Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

विट्रो में दवा-प्रेरित यकृत विषाक्तता का आकलन करने के लिए मानव यकृत माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम

Published: January 31, 2022 doi: 10.3791/63389
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1CN Bio Innovations Ltd

Summary

दवा-प्रेरित यकृत की चोट (डीआईएलआई) दवा की विफलता का एक प्रमुख कारण है। यकृत माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम (एमपीएस) का उपयोग करके एक यौगिक की डीआईएलआई देयता की सटीक भविष्यवाणी करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया गया है। यकृत मॉडल उपचार के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए प्राथमिक यकृत कोशिकाओं और ट्रांसलेशनल रूप से प्रासंगिक समापन बिंदुओं के सह-संस्कृति का उपयोग करता है।

Abstract

डीआईएलआई 1000 से अधिक एफडीए-अनुमोदित दवाओं के साथ दवा के विकास में एट्रिशन का एक प्रमुख कारण है जो संभावित रूप से मनुष्यों में डीआईएलआई का कारण बनता है। दुर्भाग्य से, डीआईएलआई का अक्सर तब तक पता नहीं लगाया जाता है जब तक कि दवाएं नैदानिक चरणों तक नहीं पहुंच जाती हैं, जिससे रोगियों की सुरक्षा को खतरा होता है और फार्मा उद्योग के लिए पर्याप्त नुकसान होता है। इस बात को ध्यान में रखते हुए कि मानक 2 डी मॉडल में डीआईएलआई का पता लगाने में सीमाएं हैं, इन विट्रो मॉडल विकसित करना आवश्यक है जो डेटा ट्रांसलैटेबिलिटी में सुधार के लिए अधिक पूर्वानुमानित हैं। डीआईएलआई के कार्य-कारण और यांत्रिक पहलुओं को विस्तार से समझने के लिए, मानव प्राथमिक यकृत पैरेन्काइमल और गैर-पैरेन्काइमल कोशिकाओं (एनपीसी) से युक्त एक मानव यकृत एमपीएस विकसित किया गया है और छिड़काव के तहत एक इंजीनियर मचान पर 3 डी माइक्रोटिश्यू में सुसंस्कृत किया गया है। क्रायोप्रिजर्व्ड प्राथमिक मानव हेपेटोसाइट्स (पीएचएच) और कुफ़्फ़र कोशिकाओं (एचकेसी) को दो सप्ताह तक एमपीएस प्लेटफॉर्म में माइक्रोटिश्यू के रूप में सह-संवर्धित किया गया था, और रुचि के प्रत्येक यौगिक को चार दिनों तक सात परीक्षण सांद्रता पर यकृत माइक्रोटिश्यूज़ पर दोहराया गया था। यकृत समारोह का मूल्यांकन करने के लिए कार्यात्मक यकृत-विशिष्ट समापन बिंदुओं का विश्लेषण किया गया (नैदानिक बायोमाकर्स जैसे एलानिन एमिनोट्रांसफेरेज़, एएलटी सहित)। विभिन्न डीआईएलआई सेवरिटी के यौगिकों के तीव्र और पुराने जोखिम का मूल्यांकन एकल और बहु-खुराक वाले माइक्रोटिश्यू की प्रतिक्रियाओं की तुलना करके किया जा सकता है। कार्यप्रणाली को गंभीर और हल्के हेपेटोटॉक्सिक यौगिकों के एक व्यापक सेट के साथ मान्य किया गया है। यहां हम पियोग्लिटाज़ोन और ट्रोग्लिटाज़ोन के लिए डेटा दिखाते हैं, प्रसिद्ध हेपेटोटॉक्सिक यौगिकों को यकृत विफलताओं के कारण बाजार से वापस ले लिया जाता है। कुल मिलाकर, यह दिखाया गया है कि यकृत एमपीएस मॉडल डीआईएलआई और यकृत समारोह में परिवर्तन के साथ इसके संबंध का आकलन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है। मॉडल का उपयोग यह आकलन करने के लिए भी किया जा सकता है कि अलग-अलग रोगी उप-समूहों में नए यौगिक कैसे व्यवहार करते हैं और यकृत रोग की स्थिति (जैसे, वायरल हेपेटाइटिस, फैटी यकृत रोग) से विषाक्तता प्रोफाइल कैसे प्रभावित हो सकते हैं।

Introduction

डीआईएलआई संयुक्त राज्य अमेरिका और यूरोप में तीव्र यकृत विफलता का सबसे आम कारण बना हुआ है और दवाविकास प्रक्रिया में यौगिकों के एट्रिशन का एक प्रमुख कारण है। दवाओं के लगभग सभी वर्ग हेपेटोटॉक्सिसिटी का कारण बन सकते हैं, जिसमें केंद्रीय तंत्रिका तंत्र एजेंट और एंटीबायोटिक्स अब तक के सबसे आम उपचार हैंजो रोगियों में डीआईएलआई का कारण बनते हैं। दवा-प्रेरित हेपेटोटॉक्सिसिटी आनुवंशिक, गैर-आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारकों की एक जटिल बातचीत के कारण होती है, जिससे हेपेटोसाइट्स और अन्य यकृत कोशिका प्रकारों की मृत्यु हो जाती है, जिसमें कोलेंजियोसाइट्स और एंडोथेलियल कोशिकाएं 1,3 शामिल हैं।

डीआईएलआई पैदा करने वाले एजेंटों को दो तरीकों से वर्गीकृत किया जा सकता है: वे जो अनुमानित खुराक-निर्भर यकृत क्षति का कारण बनते हैं या जो अज्ञात डीआईएलआई का कारण बनते हैं जो दुर्लभ है और दवा की खुराक, या मार्ग, या प्रशासन की अवधि से स्वतंत्र रूप से विकसित होता है, लेकिन संयुक्त राज्य अमेरिका में सभी तीव्र यकृत विफलताओं केछठे हिस्से के लिए जिम्मेदार है। दुर्भाग्य से, डीआईएलआई का अक्सर तब तक पता नहीं चलता है जब तक कि दवाएं दवा विकास प्रक्रिया के नैदानिक चरणों तक नहीं पहुंच जाती हैं। दवा-प्रेरित यकृत की चोट रैंक (या डीआईआईरैंक) में एक हजार से अधिक एफडीए-अनुमोदित दवाएं होती हैं जिन्हें डीआईएलआई पैदा करने की उनकी क्षमता के अनुसार चार वर्गों में विभाजितकिया जाता है, और रोगियों में उनके उपयोग की बारीकी से निगरानी की जानी चाहिए।

दवा हेपेटोटॉक्सिसिटी के तंत्र का अध्ययन करना बहुत चुनौतीपूर्ण बना हुआ है, और इसलिए, डीआईएलआई के तंत्र का पता लगाने के लिए कई प्रीक्लिनिकल मॉडल विकसित किए गए हैं। प्रीक्लिनिकल विकास में डीआईएलआई की भविष्यवाणी करने के लिए उपयोग किए जाने वाले वर्तमान इन विट्रो और विवो मॉडल में जीवित मानव शरीर में जटिल, बहुआयामी बातचीत में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए कई सीमाएं हैं। 2 डी में संवर्धित कैंसर हेपेटिक सेल लाइनें (यानी, हेपजी 2, हेपआरजी) अभी भी उम्मीदवार यौगिकों की विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए दवा विकास के शुरुआती चरणों में उपयोग कीजाती हैं। फिर भी, ये सेल लाइनें एकल दाताओं से आती हैं और यकृत समारोह के असामान्य स्तर दिखाती हैं, और हमेशा डीआईएलआई 7,8 का पता लगाने के लिए उच्च संवेदनशीलता प्रदर्शित नहीं करती हैं। कैंसर हेपेटिक सेल लाइनों के विकल्प के रूप में, पीएचएच बेहतर तरीके से मानव यकृत शरीर विज्ञान का प्रतिनिधित्व करते हैं यदि विट्रो में उचित रूप से सुसंस्कृत किया जाता है, हालांकि उनकी संस्कृति के साथ कई सीमाएं मौजूद हैं, जैसे दवाओं के साथ कम इनक्यूबेशन समय, अपेक्षाकृत कम जीवन काल, यकृत जीन अभिव्यक्ति का नुकसान, और दवा चयापचय कार्यों में परिवर्तन 9,10,11 . पीएचएच को मानक 2 डी सेल कल्चर प्लेटों में बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन पर संवर्धित किया जा सकता है, लेकिन एक नकारात्मक पक्ष के रूप में, उनके कार्य में तेजी से गिरावट का मतलब है कि उनके पास डीआईएलआई भविष्यवाणी12 के लिए कम संवेदनशीलता (<50%) है।

दूसरी ओर, पशु मॉडल पर परीक्षण धीमा, महंगा है, और मनुष्यों के लिए भविष्यवाणी को विस्तारित करने के लिए क्रॉस-प्रजाति अनुवाद की आवश्यकता है। अधिकांश नई विकसित दवाएं इस प्रक्रिया को महंगा और जोखिम भरा बनाने के लिए अनुमोदन प्राप्त करने में विफल रहतीहैं। इसके अलावा, नए मानव-विशिष्ट तौर-तरीकों का परीक्षण करने के लिए, जीन अनुक्रम या प्रतिरक्षात्मक प्रतिक्रिया मतभेदों बनाम मनुष्योंके कारण पशु मॉडल कम उपयुक्त हैं।

