Summary
Geneesmiddel-geïnduceerde leverbeschadiging (DILI) is een belangrijke oorzaak van falen van geneesmiddelen. Er is een protocol ontwikkeld om de DILI-aansprakelijkheid van een verbinding nauwkeurig te voorspellen met behulp van een levermicrofysiologisch systeem (MPS). Het levermodel maakt gebruik van de cocultuur van primaire levercellen en translationeel relevante eindpunten om cellulaire reacties op de behandeling te beoordelen.
Abstract
DILI is een belangrijke oorzaak van uitputting bij de ontwikkeling van geneesmiddelen met meer dan 1000 door de FDA goedgekeurde geneesmiddelen waarvan bekend is dat ze mogelijk DILI bij mensen veroorzaken. Helaas wordt DILI vaak pas gedetecteerd als geneesmiddelen een klinisch stadium hebben bereikt, waardoor de veiligheid van patiënten in gevaar komt en aanzienlijke verliezen voor de farmaceutische industrie wordt veroorzaakt. Rekening houdend met het feit dat standaard 2D-modellen beperkingen hebben bij het detecteren van DILI, is het essentieel om in vitro modellen te ontwikkelen die meer voorspellend zijn om de vertaalbaarheid van gegevens te verbeteren. Om causaliteit en mechanistische aspecten van DILI in detail te begrijpen, is een humaan lever-MPS ontwikkeld dat bestaat uit menselijke primaire leverparenchymale en niet-parenchymale cellen (NPC's) en gekweekt in 3D-microtissues op een ontworpen steiger onder perfusie. Gecryopreserveerde primaire menselijke hepatocyten (PHHs) en Kupffer-cellen (HKC's) werden gedurende maximaal twee weken gecocultureerd als microtissues in het MPS-platform en elke verbinding van belang werd herhaalbaar gedoseerd op levermicrotissues bij zeven testconcentraties gedurende maximaal vier dagen. Functionele leverspecifieke eindpunten werden geanalyseerd (inclusief klinische biomarkers zoals alanineaminotransferase, ALT) om de leverfunctie te evalueren. Acute en chronische blootstelling aan verbindingen van verschillende DILI-ernst kan worden beoordeeld door reacties op enkelvoudige en meervoudig gedoseerde microtissues te vergelijken. De methodologie is gevalideerd met een brede set van ernstige en mild hepatotoxische verbindingen. Hier tonen we de gegevens voor pioglitazon en troglitazon, bekende hepatotoxische verbindingen die uit de handel zijn genomen vanwege het veroorzaken van leverfalen. Over het algemeen is aangetoond dat het lever MPS-model een nuttig hulpmiddel kan zijn om DILI en de associatie met veranderingen in de leverfunctie te beoordelen. Het model kan bovendien worden gebruikt om te beoordelen hoe nieuwe verbindingen zich gedragen in verschillende subgroepen van patiënten en hoe toxiciteitsprofielen kunnen worden beïnvloed door leverziektetoestanden (bijv. Virale hepatitis, leververvetting).
Introduction
DILI blijft de meest voorkomende oorzaak voor acuut leverfalen in de VS en Europa en is een belangrijke oorzaak van uitputting van verbindingen in het ontwikkelingsproces van geneesmiddelen1. Bijna alle klassen van medicijnen kunnen hepatotoxiciteit veroorzaken, waarbij middelen van het centrale zenuwstelsel en antibiotica veruit de meest voorkomende behandelingen zijn die DILI veroorzaken bij patiënten2. Geneesmiddel-geïnduceerde hepatotoxiciteit wordt veroorzaakt door een complexe interactie van genetische, niet-genetische en omgevingsfactoren, wat leidt tot de dood van hepatocyten en andere leverceltypen, waaronder cholangiocyten en endotheelcellen 1,3.
DILI-veroorzakers kunnen op twee manieren worden geclassificeerd: die welke voorspelbare dosisafhankelijke leverschade veroorzaken of die welke idiosyncratische DILI veroorzaken die zeldzaam is en zich onafhankelijk van de dosis van het geneesmiddel, of de route of de duur van toediening ontwikkelt, maar verantwoordelijk is voor maximaal een zesde van alle acute leverfalen in de VS slechts4. Helaas wordt DILI vaak niet gedetecteerd totdat geneesmiddelen de klinische stadia van het ontwikkelingsproces van geneesmiddelen hebben bereikt. Geneesmiddel-geïnduceerde leverbeschadiging rang (of DILIrank) bestaat uit meer dan duizend FDA-goedgekeurde geneesmiddelen die zijn verdeeld in vier klassen op basis van hun potentieel voor het veroorzaken van DILI, en hun gebruik bij patiënten moet nauwlettend worden gecontroleerd5.
Het bestuderen van mechanismen van hepatotoxiciteit van geneesmiddelen blijft zeer uitdagend en daarom zijn er veel preklinische modellen ontwikkeld om mechanismen van DILI te onderzoeken. De huidige in vitro en in vivo modellen die worden gebruikt om DILI in preklinische ontwikkeling te voorspellen, hebben verschillende beperkingen om inzicht te geven in de complexe, veelzijdige interacties in een levend menselijk lichaam. Kankerachtige levercellijnen (d.w.z. HepG2, HepaRG) gekweekt in 2D worden nog steeds gebruikt in de vroege stadia van de ontwikkeling van geneesmiddelen voor het evalueren van de toxiciteit van kandidaat-verbindingen6. Toch zijn deze cellijnen afkomstig van afzonderlijke donoren en vertonen ze abnormale niveaus van leverfunctie en vertonen ze niet altijd een hoge gevoeligheid voor detectie van DILI 7,8. Als alternatief voor kankerachtige levercellijnen vertegenwoordigen PHHs beter de menselijke leverfysiologie als ze op de juiste manier in vitro worden gekweekt, hoewel er verschillende beperkingen bestaan met hun cultuur, zoals korte incubatietijd met geneesmiddelen, relatief korte levensduur, verlies van hepatische genexpressie en veranderingen in metabole functies van geneesmiddelen 9,10,11 . PHHs kunnen worden gekweekt op extracellulaire matrixeiwitten in standaard 2D-celkweekplaten, maar als nadeel betekent de snelle afname van hun functie dat ze een lage gevoeligheid (<50%) hebben voor DILI-voorspelling12.
Aan de andere kant is het testen op diermodellen traag, duur en heeft het een vertaling van verschillende soorten nodig om voorspelling naar mensen te extrapoleren. De meeste nieuw ontwikkelde geneesmiddelen krijgen geen goedkeuring, waardoor dit proces duur en riskant is5. Bovendien zijn diermodellen voor het testen van nieuwe mensspecifieke modaliteiten minder geschikt vanwege gensequentie- of immunologische responsverschillen ten opzichte van mensen13.
