematic review. Scientific Reports. 11 (1), 6403 (2021).
- Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies. Current Drug Metabolism. 9 (1), 1-11 (2008).
- Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line HepG2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism and Disposition. 31 (8), 1035-1042 (2003).
- Gerets, H. H. J., et al. Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins. Cell Biology and Toxicology. 28 (2), 69-87 (2012).
- Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier. Pharmaceutical Research. 23 (7), 1482-1490 (2006).
- Li, F., Cao, L., Parikh, S., Zuo, R. Three-dimensional spheroids with primary human liver cells and differential roles of kupffer cells in drug-induced liver injury. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (6), 1912-1923 (2020).
- Proctor, W. R., et al. Utility of spherical human liver microtissues for prediction of clinical drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 91 (8), 2849-2863 (2017).
- Lin, C., Khetani, S. R. Advances in engineered liver models for investigating drug-induced liver injury. BioMed Research International. 2016, 1829148 (2016).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 32 (1), 56-67 (2000).
- Bell, C. C., et al. Comparison of hepatic 2D sandwich cultures and 3D spheroids for long-term toxicity applications: A multicenter study. Toxicological Sciences. 162 (2), 655-666 (2018).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Khetani, S. R., et al. Use of micropatterned co-cultures to detect compounds that cause drug-induced liver injury in humans. Toxicological Sciences. 132 (1), 107-117 (2013).
- Ma, X., et al. Deterministically patterned biomimetic human iPSC-derived hepatic model via rapid 3D bioprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the united States of America. 113 (8), 2206-2211 (2016).
- Dieterle, P. Y. M., Dieterle, F. Tissue-specific, non-invasive toxicity biomarkers: translation from pre-clinical safety assessment to clinical safety monitoring. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (9), 1023-1038 (2009).
- Rowe, C., et al. Perfused human hepatocyte microtissues identify reactive metabolite-forming and mitochondria-perturbing hepatotoxins. Toxicology in Vitro. 46, 29-38 (2018).
- Rubiano, A., et al. Characterizing the reproducibility in using a liver microphysiological system for assaying drug toxicity, metabolism, and accumulation. Clinical and Translational Science. 14 (3), 1049-1061 (2021).
- Tsamandouras, N., Kostrzewski, T., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Hughes, D. J., Cirit, M. Quantitative assessment of population variability in hepatic drug metabolism using a perfused three-dimensional human liver microphysiological system. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 360 (1), 95-105 (2017).
- Ortega-Prieto, A. M., et al. 3D microfluidic liver cultures as a physiological pre-clinical tool for hepatitis B virus infection. Nature Communications. 9 (1), 682 (2018).
- Kostrzewski, T., et al. Three-dimensional perfused human in vitro model of non-alcoholic fatty liver disease. World Journal of Gastroenterology. 23 (2), 204-215 (2017).
- Kostrzewski, T., et al. A microphysiological system for studying nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology Communications. 4 (1), 77-91 (2020).
- Vacca, M., et al. Bone morphogenetic protein 8B promotes the progression of non-alcoholic steatohepatitis. Nature Metabolism. 2 (6), 514-531 (2020).
- Long, T. J., et al. Modeling therapeutic antibody-small molecule drug-drug interactions using a three-dimensional perfusable human liver co-culture platforms. Drug Metabolism and Disposition. 44, 1940-1948 (2016).
- Bai, J., Wang, C. Organoids and microphysiological systems: New tools for ophthalmic drug discovery. Frontiers in Pharmacology. 11, 407 (2020).
- Ribeiro, A. J. S., Yang, X., Patel, V., Madabushi, R., Strauss, D. G. Liver microphysiological systems for predicting and evaluating drug effects. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 106 (1), 139-147 (2019).
- Clark, A. M., et al. A microphysiological system model of therapy for liver micrometastases hhs public access. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1170-1179 (2014).
- Qosa, H., Ribeiro, A. J. S., Hartman, N. R., Volpe, D. A. Characterization of a commercially available line of iPSC hepatocytes as models of hepatocyte function and toxicity for regulatory purposes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 110, 107083 (2021).