नतीजतन, विट्रो लिवर मॉडल में अधिक उन्नत त्रि-आयामी (3 डी) में रुचि तेजी से बढ़ी है। पीएचएच को लटकती बूंदों में गुरुत्वाकर्षण एकत्रीकरण द्वारा उत्पन्न गोलाकार संरचनाओं के रूप में संवर्धन करना या अल्ट्रालो अटैचमेंट सतहों पर यौगिक देनदारियों का आकलन करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट विधि का प्रतिनिधित्व करताहै। पीएचएच स्फेरॉइड का उपयोग रोगग्रस्त पृष्ठभूमि (जैसे, स्टीटोसिस और कोलेस्टेसिस) में डीआईएलआई का आकलन करने के लिए किया गया है। स्ट्रोमल फाइब्रोब्लास्ट्स 16, 3 डी बायो-प्रिंटेड लिवर ऊतकों17, हेपेटिक गैर-पैरेन्काइमलकोशिकाओं के साथ या बिना हेपेटोसाइट्स के प्लेटेड माइक्रो-पैटर्न वाले सह-संस्कृतियों को शामिल करने के लिए विभिन्न प्रकार के मॉडल विकसित किए गए हैं। हालांकि, इन सभी विधियों में अभी भी कमियां हैं, और अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक माइक्रोएन्वायरमेंट में पीएचएच की खेती उन्हें संभावित हेपेटोटॉक्सिकेंट्स के लंबे समय तक संपर्क की जांच को सक्षम करने के लिए विस्तारित अवधि के लिए कार्यक्षमता के उच्च स्तर प्रदान कर सकती है। इसके अतिरिक्त, किसी भी उन्नत इन विट्रो पीएचएच संस्कृति की ट्रांसलेशनल प्रासंगिकता में सुधार करने के लिए, नैदानिक रूप से प्रासंगिक कार्यात्मक समापन बिंदु या विषाक्तता आउटपुट बायोमाकर्स का उपयोग विवो या नैदानिकपरिदृश्यों में डेटा की तुलना करने की अनुमति देने के लिए किया जाना चाहिए।

इस अध्ययन में, हमने मूल्यांकन किया कि क्या एक एमपीएस, जिसे ऑर्गन-ऑन-ए-चिप (ओओसी) के रूप में भी जाना जाता है, इन विट्रो लिवर मॉडल का उपयोग यकृत विषाक्तता के विस्तृत यांत्रिक पहलुओं को समझने के लिए किया जा सकता है। एमपीएस को पहले 4 सप्ताह 19 तक प्रवाह के तहत अत्यधिक कार्यात्मक 3 डी यकृत माइक्रोटिश्यू को बनाए रखने के लिएदिखाया गया है। सिस्टम को हाल ही में एफडीए द्वारा परीक्षण किया गया है और दवा विषाक्तता, चयापचय और इंट्रासेल्युलर संचय20 करते समय उच्च प्रजनन क्षमता दिखाई गई है। इसके अलावा, जब स्फेरॉइड और सैंडविच संस्कृतियों के साथ तुलना की जाती है, तो सिस्टम में कई दवाओंकी विषाक्तता का पता लगाने में अधिक स्थिर कार्य और उच्च संवेदनशीलता थी। आज तक, एमपीएस का उपयोग अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में किया गया है जो एडीएमई21, रोग मॉडलिंग (एचबीवी22, एनएएफएलडी 23,24,25), और ड्रग-ड्रग इंटरैक्शन26 को कवर करते हैं, जो संभावित रूप से इसे तीव्र और पुरानी डीआईएलआई का आकलन करने के लिए अत्यधिक अनुकूल बनाते हैं। यहां प्रस्तुत तकनीक अधिक पारंपरिक सेल संस्कृतियों और पशु मॉडल और मानव नैदानिक परीक्षणों के बीच अंतर को बंद करने का विकल्प प्रदान करती है, दवा विकास प्रक्रिया के प्रीक्लिनिकल चरणों में उम्मीदवार यौगिकों के यकृत विषाक्तता के आकलन का समर्थन करने के लिए मानव जैविक स्थितियों के सिमुलेशन की ओर आगे बढ़ती है।

Protocol

सभी काम सख्त स्वास्थ्य और सुरक्षा प्रक्रियाओं का पालन करते हुए और अपने स्वयं के प्रयोगशाला जोखिम आकलन और एसओपी के अनुसार प्रयोगशाला में आयोजित किए गए थे। उपयोग किए गए सभी उपकरण निर्माण के दिशानिर्देशों के अनुसार सेवित हैं। माइक्रोबायोलॉजिकल सुरक्षा अलमारियाँ (MBSCs) सालाना सेवा की जाती हैं, और Ki-Discus (पोटेशियम आयोडाइड) ब्रिटिश मानकों के लिए परीक्षण किया जाता है। प्रोटोकॉल यूनाइटेड किंगडम ह्यूमन टिशू अथॉरिटी (एचटीए) कोड ऑफ प्रैक्टिस और निर्देशों का पालन करता है और विक्रेताओं द्वारा आपूर्ति की गई नैतिक रूप से सोर्स प्राथमिक मानव कोशिकाओं का उपयोग करता है जो सूचित सहमति (45 सीएफआर §46.116 और §46.117) और गुड क्लिनिकल प्रैक्टिस (जीएलपी), (आईसीएच ई 6), और नियामक और नैतिकता समितियों के लिए सामान्य आवश्यकताओं का पूरी तरह से पालन करते हैं।

1. सेल संस्कृति मीडिया तैयार करना

नोट: दिन -1 पर उन्नत डीएमईएम माध्यम की सीडिंग तैयार करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। पहले दिन उन्नत डीएमईएम माध्यम तैयार करें और 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

  1. पीएचएच और एचकेसी सहसंस्कृति के लिए उन्नत डीएमईएम माध्यम की सीडिंग: 500 एमएल उन्नत डीएमईएम माध्यम (सामग्री की तालिका) की एक बोतल को कॉकटेल ए के 18 एमएल (3.6% की अंतिम एकाग्रता) और 25 एमएल एफबीएस (अंतिम एकाग्रता 5%) के साथ पूरक करें।
  2. पीएचएच और एचकेसी कोकल्चर के लिए उन्नत डीएमईएम माध्यम: 20 एमएल कॉकटेल बी (4% की अंतिम एकाग्रता) और 500 एनएम हाइड्रोकार्टिसोन के साथ 500 एमएल उन्नत डीएमईएम माध्यम (सामग्री की तालिका) की एक बोतल को पूरक करें।
    नोट: हाइड्रोकार्टिसोन को उपयोग के दिन ताजा बनाया जाएगा, और स्टॉक समाधान और आवश्यक कमजोर पड़ने के तरीके पर कदम नीचे दिए गए हैं।
  3. रखरखाव उन्नत डीएमईएम माध्यम में 500 एनएम हाइड्रोकार्टिसोन की तैयारी
    1. शुरुआती स्टॉक समाधान (20 एमएम) की तैयारी: 1 एमएल ग्लास शीशी में 7.24 मिलीग्राम हाइड्रोकार्टिसोन (सामग्री की तालिका) का वजन करें। वजन किए गए हाइड्रोकार्टिसोन की सटीक मात्रा रिकॉर्ड करें और निम्नलिखित गणना का उपयोग करके डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) की मात्रा निर्धारित करें:
      Equation 1
    2. काम करने वाले 100 μM हाइड्रोकार्टिसोन स्टॉक समाधान की तैयारी: उन्नत DMEM के 995 μL में शुरुआती 20 mM स्टॉक समाधान का 5 μL जोड़ें।
      नोट: पानी या मीडिया में चरण 1 से डीएमएसओ समाधान के 25 μL को पतला करने से 0.5% DMSO एकाग्रता होती है। अंतिम समाधान में, डीएमएसओ एकाग्रता 0.0025% होगी। इस मामले में, 5 μL की अतिरिक्त मात्रा के परिणामस्वरूप कुल मात्रा में एक महत्वहीन परिवर्तन होता है।
    3. उन्नत डीएमईएम में काम करने वाले 500 एनएम हाइड्रोकार्टिसोन समाधान की तैयारी: उन्नत डीएमईएम में 500 एनएम हाइड्रोकार्टिसोन समाधान का 1 एमएल तैयार करने के लिए, रखरखाव उन्नत डीएमईएम माध्यम के 995 μL में 100 μM हाइड्रोकार्टिसोन के स्टॉक समाधान का 5 μL जोड़ें।

2. एमपीएस सेट-अप और प्राइमिंग (दिन -1)