Bijgevolg is de belangstelling voor meer geavanceerde driedimensionale (3D) in vitro levermodellen exponentieel gegroeid. Het kweken van PHHs als sferoïdale structuren gegenereerd door zwaartekrachtaggregatie in hangende druppels of op ultralage bevestigingsoppervlakken vertegenwoordigt een high-throughput methode voor het beoordelen van samengestelde aansprakelijkheden14. PHH-sferoïden zijn gebruikt om DILI te beoordelen in een zieke achtergrond (bijv. steatose en cholestase)15. Een breed scala aan modellen is ontwikkeld om vergulde micro-patroon coculturen van hepatocyten met stromale fibroblasten16, 3D bio-geprinte leverweefsels17, 3D-sferoïde culturen met of zonder hepatische niet-parenchymale cellen15 te omvatten. Al deze methoden hebben echter nog steeds nadelen, en het kweken van PHHs in een meer fysiologisch relevante micro-omgeving zou hen gedurende langere tijd hogere niveaus van functionaliteit kunnen bieden om het onderzoek naar langdurige blootstelling aan potentiële hepatotoxische middelen mogelijk te maken. Om de translationele relevantie van een geavanceerde in vitro PHH-cultuur te verbeteren, moeten bovendien klinisch relevante functionele eindpunten of biomarkers voor toxiciteitsoutput worden gebruikt om gegevens in vivo of klinische scenario's te kunnen vergelijken18.
In deze studie beoordeelden we of een MPS, ook bekend als een Organ-on-a-Chip (OOC), in vitro levermodel kon worden gebruikt om de gedetailleerde mechanistische aspecten van levertoxiciteit te begrijpen. Van het MPS is eerder aangetoond dat het zeer functionele 3D-levermicrotissues onder stroom houdt gedurende maximaal 4 weken19. Het systeem is onlangs getest door de FDA en heeft aangetoond dat het een hoge reproduceerbaarheid heeft bij het uitvoeren van geneesmiddeltoxiciteit, metabolisme en intracellulaire accumulatie20. Bovendien had het systeem in vergelijking met sferoïden en sandwichculturen een stabielere functie en een hogere gevoeligheid bij het detecteren van de toxiciteit van verschillende geneesmiddelen20. Tot op heden is het MPS gebruikt in een breed scala aan toepassingen die adme21, ziektemodellering (HBV22, NAFLD 23,24,25) en geneesmiddelinteracties26 omvatten, waardoor het mogelijk zeer geschikt is voor het beoordelen van acute en chronische DILI. De hier gepresenteerde technologie biedt een alternatief om de kloof tussen meer traditionele celculturen en diermodellen en menselijke klinische proeven te dichten, en vordert in de richting van de simulatie van menselijke biologische aandoeningen ter ondersteuning van de beoordeling van de levertoxiciteit van kandidaat-verbindingen in preklinische stadia van het ontwikkelingsproces van geneesmiddelen.
Protocol
Al het werk werd uitgevoerd in het laboratorium volgens strikte gezondheid en veiligheidsprocedures en in overeenstemming met de eigen laboratoriumrisicobeoordelingen en SOP's. Alle gebruikte apparatuur wordt onderhouden volgens de richtlijnen van de fabrikant. Microbiologische veiligheidskasten (MBSC's) worden jaarlijks onderhouden en Ki-Discus (kaliumjodide) getest volgens Britse normen. Het protocol volgt de praktijkcode en richtlijnen van de Human Tissue Authority (HTA) van het Verenigd Koninkrijk en maakt gebruik van ethisch geproduceerde primaire menselijke cellen die worden geleverd door leveranciers die volledig voldoen aan de algemene vereisten voor geïnformeerde toestemming (45 CFR § 46.116 en § 46.117) en Good Clinical Practice (GLP) (ICH E6) en regelgevende en ethische commissies.
1. Celkweekmedia voorbereiden
OPMERKING: Bereid Seeding Advanced DMEM medium voor op dag -1 en bewaar bij 4 °C. Bereid Maintenance Advanced DMEM medium voor op dag 1 en bewaar het bij 4 °C gedurende maximaal 1 week.
- Seeding Advanced DMEM medium voor PHHs en HKCs cocultuur: Vul één fles van 500 ml Advanced DMEM medium (Table of Materials) aan met 18 ml cocktail A (eindconcentratie van 3,6%) en met 25 ml FBS (eindconcentratie 5%).
- Onderhoud Geavanceerd DMEM-medium voor PHHs en HKCs-cocultuur: Vul één fles van 500 ml geavanceerd DMEM-medium (materiaaltabel) aan met 20 ml cocktail B (eindconcentratie van 4%) en 500 nM hydrocortison.
OPMERKING: Hydrocortison wordt vers gemaakt op de dag van gebruik en de stappen voor het bereiden van de stamoplossing en de vereiste verdunningen worden hieronder vermeld. - Bereiding van 500 nM hydrocortison in Maintenance Advanced DMEM Medium
- Bereiding van de uitgangsvoorraadoplossing (20 mM): Weeg 7,24 mg hydrocortison (Materiaaltabel) af in een glazen injectieflacon van 1 ml. Noteer de exacte hoeveelheid gewogen hydrocortison en bepaal het volume dimethylsulfoxide (DMSO) met behulp van de volgende berekening:
- Bereiding van de werkende 100 μM hydrocortison stockoplossing: Voeg 5 μL van de startende 20 mM stamoplossing toe aan 995 μL Advanced DMEM.
OPMERKING: Het verdunnen van 25 μL van de DMSO-oplossing uit stap 1 in water of media resulteert in een DMSO-concentratie van 0,5%. In de uiteindelijke oplossing is de DMSO-concentratie 0,0025%. In dit geval resulteert het extra volume van 5 μL in een onbeduidende verandering in het totale volume. - Bereiding van de werkende 500 nM hydrocortisonoplossing in Advanced DMEM: Voeg voor het bereiden van 1 ml 500 nM hydrocortisonoplossing in Advanced DMEM 5 μL van de stamoplossing van 100 μM hydrocortison toe aan 995 μL van het Maintenance Advanced DMEM-medium.
- Bereiding van de uitgangsvoorraadoplossing (20 mM): Weeg 7,24 mg hydrocortison (Materiaaltabel) af in een glazen injectieflacon van 1 ml. Noteer de exacte hoeveelheid gewogen hydrocortison en bepaal het volume dimethylsulfoxide (DMSO) met behulp van de volgende berekening:
2. MPS set-up en priming (Dag -1)
- Sluit de controller aan op het dockingstationhuis in een celkweekincubator en zorg ervoor dat vers droogmiddel (Table of Materials) wordt toegevoegd aan de droogmiddelpot aan de achterkant van de controller.
OPMERKING: De controllereenheid trekt na verloop van tijd vocht uit de incubator en wordt droog gehouden met vers droogmiddel. - Schakel de controller IN door op de bootknopknop erachter te drukken en wacht 5 minuten tot het systeem stabiliseert en de druk bereikt. Controleer vervolgens het scherm voor het pneumatische rapport om er zeker van te zijn: (i) de output van het drukreservoir bereikte ~ 2000 mBar en (ii) de vacuümreservoiruitgang ~ 850 mBar bereikte.
- Verwijder elke plaat uit de verpakking en inspecteer elke put visueel om te controleren op mogelijke defecten (ontbrekende steigers, scheuren, enz.).
- Plaats een stuurprogramma (met een plaat erop) op het dockingstation om te controleren of de bestuurder wordt herkend door het dockingstation en de controller. Controleer of de output van het drukreservoir met minder dan 100 mBar is gedaald en dat de output van het vacuümreservoir met minder dan 500 mBar is toegenomen.