  1. नियंत्रक को सेल कल्चर इनक्यूबेटर में अपने डॉकिंग स्टेशन हाउस से कनेक्ट करें और सुनिश्चित करें कि नियंत्रक के पीछे स्थित डेसिकेंट जार में ताजा डेसिकेंट (सामग्री की तालिका) जोड़ा जाए।
    नोट: नियंत्रक इकाई समय के साथ इनक्यूबेटर से नमी खींचती है और ताजा डेसिकेंट का उपयोग करके सूखा रखा जाता है।
  2. इसके पीछे स्थित बोट रॉकर स्विच को दबाकर नियंत्रक को चालू करें और सिस्टम को स्थिर करने और दबाव तक पहुंचने के लिए 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें। फिर यह सुनिश्चित करने के लिए वायवीय रिपोर्ट के लिए स्क्रीन की जांच करें: (i) दबाव जलाशय आउटपुट ~ 2000 mBar तक पहुंच गया और (ii) वैक्यूम जलाशय आउटपुट ~ 850 mBar तक पहुंच गया।
  3. पैकेजिंग से प्रत्येक प्लेट को हटा दें और संभावित दोषों (लापता मचानों, दरारें आदि) की जांच के लिए हर कुएं का निरीक्षण करें।
  4. डॉकिंग स्टेशन पर एक ड्राइवर (एक प्लेट के साथ) डालें ताकि यह जांचा जा सके कि ड्राइवर डॉकिंग स्टेशन और नियंत्रक द्वारा पहचाना गया है। प्रेशर रिजर्वायर आउटपुट में 100 मीटर से कम की गिरावट आई है, और वैक्यूम जलाशय आउटपुट में 500 मीटर से कम की वृद्धि हुई है।
  5. जलाशय की तरफ 500 μL सीडिंग उन्नत DMEM माध्यम (37 °C तक पूर्व-गर्म) जोड़कर प्रत्येक अच्छी तरह से तैयार करें।
  6. नियंत्रक स्क्रीन पर प्राइम प्रोग्राम का चयन करें (2.5 μL / s पर 3 मिनट के लिए प्रवाह) जब तक कि तरल पदार्थ फ़िल्टर समर्थन के माध्यम से नहीं आता है। नोट: 'अप फ्लो' नियंत्रक पर एक सेटिंग है जो मीडिया को एलसी 12 प्लेट में मचानों के माध्यम से जलाशय से ऊपर की ओर बहने की अनुमति देता है।
  7. सतह चैनल को कवर करने के लिए उन्नत डीएमईएम माध्यम के 1.1 एमएल के साथ सभी कुओं को भरें। सभी कुएं तब 1.6 एमएल की अपनी पूर्ण कार्यशील मात्रा पर होंगे।
  8. प्लेटों वाले ड्राइवरों को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें, डॉकिंग स्टेशन से कनेक्ट करें और इनक्यूबेट प्रोग्राम चलाएं ।
    नोट: प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले सभी कार्यक्रम (प्राइम, इनक्यूबेट, बीज, मीडिया परिवर्तन) एमपीएस प्रणाली में पूर्व-निर्धारित हैं। इनक्यूबेटर में प्लेटों को तब तक प्राइम करें जब तक कि बीज के लिए तैयार न हो जाएं।

3. यकृत कोशिकाओं को एमपीएस में सीडिंग (दिन 0)

  1. सभी पीएचएचएस और एचकेसी को पूर्व वैध करें। सेल कल्चर प्रयोग करने से पहले सभी पीएचएच और एचकेसी लॉट पूर्व-मान्य इन-हाउस हैं ( पूरक सामग्री देखें)।
  2. पीएचएच और एचकेसी कोशिकाओं (सामग्री की तालिका) की शीशियों को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में लगातार पकड़कर पिघलाएं जब तक कि बर्फ का केवल एक छोटा सा टुकड़ा शेष न रह जाए।
  3. पिपेट पीएचएच सीधे पूर्व-गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) क्रायोप्रिजर्व्ड हेपेटोसाइट रिकवरी मीडियम सीएचआरएम मीडिया (प्रति ट्यूब अधिकतम दो शीशियां) की ट्यूब में।
  4. कोशिकाओं को धीरे से पिपेट करें, फिर क्रायोट्यूब से किसी भी शेष कोशिकाओं को धोने के लिए 1 एमएल सीएचआरएम का उपयोग करें। शंक्वाकार ट्यूब में पिघलने और स्थानांतरित करते समय कोशिकाओं के साथ बहुत सौम्य रहें।
    सावधानी पिघलने के दौरान शीशियों को उत्तेजित न करें, और उनकी सामग्री को ऊपर और नीचे न करें।
  5. पिपेट एचकेसी कोशिकाएं क्रायोट्यूब से 10 एमएल बर्फ-ठंडा सीडिंग उन्नत डीएमईएम माध्यम में 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में धीरे-धीरे होती हैं।
    नोट: एचकेसी की 2 शीशियों तक संयुक्त किया जा सकता है।
  6. 10 मिनट के लिए 100 x g पर कमरे के तापमान (आरटी) पर दोनों सेल प्रकारों को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
  7. ट्यूब में जोड़े गए कोशिकाओं की 1 एमएल प्रति शीशी का उपयोग करके गर्म सीडिंग उन्नत डीएमईएम माध्यम और एचकेसी में पीएचएच को फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं को पुन: निलंबित करने के लिए एक सौम्य रॉकिंग क्रिया का उपयोग करें।
    सावधानी: पिपेट क्रिया द्वारा पीएचएच को पुन: निलंबित न करें, क्योंकि इससे कोशिका मृत्यु हो सकती है।
  8. कई ट्यूबों से सेल निलंबन को मिलाएं (यदि लागू हो - यानी, यदि सभी पीएचएच एक ही दाता से हैं), लेकिन सेल प्रकारों को मिश्रण न करें।
  9. कोशिकाओं की गिनती करें। व्यवहार्यता रिकॉर्ड करें (सेल प्रकार, पीएचएच और एचकेसी दोनों के लिए 85% से ऊपर होना चाहिए) और कोशिकाओं की कुल संख्या। यदि सेल व्यवहार्यता 85% से नीचे गिर जाती है, तो कोशिकाओं की एक नई शीशी को पिघलाएं, और सेल व्यवहार्यता का पुनर्मूल्यांकन करें।
  10. निम्न सूत्र का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता की गणना करें:
    Equation 2
  11. प्रत्येक कुएं में बीज देने के लिए सेल निलंबन की वांछित मात्रा की गणना करें और कुल सीडिंग मात्रा को 400 μL तक ले जाने के लिए आवश्यक उन्नत DMEM माध्यम की अतिरिक्त मात्रा की गणना करें। प्रति अच्छी तरह से सेल संख्या: 0.4 x 106 PHH और 0.04 x 106 HKCs प्रति कुएं, और 0.25 x 106 PHH / mL का सेल घनत्व, क्रमशः 0.025 x 106 HKCs/
  12. डॉकिंग स्टेशन से ड्राइवर को डिस्कनेक्ट करें और इसे एमबीएससी में रखें।
  13. मीडिया को उपरोक्त मचान से स्टॉपिंग पॉइंट तक ले जाएं (रिटेनिंग रिंग पर गहरी पायदान से नीचे जाना), चैनल और जलाशय। कल्चर वेल में 0.2 एमएल की "मृत मात्रा" छोड़ दें, मचान के ठीक ऊपर पहुंचें। हवा के बुलबुले बनने से बचने के लिए इस बात का ध्यान रखा जाना चाहिए कि मचान के ऊपर से कुल माध्यम को न हटाया जाए।
  14. कुएं के कक्ष में उन्नत डीएमईएम माध्यम के 400 μL जोड़ें, ड्राइवर को इनक्यूबेटर में डॉकिंग स्टेशन पर वापस करें और 3 मिनट के लिए मीडिया परिवर्तन कार्यक्रम चलाएं। प्रोग्राम स्वचालित रूप से 3 मिनट के बाद रुक जाएगा।
  15. एक बार पूरा होने के बाद, ड्राइवर को डॉकिंग स्टेशन से डिस्कनेक्ट करें और इसे एमबीएससी में वापस रखें।
  16. मीडिया को उपरोक्त मचान से नीचे के बिंदु तक और प्रत्येक कुएं के जलाशय के छोर पर रखें।
  17. ट्यूब को धीरे से हिलाकर पीएचएच को सावधानीपूर्वक पुन: निलंबित करें, फिर प्रत्येक संस्कृति में सेल निलंबन की आवश्यक मात्रा को अच्छी तरह से जोड़ें। सेल निलंबन को ध्यान से पाइप करें, सुनिश्चित करें कि कोशिकाएं प्लेट के मचान में समान रूप से फैल जाएं।
    नोट: पूरे मचान में अच्छा कवरेज सुनिश्चित करने के लिए, पाड़ पर कोशिकाओं को नीचे लाने के लिए धीमी गति से घूमने वाली गति का उपयोग करें।
  18. इसी तरह, सावधानीपूर्वक एचकेसी को फिर से निलंबित करें और प्रत्येक संस्कृति में सेल निलंबन को अच्छी तरह से जोड़ें।
    नोट: पूरे मचान में अच्छी कवरेज सुनिश्चित करने के लिए एचकेसी को बीज देने के लिए धीमी गति से घूमने वाली गति का उपयोग करें। दो बीज उप-चरणों को अलग किया जा सकता है, या दो सेल प्रकारों को उचित घनत्व पर पूर्व-मिश्रित किया जा सकता है और सहवर्ती रूप से बीज दिया जा सकता है।
  19. एक बार जब सभी कुओं में दोनों सेल प्रकार होते हैं, तो एमपीएस ड्राइवर को शारीरिक रूप से कनेक्ट किए बिना इनक्यूबेटर में डॉकिंग स्टेशन पर रखें और इसे 1 घंटे तक खड़े रहने के लिए छोड़ दें।
  20. 1 घंटे के बाद, प्रत्येक कुएं को अतिरिक्त सीडिंग उन्नत डीएमईएम माध्यम की आवश्यक मात्रा के साथ भरें ताकि 400 μL तक पहुंच सकें और बीज कार्यक्रम चला सकें।
  21. 2 मिनट के बाद, कार्यक्रम स्वचालित रूप से रुक जाएगा, ड्राइवर को इनक्यूबेटर से हटा देगा और धीरे-धीरे चैनल में सीडिंग एडवांस्ड डीएमईएम माध्यम के 1000 μL को जोड़ देगा (कुएं के कक्ष की तुलना में जलाशय के अंत के करीब) 1.4 एमएल की कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए (चैनलों में आगे 200 μL मृत मात्रा के साथ)।
  22. प्लेटों को इनक्यूबेटर में ले जाएं और शेष बीज कार्यक्रम को 8 घंटे तक चलाएं।
    नोट: प्रवाह स्वचालित रूप से 8 घंटे के बाद इनक्यूबेट प्रोग्राम पर स्विच करेगा।