- Primeer elk putje door 500 μL Seeding Advanced DMEM-medium (voorverwarmd tot 37 °C) aan de reservoirzijde toe te voegen.
- Selecteer het Prime-programma op het controllerscherm (upflow gedurende 3 minuten bij 2,5 μL/s) totdat de vloeistof door de filtersteunen komt. OPMERKING: 'Up flow' is een instelling op de controller waarmee media van het reservoir naar boven kunnen stromen door de steigers in de LC12-plaat.
- Vul alle putten met nog eens 1,1 ml Seeding Advanced DMEM-medium om het oppervlaktekanaal te bedekken. Alle putten zullen dan op hun volledige werkvolume van 1,6 ml zijn.
- Plaats de drivers met platen in een 37 °C en 5% CO2-incubator , sluit ze aan op het dockingstation en voer het Incubate-programma uit.
OPMERKING: Alle programma's die in het experiment worden gebruikt (Prime, Incubate, Seed, Media Change) zijn vooraf ingesteld in het MPS-systeem. Primeer de borden in de incubator tot ze klaar zijn om te zaaien.
3. Levercellen zaaien in MPS (dag 0)
- Prevalidateer alle PHHS en HKCs. Alle PHHs en HKC's loten worden vooraf intern gevalideerd voordat het celkweekexperiment wordt uitgevoerd (zie Aanvullend materiaal).
- Ontdooi injectieflacons met PHHs en HKCs-cellen (Tabel van Materialen) door de injectieflacons gestaag in een waterbad van 37 °C te houden totdat er slechts een klein stukje ijs overblijft.
- Pipetteer PHHs rechtstreeks in een buis met voorverwarmde (37 °C) gecryopreserveerde Hepatocyte Recovery Medium CHRM media (maximaal twee injectieflacons per buis).
- Pipetteer de cellen voorzichtig en gebruik vervolgens 1 ml CHRM om de resterende cellen uit de cryobuis te wassen. Wees heel voorzichtig met cellen bij het ontdooien en overbrengen in een conische buis.
LET OP Roer de injectieflacons niet tijdens het ontdooien en pipetteer de inhoud ervan niet op en neer. - Pipetteer HKCs-cellen voorzichtig van de cryobuis in 10 ml ijskoud Seeding Advanced DMEM-medium in een centrifugebuis van 15 ml.
OPMERKING: Er kunnen maximaal 2 injectieflacons met HKC's worden gecombineerd. - Centrifugeer beide celtypen bij kamertemperatuur (RT) bij 100 x g gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de PHHs in warm Seeding Advanced DMEM medium en HKCs in ijskoud Seeding Advanced DMEM medium (om celklontering te helpen verminderen), met behulp van 1 ml per flacon met cellen toegevoegd aan de buis en plaats de cellen op ijs. Gebruik een zachte schommelende actie om de cellen te resuspenderen.
LET OP: Resuspend PHHs niet door pipetwerking, omdat dit kan leiden tot celdood. - Combineer de celsuspensies uit meerdere buizen (indien van toepassing - d.w.z. als alle PHHs van dezelfde donor zijn), maar meng geen celtypen.
- Cellen tellen. Noteer de levensvatbaarheid (moet hoger zijn dan 85% voor beide celtypen, PHHs en HKCs) en het totale aantal cellen. Als de levensvatbaarheid van cellen onder de 85% daalt, ontdooi dan een nieuwe injectieflacon met cellen en beoordeel de levensvatbaarheid van cellen opnieuw.
- Bereken de levensvatbaarheid van cellen met behulp van de volgende formule:
- Bereken het gewenste volume van de celsuspensie om in elke put te zaaien en extra volume Seeding Advanced DMEM-medium dat nodig is om het totale zaaivolume op 400 μL te brengen. Celaantallen per put: 0,4 x 106 PHHs en 0,04 x 106 HKCs per put, en celdichtheid van 0,25 x 106 PHHs / ml, respectievelijk 0,025 x 106 HKCs/ml.
- Koppel het stuurprogramma los van het dockingstation en plaats het in de MBSC.
- Aspirateer de media van de bovenstaande steiger naar het stoppunt (naar beneden gaand door de diepe inkeping op de keerring), kanaal en reservoir. Laat een "dood volume" van 0,2 ml in de cultuurput en bereik net boven het schavot. Er moet voor worden gezorgd dat het totale medium niet van boven de steiger wordt verwijderd om te voorkomen dat er luchtbellen ontstaan.
- Voeg 400 μL Seeding Advanced DMEM-medium toe aan de putkamer, breng de driver terug naar het dockingstation in de incubator en voer het Media Change-programma gedurende 3 minuten uit. Het programma pauzeert automatisch na 3 minuten.
- Zodra dit is voltooid, koppelt u de driver los van het dockingstation en plaatst u deze terug in de MBSC.
- Adem de media van de bovenstaande steiger naar beneden naar het stoppunt en aan het uiteinde van het reservoir van elke put.
- Resuspendeer de PHHs voorzichtig door de buis voorzichtig te schudden en voeg vervolgens het vereiste volume van de celsuspensie toe aan elke kweekput. Pipetteer voorzichtig de celsuspensie en zorg ervoor dat de cellen gelijkmatig over de steiger van de plaat verspreiden.
OPMERKING: Om een goede dekking in de hele steiger te garanderen, gebruikt u een langzame wervelbeweging om cellen op de steiger te pipetteren. - Neem op dezelfde manier hkcs zorgvuldig opnieuw op en voeg de celsuspensies goed toe aan elke cultuur.
OPMERKING: Gebruik een langzame wervelende beweging om HKC's te zaaien om een goede dekking op het hele schavot te garanderen. De twee substappen van het zaaien kunnen worden gescheiden, of de twee celtypen kunnen vooraf worden gemengd met een geschikte dichtheid en gelijktijdig worden gezaaid. - Zodra alle putten beide celtypen bevatten, plaatst u de MPS-driver op het dockingstation in de incubator zonder deze fysiek aan te sluiten en laat u deze 1 uur staan.
- Vul na 1 uur elke put met het vereiste volume extra Seeding Advanced DMEM-medium om 400 μL te bereiken en voer het Seed-programma uit.
- Na 2 minuten pauzeert het programma automatisch, verwijdert de driver uit de incubator en voegt langzaam 1000 μL van het Seeding Advanced DMEM-medium toe aan het kanaal (dichter bij het reservoireinde dan de putkamer) om een totaal volume van 1,4 ml te bereiken (met nog eens 200 μL dood volume in de kanalen).
- Verplaats de platen naar de incubator en voer de rest van het Seed-programma gedurende 8 uur uit.
OPMERKING: Flow schakelt na 8 uur automatisch over naar het Incubate-programma.
4. Media verandering (Dag 1)
- Koppel het stuurprogramma los van het dockingstation en plaats het in de MBSC.
- Voer mediaverandering uit door het Seeding Advanced DMEM-medium in de putkamer tot aan het stoppunt te verwijderen.
- Voeg 400 μL van het Maintenance Advanced DMEM-medium toe aan de putkamer, breng de driver terug naar het dockingstation in de incubator en voer het Media Change-programma gedurende 3 minuten uit. Het programma pauzeert automatisch na 3 minuten.
- Koppel de driver los van het dockingstation en haal in de MBSC media weg uit de reservoirkamer, het kanaal en het stoppunt boven de steiger. Op dit punt zal de cultuurput worden teruggebracht naar het dode volume.
- Vul de reservoirkamer aan met 1,4 ml vers voorverwarmd (37 °C) Maintenance Advanced DMEM-medium.
- Breng de chauffeur terug naar het dockingstation in de incubator en voer het Incubate-programma uit.
5. Lever microtissue kwaliteitscontrole (QC), mediaverzameling, mediaverandering en medicijndosering (dag 4)
- Voer op dag 4 een mediawijziging uit met behulp van de Maintenance Advanced DMEM-medium- en QC-controles om ervoor te zorgen dat het zaaien succesvol is geweest.
OPMERKING: QC is een proces dat wordt gebruikt om de gezondheid van de gevormde microtissues te controleren door lactaatdehydrogenase (LDH) en ureum te meten. - Voordat u de QC uitvoert, bereidt u verse voorraadoplossingen voor elke te testen verbinding voor (in Maintenance Advanced DMEM-medium of Maintenance Advanced DMEM-medium met 0,1% DMSO, afhankelijk van de oplosbaarheid van elke verbinding). Bereid de verdunningen dienovereenkomstig voor om de testconcentraties voor elke verbinding te verkrijgen.
- Koppel de driver en de plaat los van het dockingstation en breng over naar een MBSC.
- Breng 50 μL media over van elke put met behulp van een pipet naar een 96-putplaat om een LDH-test (Tabel van materialen) uit te voeren voordat u monsters neemt en 25 μL voor een ureumtest (Tabel met materialen).
OPMERKING: LDH- en ureumtests worden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. - Ga verder met het experiment na QC als de LDH-waarden lager zijn dan 2 AU/106 cellen en het ureum hoger is dan 40 μg/dag/106 cellen.
OPMERKING: Albumine wordt niet gebruikt als QC omdat het een lange test is om op de dag uit te voeren en later zal worden getest zodra het experiment is voltooid uit de monsters die op dag 4 zijn teruggetrokken. - Als putten QC falen, verwijder ze dan uit het experimentele ontwerp.
- Zodra de experimentele lay-out is bevestigd, bemonstert u de resterende media uit elke put en zorgt u ervoor dat u de celcultuur niet verstoort door de steiger aan te raken. Bewaar de verzamelde media (gelabeld als pre-dosismonsters) bij -80 °C voor latere testen.
- Voer mediawijzigingen uit in een MBSC volgens de stappen 4.3-4.5. Verander de putten in Maintenance Advanced DMEM-medium met de juiste medicijnconcentratie volgens het experimentele ontwerp.
- Eenmaal voltooid, brengt u de bestuurder terug naar het dockingstation in de incubator en voert u het Incubate-programma uit.
6. Mediaverzameling, mediawissel en medicijndosering (dag 6)
- Bereid verse voorraadoplossingen voor elke te testen verbinding (in Maintenance Advanced DMEM medium of Maintenance Advanced DMEM medium met 0,1% DMSO, afhankelijk van de oplosbaarheid van elke verbinding). Bereid verdunningen dienovereenkomstig voor om de testconcentraties voor elke verbinding volgens het plaatplan op te leveren.
- Koppel de driver en de plaat los van het dockingstation en breng over naar een MBSC.
- Verzamel media uit elke put (~ 1 ml) handmatig met een pipet om ervoor te zorgen dat de celcultuur niet wordt verstoord door de steiger aan te raken, test voor LDH en ureum. Bewaar de rest van de verzamelde media bij -80 °C voor latere testen en label ze 48 uur na de dosis monsters.
- Doseer elke put opnieuw met dezelfde geneesmiddelconcentratie als op dag 4 en volgens het plaatplan door mediaverandering uit te voeren volgens de stappen 4.3-4.5.
- Eenmaal voltooid, brengt u de bestuurder terug naar het dockingstation in de incubator en voert u het Incubate-programma uit.
7. Het experiment beëindigen (dag 8)
- Koppel de driver en de plaat los van het dockingstation en breng over naar een MBSC.
- Monster media uit elke put handmatig met behulp van een pipet, zorg ervoor dat u de celcultuur niet verstoort door de steiger aan te raken.
- Test de teruggetrokken media voor LDH en ureum en bewaar de rest van de verzamelde media bij -80 °C voor latere testen.
- Cyp3A4-glo-test uitvoeren.
- Meet de effecten van de geteste geneesmiddelen op cytochroom P450 CYP3A4-activiteit in PHHs aan het einde van het experiment met behulp van deze test.
- Reconstitueer het detectiereagens (voor cyp3a4-test, zie materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant. Als het detectiereagens eerder is gereconstitueerd en ingevroren, haal het dan uit de vriezer van -20 °C en laat het ontdooien bij RT.
- Bereid 20 mM voorraad D-luciferin standaard volgens de instructies van de fabrikant.
- Bereid werkend luminogeen substraatmedium voor met een 1:1000 verdunning van Luciferin IPA in Maintenance Advanced DMEM medium (2 ml luminogeen substraatmedium per put).
- Voer een mediawijziging uit zoals beschreven in stap 4.3-4.5 met luminogeen substraatmedium. Bewaar 500 μL van het luminogene substraatmedium in een glazen injectieflacon van 1,5 ml (materiaaltabel) als invoermateriaal.
- Breng de chauffeur terug naar het dockingstation in de incubator en voer het Incubate-programma gedurende 1,5 uur uit.
- Bereid de D-luciferine standaardcurve in kweekmedium voor in buizen van 1,5 ml volgens de instructies van de fabrikant en pipetteer 50 μL van elke standaard in tweevoud op een witte ondoorzichtige plaat met 96 putten (zie materiaaltabel), waarbij kweekmedium als blanco of 0 μM wordt gebruikt.
- Zodra de tijd is verstreken, verwijdert u het stuurprogramma uit het dockingstation en monstert u de media voor de CYP3A4-test volgens de stappen 7.4.9-7.4.13.
- Breng na incubatie 50 μL van het monstermedium over van elke put en elk invoermateriaal naar de 96-well ondoorzichtige witte luminometerplaat met standaarden. Zorg ervoor dat u ten minste twee lege rijen op de ondoorzichtige plaat tussen de normen en monsters laat om lichte overdracht tussen de hoogste normen en de metingen van de monsters te voorkomen.
- Voeg 50 μL Luciferine Detection Reagentia toe aan elk putje om een luminescerende reactie op gang te brengen.
- Incubeer de plaat bij RT op een platenschudder gedurende 20 minuten in het donker om het luminescerende signaal te stabiliseren.
- Neem de luminescentie op met behulp van een luminometer of CCD-camera.
- Plot de standaardcurve door het gemiddelde van elk punt te nemen en vervolgens het gemiddelde van de lege plekken af te trekken. Gebruik de vergelijking van de lijn om de stofwisseling (pmol/min/106 cellen) in de rest van de monsters te berekenen, waarbij u eraan denkt om eventuele verdunningen op te nemen.