4. मीडिया परिवर्तन (दिन 1)

  1. डॉकिंग स्टेशन से ड्राइवर को डिस्कनेक्ट करें और इसे एमबीएससी में रखें।
  2. कुएं के कक्ष में सीडिंग उन्नत डीएमईएम माध्यम को रोक बिंदु तक हटाकर मीडिया परिवर्तन करें।
  3. कुएं के कक्ष में रखरखाव उन्नत डीएमईएम माध्यम के 400 μL जोड़ें, ड्राइवर को इनक्यूबेटर में डॉकिंग स्टेशन पर वापस करें और 3 मिनट के लिए मीडिया परिवर्तन कार्यक्रम चलाएं। प्रोग्राम स्वचालित रूप से 3 मिनट के बाद रुक जाएगा।
  4. डॉकिंग स्टेशन से ड्राइवर को डिस्कनेक्ट करें और, एमबीएससी में, जलाशय कक्ष, चैनल और पाड़ के ऊपर स्टॉपिंग पॉइंट से मीडिया को दूर रखें। इस बिंदु पर, संस्कृति अच्छी तरह से मृत मात्रा में वापस आ जाएगी।
  5. 1.4 एमएल ताजा प्री-वार्मेड (37 डिग्री सेल्सियस) रखरखाव उन्नत डीएमईएम माध्यम के साथ जलाशय कक्ष को ऊपर उठाएं।
  6. ड्राइवर को इनक्यूबेटर में डॉकिंग स्टेशन पर वापस करें और इनक्यूबेट प्रोग्राम चलाएं ।

5. लिवर माइक्रोटिश्यू गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी), मीडिया संग्रह, मीडिया परिवर्तन, और दवा खुराक (दिन 4)

  1. चौथे दिन रखरखाव उन्नत डीएमईएम माध्यम और क्यूसी जांच का उपयोग करके मीडिया परिवर्तन करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सीडिंग सफल रही है।
    नोट: क्यूसी लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच) और यूरिया को मापकर गठित माइक्रोटिश्यू के स्वास्थ्य की जांच करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रक्रिया है।
  2. क्यूसी चलाने से पहले, परीक्षण करने के लिए प्रत्येक यौगिक के लिए नए स्टॉक समाधान तैयार करें (या तो रखरखाव उन्नत डीएमईएम माध्यम या रखरखाव उन्नत डीएमईएम माध्यम में जिसमें प्रत्येक यौगिक की घुलनशीलता के आधार पर 0.1% डीएमएसओ होता है)। प्रत्येक यौगिक के लिए परीक्षण सांद्रता प्राप्त करने के लिए तदनुसार कमजोर पड़ने की तैयारी करें।
  3. डॉकिंग स्टेशन से ड्राइवर और प्लेट डिस्कनेक्ट करें और एमबीएससी में स्थानांतरित करें।
  4. नमूने से पहले एलडीएच परख (सामग्री की तालिका) करने के लिए पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक कुएं से 96 वेल प्लेट में 50 μL मीडिया स्थानांतरित करें और यूरिया परख (सामग्री की तालिका) के लिए 25 μL।
    नोट: एलडीएच और यूरिया परख निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए किया जाएगा।
  5. क्यूसी के बाद प्रयोग जारी रखें यदि एलडीएच रीडिंग 2 एयू / 106 कोशिकाओं से कम है और यूरिया 40 μg / दिन / 106 कोशिकाओं से ऊपर है।
    नोट: एल्बुमिन का उपयोग क्यूसी के रूप में नहीं किया जाता है क्योंकि यह दिन में चलने के लिए एक लंबी परख है और बाद में परीक्षण पूरा होने के बाद जांच की जाएगी।
  6. यदि कोई कुआं क्यूसी में विफल हो जाता है, तो उन्हें प्रयोगात्मक डिजाइन से हटा दें।
  7. एक बार प्रयोगात्मक लेआउट की पुष्टि हो जाने के बाद, प्रत्येक कुएं से शेष मीडिया का नमूना लें, यह सुनिश्चित करें कि मचान को छूकर सेल संस्कृति को परेशान न करें। एकत्रित मीडिया (पूर्व-खुराक नमूने के रूप में लेबल) को बाद के परीक्षणों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  8. चरण 4.3-4.5 के बाद MBSC में मीडिया परिवर्तन करें। प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार सही दवा एकाग्रता के साथ उन्नत डीएमईएम माध्यम के रखरखाव के लिए कुओं को बदलें।
  9. एक बार पूरा होने के बाद, ड्राइवर को इनक्यूबेटर में डॉकिंग स्टेशन पर वापस करें और इनक्यूबेट प्रोग्राम चलाएं ।

6. मीडिया संग्रह, मीडिया परिवर्तन और दवा खुराक (दिन 6)

  1. परीक्षण के लिए प्रत्येक यौगिक के लिए नए स्टॉक समाधान तैयार करें (या तो रखरखाव उन्नत डीएमईएम माध्यम या रखरखाव उन्नत डीएमईएम माध्यम में, प्रत्येक यौगिक की घुलनशीलता के आधार पर 0.1% डीएमएसओ युक्त)। प्लेट योजना के अनुसार प्रत्येक यौगिक के लिए परीक्षण सांद्रता प्राप्त करने के लिए तदनुसार कमजोर पड़ने की तैयारी करें।
  2. डॉकिंग स्टेशन से ड्राइवर और प्लेट को डिस्कनेक्ट करें और एमबीएससी में स्थानांतरित करें।
  3. प्रत्येक कुएं (~ 1 एमएल) से मीडिया को मैन्युअल रूप से एक पिपेट के साथ इकट्ठा करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि एलडीएच और यूरिया के लिए पाड़, परख को छूकर सेल संस्कृति को परेशान न किया जाए। बाद के परीक्षणों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर शेष एकत्रित मीडिया को स्टोर करें, और उन्हें 48 घंटे पोस्ट-डोज नमूने लेबल करें।
  4. चरण 4.3-4.5 के बाद मीडिया परिवर्तन करके और प्लेट योजना के अनुसार दिन 4 के समान दवा एकाग्रता के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से फिर से खुराक लें।
  5. एक बार पूरा होने के बाद, ड्राइवर को इनक्यूबेटर में डॉकिंग स्टेशन पर वापस करें और इनक्यूबेट प्रोग्राम चलाएं ।

7. प्रयोग को समाप्त करना (दिन 8)