- Verwijder de steigers van de platen met een pincet en plaats ze in een 24-putplaat met 500 μL D-PBS (zonder Ca ++ en Mg ++) in elke put, waarbij u ervoor zorgt dat de microtissue niet wordt verstoord.
- Maak snapshots van elke steiger met behulp van een omgekeerde lichtmicroscoop bij vergroting 10x.
- Het uitvoeren van de ATP-test (zie materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant:
- Ontdooi het reagens bij RT.
- Was de steigers twee keer met 500 μL D-PBS (Zonder Ca++ en Mg++) voor elke wasstap.
- Voeg 120 μL reagens en 120 μL PBS toe aan elke steiger en dezelfde volumes aan een lege put (dit zal als blanco dienen). Plaats de plaat bedekt met aluminiumfolie op een shaker en schud krachtig (500 rpm) gedurende 5 minuten gevolgd door 30 minuten incubatie om het luminescentiesignaal te stabiliseren.
- Breng 100 μL van de gelyseerde monsters in tweevoud over naar een heldere vlakke bodem 96-well testplaat voor meting. Zorg ervoor dat de lege putten niet naast de andere meetputten met een hoge luminescentie worden geplaatst.
- Noteer de luminescentie met behulp van een microplaatlezer.
- Vergelijk de luminescentie van de monsters met de luminescentie van de normen om ATP te bepalen die door het reagens in de monsters wordt gedetecteerd.
Representative Results
Het manuscript beschrijft een lever MPS-model dat wordt gebruikt voor het beoordelen van DILI. Het MPS vergemakkelijkt de generatie van 3D-levermicrotissues die tot 4 weken lang zeer functioneel onder stroom worden gehouden. PHHs / HKCs worden gezaaid op met collageen gecoate steigers om levermicrotissues te vormen die worden doordrenkt met een groeimedium en, na het passeren van de QC-controle, worden gedoseerd met verbindingen. Hier tonen we gegevens voor troglitazon en pioglitazon, twee structureel vergelijkbare verbindingen maar met verschillende DILI-ernst.
Op dag 4, voorafgaand aan de toediening van geneesmiddelen, wordt een QC-controle van gevormde levermicrotissues beoordeeld en bestaat uit LDH-afgifte en ureumsynthese (figuur 1A). De QC is bedoeld om te bevestigen dat de lever MPS produceert zeer consistente en functionerende lever microtissues. De hier gepresenteerde gegevens zijn gegenereerd uit drie experimenten en tonen goede niveaus van reproduceerbaarheid met lage intra- en inter-studie variabiliteit. Na een kweek van 8 dagen worden meerdere gezondheids- en leverstatistieken (albumine, ureum, CYP3A4, ATP) beoordeeld en tonen controlemicrotissues hoge niveaus van leverfunctionaliteit en reproduceerbaarheid (figuur 1B, C). Contrastfasemicroscopie en IF-kleuring van de levermicrotissues (zie aanvullend materiaal) toont een hoge zaaiconsistentie in de microkanalen van de steiger en onthult de verdeling van HKC's in de PHH-microtissues (figuur 1D)
Figuur 1: Lever MPS produceert zeer reproduceerbare gegevens en consistente microtissues. (A) 3D Liver microtissue QC-statistieken op dag 4 en functionaliteitsbeoordeling aan het einde van het onderzoek op dag 8 - (B) albumine en ureum, (C) CY3A4 en ATP). Gegevens worden verzameld uit 3 experimenten; in elk experiment waren er 3 replica's van voertuigbesturing. De getoonde gegevens zijn Gemiddelde ± SD, N = 9. (D) Fasecontrastmicroscopie (10x en 20x) en IF van 3D-levermicrotissues gegenereerd door het cocultureren van PHHs en HKCs in het MPS-platform van de lever voor het beoordelen van DILI. Om de HKC's te visualiseren, werden HKC's voorafgaand aan het zaaien getransduceerd met een adenovirale vector die eGFP uitdrukte (zie Aanvullend materiaal). Representatieve fotomicrografen worden getoond. De transductie en beeldvorming werden uitgevoerd als een op zichzelf staand experiment om cellokalisatie aan te tonen en niet gedaan met het beschreven DILI-protocol. HKC-cellen worden vooraf intern gevalideerd voor gebruik in experimentele celkweek en moeten lage niveaus van post-dooiactivatie hebben; dit wordt beoordeeld door biomarkers IL-6 en TNF-alfa te meten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Van troglitazon is bekend dat het ernstige DILI veroorzaakt; na de licentie voor de behandeling van diabetes type 2, werd het na 3 jaar op de markt door de FDA ingetrokken vanwege de frequentie van leverbeschadiging in verband met het gebruik ervan. Tot op heden slaagden gepubliceerde dierstudies er niet in om het potentieel van troglitazon om ernstige leverbeschadiging te veroorzaken te voorspellen. De toxiciteit van deze verbinding werd ook niet gedetecteerd in standaard in vitro 2D-levertests14.
Levermicrotissues in het MPS werden gedoseerd met troglitazon gedurende 96 h, en het veroorzaakte een acute toxische respons, Cmax aangedreven, die werd gedetecteerd door ALT- en LDH-afgifte en een snelle vermindering van de albumine- en ureumproductie, bij circa 15 x Cmax, na acute blootstelling aan troglitazon (figuur 2A). Cellulair eindpunt (ATP-gehalte) en CYP3A4-activiteit (voor het beoordelen van metabole biotransformatie), bemonsterd na blootstelling aan 96 uur, waren verdere bevestigde toxiciteit veroorzaakt door troglitazon- en EC:50-waarden zeer vergelijkbaar met andere eindpunten (figuur 2B). Brightfield-microscopiebeelden genomen na 8-daagse kweek in de MPS onthullen een gezonde levermicrotissue, gelijkmatig gezaaid door de scaffold (voertuigcontrole) in tegenstelling tot gegeneraliseerde weefseldood / -afbraak zoals gezien in de replica's behandeld met positieve controle en troglitazon bij de bovenste twee testconcentraties (figuur 2C).
Figuur 2: Dili-risico op troglitazon bepalen met behulp van meerdere hepatotoxische eindpunten. Levermicrotissues werden gedurende 96 uur blootgesteld aan zeven testconcentraties troglitazon en vergeleken voor (A) LDH-afgifte, ALT-afgifte, albumineproductie, ureumsynthese, CYP3A4-activiteit en ATP-gehalte. Blauwe lijnen - 48 uur belichting (alleen media-eindpunten), rode lijnen - 96 uur blootstelling. Positieve controle was 100 μM chloorpromazine. Alle eindpunten worden gemeten vanuit dezelfde lever MPS-culturen. De getoonde gegevens zijn gemiddeld ± SD, N = 3. (B) Samenvatting van E:50-getallen gegenereerd op basis van gegevens. N.D. = gegevens niet uitzetbaar. Lijn = niet getest. (C) Representatieve brightfield microscopie van levermicrotissues na 8-daagse kweek (vergroting 10x). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Levertoxiciteit na blootstelling aan pioglitazon werd ook onderzocht. Pioglitazon is een verbinding waarvan bekend is dat het van lage DILI-bezorgdheidis 4 en geen hepatotoxiciteit uitoefende in klassieke 2D primaire hepatocytenculturen en zelfs in sommige meer geavanceerde 3D-modellen10,11. Milde hepatotoxische effecten werden waargenomen op beide geteste tijdstippen (figuur 3). Er is geen LDH- of ALT-afgifte gedetecteerd; na 48 uur werd echter een lichte vermindering van de albumine- en ureumproductie waargenomen, bij ca. 25x Cmax (figuur 3A). Zeer geringe verlaging van het ATP-gehalte werd ook waargenomen bij hoge pioglitazonconcentraties, maar dit was niet significant. EC:50-waarden gegenereerd uit dosis-responscurven zijn weergegeven in figuur 3B. Microscopie toonde een lichte verandering in microtissue na blootstelling van 96 uur aan pioglitazon bij de twee hoogste geteste concentraties (figuur 3C). De resultaten tonen het vermogen van de lever MPS om de toxiciteit van verbindingen met milde DILI-bezorgdheid te detecteren.
Figuur 3: Dili-risico op pioglitazon bepalen met behulp van meerdere hepatotoxische eindpunten. Levermicrotissues werden gedurende 96 uur blootgesteld aan zeven testconcentraties pioglitazon en vergeleken voor (A) LDH-afgifte, ALT-afgifte, albumineproductie, ureumsynthese, CYP3A4-activiteit en ATP-gehalte. Blauwe lijnen - 48 uur belichting (alleen media-eindpunten), rode lijnen - 96 uur blootstelling. Positieve controle was 100 μM chloorpromazine. Alle eindpunten worden gemeten vanuit dezelfde lever MPS-culturen. De getoonde gegevens zijn gemiddeld ± SD, N = 3. (B) Samenvatting van de EG:50-nummers die op basis van gegevens zijn gegenereerd. N.D. = gegevens niet uitzetbaar. Lijn = niet getest. (C) Representatieve brightfield microscopie van levermicrotissues na 8-daagse kweek (vergroting 10x). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Door alle functionele eindpunten en toxiciteitsoutputbiomarkers te beoordelen die in vivo of klinische scenario's kunnen vertegenwoordigen (LDH-afgifte, ureumsynthese, albumineproductie, CYP3A4-activiteit, ATP-gehalte, ALT-afgifte) en de gegevens te bevestigen die zijn gegenereerd voor beide geteste verbindingen die zijn gedoseerd in een dosisbereik van zeven punten gedurende 48 uur en 96 uur, is een heatmap gegenereerd om een "handtekening van hepatotoxiciteit" te verkrijgen, helpen bij het identificeren van verbindingen met een wisselend niveau van DILI-bezorgdheid (figuur 4).
Figuur 4: Bepaling van "signatuur van toxiciteit" met Lever MPS. Heatmap met troglitazon en pioglitazon vanaf zes functionele leverspecifieke eindpunten (LDH-afgifte, ureumsynthese, albumineproductie, ALT-afgifte, CYP3A4-activiteit en ATP-gehalte) na blootstelling van 48 uur en 96 uur aan een dosisbereik van zeven punten. Elke waarde wordt gegenereerd als Gemiddelde, N = 3 en genormaliseerd om monsters te controleren. De waarden op de kleurenbalken vertegenwoordigen een vouwtoename ten opzichte van basislijnbesturingselementen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend materiaal: Fluorescerende microscoop beeldvorming van microtissues en pre-kwalificatie beoordeling van cellen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
MPS zijn ontworpen om functionele eenheden van menselijke organen in vitro samen te vatten en zijn ontwikkeld om de beperkingen van conventionele 3D-celkweekmodellen aan te pakken27. De lever is een van de meest gemodelleerde organen met mps en er is een breed scala aan systemen ontwikkeld. De menselijke lever is verantwoordelijk voor het metabolisme van geneesmiddelen en de productie van toxische geneesmiddelmetabolieten, en de functie ervan is een belangrijk element voor het model voor de ontwikkeling van geneesmiddelen, inclusief de beoordeling van DILI-aansprakelijkheid van verbindingen28. Hier hebben we een nieuwe methode geïntroduceerd voor het beoordelen van DILI met behulp van een lever-MPS; het protocol maakt het mogelijk om mechanistische inzichten te zoeken voor elke geteste verbinding om te bepalen hoe het DILI kan veroorzaken en een zeer gevoelige en robuuste test is. Levermicrotissues worden gevormd in de MPS-platen, die een cocultuur zijn van PHH en HKCs en zeer functioneel zijn met hoge niveaus van albumine- en ureumproductie en een hoge CYP3A4-activiteit in vergelijking met standaard in vitro levermodellen20.
Hoewel het hier beschreven DILI-model kan dienen als een nuttig hulpmiddel in latere stadia van preklinisch testen in het ontwikkelingsproces van geneesmiddelen, heeft het ook verschillende beperkingen. Aangezien de meeste MPS momenteel op de markt beschikbaar zijn, is het een platform met een lage doorvoer en daarom moeilijker te gebruiken voor grootschalige drugsscreeningactiviteiten. Bestaande uit microtissues gevormd door het cocultureren van PHHs en HKCs kan het DILI-model ook de complexiteit van de menselijke lever niet volledig vastleggen, en verdere optimalisatie door het opnemen van verschillende soorten cellen (bijv. Immuuncellen) zou gunstig zijn om waarde toe te voegen aan het bestaande model. Deze mps met één orgaan kan ook worden gecombineerd met andere orgaanplatforms die een gemeenschappelijk medium kunnen delen en orgaanoverspraak op cellulair of endocriene niveau mogelijk maken, en dat kan helpen om de mechanistische inzichten van toxiciteit beter te begrijpen, niet alleen beperkt tot de lever zelf. Bovendien kan het, zoals elke relatief nieuwe technologie, als duur en dus van beperkte toegankelijkheid worden beschouwd.
MPS is een platform dat wordt gebruikt om organotypische modellen van enkelvoudige of meervoudige menselijke weefsels te ontwikkelen. Het systeem bestaat uit een controller, navelstrengkabel en MPS-driver waarin de plaat wordt gestoken (figuur 5A). Elke lever MPS-plaat heeft 12 onafhankelijke open putten voor het kweken van primaire levercellen in 3D op ontworpen steigers. Samenvattend, het systeem wordt QC gecontroleerd en de platen worden geprimed op dag -1, de PHHs en HKC's worden op dag nul op de platen gezaaid (figuur 5B, zie 1). Ingebedde micropompen vergemakkelijken de circulatie van celkweekmedia door de steigers om de vorming van 3D-microtissues te vergemakkelijken (figuur 5B, zie 2). Gevormde microtissues zijn QC'd op dag 4, gedoseerd met verschillende concentraties van elke verbinding om de 48 uur gedurende 4 dagen, en getest op eindpuntbiomarkers op dag 8 (figuur 5C). De experimentele tijdlijn van de DILI-test in de MPS-plaat is weergegeven in figuur 5D.