  1. डॉकिंग स्टेशन से ड्राइवर और प्लेट को डिस्कनेक्ट करें और एमबीएससी में स्थानांतरित करें।
  2. एक पिपेट का उपयोग करके मैन्युअल रूप से प्रत्येक कुएं से नमूना मीडिया, यह सुनिश्चित करना कि मचान को छूकर सेल संस्कृति को परेशान न करें।
  3. एलडीएच और यूरिया के लिए वापस लिए गए मीडिया की परख करें और बाद के परीक्षणों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर शेष एकत्रित मीडिया को संग्रहीत करें।
  4. सीवाईपी 3 ए 4-ग्लो परख चलाना।
    1. इस परख का उपयोग करके प्रयोग के अंत में पीएचएच में साइटोक्रोम पी 450 सीवाईपी 3 ए 4 गतिविधि पर परीक्षण की गई दवाओं के प्रभावों को मापें।
    2. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए डिटेक्शन अभिकर्मक (CYP3A4 परख के लिए, सामग्री की तालिका देखें) का पुनर्गठन करें। यदि डिटेक्शन अभिकर्मक को पहले पुनर्गठित और जमे हुए किया गया है, तो इसे -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से हटा दें और इसे आरटी पर पिघलने दें।
    3. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए 20 एमएम स्टॉक डी-लूसिफेरिन मानक तैयार करें।
    4. रखरखाव उन्नत डीएमईएम माध्यम (प्रति कुएं ल्यूमिनोजेनिक सब्सट्रेट माध्यम के 2 एमएल) में लूसिफेरिन आईपीए के 1: 1000 कमजोर पड़ने के साथ काम करने वाले ल्यूमिनोजेनिक सब्सट्रेट माध्यम तैयार करें।
    5. ल्यूमिनोजेनिक सब्सट्रेट माध्यम के साथ चरण 4.3-4.5 में वर्णित मीडिया परिवर्तन करें। इनपुट सामग्री के रूप में 1.5 एमएल ग्लास शीशी (सामग्री की तालिका) में ल्यूमिनोजेनिक सब्सट्रेट माध्यम के 500 μL को सहेजें।
    6. ड्राइवर को इनक्यूबेटर में डॉकिंग स्टेशन पर वापस करें और 1.5 घंटे के लिए इनक्यूबेट प्रोग्राम चलाएं।
    7. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए 1.5 एमएल ट्यूबों में संस्कृति माध्यम में डी-लूसिफेरिन मानक वक्र तैयार करें और प्रत्येक मानक के 50 μL को एक सफेद अपारदर्शी 96-वेल प्लेट पर डुप्लिकेट में तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें), संस्कृति माध्यम को रिक्त या 0 μM के रूप में उपयोग करते हुए।
    8. एक बार समय बीत जाने के बाद, चरण 7.4.9-7.4.13 का पालन करते हुए सीवाईपी 3 ए 4 परख के लिए डॉकिंग स्टेशन और नमूना मीडिया से ड्राइवर को हटा दें।
    9. इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक कुएं और इनपुट सामग्री से नमूना माध्यम के 50 μL को मानकों वाले 96-अच्छी तरह से अपारदर्शी सफेद ल्यूमिनोमीटर प्लेट में स्थानांतरित करें। शीर्ष मानकों और नमूने रीडिंग के बीच प्रकाश कैरीओवर से बचने के लिए मानकों और नमूनों के बीच अपारदर्शी प्लेट पर कम से कम दो खाली पंक्तियों को छोड़ने का ध्यान रखें।
    10. एक चमकदार प्रतिक्रिया शुरू करने के लिए प्रत्येक कुएं में लूसिफेरिन डिटेक्शन अभिकर्मक का 50 μL जोड़ें।
    11. ल्यूमिनेसेंट सिग्नल को स्थिर करने के लिए अंधेरे में 20 मिनट के लिए प्लेट शेकर पर आरटी पर प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    12. ल्यूमिनोमीटर या सीसीडी कैमरे का उपयोग करके ल्यूमिनेसेंस रिकॉर्ड करें।
    13. प्रत्येक बिंदु का औसत लेकर मानक वक्र को प्लॉट करें और फिर रिक्त स्थानों के औसत को घटाएं। शेष नमूनों में चयापचय दर (pmol/min/106 कोशिकाओं) की गणना करने के लिए रेखा के समीकरण का उपयोग करें, किसी भी कमजोर पड़ने को शामिल करना याद रखें।
  5. चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करके प्लेटों से मचानों को हटा दें और उन्हें प्रत्येक कुएं में 500 μL D-PBS (Ca++ और Mg++) युक्त 24 वेल प्लेट में रखें, इस बात का ध्यान रखते हुए कि माइक्रोटिश्यू को परेशान न किया जाए।
  6. आवर्धन 10x पर उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रत्येक मचान के स्नैपशॉट लें।
  7. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एटीपी परख चलाना ( सामग्री की तालिका देखें):
    1. आरटी पर अभिकर्मक को पिघलाएं।
    2. मचानों को प्रत्येक वॉश स्टेप के लिए 500 μL D-PBS (Ca++ और Mg++के बिना) के साथ दो बार धोएं।
    3. प्रत्येक मचान में अभिकर्मक का 120 μL और PBS का 120 μL जोड़ें और एक खाली कुएं में समान मात्रा जोड़ें (यह रिक्त के रूप में काम करेगा)। एल्यूमीनियम पन्नी में ढकी प्लेट को एक शेकर पर रखें और 5 मिनट के लिए जोर से (500 आरपीएम) हिलाएं, इसके बाद ल्यूमिनेसेंस सिग्नल को स्थिर करने के लिए 30 मिनट की इनक्यूबेशन करें।
    4. माप के लिए एक स्पष्ट फ्लैट-बॉटम 96-वेल परख प्लेट में डुप्लिकेट में लाइस्ड नमूनों के 100 μL को स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि खाली कुओं को उच्च ल्यूमिनेसेंस के अन्य मापने वाले कुओं के बगल में नहीं रखा गया है।
    5. माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके ल्यूमिनेसेंस रिकॉर्ड करें।
    6. नमूनों में अभिकर्मक द्वारा पता लगाए गए एटीपी को निर्धारित करने के लिए मानकों के ल्यूमिनेसेंस के लिए नमूनों के ल्यूमिनेसेंस की तुलना करें।

Representative Results

पांडुलिपि डीआईएलआई का आकलन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले यकृत एमपीएस मॉडल का वर्णन करती है। एमपीएस 3 डी यकृत माइक्रोटिश्यू की पीढ़ी की सुविधा प्रदान करता है जो 4 सप्ताह तक प्रवाह के तहत अत्यधिक कार्यात्मक बनाए रखा जाता है। पीएचएच/एचकेसी को कोलेजन-लेपित मचानों पर बीज दिया जाता है ताकि यकृत माइक्रोटिश्यूज बनाए जा सकें, जो विकास माध्यम से जुड़े होते हैं और क्यूसी जांच पास करने के बाद, यौगिकों के साथ खुराक दी जाती है। यहां, हम ट्रोग्लिटाज़ोन और पियोग्लिटाज़ोन के लिए डेटा दिखाते हैं, दो संरचनात्मक रूप से समान यौगिक लेकिन अलग-अलग डीआईएलआई सेवरिटी के साथ।

दिन 4 पर, दवा खुराक से पहले, गठित यकृत माइक्रोटिश्यूज की क्यूसी जांच का मूल्यांकन किया जाता है और इसमें एलडीएच रिलीज और यूरिया संश्लेषण (चित्रा 1 ए) होता है। क्यूसी का उद्देश्य यह पुष्टि करना है कि यकृत एमपीएस अत्यधिक सुसंगत और कार्यशील यकृत माइक्रोटिश्यू का उत्पादन करता है। यहां प्रस्तुत डेटा तीन प्रयोगों से उत्पन्न होते हैं और कम इंट्रा-और इंटर-स्टडी परिवर्तनशीलता के साथ प्रजनन क्षमता के अच्छे स्तर को दर्शाते हैं। 8-दिवसीय संस्कृति के बाद, कई स्वास्थ्य और यकृत मैट्रिक्स (एल्बुमिन, यूरिया, सीवाईपी 3 ए 4, एटीपी) का मूल्यांकन किया जाता है और नियंत्रण माइक्रोटिश्यू यकृत कार्यक्षमता और प्रजनन क्षमता के उच्च स्तर दिखाते हैं (चित्रा 1 बी, सी)। कंट्रास्ट फेज माइक्रोस्कोपी और यकृत माइक्रोटिश्यूज ( पूरक सामग्री देखें) का धुंधला होना मचान के माइक्रोचैनलों में उच्च सीडिंग स्थिरता दिखाता है और पीएचएच माइक्रोटिश्यूज में एचकेसी के वितरण को प्रकट करता है (चित्रा 1 डी)

Figure 1
चित्र 1: लिवर एमपीएस अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा और सुसंगत माइक्रोटिश्यू का उत्पादन करता है। (ए) दिन 4 पर 3 डी लिवर माइक्रोटिशू क्यूसी मैट्रिक्स, और दिन 8 में अध्ययन के अंत में कार्यक्षमता मूल्यांकन - (बी) एल्बुमिन और यूरिया, (सी) सीवाई 3 ए 4 और एटीपी)। डेटा 3 प्रयोगों से एकत्र किया जाता है; प्रत्येक प्रयोग में, 3 वाहन नियंत्रण प्रतिकृतियां थीं। दिखाए गए डेटा एसडी ± माध्य हैं, एन = 9। (घ) डीआईएलआई का आकलन करने के लिए यकृत एमपीएस प्लेटफार्म में पीएचएच और एचकेसी के सह-संवर्धन द्वारा उत्पन्न 3डी यकृत सूक्ष्म ऊतकों की चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी (10x और 20x) और IF। एचकेसी की कल्पना करने के लिए, बीज बोने से पहले एचकेसी को ईजीएफपी व्यक्त करने वाले एडेनोवायरल वेक्टर के साथ ट्रांसड्यूस किया गया था ( पूरक सामग्री देखें)। प्रतिनिधि फोटोमाइक्रोग्राफ दिखाए गए हैं। पारगमन और इमेजिंग सेल स्थानीयकरण को प्रदर्शित करने के लिए एक स्टैंडअलोन प्रयोग के रूप में किया गया था और वर्णित डीआईएलआई प्रोटोकॉल के साथ नहीं किया गया था। एचकेसी कोशिकाएं प्रयोगात्मक सेल संस्कृति में उपयोग से पहले पूर्व-मान्य इन-हाउस हैं और इसमें पोस्ट-पिघलने सक्रियण का निम्न स्तर होना चाहिए; इसका मूल्यांकन बायोमाकर्स आईएल -6 और टीएनएफ-अल्फा को मापकर किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ट्रोग्लिटाज़ोन गंभीर डीआईएलआई का कारण माना जाता है; टाइप 2 मधुमेह के उपचार के लिए इसके लाइसेंस के बाद, इसके उपयोग से जुड़े जिगर की चोट की आवृत्ति के कारण बाजार पर 3 साल बाद एफडीए द्वारा इसे वापस ले लिया गया था। आज तक, प्रकाशित पशु अध्ययन गंभीर जिगर की चोट का कारण बनने के लिए ट्रोग्लिटाज़ोन की क्षमता की भविष्यवाणी करने में विफल रहे। इस यौगिक की विषाक्तता मानक इन विट्रो 2 डी हेपेटिक एसेस14 में भी नहीं पाई गई थी।

एमपीएस में लिवर माइक्रोटिश्यू को 96 घंटे के लिए ट्रोग्लिटाज़ोन के साथ खुराक दी गई थी, और इसने एक तीव्र विषाक्त प्रतिक्रिया, सीमैक्स संचालित का कारण बना, जिसे एएलटी और एलडीएच रिलीज द्वारा पता लगाया गया था और ट्रोग्लिटाज़ोन (चित्रा 2 ए) के तीव्र संपर्क के बाद लगभग 15 x Cअधिकतम पर एल्बुमिन और यूरिया उत्पादन में तेजी से कमी आई थी। सेलुलर एंडपॉइंट (एटीपी सामग्री) और सीवाईपी 3 ए 4 गतिविधि (चयापचय बायोट्रांसफॉर्म का आकलन करने के लिए), 96 घंटे के जोखिम के बाद नमूना लिया गया, आगे पुष्टि की गई कि ट्रोग्लिटाज़ोन के कारण विषाक्तता और ईसी: 50 मान अन्य समापन बिंदुओं (चित्रा 2 बी) के लिए अत्यधिक तुलनीय थे। एमपीएस में 8-दिवसीय संस्कृति के बाद ली गई ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी छवियों से एक स्वस्थ यकृत माइक्रोटिशू का पता चलता है, जो सामान्यीकृत ऊतक मृत्यु / गिरावट के विपरीत मचान (वाहन नियंत्रण) में समान रूप से बीजित होता है, जैसा कि शीर्ष दो परीक्षण सांद्रता (चित्रा 2 सी) पर सकारात्मक नियंत्रण और ट्रोग्लिटाज़ोन के साथ इलाज किए गए प्रतिकृति में देखा गया है।