Figuur 5: Het microfysiologische systeem en de experimentele tijdlijn van een standaard DILI-test. (A) Het microfysiologische systeem met zijn componenten: controller (1), navelstrengkabel (2), dockingstation (3), MPS-driver (4) en LC12-plaat (5). (B) Het zaaien van PHHs en HKCs op LC12-plaat op dag 1 (1) en ingebedde micropompen vergemakkelijken de circulatie van celkweekmedia met instelbare stroomsnelheden door de 3D-microtissues die op de steigers zijn gezaaid (2). (C) Het neerhalen van de steigers aan het einde van het onderzoek. (D) Experimentele tijdlijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Bij het uitvoeren van het protocol is het belangrijk dat een robuuste QC-controle van het systeem wordt uitgevoerd voordat u begint, controleert of het systeem pneumatisch correct functioneert en dat de verbruiksplaten visueel worden geïnspecteerd en efficiënt worden voorbereid om een gelijkmatige functionaliteit in alle putten te garanderen. Het hebben van hoogwaardige primaire menselijke cellen is essentieel voor dit protocol, met hepatocyten waarvan bekend is dat ze zich consistent hechten aan celkweekexperimenten en 3D-interacties vormen. Het ontdooien van deze cellen is ook een kritieke stap, omdat primaire hepatocyten niet mogen worden geresuspendeerd door pipetteerwerking, omdat dit snel tot celdood kan leiden. Het hebben van een levensvatbaarheid van meer dan 85% is van cruciaal belang voor succesvol zaaien, omdat grote hoeveelheden cellulair puin de vorming van 3D-microtissue zullen verstoren. De QC-controle van gevormde levermicrotissues op dag 4 is ook belangrijk en de gebruiker moet ervoor zorgen dat aanvaardbare niveaus van LDH en ureum worden gemeten, omdat parameters buiten het bereik indicatief kunnen zijn voor weefselvorming van slechte kwaliteit en eenvoudige probleemoplossing mogelijk maken. Ten slotte moet de hydrocortison die in de celkweekmedia wordt gebruikt, op de dag van gebruik vers worden bereid om ongewenste afbraak te voorkomen die de celkweekfunctionaliteit kan beïnvloeden, omdat dit nodig is om de metabole functionaliteit van de hepatocyten te behouden.
Ondanks het feit dat het een aanzienlijke complexiteit heeft, bevat de lever MPS niet alle celtypen van de menselijke lever. Het is mogelijk om verdere celtypen aan het model24,29 toe te voegen om de fysiologische relevantie te vergroten, maar deze mogen alleen worden toegevoegd met een duidelijke rechtvaardiging voor de gebruikscontext. Voor het bestuderen van DILI phh zijn de belangrijkste celtype, en de opname van HKCs in dit model maakt het mogelijk om enkele immunologische reacties te bepalen. Er moet ook worden opgemerkt dat PHHs geïsoleerd uit menselijke levers en commercieel verkrijgbare gecryopreserveerde PHHs de neiging hebben om enkele variaties van partij tot partij aan te tonen. We hebben hier aangetoond dat dit protocol reproduceerbare resultaten oplevert bij gebruik met hoogwaardige preparaten van cellen. Er zou echter enige variatie in partijpartijen worden verwacht, en dit zou verder kunnen worden ondervangen door gepoolde partijen van meerdere donoren te gebruiken. Deze beperkingen kunnen worden overwonnen door hepatocytachtige cellen te gebruiken die zijn gedifferentieerd van iPSC en die veel functionele eigenschappen van PHHs recapituleren en die zijn gebruikt in het ontwikkelingsproces van geneesmiddelen30. HKC's vertonen ook veel tot veel variabiliteit en een hoog niveau van activering bij dooi; daarom worden HKC-donoren intern vooraf gevalideerd voor gebruik in experimentele celkweek (cocultuur met gevalideerde PHHs) en moeten ze lage niveaus van post-dooiactivering hebben; dit wordt beoordeeld door biomarkers IL-6 en TNF-alpha te meten (zie Aanvullend materiaal).
De hier gepresenteerde gegevens bevestigen dat de test DILI nauwkeurig kan detecteren, wat helpt bij het identificeren van hepatotoxische middelen die mogelijk niet worden gedetecteerd door 2D10,11 en zelfs sommige 3D-modellen. Gegevens gegenereerd uit MPS worden nog steeds niet als standaard gebruikt door de farmaceutische industrie voor het indienen van regelgeving of het screenen van geneesmiddelen vanwege het gebrek aan processtandaardisatie en -harmonisatie, inclusief reproduceerbaarheid tussen locaties20. De hier gedemonstreerde gegevens en experimentele benaderingen pakken dit aan en tonen aan dat het levermodel routinematig en robuust kan worden gebruikt in DILI-schermen om de aansprakelijkheid van nieuwe verbindingen nauwkeurig te voorspellen.
Door een reeks eindpunten te meten om een "handtekening van hepatotoxiciteit" te produceren, helpt het bij het identificeren van verbindingen met verschillende niveaus van DILI-bezorgdheid (inclusief verbindingen die niet detecteerbaar zijn met andere in vitro methoden) en hun toxiciteitsmechanismen onthuld. Deze technologie kan de kloof dichten tussen traditionele celkweek en diermodellen aan de ene kant en menselijke klinische proeven, en vooruitgang boeken in de richting van de simulatie van menselijke biologische aandoeningen voor de preklinische beoordeling van levertoxiciteit als onderdeel van het ontwikkelingsproces van geneesmiddelen.
Disclosures
Alle auteurs zijn medewerkers van CN Bio Innovations Limited.
Acknowledgments
CN Bio Innovations Ltd. financierde deze studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well cell culture cluster plates flat bottom | Corning | 3524 | |
| 96 well clear assay plates, flat bottom clear plastic | Greiner | 655101 | |
| 96 well plates black flat bottom | Corning | 3915 | |
| 96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | ThermoScientific | 165306 | |
| Advanced DMEM (1x) | Gibco | 12491015 | Cell culture media. |
| AssayMax Albumin ELISA Kit | AssayPro | EA3201-1 | Dilution 1:250. Time point Day 4, 6, and 8. |
| Cell Maintenance Cocktail B, (Primary Hepatocyte Maintenance Supplements) | Gibco | CM4000 | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9682 | Dilution 1:1. Time point Day 8. |
| Chlorpromazine HCl | Sigma Aldrich | C8138 | |
| Chromacol blue lids, 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps | ThermoScientific | 9-SCK(B)-ST1 | glass vial |
| Chromacol vials, 9 mm Clear Glass Screw Thread Vials | ThermoScientific | 2-SVW | |
| Class 2 Microbiological Safety Cabinets - Trimat2 1500 exhaust | Contained Air Solutions | ||
| Conical tubes 50 mL | Greiner | 227261 | |
| Cryopreserved Hepatocyte Recovery Medium (CHRM) | ThermoFisher Scientific | Gibco CM7000 | |
| Cryopreserved primary human hepatocytes | BioIVT Europe | Lot. RAS | |
| CytoTox 96 Cytotoxicty (LDH) Assay Kit | Promega | G1781 | Dilution - none. Time point Day 4, 6 and 8 |
| >Data analysis model used to generate the graph and EC:50 curves was nonlinear regression (curve fit) asymmetric sigmoidal, 5PL, where X is log(concentration | GraphPad Prism 9 | ||
| Disposable PES Filter Units 500mL | Fisher Scientific | 15913307 | |
| Disposable Pipette Basins 50ml | Fisher Scientific | 12369175 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich | Sigma D2650 | |
| Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (D-PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | |
| Easy Reader Conical Polypropylene Centrifuge Tubes 15 mL | Fisher Scientific | 11889640 | |
| Foetal bovine serum | Gibco | 10500064 | |
| Human ALT ELISA Kit | Abcam | ab 234578 | Dilution 1:5. Time point Day 6 and 8. |
| Human Cryopreserved Kupffer Cells | Lonza Europe | Lot. 190088KC | |
| hydrocortisone | Merck | H0888-1G | |
| Incubators models: New Brunswick Galaxy 170 S, New Brunswick Galaxy 170 R and CellXpert® C170. | Eppendorf | All serviced yearly; paperwork available upon request. | |
| Inverted Microscope | Leica DMIL LED | ||
| MPS know as Organ-on-a-Chip (OOC) | CN Bio Innovations Ltd. | ||
| MPS LC-12 plate | CN Bio Innovations Ltd. | ||
| Neubauer Improved C-Chip Disposable Haemocytometer (2 channel) | Cambridge Bioscience | DHC-N01-50 | |
| P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V9002 | Dilution - none. Time point Day 8 |
| PhysioMimix MPS platform | CN Bio Innovations Ltd. | ||
| Pioglitazone | MedChemExpress Tocris | HY-13956/CS-1700 | |
| Quantichrom Urea Assay Kit – Bioassay systems | Bioassay Systems | DY970-05 | Dilution 1:2 if initial reading is too high. Time point Day 4, 6 and 8. |
| Silica gel | Sigma-Aldrich | S7625 | |
| Software used to analyse and generate all the graphs was | GraphPad Prism 9 | ||
| Stripettes 10 mL | Fisher Scientific | 11839660 | |
| Stripettes 25 mL | Fisher Scientific | 11839181 | |
| Thawing plate Cocktail A, (Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements) | Gibco | CM3000 | |
| Troglitazone | MedChemExpress Tocris | 97322-87-7 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Tubes 1.5 mL | Greiner | 616201 | |
| Weighing balance - model PA214C and AV213C | Ohaus Corp |
References
- Lisi, D. M. Drug-induced liver injury: An overview. US Pharmacist. 41 (12), 30-34 (2016).
- Kuna, L., et al. Models of drug induced liver injury (DILI)-current issues and future perspectives. Current Drug Metabolism. 19 (10), 830-838 (2018).
- Katarey, D., Verma, S. Drug-induced liver injury. Clinical Medicine. 16 (6), London, England. 104-109 (2016).
- Kullak-Ublick, G. A., et al. Drug-induced liver injury: recent advances in diagnosis and risk assessment Recent advances in clinical practice. Gut. 66, 1154-1164 (2017).
- Dirven, H., et al. Performance of pre-clinical models in predicting drug-induced liver injury in humans: a systematic review. Scientific Reports. 11 (1), 6403 (2021).
- Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies. Current Drug Metabolism. 9 (1), 1-11 (2008).
- Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line HepG2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism and Disposition. 31 (8), 1035-1042 (2003).
- Gerets, H. H. J., et al. Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins. Cell Biology and Toxicology. 28 (2), 69-87 (2012).
- Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier. Pharmaceutical Research. 23 (7), 1482-1490 (2006).
- Li, F., Cao, L., Parikh, S., Zuo, R. Three-dimensional spheroids with primary human liver cells and differential roles of kupffer cells in drug-induced liver injury. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (6), 1912-1923 (2020).
- Proctor, W. R., et al. Utility of spherical human liver microtissues for prediction of clinical drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 91 (8), 2849-2863 (2017).
- Lin, C., Khetani, S. R. Advances in engineered liver models for investigating drug-induced liver injury. BioMed Research International. 2016, 1829148 (2016).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 32 (1), 56-67 (2000).
- Bell, C. C., et al. Comparison of hepatic 2D sandwich cultures and 3D spheroids for long-term toxicity applications: A multicenter study. Toxicological Sciences. 162 (2), 655-666 (2018).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Khetani, S. R., et al. Use of micropatterned co-cultures to detect compounds that cause drug-induced liver injury in humans. Toxicological Sciences. 132 (1), 107-117 (2013).
- Ma, X., et al. Deterministically patterned biomimetic human iPSC-derived hepatic model via rapid 3D bioprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the united States of America. 113 (8), 2206-2211 (2016).
- Dieterle, P. Y. M., Dieterle, F. Tissue-specific, non-invasive toxicity biomarkers: translation from pre-clinical safety assessment to clinical safety monitoring. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (9), 1023-1038 (2009).
- Rowe, C., et al. Perfused human hepatocyte microtissues identify reactive metabolite-forming and mitochondria-perturbing hepatotoxins. Toxicology in Vitro. 46, 29-38 (2018).
- Rubiano, A., et al. Characterizing the reproducibility in using a liver microphysiological system for assaying drug toxicity, metabolism, and accumulation. Clinical and Translational Science. 14 (3), 1049-1061 (2021).
- Tsamandouras, N., Kostrzewski, T., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Hughes, D. J., Cirit, M. Quantitative assessment of population variability in hepatic drug metabolism using a perfused three-dimensional human liver microphysiological system. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 360 (1), 95-105 (2017).
- Ortega-Prieto, A. M., et al. 3D microfluidic liver cultures as a physiological pre-clinical tool for hepatitis B virus infection. Nature Communications. 9 (1), 682 (2018).
- Kostrzewski, T., et al. Three-dimensional perfused human in vitro model of non-alcoholic fatty liver disease. World Journal of Gastroenterology. 23 (2), 204-215 (2017).
- Kostrzewski, T., et al. A microphysiological system for studying nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology Communications. 4 (1), 77-91 (2020).
- Vacca, M., et al. Bone morphogenetic protein 8B promotes the progression of non-alcoholic steatohepatitis. Nature Metabolism. 2 (6), 514-531 (2020).
- Long, T. J., et al. Modeling therapeutic antibody-small molecule drug-drug interactions using a three-dimensional perfusable human liver co-culture platforms. Drug Metabolism and Disposition. 44, 1940-1948 (2016).
- Bai, J., Wang, C. Organoids and microphysiological systems: New tools for ophthalmic drug discovery. Frontiers in Pharmacology. 11, 407 (2020).
- Ribeiro, A. J. S., Yang, X., Patel, V., Madabushi, R., Strauss, D. G. Liver microphysiological systems for predicting and evaluating drug effects. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 106 (1), 139-147 (2019).
- Clark, A. M., et al. A microphysiological system model of therapy for liver micrometastases hhs public access. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1170-1179 (2014).
- Qosa, H., Ribeiro, A. J. S., Hartman, N. R., Volpe, D. A. Characterization of a commercially available line of iPSC hepatocytes as models of hepatocyte function and toxicity for regulatory purposes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 110, 107083 (2021).