Figure 2
चित्रा 2: कई हेपेटोटॉक्सिक एंडपॉइंट का उपयोग करके ट्रोग्लिटाज़ोन के डीआईएलआई जोखिम का निर्धारण करना। लिवर माइक्रोटिश्यू को 96 घंटे के लिए ट्रोग्लिटाज़ोन की सात परीक्षण सांद्रता के संपर्क में लाया गया था और (ए) एलडीएच रिलीज, एएलटी रिलीज, एल्ब्यूमिन उत्पादन, यूरिया संश्लेषण, सीवाईपी 3 ए 4 गतिविधि और एटीपी सामग्री के लिए तुलना की गई थी। ब्लू लाइनें - 48 घंटे एक्सपोजर (केवल मीडिया एंडपॉइंट), लाल रेखाएं - 96 एच एक्सपोजर। सकारात्मक नियंत्रण 100 μM chlorpromazine था। सभी समापन बिंदुओं को एक ही यकृत एमपीएस संस्कृतियों से मापा जाता है। दिखाए गए डेटा एसडी, एन = 3 ± माध्य हैं। (बी) डेटा से उत्पन्न ई: 50 संख्याओं का सारांश। N.D. = डेटा प्लॉट करने योग्य नहीं है। रेखा = परख नहीं। (सी) 8-दिवसीय संस्कृति (आवर्धन 10x) के बाद यकृत माइक्रोटिश्यूज की प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पियोग्लिटाज़ोन के संपर्क में आने के बाद यकृत विषाक्तता की भी जांच की गई थी। पियोग्लिटाज़ोन एक यौगिक है जिसे कम-डीआईएलआई चिंता4 के रूप में जाना जाता है और क्लासिक 2 डी प्राथमिक हेपेटोसाइट्स संस्कृतियों में हेपेटोटॉक्सिसिटी नहीं थी और यहां तक कि कुछ और उन्नत 3 डी मॉडल10,11 में भी। दोनों परीक्षण किए गए समय बिंदुओं पर हल्के हेपेटोटॉक्सिक प्रभाव देखे गए (चित्रा 3)। कोई एलडीएच या एएलटी रिलीज का पता नहीं चला; हालांकि, 48 घंटे के बाद, एल्बुमिन और यूरिया उत्पादन में हल्की कमी देखी गई, लगभग 25x Cअधिकतम (चित्रा 3A)। उच्च पियोग्लिटाज़ोन सांद्रता में एटीपी सामग्री में बहुत मामूली कमी भी देखी गई थी, लेकिन यह महत्वपूर्ण नहीं था। खुराक-प्रतिक्रिया वक्रों से उत्पन्न ईसी: 50 मान चित्रा 3 बी में प्रस्तुत किए गए हैं। माइक्रोस्कोपी ने दो उच्चतम परीक्षण सांद्रता (चित्रा 3 सी) पर पियोग्लिटाज़ोन के 96 घंटे के संपर्क के बाद मामूली सूक्ष्म ऊतक परिवर्तन का खुलासा किया। परिणाम हल्के डीआईएलआई चिंता वाले यौगिकों की विषाक्तता का पता लगाने के लिए यकृत एमपीएस की क्षमता को प्रदर्शित करते हैं।

Figure 3
चित्रा 3: कई हेपेटोटॉक्सिक एंडपॉइंट का उपयोग करके पियोग्लिटाज़ोन के डीआईएलआई जोखिम का निर्धारण करना। लिवर माइक्रोटिश्यू को 96 घंटे के लिए पियोग्लिटाज़ोन की सात परीक्षण सांद्रता के संपर्क में लाया गया था और (ए) एलडीएच रिलीज, एएलटी रिलीज, एल्बुमिन उत्पादन, यूरिया संश्लेषण, सीवाईपी 3 ए 4 गतिविधि और एटीपी सामग्री के लिए तुलना की गई थी। ब्लू लाइनें - 48 घंटे एक्सपोजर (केवल मीडिया एंडपॉइंट), लाल रेखाएं - 96 एच एक्सपोजर। सकारात्मक नियंत्रण 100 μM chlorpromazine था। सभी समापन बिंदुओं को एक ही यकृत एमपीएस संस्कृतियों से मापा जाता है। दिखाए गए डेटा एसडी, एन = 3 ± माध्य हैं। (बी) डेटा से उत्पन्न ईसी: 50 संख्याओं का सारांश। N.D. = डेटा प्लॉट करने योग्य नहीं है। रेखा = परख नहीं। (सी) 8-दिवसीय संस्कृति (आवर्धन 10x) के बाद यकृत माइक्रोटिश्यूज की प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सभी कार्यात्मक समापन बिंदुओं और विषाक्तता आउटपुट बायोमाकर्स का आकलन करके जो विवो या नैदानिक परिदृश्यों (एलडीएच रिलीज, यूरिया संश्लेषण, एल्बुमिन उत्पादन, सीवाईपी 3 ए 4 गतिविधि, एटीपी सामग्री, एएलटी रिलीज) में प्रतिनिधित्व कर सकते हैं और 48 घंटे और 96 घंटे के लिए सात-बिंदु खुराक सीमा पर खुराक किए गए दोनों परीक्षण किए गए यौगिकों के लिए उत्पन्न डेटा की पुष्टि करके, "हेपेटोटॉक्सिसिटी के हस्ताक्षर" उत्पन्न करने के लिए एक हीटमैप उत्पन्न किया गया है। डीआईएलआई चिंता के अलग-अलग स्तर वाले यौगिकों की पहचान करने में मदद करना (चित्रा 4)।

Figure 4
चित्रा 4: लिवर एमपीएस के साथ "विषाक्तता के हस्ताक्षर" का निर्धारण। 48 घंटे और 96 घंटे के संपर्क में आने के बाद छह कार्यात्मक यकृत-विशिष्ट समापन बिंदुओं (एलडीएच रिलीज, यूरिया संश्लेषण, एल्ब्यूमिन उत्पादन, एएलटी रिलीज, सीवाईपी 3 ए 4 गतिविधि और एटीपी सामग्री) से ट्रोग्लिटाज़ोन और पियोग्लिटाज़ोन का हीटमैप दिखाना। प्रत्येक मान माध्य, एन = 3 के रूप में उत्पन्न होता है, और नमूने को नियंत्रित करने के लिए सामान्यीकृत होता है। रंग पट्टियों पर मान बेसलाइन नियंत्रणों पर गुना वृद्धि का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक सामग्री: माइक्रोटिश्यूज के फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप इमेजिंग और कोशिकाओं का पूर्व-योग्यता मूल्यांकन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

एमपीएस को विट्रो में मानव अंगों की कार्यात्मक इकाइयों को पुन: व्यवस्थित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है और पारंपरिक 3 डी सेल संस्कृति मॉडल27 की सीमाओं को संबोधित करने के लिए विकसित किया गया है। यकृत एमपीएस का उपयोग करने वाले सबसे मॉडलिंग अंगों में से एक है, और विभिन्न प्रकार की प्रणालियां विकसित की गई हैं। मानव यकृत दवा चयापचय और विषाक्त दवा मेटाबोलाइट्स की पीढ़ी के लिए जिम्मेदार है, और इसका कार्य दवा के विकास के लिए मॉडल करने के लिए एक महत्वपूर्ण तत्व है, जिसमें यौगिकों के डीआईएलआई देयता का आकलन भीशामिल है। यहां हमने यकृत एमपीएस का उपयोग करके डीआईएलआई का आकलन करने के लिए एक नई विधि पेश की है; प्रोटोकॉल प्रत्येक यौगिक के लिए यांत्रिक अंतर्दृष्टि की मांग करने में सक्षम बनाता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि यह डीआईएलआई के साथ-साथ अत्यधिक संवेदनशील और मजबूत परख होने का कारण कैसे बन सकता है। लिवर माइक्रोटिश्यू एमपीएस प्लेटों में बनते हैं, जो पीएचएच और एचकेसी का एक सह-संवर्धन हैं और मानक इन विट्रो लिवर मॉडल20 की तुलना में एल्बुमिन और यूरिया उत्पादन के उच्च स्तर के साथ-साथ उच्च सीवाईपी 3 ए 4 गतिविधि के साथ अत्यधिक कार्यात्मक हैं।

यद्यपि यहां वर्णित डीआईएलआई मॉडल दवा विकास प्रक्रिया में प्रीक्लिनिकल परीक्षण के बाद के चरणों में एक उपयोगी उपकरण के रूप में काम कर सकता है, लेकिन इसकी कई सीमाएं भी हैं। जैसा कि वर्तमान में बाजार पर अधिकांश एमपीएस उपलब्ध हैं, यह एक कम-थ्रूपुट प्लेटफॉर्म है और इसलिए, बड़े पैमाने पर दवा स्क्रीनिंग गतिविधियों के लिए उपयोग करना अधिक कठिन है। पीएचएच और एचकेसी द्वारा गठित सूक्ष्म ऊतकों से मिलकर डीआईएलआई मॉडल भी मानव यकृत की जटिलता को पूरी तरह से पकड़ नहीं सकता है, और विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं (जैसे, प्रतिरक्षा कोशिकाओं) को शामिल करके आगे अनुकूलन मौजूदा मॉडल में मूल्य जोड़ने के लिए फायदेमंद होगा। इस एकल-अंग एमपीएस को अन्य अंग प्लेटफार्मों के साथ भी जोड़ा जा सकता है जो एक सामान्य माध्यम साझा कर सकते हैं और सेलुलर या अंतःस्रावी स्तर पर अंग क्रॉसस्टॉक की अनुमति दे सकते हैं, और यह विषाक्तता की यांत्रिक अंतर्दृष्टि को बेहतर ढंग से समझने में मदद कर सकता है जो केवल यकृत तक ही सीमित नहीं है। इसके अलावा, किसी भी अपेक्षाकृत नई तकनीक के रूप में, इसे महंगा माना जा सकता है और इसलिए सीमित पहुंच है।

एमपीएस एक मंच है जिसका उपयोग एकल या बहु-मानव ऊतकों के ऑर्गेनोटाइपिक मॉडल विकसित करने के लिए किया जाता है। सिस्टम एक नियंत्रक, गर्भनाल केबल और एमपीएस ड्राइवर से बना है जिसमें प्लेट डाली जाती है (चित्रा 5 ए)। प्रत्येक लिवर एमपीएस प्लेट में इंजीनियर मचानों पर 3 डी में प्राथमिक यकृत कोशिकाओं के संवर्धन के लिए 12 स्वतंत्र खुले कुएं होते हैं। सारांश में, सिस्टम की जांच क्यूसी की जाती है, और प्लेटों को दिन -1 पर प्राइम किया जाता है, पीएचएच और एचकेसी को दिन शून्य पर प्लेटों पर बीज दिया जाता है (चित्रा 5 बी, देखें 1)। एम्बेडेड माइक्रोपंप 3 डी माइक्रोटिश्यू के गठन की सुविधा के लिए मचानों के माध्यम से सेल कल्चर मीडिया के संचलन की सुविधा प्रदान करते हैं (चित्रा 5 बी, देखें 2)। गठित माइक्रोटिश्यू को दिन 4 पर क्यूसी डी किया जाता है, 4 दिनों के लिए हर 48 घंटे में प्रत्येक यौगिक की अलग-अलग सांद्रता के साथ खुराक दी जाती है, और दिन 8 (चित्रा 5 सी) में समापन बिंदु बायोमार्कर के लिए परख की जाती है। एमपीएस प्लेट में डीआईएलआई परख की प्रयोगात्मक समयरेखा चित्रा 5 डी में चित्रित की गई है।

Figure 5
(ए) इसके घटकों के साथ माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम: नियंत्रक (1), नाभि केबल (2), डॉकिंग स्टेशन (3), एमपीएस ड्राइवर (4) और एलसी 12 प्लेट (5)। (ख) पहले (1) दिन एलसी12 प्लेट पर पीएचएच और एचकेसी की सीडिंग और एम्बेडेड माइक्रोपंप ों से मचानों पर बीजित 3डी माइक्रोटिश्यूज के माध्यम से ट्यूनेबल प्रवाह दर के साथ सेल कल्चर मीडिया के संचलन की सुविधा प्रदान की जा सकती है (2). (ग) अध्ययन के अंत में मचानों को हटाना। (डी) प्रायोगिक समयरेखा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करते समय, यह महत्वपूर्ण है कि शुरू करने से पहले एक मजबूत सिस्टम क्यूसी जांच की जाए, यह जांचना कि सिस्टम वायवीय रूप से सही तरीके से काम कर रहा है और उपभोग्य प्लेटों को नेत्रहीन रूप से निरीक्षण किया जाता है और सभी कुओं में कार्यक्षमता सुनिश्चित करने के लिए कुशलता से प्राइम किया जाता है। इस प्रोटोकॉल के लिए उच्च गुणवत्ता वाली प्राथमिक मानव कोशिकाओं का होना आवश्यक है, जिसमें हेपेटोसाइट्स को सेल संस्कृति प्रयोगों में लगातार पालन करने और 3 डी इंटरैक्शन बनाने के लिए जाना जाता है। इन कोशिकाओं को पिघलाना भी एक महत्वपूर्ण कदम है, क्योंकि प्राथमिक हेपेटोसाइट्स को पिपेटिंग एक्शन द्वारा पुन: निलंबित नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि इससे तेजी से कोशिका मृत्यु हो सकती है। सफल सीडिंग के लिए 85% से अधिक सेल व्यवहार्यता होना महत्वपूर्ण है, क्योंकि बड़ी मात्रा में सेलुलर मलबे 3 डी माइक्रोटिशू गठन में हस्तक्षेप करेंगे। दिन 4 पर गठित यकृत माइक्रोटिश्यू की क्यूसी जांच भी महत्वपूर्ण है, और उपयोगकर्ता को यह सुनिश्चित करने की आवश्यकता है कि एलडीएच और यूरिया के स्वीकार्य स्तर को मापा जाता है, क्योंकि आउट-ऑफ-रेंज पैरामीटर खराब गुणवत्ता वाले ऊतक गठन का संकेत हो सकते हैं और सीधे समस्या निवारण की अनुमति दे सकते हैं। अंत में, सेल कल्चर मीडिया में उपयोग किए जाने वाले हाइड्रोकार्टिसोन को किसी भी अवांछित गिरावट को रोकने के लिए उपयोग के दिन ताजा तैयार किया जाना चाहिए जो सेल संस्कृति कार्यक्षमता को प्रभावित कर सकता है, क्योंकि हेपेटोसाइट्स की चयापचय कार्यक्षमता को बनाए रखने के लिए आवश्यक है।

महत्वपूर्ण जटिलता होने के बावजूद, यकृत एमपीएस में मानव यकृत के सभी सेल प्रकार नहीं होते हैं। शारीरिक प्रासंगिकता बढ़ाने के लिए मॉडल24,29 में आगे की कोशिकाओं के प्रकार जोड़ना संभव है, लेकिन इन्हें केवल उपयोग के संदर्भ के लिए स्पष्ट औचित्य के साथ जोड़ा जाना चाहिए। डीआईएलआई पीएचएच का अध्ययन करने के लिए प्रमुख सेल प्रकार हैं, और इस मॉडल में एचकेसी का समावेश कुछ प्रतिरक्षात्मक प्रतिक्रियाओं को निर्धारित करने की अनुमति देता है। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि मानव यकृत और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध क्रायोसंरक्षित पीएचएच से अलग पीएचएच बहुत से बहुत कुछ भिन्नताओं को प्रदर्शित करते हैं। हमने यहां प्रदर्शित किया है कि यह प्रोटोकॉल कोशिकाओं की उच्च गुणवत्ता वाली तैयारी के साथ उपयोग किए जाने पर प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम उत्पन्न करता है। हालांकि, कुछ बहुत अधिक भिन्नता की उम्मीद की जाएगी, और इसे कई दाताओं के पूल किए गए बहुत से का उपयोग करके दूर किया जा सकता है। इन सीमाओं को आईपीएससी से विभेदित हेपेटोसाइट जैसी कोशिकाओं का उपयोग करके दूर किया जा सकता है जो पीएचएच के कई कार्यात्मक गुणों को पुन: उत्पन्न करते हैं और जिनका उपयोग दवा विकास प्रक्रियामें किया गया है। एचकेसी भी बहुत परिवर्तनशीलता और पिघलने पर सक्रियण के उच्च स्तर को दिखाते हैं; इसलिए, एचकेसी दाताओं को प्रयोगात्मक सेल संस्कृति (मान्य पीएचएच के साथ सह-संस्कृति) में उपयोग करने से पहले पूर्व-मान्य इन-हाउस किया जाता है और पोस्ट-पिघलाव सक्रियण का निम्न स्तर होना चाहिए; इसका मूल्यांकन बायोमाकर्स आईएल -6 और टीएनएफ-अल्फा को मापकर किया जाता है (पूरक सामग्री देखें)।

यहां प्रस्तुत डेटा पुष्टि करते हैं कि परख डीआईएलआई का सटीक रूप से पता लगा सकती है, जिससे हेपेटोटॉक्सिकेंट्स की पहचान करने में मदद मिलती है जिन्हें 2 डी10,11 और यहां तक कि कुछ 3 डी मॉडल द्वारा पता नहीं लगाया जा सकता है। एमपीएस से उत्पन्न डेटा अभी भी प्रक्रिया मानकीकरण और सामंजस्य की कमी के कारण नियामक प्रस्तुतियों या दवा स्क्रीनिंग उद्देश्यों के लिए दवा उद्योग द्वारा एक मानक के रूप में उपयोग नहीं किया जाता है, जिसमें अंतर-साइट प्रजनन क्षमता20 भी शामिल है। यहां प्रदर्शित डेटा और प्रयोगात्मक दृष्टिकोण इसे संबोधित करते हैं, यह दिखाते हुए कि यकृत मॉडल का उपयोग डीआईएलआई स्क्रीन में नियमित रूप से और मजबूती से किया जा सकता है ताकि नए यौगिकों की देयता की सटीक भविष्यवाणी की जा सके।

"हेपेटोटॉक्सिसिटी के हस्ताक्षर" का उत्पादन करने के लिए एंडपॉइंट की एक श्रृंखला को मापकर, डीआईएलआई चिंता के विभिन्न स्तरों (अन्य इन विट्रो विधियों द्वारा पता लगाने योग्य यौगिकों सहित) के साथ यौगिकों की पहचान करने में मदद करता है और विषाक्तता के उनके तंत्र का पता चला है। यह तकनीक एक तरफ पारंपरिक सेल संस्कृति और पशु मॉडल और मानव नैदानिक परीक्षणों के बीच की खाई को बंद कर सकती है, दवा विकास प्रक्रिया के हिस्से के रूप में यकृत विषाक्तता के प्रीक्लिनिकल मूल्यांकन के लिए मानव जैविक स्थितियों के अनुकरण की ओर आगे बढ़ रही है।

Disclosures

सभी लेखक सीएन बायो इनोवेशन लिमिटेड के कर्मचारी हैं।

Acknowledgments

सीएन बायो इनोवेशन लिमिटेड ने इस अध्ययन को वित्त पोषित किया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 well cell culture cluster plates flat bottom Corning 3524
96 well clear assay plates, flat bottom clear plastic Greiner 655101
96 well plates black flat bottom Corning 3915
96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface ThermoScientific 165306
Advanced DMEM (1x) Gibco 12491015 Cell culture media.
AssayMax Albumin ELISA Kit AssayPro EA3201-1 Dilution 1:250. Time point Day 4, 6, and 8.
Cell Maintenance Cocktail B, (Primary Hepatocyte Maintenance Supplements) Gibco CM4000
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega G9682 Dilution 1:1. Time point Day 8.
Chlorpromazine HCl Sigma Aldrich C8138
Chromacol blue lids, 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps ThermoScientific 9-SCK(B)-ST1 glass vial
Chromacol vials, 9 mm Clear Glass Screw Thread Vials ThermoScientific 2-SVW
Class 2 Microbiological Safety Cabinets - Trimat2 1500 exhaust Contained Air Solutions
Conical tubes 50 mL Greiner 227261
Cryopreserved Hepatocyte Recovery Medium (CHRM) ThermoFisher Scientific Gibco CM7000
Cryopreserved primary human hepatocytes BioIVT Europe Lot. RAS
CytoTox 96 Cytotoxicty (LDH) Assay Kit Promega G1781 Dilution - none. Time point Day 4, 6 and 8
>Data analysis model used to generate the graph and EC:50 curves was nonlinear regression (curve fit) asymmetric sigmoidal, 5PL, where X is log(concentration GraphPad Prism 9
Disposable PES Filter Units 500mL Fisher Scientific 15913307
Disposable Pipette Basins 50ml Fisher Scientific 12369175
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma-Aldrich Sigma D2650
Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (D-PBS) ThermoFisher Scientific 14190-144
Easy Reader Conical Polypropylene Centrifuge Tubes 15 mL Fisher Scientific 11889640
Foetal bovine serum Gibco 10500064
Human ALT ELISA Kit Abcam  ab 234578 Dilution 1:5. Time point Day 6 and 8.
Human Cryopreserved Kupffer Cells Lonza Europe Lot. 190088KC
hydrocortisone Merck H0888-1G
Incubators models: New Brunswick  Galaxy 170 S, New Brunswick  Galaxy 170 R and CellXpert® C170. Eppendorf All serviced yearly; paperwork available upon request.
Inverted Microscope Leica DMIL LED
MPS know as Organ-on-a-Chip (OOC) CN Bio Innovations Ltd.
MPS LC-12 plate CN Bio Innovations Ltd.
Neubauer Improved C-Chip Disposable Haemocytometer (2 channel) Cambridge Bioscience DHC-N01-50
P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System Promega V9002 Dilution - none. Time point Day 8
PhysioMimix MPS platform CN Bio Innovations Ltd.
Pioglitazone MedChemExpress Tocris HY-13956/CS-1700
Quantichrom Urea Assay Kit – Bioassay systems Bioassay Systems DY970-05 Dilution 1:2 if initial reading is too high. Time point Day 4, 6 and 8.
Silica gel Sigma-Aldrich S7625
Software used to analyse and generate all the graphs was GraphPad Prism 9
Stripettes 10 mL Fisher Scientific 11839660
Stripettes 25 mL Fisher Scientific 11839181
Thawing plate Cocktail A, (Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements) Gibco CM3000
Troglitazone MedChemExpress Tocris 97322-87-7
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Tubes 1.5 mL Greiner 616201
Weighing balance - model PA214C and AV213C Ohaus Corp

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lisi, D. M. Drug-induced liver injury: An overview. US Pharmacist. 41 (12), 30-34 (2016).
  2. Kuna, L., et al. Models of drug induced liver injury (DILI)-current issues and future perspectives. Current Drug Metabolism. 19 (10), 830-838 (2018).
  3. Katarey, D., Verma, S. Drug-induced liver injury. Clinical Medicine. 16 (6), London, England. 104-109 (2016).
  4. Kullak-Ublick, G. A., et al. Drug-induced liver injury: recent advances in diagnosis and risk assessment Recent advances in clinical practice. Gut. 66, 1154-1164 (2017).
  5. Dirven, H., et al. Performance of pre-clinical models in predicting drug-induced liver injury in humans: a systematic review. Scientific Reports. 11 (1), 6403 (2021).
  6. Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies. Current Drug Metabolism. 9 (1), 1-11 (2008).
  7. Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line HepG2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism and Disposition. 31 (8), 1035-1042 (2003).
  8. Gerets, H. H. J., et al. Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins. Cell Biology and Toxicology. 28 (2), 69-87 (2012).
  9. Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier. Pharmaceutical Research. 23 (7), 1482-1490 (2006).
  10. Li, F., Cao, L., Parikh, S., Zuo, R. Three-dimensional spheroids with primary human liver cells and differential roles of kupffer cells in drug-induced liver injury. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (6), 1912-1923 (2020).
  11. Proctor, W. R., et al. Utility of spherical human liver microtissues for prediction of clinical drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 91 (8), 2849-2863 (2017).
  12. Lin, C., Khetani, S. R. Advances in engineered liver models for investigating drug-induced liver injury. BioMed Research International. 2016, 1829148 (2016).
  13. Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 32 (1), 56-67 (2000).
  14. Bell, C. C., et al. Comparison of hepatic 2D sandwich cultures and 3D spheroids for long-term toxicity applications: A multicenter study. Toxicological Sciences. 162 (2), 655-666 (2018).
  15. Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
  16. Khetani, S. R., et al. Use of micropatterned co-cultures to detect compounds that cause drug-induced liver injury in humans. Toxicological Sciences. 132 (1), 107-117 (2013).
  17. Ma, X., et al. Deterministically patterned biomimetic human iPSC-derived hepatic model via rapid 3D bioprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the united States of America. 113 (8), 2206-2211 (2016).
  18. Dieterle, P. Y. M., Dieterle, F. Tissue-specific, non-invasive toxicity biomarkers: translation from pre-clinical safety assessment to clinical safety monitoring. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (9), 1023-1038 (2009).
  19. Rowe, C., et al. Perfused human hepatocyte microtissues identify reactive metabolite-forming and mitochondria-perturbing hepatotoxins. Toxicology in Vitro. 46, 29-38 (2018).
  20. Rubiano, A., et al. Characterizing the reproducibility in using a liver microphysiological system for assaying drug toxicity, metabolism, and accumulation. Clinical and Translational Science. 14 (3), 1049-1061 (2021).
  21. Tsamandouras, N., Kostrzewski, T., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Hughes, D. J., Cirit, M. Quantitative assessment of population variability in hepatic drug metabolism using a perfused three-dimensional human liver microphysiological system. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 360 (1), 95-105 (2017).
  22. Ortega-Prieto, A. M., et al. 3D microfluidic liver cultures as a physiological pre-clinical tool for hepatitis B virus infection. Nature Communications. 9 (1), 682 (2018).
  23. Kostrzewski, T., et al. Three-dimensional perfused human in vitro model of non-alcoholic fatty liver disease. World Journal of Gastroenterology. 23 (2), 204-215 (2017).
  24. Kostrzewski, T., et al. A microphysiological system for studying nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology Communications. 4 (1), 77-91 (2020).
  25. Vacca, M., et al. Bone morphogenetic protein 8B promotes the progression of non-alcoholic steatohepatitis. Nature Metabolism. 2 (6), 514-531 (2020).
  26. Long, T. J., et al. Modeling therapeutic antibody-small molecule drug-drug interactions using a three-dimensional perfusable human liver co-culture platforms. Drug Metabolism and Disposition. 44, 1940-1948 (2016).
  27. Bai, J., Wang, C. Organoids and microphysiological systems: New tools for ophthalmic drug discovery. Frontiers in Pharmacology. 11, 407 (2020).
  28. Ribeiro, A. J. S., Yang, X., Patel, V., Madabushi, R., Strauss, D. G. Liver microphysiological systems for predicting and evaluating drug effects. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 106 (1), 139-147 (2019).
  29. Clark, A. M., et al. A microphysiological system model of therapy for liver micrometastases hhs public access. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1170-1179 (2014).
  30. Qosa, H., Ribeiro, A. J. S., Hartman, N. R., Volpe, D. A. Characterization of a commercially available line of iPSC hepatocytes as models of hepatocyte function and toxicity for regulatory purposes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 110, 107083 (2021).

Tags

जीव विज्ञान अंक 179
<em>विट्रो में</em> दवा-प्रेरित यकृत विषाक्तता का आकलन करने के लिए मानव यकृत माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Novac, O., Silva, R., Young, L. M.,… More

Novac, O., Silva, R., Young, L. M., Lachani, K., Hughes, D., Kostrzewski, T. Human Liver Microphysiological System for Assessing Drug-Induced Liver Toxicity In Vitro. J. Vis. Exp. (179), e63389, doi:10.3791/63389 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter