Summary
Legemiddelindusert leverskade (DILI) er en viktig årsak til legemiddelsvikt. En protokoll er utviklet for å nøyaktig forutsi DILI-ansvaret til en forbindelse ved hjelp av et levermikrofysiologisk system (MPS). Levermodellen bruker kokulturen til primære leverceller og translasjonelt relevante endepunkter for å vurdere cellulær respons på behandling.
Abstract
DILI er en viktig årsak til slitasje i stoffutvikling med over 1000 FDA-godkjente legemidler som er kjent for å potensielt forårsake DILI hos mennesker. Dessverre oppdages DILI ofte ikke før medisinene har nådd kliniske stadier, noe som risikerer pasientenes sikkerhet og fører til betydelige tap for legemiddelindustrien. Tatt i betraktning at standard 2D-modeller har begrensninger i å oppdage DILI, er det viktig å utvikle in vitro-modeller som er mer prediktive for å forbedre dataoversettbarheten. For å forstå kausalitet og mekanistiske aspekter ved DILI i detalj, er det utviklet en human lever-MPS bestående av humane primære leverparenkymale og ikke-parenkymale celler (NPC) og dyrket i 3D-mikrovev på et konstruert stillas under perfusjon. Kryopreserverte primære humane hepatocytter (PHH) og Kupffer-celler (HKC) ble dyrket som mikrovev i MPS-plattformen i opptil to uker, og hver sammensetning av interesse ble gjentatt dosert på levermikrovev ved syv testkonsentrasjoner i opptil fire dager. Funksjonelle leverspesifikke endepunkter ble analysert (inkludert kliniske biomarkører som alaninaminotransferase, ALAT) for å evaluere leverfunksjonen. Akutt og kronisk eksponering for forbindelser av ulik DILI-alvorlighetsgrad kan vurderes ved å sammenligne respons på enkelt- og flerdosert mikrovev. Metodikken er validert med et bredt sett av alvorlige og mildt hepatotoksiske forbindelser. Her viser vi dataene for pioglitazon og troglitazon, kjente hepatotoksiske forbindelser trukket fra markedet for å forårsake leversvikt. Samlet sett har det vist seg at MPS-modellen i leveren kan være et nyttig verktøy for å vurdere DILI og dens tilknytning til endringer i leverfunksjon. Modellen kan i tillegg brukes til å vurdere hvordan nye forbindelser oppfører seg i forskjellige pasientundergrupper og hvordan toksisitetsprofiler kan påvirkes av leversykdomstilstander (f.eks. Viral hepatitt, fettleversykdom).
Introduction
DILI er fortsatt den vanligste årsaken til akutt leversvikt i USA og Europa og er en ledende årsak til slitasje av forbindelser i legemiddelutviklingsprosessen1. Nesten alle klasser av medisiner kan forårsake hepatotoksisitet, med sentralnervesystemet agenter og antibiotika er langt de vanligste behandlingene som forårsaker DILI hos pasienter2. Legemiddelindusert hepatotoksisitet er forårsaket av en kompleks interaksjon av genetiske, ikke-genetiske og miljømessige faktorer, noe som fører til død av hepatocytter og andre levercelletyper, inkludert kolangiocytter og endotelceller 1,3.
DILI-forårsakende stoffer kan klassifiseres på to måter: de som forårsaker forutsigbar doseavhengig leverskade eller de som forårsaker idiosynkratisk DILI som er sjelden og utvikler seg uavhengig av legemiddeldose, eller rute eller administrasjonsvarighet, men er ansvarlig for opptil en sjettedel av alle akutte leversvikt i USA bare4. Dessverre oppdages DILI ofte ikke før stoffene har nådd de kliniske stadiene av legemiddelutviklingsprosessen. Legemiddelindusert leverskaderangering (eller DILIrank) består av mer enn tusen FDA-godkjente medisiner som er delt inn i fire klasser i henhold til deres potensial for å forårsake DILI, og deres bruk hos pasienter må overvåkes nøye5.
Studier av mekanismer for legemiddel hepatotoksisitet er fortsatt svært utfordrende, og derfor har mange prekliniske modeller blitt utviklet for å utforske mekanismer for DILI. Nåværende in vitro og in vivo modeller som brukes til å forutsi DILI i preklinisk utvikling har flere begrensninger for å gi innsikt i de komplekse, mangefasetterte interaksjonene i en levende menneskekropp. Kreftfremkallende levercellelinjer (dvs. HepG2, HepaRG) dyrket i 2D brukes fortsatt i de tidlige stadiene av legemiddelutvikling for å evaluere toksisiteten til kandidatforbindelser6. Likevel kommer disse cellelinjene fra enkeltdonorer og viser unormale nivåer av leverfunksjon, og viser ikke alltid høy følsomhet for påvisning av DILI 7,8. Som et alternativ til kreft i levercellelinjer, representerer PHHs bedre menneskelig leverfysiologi hvis de dyrkes hensiktsmessig in vitro, selv om det finnes flere begrensninger med deres kultur, som kort inkubasjonstid med medisiner, relativt kort levetid, tap av hepatisk genuttrykk og endringer i stoffets metabolske funksjoner 9,10,11 . PHH kan dyrkes på ekstracellulære matriksproteiner i standard 2D-cellekulturplater, men som en ulempe betyr den raske nedgangen i funksjonen at de har lav følsomhet (<50%) for DILI-prediksjon12.
På den annen side er testing på dyremodeller langsom, dyrt og trenger en oversettelse på tvers av arter for å ekstrapolere prediksjon til mennesker. De fleste nyutviklede legemidler klarer ikke å få godkjenning, noe som gjør denne prosessen kostbar og risikabel5. Videre, for å teste nye menneskespesifikke modaliteter, er dyremodeller mindre egnet på grunn av gensekvens eller immunologiske responsforskjeller mot mennesker13.
Følgelig har interessen for mer avanserte tredimensjonale (3D) in vitro levermodeller eksponentielt vokst. Dyrking av PHH-er som sfæriske strukturer generert av gravitasjonsaggregering i hengende dråper eller på ultralave festeflater representerer en høy gjennomstrømningsmetode for å vurdere sammensatte forpliktelser14. PHH-sfæroider har blitt brukt til å vurdere DILI i en syk bakgrunn (f.eks. steatose og kolestase)15. Et bredt utvalg av modeller er utviklet for å inkludere belagte mikromønstrede kokulturer av hepatocytter med stromale fibroblaster16, 3D bioprintede levervev17, 3D-sfæroidkulturer med eller uten hepatiske ikke-parenkymale celler15. Imidlertid har alle disse metodene fortsatt ulemper, og dyrking av PHH i et mer fysiologisk relevant mikromiljø kan gi dem høyere nivåer av funksjonalitet i lengre perioder for å muliggjøre undersøkelse av langvarig eksponering for potensielle hepatotoksiske stoffer. I tillegg, for å forbedre translasjonsrelevansen av enhver avansert in vitro PHH-kultur, må klinisk relevante funksjonelle endepunkter eller biomarkører for toksisitetsutgang brukes for å tillate at data sammenlignes in vivo eller kliniske scenarier18.
I denne studien vurderte vi om en MPS, også kjent som en Organ-on-a-Chip (OOC), in vitro levermodell kunne brukes til å forstå de detaljerte mekanistiske aspektene ved levertoksisitet. MPS har tidligere vist seg å opprettholde svært funksjonelle 3D levermikrovev, under strømning, i opptil 4 uker19. Systemet har nylig blitt testet av FDA og vist seg å ha høy reproduserbarhet ved utførelse av legemiddeltoksisitet, metabolisme og intracellulær akkumulering20. Videre, sammenlignet med sfæroider og sandwichkulturer, hadde systemet en mer stabil funksjon og høyere følsomhet for å oppdage toksisiteten til flere stoffer20. Til dags dato har MPS blitt brukt i et bredt spekter av applikasjoner som dekker ADME 21, sykdomsmodellering (HBV 22, NAFLD 23,24,25) og legemiddelinteraksjoner 26, noe som potensielt gjør den svært egnet til å vurdere akutt og kronisk DILI. Teknologien som presenteres her tilbyr et alternativ for å lukke gapet mellom mer tradisjonelle cellekulturer og dyremodeller og menneskelige kliniske studier, og fremme mot simulering av humane biologiske forhold for å støtte vurderingen av kandidatforbindelsers levertoksisitet i prekliniske stadier av legemiddelutviklingsprosessen.
Protocol
Alt arbeidet ble utført i laboratoriet etter strenge helse- og sikkerhetsprosedyrer og i samsvar med egne laboratorierisikovurderinger og SOP-er. Alt utstyr som brukes vedlikeholdes i henhold til produsentens retningslinjer. Mikrobiologiske sikkerhetsskap (MBSC) vedlikeholdes årlig, og Ki-Discus (kaliumjodid) testes etter britiske standarder. Protokollen følger United Kingdom Human Tissue Authority (HTA) Code of Practice og direktiver og bruker etisk hentede primære menneskelige celler levert av leverandører som fullt ut overholder de generelle kravene til informert samtykke (45 CFR §46.116 og §46.117) og Good Clinical Practice (GLP), (ICH E6), og regulatoriske og etiske komiteer.
1. Forbereder cellekulturmedier
MERK: Klargjør Seeding Advanced DMEM medium på dag -1 og oppbevar ved 4 °C. Klargjør Maintenance Advanced DMEM medium på dag 1 og oppbevar ved 4 °C i opptil 1 uke.
- Seeding Advanced DMEM medium for PHHs og HKCs kokultur: Suppler en flaske med 500 ml Advanced DMEM medium (Table of Materials) med 18 ml Cocktail A (endelig konsentrasjon på 3,6%) og med 25 ml FBS (endelig konsentrasjon 5%).
- Vedlikehold Avansert DMEM-medium for PHH-er og HKC-kokultur: Suppler en flaske med 500 ml avansert DMEM-medium (materialtabell) med 20 ml cocktail B (endelig konsentrasjon på 4 %) og 500 nM hydrokortison.
MERK: Hydrokortison vil bli laget fersk på bruksdagen, og trinnene for hvordan du klargjør stamløsningen og nødvendige fortynninger er nevnt nedenfor. - Tilberedning av 500 nM hydrokortison i vedlikehold avansert DMEM medium
- Tilberedning av startmateriellløsning (20 mM): Vei 7,24 mg hydrokortison (materialtabell) i et 1 ml hetteglass. Registrer den nøyaktige mengden hydrokortison som er veid ut og bestem volumet av dimetylsulfoksid (DMSO) ved hjelp av følgende beregning:
- Klargjøring av den arbeidende 100 μM hydrokortisonlagerløsningen: Tilsett 5 μL av den startende 20 mM lagerløsningen til 995 μL Advanced DMEM.
MERK: Fortynning av 25 μL av DMSO-oppløsningen fra trinn 1 i vann eller medier resulterer i 0,5 % DMSO-konsentrasjon. I den endelige løsningen vil DMSO-konsentrasjonen være 0, 0025%. I dette tilfellet resulterer det ekstra volumet på 5 μL i en ubetydelig endring i totalvolumet. - Fremstilling av den arbeidende 500 nM hydrokortisonløsningen i Avansert DMEM: For å klargjøre 1 ml 500 nM hydrokortisonløsning i Avansert DMEM, tilsett 5 μL av stamløsningen på 100 μM hydrokortison til 995 μL av Maintenance Advanced DMEM-mediet.
- Tilberedning av startmateriellløsning (20 mM): Vei 7,24 mg hydrokortison (materialtabell) i et 1 ml hetteglass. Registrer den nøyaktige mengden hydrokortison som er veid ut og bestem volumet av dimetylsulfoksid (DMSO) ved hjelp av følgende beregning:
2. MPS-oppsett og klargjøring (dag -1)
- Koble kontrolleren til dokkingstasjonshuset i en cellekulturinkubator og sørg for at fersk tørkemiddel (materialtabell) legges inn i tørkemiddelkrukken på baksiden av kontrolleren.
MERK: Styreenheten trekker fuktighet fra inkubatoren over tid og holdes tørr ved hjelp av ferskt tørkemiddel. - Slå kontrolleren PÅ ved å trykke på båtvippebryteren bak den og vent i 5 minutter på at systemet skal stabilisere seg og nå trykk. Kontroller deretter skjermen for den pneumatiske rapporten for å sikre: (i) Trykkreservoarutgangen nådde ~2000 mBar og (ii) vakuumreservoarutgangen nådde ~850 mbar.
- Fjern hver plate fra emballasjen og inspiser visuelt hver brønn for å se etter mulige feil (manglende stillaser, sprekker osv.).
- Sett inn en driver (med en plate på) på dokkingstasjonen for å kontrollere at føreren gjenkjennes av dokkingstasjonen og kontrolleren. Kontroller at produksjonen fra trykkbeholderen har falt med mindre enn 100 mbar, og produksjonen fra vakuumreservoaret har økt med mindre enn 500 mbar.
- Prime hver brønn ved å tilsette 500 μL Seeding Advanced DMEM medium (forvarmet til 37 °C) på reservoarsiden.
- Velg Prime-programmet på kontrollerskjermen (oppstrømning i 3 minutter ved 2,5 μL/s) til væsken kommer gjennom filterstøttene. MERK: 'Oppstrømning' er en innstilling på kontrolleren som lar media strømme fra reservoaret oppover gjennom stillasene i LC12-platen.
- Fyll alle brønnene med ytterligere 1,1 ml Seeding Advanced DMEM-medium for å dekke overflatekanalen. Alle brønnene vil da ha et fullt arbeidsvolum på 1,6 ml.
- Plasser driverne med plater i en 37 ° C og 5% CO2 inkubator, koble til dokkingstasjonen og kjør Incubate-programmet .
MERK: Alle programmer som brukes i eksperimentet (Prime, Incubate, Seed, Media Change) er forhåndsinnstilt i MPS-systemet. Prime platene i inkubatoren til klar til frø.
3. Såing av leverceller til MPS (dag 0)
- Prevalidere alle PHHS og HKCs. Alle PHH-er og HKC-objekter er forhåndsvalidert internt før cellekultureksperimentet utføres (se tilleggsmateriale).
- Tine hetteglass med PHH- og HKCs-celler (Table of Materials) ved å holde hetteglassene jevnt i et vannbad på 37 °C til bare en liten isbit er igjen.
- Pipette PHH-er direkte inn i et rør med forvarmet (37 °C) kryopreservert hepatocyttgjenvinningsmedium CHRM-medium (to hetteglass maks per slange).
- Pipette cellene forsiktig, og bruk deretter 1 ml CHRM til å vaske eventuelle gjenværende celler fra kryotuben. Vær veldig forsiktig med celler når du tiner og overfører til et konisk rør.
FORSIKTIG Ikke beveg hetteglassene under tining, og piplegg ikke innholdet opp og ned. - Pipette HKC-celler forsiktig fra kryotuben til 10 ml iskald såing Avansert DMEM-medium i et 15 ml sentrifugerør.
MERK: Opptil 2 hetteglass med HKC kan kombineres. - Sentrifuge begge celletyper ved romtemperatur (RT) ved 100 x g i 10 minutter. Fjern supernatanten.
- Resuspender PHH-ene i varmt Seeding Advanced DMEM-medium og HKC-er i iskald såing Advanced DMEM-medium (for å redusere celleklumping), ved å bruke 1 ml per hetteglass med celler tilsatt slangen og legg cellene på is. Bruk en mild gyngehandling for å resuspendere cellene.
FORSIKTIG: Ikke resuspender PHH ved pipettevirkning, da det kan føre til celledød. - Kombiner cellesuspensjonene fra flere rør (hvis aktuelt - dvs. hvis alle PHH-er er fra samme donor), men ikke bland celletyper.
- Telle celler. Registrer levedyktigheten (må være over 85% for begge celletyper, PHHs og HKCs) og totalt antall celler. Hvis cellens levedyktighet faller under 85%, tine et nytt hetteglass med celler, og revurdere cellens levedyktighet.
- Beregn cellens levedyktighet ved hjelp av følgende formel:
- Beregn ønsket volum av cellesuspensjonen for å frø i hver brønn og ekstra volum av Seeding Advanced DMEM-medium som trengs for å ta totalt såvolum til 400 μL. Celletall per brønn: 0,4 x 10 6 PHHs og 0,04 x 10 6 HKC per brønn, og celletetthet på 0,25 x 106 PHH/ml, henholdsvis 0,025 x 106 HKC/ml.
- Koble driveren fra dokkingstasjonen og plasser den i MBSC.
- Aspirer media fra ovennevnte stillas til stoppestedet (går ned i det dype hakket på festeringen), kanalen og reservoaret. La et "dødt volum" på 0,2 ml ligge godt i kulturen, og nå like over stillaset. Det må utvises forsiktighet for ikke å fjerne det totale mediet fra over stillaset for å unngå at det dannes luftbobler.
- Tilsett 400 μL Seeding Advanced DMEM-medium i brønnkammeret, returner driveren på dokkingstasjonen i inkubatoren og kjør Media Change-programmet i 3 minutter. Programmet vil automatisk pause etter 3 min.
- Når du er ferdig, kobler du driveren fra dokkingstasjonen og plasserer den tilbake i MBSC.
- Aspirer media fra ovennevnte stillas ned til stoppestedet og ved reservoarenden av hver brønn.
- Resuspender forsiktig PHH-ene ved å gynge røret forsiktig, og tilsett deretter det nødvendige volumet av cellesuspensjonen til hver kulturbrønn. Pipette cellesuspensjonen forsiktig, sørg for at cellene sprer seg jevnt over platens stillas.
MERK: For å sikre god dekning i hele stillaset, bruk en langsom virvlende bevegelse for å pipettere celler ned på stillaset. - På samme måte må du forsiktig resuspendere HKC-er og legge cellesuspensjonene til hver kultur godt.
MERK: Bruk en langsom virvlende bevegelse for å frø HKC-er for å sikre god dekning gjennom hele stillaset. De to såingstrinnene kan skilles fra hverandre, eller de to celletypene kan forblandes med passende tetthet og sås samtidig. - Når alle brønnene inneholder begge celletyper, plasser MPS-driveren på dokkingstasjonen i inkubatoren uten å koble den fysisk til og la den stå i 1 time.
- Etter 1 time fyller du hver brønn med det nødvendige volumet av ekstra Seeding Advanced DMEM-medium for å nå 400 μL og kjøre Seed-programmet .
- Etter 2 minutter vil programmet automatisk pause, fjerne driveren fra inkubatoren og sakte tilsette 1000 μL av Seeding Advanced DMEM-mediet til kanalen (nærmere reservoarenden enn brønnkammeret) for å oppnå et totalt volum på 1,4 ml (med ytterligere 200 μL dødvolum i kanalene).
- Flytt platene til inkubatoren og kjør resten av frøprogrammet i 8 timer.
MERK: Flow vil automatisk bytte til Inkubere program etter 8 timer.
4. Medieendring (dag 1)
- Koble driveren fra dokkingstasjonen og plasser den i MBSC.
- Utfør Media Change ved å fjerne Seeding Advanced DMEM-mediet i brønnkammeret ned til stoppestedet.
- Tilsett 400 μL av Maintenance Advanced DMEM-mediet i brønnkammeret, returner driveren på dokkingstasjonen i inkubatoren og kjør Media Change-programmet i 3 minutter. Programmet vil automatisk pause etter 3 min.
- Koble føreren fra dokkingstasjonen, og i MBSC, aspirer bort media fra reservoarkammeret, kanalen og stoppestedet over stillaset. På dette tidspunktet vil kulturbrønnen bli returnert til dødvolumet.
- Fyll opp reservoarkammeret med 1,4 ml ferskt forvarmet (37 °C) vedlikeholdsbasert DMEM-medium.
- Returner sjåføren på dokkingstasjonen i inkubatoren og kjør Incubate-programmet .
5. Levermikrotissue kvalitetskontroll (QC), medieinnsamling, medieendring og legemiddeldosering (dag 4)
- På dag 4 utfører du en medieendring ved hjelp av Maintenance Advanced DMEM-medium- og QC-kontrollene for å sikre at seedingen har vært vellykket.
MERK: QC er en prosess som brukes til å kontrollere helsen til de dannede mikrovevene ved å måle laktatdehydrogenase (LDH) og urea. - Før du kjører QC, må du klargjøre ferske stamløsninger for hver forbindelse som skal testes (enten i Maintenance Advanced DMEM medium eller Maintenance Advanced DMEM medium som inneholder 0,1% DMSO, avhengig av løseligheten til hver forbindelse). Forbered fortynninger tilsvarende for å gi testkonsentrasjoner for hver forbindelse.
- Koble driveren og platen fra dokkingstasjonen og overfør til en MBSC.
- Overfør 50 μL media fra hver brønn ved hjelp av en pipette til en 96-brønnplate for å utføre en LDH-analyse (materialtabell) før prøvetaking og 25 μL for en ureaanalyse (materialtabell).
MERK: LDH- og ureaanalyser vil bli utført i henhold til produsentens instruksjoner. - Fortsett forsøket etter QC hvis LDH-avlesninger er lavere enn 2 AU/10 6 celler og urea er over 40 μg/dag/106 celler.
MERK: Albumin brukes ikke som QC fordi det er en lang analyse å kjøre på dagen og vil bli analysert senere når eksperimentet er fullført fra prøvene trukket tilbake på dag 4. - Hvis noen brønner mislykkes i QC, fjern dem fra eksperimentell design.
- Når det eksperimentelle oppsettet er bekreftet, ta prøver av gjenværende medier fra hver brønn, og sørg for ikke å forstyrre cellekulturen ved å berøre stillaset. Oppbevar det innsamlede mediet (merket som predoseprøver) ved -80 °C for senere analyser.
- Utfør medieendring i en MBSC ved å følge trinn 4.3-4.5. Bytt brønnene til Maintenance Advanced DMEM medium med riktig legemiddelkonsentrasjon i henhold til eksperimentell design.
- Når du er ferdig, returnerer du sjåføren til dokkingstasjonen i inkubatoren og kjører Incubate-programmet .
6. Medieinnsamling, medieendring og legemiddeldosering (dag 6)
- Forbered ferske stamløsninger for hver forbindelse som skal testes (enten i Maintenance Advanced DMEM medium eller Maintenance Advanced DMEM medium som inneholder 0,1% DMSO, avhengig av løseligheten til hver forbindelse). Forbered fortynninger tilsvarende for å gi testkonsentrasjoner for hver forbindelse i henhold til plateplanen.
- Koble driveren og platen fra dokkingstasjonen og overfør til en MBSC.
- Samle medier fra hver brønn (~1 ml) manuelt med en pipette, og pass på at cellekulturen ikke forstyrres ved å berøre stillaset, analysen for LDH og Urea. Oppbevar resten av de innsamlede mediene ved -80 °C for senere analyser, og merk dem 48 timer etter doseprøver.
- Re-dose hver brønn med samme legemiddelkonsentrasjon som på dag 4 og i henhold til plateplanen ved å utføre Media Change ved å følge trinn 4.3-4.5.
- Når du er ferdig, returnerer du sjåføren til dokkingstasjonen i inkubatoren og kjører Incubate-programmet .
7. Avslutte eksperimentet (dag 8)
- Koble driveren og platen fra dokkingstasjonen og overfør til en MBSC.
- Eksempelmedier fra hver brønn manuelt ved hjelp av en pipette, og pass på at du ikke forstyrrer cellekulturen ved å berøre stillaset.
- Analyser de tilbaketrukne mediene for LDH og Urea og lagre resten av de innsamlede mediene ved -80 °C for senere analyser.
- Kjører CYP3A4-glo-analyse.
- Mål effekten av stoffene som ble testet på cytokrom P450 CYP3A4-aktivitet i PHH-er på slutten av eksperimentet ved hjelp av denne analysen.
- Rekonstituer deteksjonsreagenset (for CYP3A4-analyse, se Materialfortegnelse) i henhold til produsentens instruksjoner. Hvis deteksjonsreagenset tidligere har blitt rekonstituert og frosset, fjern det fra fryseren på -20 °C og la det tine ved RT.
- Forbered 20 mM lager D-luciferin standard etter produsentens instruksjoner.
- Forbered fungerende luminogent substratmedium med en 1:1000 fortynning av Luciferin IPA i Maintenance Advanced DMEM medium (2 ml luminogent substratmedium per brønn).
- Utfør en medieendring som beskrevet i trinn 4.3–4.5 med lysinogent substratmedium. Lagre 500 μL av det luminogene substratmediet i et 1,5 ml hetteglass (materialtabell) som inngangsmateriale.
- Returner sjåføren på dokkingstasjonen i inkubatoren og kjør Incubate-programmet i 1,5 time.
- Forbered D-luciferin standardkurve i kulturmedium i 1,5 ml rør etter produsentens instruksjoner og pipette 50 μL av hver standard i duplikat på en hvit ugjennomsiktig 96-brønnplate (se materialtabell), ved hjelp av kulturmedium som blank eller 0 μM.
- Når tiden er gått, fjerner du driveren fra dokkingstasjonen og eksempelmediet for CYP3A4-analysen ved å følge trinn 7.4.9-7.4.13.
- Etter inkubering, overfør 50 μL av prøvemediet fra hver brønn og inngangsmateriale til 96-brønns ugjennomsiktig hvit lumiometerplate som inneholder standarder. Pass på å la minst to tomme rader ligge på den ugjennomsiktige platen mellom standardene og prøvene for å unngå lett overføring mellom de øverste standardene og prøveavlesningene.
- Tilsett 50 μL Luciferin Detection Reagent til hver brønn for å starte en selvlysende reaksjon.
- Inkuber platen ved RT på en plateshaker i 20 minutter i mørket for å stabilisere det selvlysende signalet.
- Ta opp luminescensen ved hjelp av et luminometer eller CCD-kamera.
- Plott standardkurven ved å ta gjennomsnittet av hvert punkt og deretter trekke fra gjennomsnittet av emnene. Bruk linjens ligning for å beregne metabolismen (pmol / min / 106 celler) i resten av prøvene, husk å inkludere eventuelle fortynninger som er gjort.
- Fjern stillasene fra platene ved hjelp av en pinsett og legg dem i en 24-brønnplate som inneholder 500 μL D-PBS (uten Ca++ og Mg++) i hver brønn, pass på at mikrovevet ikke forstyrres.
- Ta øyeblikksbilder av hvert stillas ved hjelp av et omvendt lysmikroskop ved forstørrelse 10x.
- Kjøre ATP-analysen (se Materialfortegnelse) ved å følge produsentens instruksjoner:
- Tine reagenset på RT.
- Vask stillasene to ganger med 500 μL D-PBS (uten Ca++ og Mg++) for hvert vasketrinn.
- Tilsett 120 μL reagens og 120 μL PBS til hvert stillas og de samme volumene til en tom brønn (dette vil tjene som tomt). Plasser platen dekket av aluminiumsfolie på en shaker og rist kraftig (500 o / min) i 5 minutter etterfulgt av 30 minutter inkubasjon for å stabilisere luminescenssignalet.
- Overfør 100 μL av de lyse prøvene i duplikat til en klar flatbunnet 96-brønns analyseplate for måling. Forsikre deg om at de tomme brønnene ikke er plassert ved siden av de andre målebrønnene med høy luminescens.
- Ta opp luminescensen ved hjelp av en mikroplateleser.
- Sammenlign luminescensen av prøvene med luminescensen av standardene for å bestemme ATP oppdaget av reagenset i prøvene.
Representative Results
Manuskriptet beskriver en MPS-modell for leveren som brukes til å vurdere DILI. MPS letter genereringen av 3D-levermikrovev som opprettholdes svært funksjonelle under flyt i opptil 4 uker. PHHs / HKCs blir sådd på kollagenbelagte stillaser for å danne levermikrovev som perfunderes med et vekstmedium, og etter å ha bestått QC-kontrollen, doseres med forbindelser. Her viser vi data for troglitazone og pioglitazone, to strukturelt like forbindelser, men med forskjellige DILI-alvorlighetsgrader.
På dag 4, før legemiddeldosering, vurderes en QC-kontroll av dannede levermikrovev og består av LDH-frigjøring og ureasyntese (figur 1A). QC har som mål å bekrefte at leveren MPS produserer svært konsistente og fungerende levermikrovev. Dataene som presenteres her er generert fra tre eksperimenter og viser gode nivåer av reproduserbarhet med lav intra- og interstudievariabilitet. Etter en 8-dagers kultur vurderes flere helse- og levermålinger (albumin, urea, CYP3A4, ATP) og kontrollmikrovev viser høye nivåer av leverfunksjonalitet og reproduserbarhet (figur 1B, C). Kontrastfasemikroskopi og IF-farging av levermikrovev (se tilleggsmateriale) viser høy såkonsistens i stillasets mikrokanaler og avslører fordelingen av HKC i PHH-mikrovevet (figur 1D)
Figur 1: Lever-MPS gir svært reproduserbare data og konsistente mikrovev. (A) 3D Liver microtissue QC metrics på dag 4, og funksjonalitetsvurdering ved slutten av studien på dag 8 -(B) Albumin og Urea, (C) CY3A4 og ATP). Data er samlet inn fra 3 eksperimenter; I hvert eksperiment var det 3 kjøretøykontrollreplikasjoner. Data som vises er Gjennomsnitt ± SD, N = 9. (D) Fasekontrastmikroskopi (10x og 20x) og IF av 3D-levermikrovev generert ved kokulturering av PHH-er og HKC-er i lever-MPS-plattform for vurdering av DILI. For å visualisere HKC-ene ble HKC-er før såing transdusert med en adenoviral vektor som uttrykker eGFP (se Tilleggsmateriale). Representative fotomikrografier vises. Transduksjonen og avbildningen ble utført som et frittstående eksperiment for å demonstrere cellelokalisering og ikke gjort med den beskrevne DILI-protokollen. HKC-celler er forhåndsvalidert internt før bruk i eksperimentell cellekultur og må ha lave nivåer av aktivering etter tining; Dette vurderes ved å måle biomarkørene IL-6 og TNF-alfa. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Troglitazone er kjent for å forårsake alvorlig DILI; Etter lisensen for behandling av type 2 diabetes ble den trukket tilbake av FDA etter 3 år på markedet på grunn av hyppigheten av leverskade forbundet med bruken. Til dags dato har publiserte dyreforsøk ikke klart å forutsi troglitazonens potensial til å forårsake alvorlig leverskade. Toksisiteten til denne forbindelsen ble heller ikke påvist i standard in vitro 2D leveranalyser14.
Levermikrovev i MPS ble dosert med troglitazon i 96 timer, og det forårsaket en akutt toksisk respons,Cmax drevet, som ble påvist ved ALAT- og LDH-frigjøring og en rask reduksjon i albumin- og ureaproduksjonen ved ca. 15 x Cmaks, etter akutt eksponering for troglitazon (figur 2A). Cellulært endepunkt (ATP-innhold) og CYP3A4-aktivitet (for vurdering av metabolsk biotransformasjon), samplet etter 96 timers eksponering, ytterligere bekreftet toksisitet forårsaket av troglitazon- og EC:50-verdier var svært sammenlignbare med andre endepunkter (figur 2B). Brightfield-mikroskopibilder tatt etter 8-dagers dyrkning i MPS viser et friskt levermikrotissue, jevnt sådd gjennom stillaset (kjøretøykontroll) i motsetning til generalisert vevsdød/nedbrytning som vist i replikasjonene behandlet med positiv kontroll og troglitazonkonsentrasjoner ved de to øverste testkonsentrasjonene (figur 2C).
Figur 2: Bestemmelse av DILI-risiko for troglitazon ved bruk av flere levertoksiske endepunkter. Levermikrovev ble eksponert for syv testkonsentrasjoner av troglitazon i 96 timer og sammenlignet for (A) LDH-frigjøring, ALAT-frigjøring, albuminproduksjon, ureasyntese, CYP3A4-aktivitet og ATP-innhold. Blå linjer - 48 timers eksponering (kun medieendepunkter), røde linjer - 96 timers eksponering. Positiv kontroll var 100 μM klorpromazin. Alle endepunkter måles fra samme MPS-dyrkning i leveren. Data som vises er gjennomsnitt ± SD, N = 3. (B) Sammendrag av E:50-tall generert fra data. N.D. = data som ikke kan plottes. Linje = ikke analysert. (C) Representativ brightfield-mikroskopi av levermikrovev etter 8-dagers kultur (forstørrelse 10x). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Levertoksisitet etter eksponering for pioglitazon ble også undersøkt. Pioglitazon er en forbindelse kjent for å være av lav-DILI bekymring4 og ikke utøve hepatotoksisitet i klassiske 2D primære hepatocytter kulturer og selv i noen mer avanserte 3D-modeller10,11. Milde hepatotoksiske effekter ble observert ved begge testede tidspunkter (figur 3). Ingen LDH- eller ALT-frigjøring ble oppdaget. Etter 48 timer ble det imidlertid observert en mild reduksjon i albumin- og ureaproduksjonen, ved ca. 25x Cmax (figur 3A). Svært liten reduksjon i ATP-innhold ble også observert ved høye pioglitazonkonsentrasjoner, men dette var ikke signifikant. EC:50-verdier generert fra dose-respons-kurver er presentert i figur 3B. Mikroskopi viste lett endring i mikrovev etter 96 timers eksponering for pioglitazon ved de to høyeste testede konsentrasjonene (figur 3C). Resultatene viser at leveren MPS har evnen til å oppdage toksisiteten av forbindelser med mild DILI-bekymring.
Figur 3: Bestemmelse av DILI-risiko for pioglitazon ved bruk av flere levertoksiske endepunkter. Levermikrovev ble eksponert for syv testkonsentrasjoner av pioglitazon i 96 timer og sammenlignet for (A) LDH-frigjøring, ALAT-frigjøring, albuminproduksjon, ureasyntese, CYP3A4-aktivitet og ATP-innhold. Blå linjer - 48 timers eksponering (kun medieendepunkter), røde linjer - 96 timers eksponering. Positiv kontroll var 100 μM klorpromazin. Alle endepunkter måles fra samme MPS-dyrkning i leveren. Data som vises er gjennomsnitt ± SD, N = 3. (B) Sammendrag av EC:50-tall generert fra data. N.D. = data som ikke kan plottes. Linje = ikke analysert. (C) Representativ brightfield-mikroskopi av levermikrovev etter 8-dagers kultur (forstørrelse 10x). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ved å vurdere alle funksjonelle endepunkter og biomarkører for toksisitetsutgang som kan representere in vivo eller kliniske scenarier (LDH-frigjøring, ureasyntese, albuminproduksjon, CYP3A4-aktivitet, ATP-innhold, ALAT-frigjøring) og bekrefte dataene generert for begge testede forbindelser dosert ved et syvpunkts doseområde i 48 timer og 96 timer, er det generert et varmekart for å gi en "signatur av hepatotoksisitet", bidra til å identifisere forbindelser med varierende grad av DILI-bekymring (figur 4).
Figur 4: Bestemmelse av "signatur for toksisitet" med lever-MPS. Varmekart som viser troglitazon- og pioglitazon fra seks funksjonelle leverspesifikke endepunkter (LDH-frigjøring, ureasyntese, albuminproduksjon, ALAT-frigjøring, CYP3A4-aktivitet og ATP-innhold) etter 48 timer og 96 timers eksponering for syvpunkts doseområde. Hver verdi genereres som gjennomsnitt, N = 3 og normaliseres for å kontrollere prøver. Verdiene på fargefeltene representerer en sammenleggbar økning i forhold til kontroller for opprinnelig plan. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tilleggsmateriale: Fluorescerende mikroskopavbildning av mikrovev og prekvalifiseringsvurdering av celler. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
MPS er designet for å rekapitulere funksjonelle enheter av menneskelige organer in vitro og er utviklet for å adressere begrensningene i konvensjonelle 3D-cellekulturmodeller27. Leveren er et av de mest modellerte organene som bruker MPS, og et bredt utvalg av systemer er utviklet. Den humane leveren er ansvarlig for legemiddelmetabolisme og generering av toksiske legemiddelmetabolitter, og dens funksjon er et nøkkelelement for modell for legemiddelutvikling, inkludert vurdering av DILI-ansvar for forbindelser28. Her har vi introdusert en ny metode for å vurdere DILI ved hjelp av en lever-MPS; protokollen gjør det mulig å søke mekanistisk innsikt for hver forbindelse som analyseres for å bestemme hvordan den kan forårsake DILI, samt å være en svært sensitiv og robust analyse. Levermikrovev dannes i MPS-platene, som er en kokultur av PHH og HKC og er svært funksjonelle med høye nivåer av albumin- og ureaproduksjon samt høy CYP3A4-aktivitet sammenlignet med standard in vitro levermodeller20.
Selv om DILI-modellen beskrevet her kan tjene som et nyttig verktøy i senere stadier av preklinisk testing i legemiddelutviklingsprosessen, har den også flere begrensninger. Som flertallet av MPS som for tiden er tilgjengelig på markedet, er det en plattform med lav gjennomstrømning og derfor vanskeligere å bruke til store narkotikascreeningsaktiviteter. Bestående av mikrovev dannet ved å kokulere PHHs og HKCs, kan DILI-modellen heller ikke helt fange kompleksiteten til den menneskelige leveren, og ytterligere optimalisering ved å inkorporere forskjellige typer celler (f.eks. Immunceller) vil være gunstig for å tilføre verdi til den eksisterende modellen. Denne enkeltorgan-MPS kan også kombineres med andre organplattformer som kan dele et felles medium og tillate organkrysstale på cellulært eller endokrint nivå, og som kan bidra til å bedre forstå den mekanistiske innsikten om toksisitet, ikke bare begrenset til leveren selv. Videre, som enhver relativt ny teknologi, kan det betraktes som kostbart og dermed begrenset tilgjengelighet.
MPS er en plattform som brukes til å utvikle organotypiske modeller av enkelt eller multi- humant vev. Systemet består av en kontroller, navlestreng og MPS-driver som platen er satt inn i (figur 5A). Hver lever-MPS-plate har 12 uavhengige åpne brønner for dyrking av primære leverceller i 3D på konstruerte stillaser. Oppsummert er systemet QC-kontrollert, og platene er primet på dag -1, PHH-ene og HKC-ene er sådd på platene ved dag null (figur 5B, se 1). Innebygde mikropumper letter sirkulasjonen av cellekulturmedier gjennom stillasene for å lette dannelsen av 3D-mikrovev (figur 5B, se 2). Dannede mikrovev er QC'd på dag 4, dosert med forskjellige konsentrasjoner av hver forbindelse hver 48. time i 4 dager, og analysert for endepunktbiomarkører på dag 8 (figur 5C). Den eksperimentelle tidslinjen for DILI-analysen i MPS-platen er avbildet i figur 5D.
Figur 5: Det mikrofysiologiske systemet og eksperimentell tidslinje for en standard DILI-analyse. (A) Det mikrofysiologiske systemet med dets komponenter: kontroller (1), navlestreng (2), dokkingstasjon (3), MPS-driver (4) og LC12-plate (5). (B) Såing av PHH-er og HKC-er på LC12-plate på dag 1 (1) og innebygde mikropumper letter sirkulasjonen av cellekulturmedier med justerbare strømningshastigheter gjennom 3D-mikrovevene som er sådd på stillasene (2). (C) Ta ned stillasene på slutten av studien. (D) Eksperimentell tidslinje. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Når du utfører protokollen, er det viktig at en robust system QC-kontroll utføres før start, kontrollerer at systemet fungerer pneumatisk riktig og forbruksplatene blir visuelt inspisert og primet effektivt for å sikre jevn funksjonalitet på tvers av alle brønner. Å ha høykvalitets primære humane celler er avgjørende for denne protokollen, med hepatocytter kjent for å holde seg konsekvent i cellekultureksperimenter og danne 3D-interaksjoner. Tining av disse cellene er også et kritisk skritt, da primære hepatocytter ikke bør resuspenderes ved pipettering, da dette raskt kan føre til celledød. Å ha celle levedyktighet over 85% er avgjørende for vellykket såing, da store mengder cellulært rusk vil forstyrre 3D-mikrotissuedannelse. QC-kontroll av dannede levermikrovev på dag 4 er også viktig, og brukeren må sørge for at akseptable nivåer av LDH og urea måles, da parametere utenfor rekkevidde kan være en indikasjon på vevsdannelse av dårlig kvalitet og tillate enkel feilsøking. Endelig må hydrokortisonet som brukes i cellekulturmediet fremstilles friskt på bruksdagen for å forhindre uønsket nedbrytning som kan påvirke cellekulturens funksjonalitet, da det er nødvendig for å opprettholde hepatocyttenes metabolske funksjonalitet.
Til tross for å ha betydelig kompleksitet, inneholder leveren MPS ikke alle celletyper i den menneskelige leveren. Det er mulig å legge til flere celletyper i modellen24,29 for å øke fysiologisk relevans, men disse bør bare legges til med en klar begrunnelse for brukskonteksten. For å studere DILI PHH er nøkkelcelletypen, og inkorporering av HKC i denne modellen gjør det mulig å bestemme noen immunologiske responser. Det skal også bemerkes at PHH isolert fra humane lever og kommersielt tilgjengelige kryopreserverte PHH-er har en tendens til å demonstrere noen variasjoner fra parti til parti. Vi har vist her at denne protokollen gir reproduserbare resultater når den brukes med høykvalitets preparater av celler. Imidlertid forventes det noe mye variasjon, og dette kan overvinnes ytterligere ved å bruke mange flere givere. Disse begrensningene kan overvinnes ved å bruke hepatocyttlignende celler differensiert fra iPSC som rekapitulerer mange funksjonelle egenskaper til PHH, og som har blitt brukt i stoffutviklingsprosessen30. HKC-er viser også mye for mye variasjon og et høyt aktiveringsnivå ved tining; Derfor er HKC-givere forhåndsvalidert internt før bruk i eksperimentell cellekultur (kokultur med validerte PHH-er) og må ha lave nivåer av aktivering etter tining; Dette vurderes ved å måle biomarkørene IL-6 og TNF-alfa (se Tilleggsmateriale).
Dataene som presenteres her bekrefter at analysen kan oppdage DILI nøyaktig, noe som bidrar til å identifisere hepatotoxicants som kanskje ikke oppdages av 2D10,11 og til og med noen 3D-modeller. Data generert fra MPS brukes fortsatt ikke som standard av farmasøytisk industri for regulatoriske innleveringer eller legemiddelscreeningsformål på grunn av mangel på prosessstandardisering og harmonisering, inkludert reproduserbarhetmellom steder 20. Dataene og eksperimentelle tilnærminger som er demonstrert her, adresserer dette, og viser at levermodellen kan brukes rutinemessig og robust i DILI-skjermer for å nøyaktig forutsi ansvaret for nye forbindelser.
Ved å måle en rekke endepunkter for å produsere en "signatur av hepatotoksisitet", som bidrar til å identifisere forbindelser med forskjellige nivåer av DILI-bekymring (inkludert forbindelser som ikke kan påvises ved andre in vitro-metoder) og deres mekanismer for toksisitet avslørt. Denne teknologien kan lukke gapet mellom tradisjonell cellekultur og dyremodeller på den ene siden og menneskelige kliniske studier, og fremme mot simulering av humane biologiske forhold for preklinisk vurdering av levertoksisitet som en del av legemiddelutviklingsprosessen.
Disclosures
Alle forfatterne er ansatte i CN Bio Innovations Limited.
Acknowledgments
CN Bio Innovations Ltd. finansierte denne studien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well cell culture cluster plates flat bottom | Corning | 3524 | |
| 96 well clear assay plates, flat bottom clear plastic | Greiner | 655101 | |
| 96 well plates black flat bottom | Corning | 3915 | |
| 96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | ThermoScientific | 165306 | |
| Advanced DMEM (1x) | Gibco | 12491015 | Cell culture media. |
| AssayMax Albumin ELISA Kit | AssayPro | EA3201-1 | Dilution 1:250. Time point Day 4, 6, and 8. |
| Cell Maintenance Cocktail B, (Primary Hepatocyte Maintenance Supplements) | Gibco | CM4000 | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9682 | Dilution 1:1. Time point Day 8. |
| Chlorpromazine HCl | Sigma Aldrich | C8138 | |
| Chromacol blue lids, 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps | ThermoScientific | 9-SCK(B)-ST1 | glass vial |
| Chromacol vials, 9 mm Clear Glass Screw Thread Vials | ThermoScientific | 2-SVW | |
| Class 2 Microbiological Safety Cabinets - Trimat2 1500 exhaust | Contained Air Solutions | ||
| Conical tubes 50 mL | Greiner | 227261 | |
| Cryopreserved Hepatocyte Recovery Medium (CHRM) | ThermoFisher Scientific | Gibco CM7000 | |
| Cryopreserved primary human hepatocytes | BioIVT Europe | Lot. RAS | |
| CytoTox 96 Cytotoxicty (LDH) Assay Kit | Promega | G1781 | Dilution - none. Time point Day 4, 6 and 8 |
| >Data analysis model used to generate the graph and EC:50 curves was nonlinear regression (curve fit) asymmetric sigmoidal, 5PL, where X is log(concentration | GraphPad Prism 9 | ||
| Disposable PES Filter Units 500mL | Fisher Scientific | 15913307 | |
| Disposable Pipette Basins 50ml | Fisher Scientific | 12369175 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich | Sigma D2650 | |
| Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (D-PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | |
| Easy Reader Conical Polypropylene Centrifuge Tubes 15 mL | Fisher Scientific | 11889640 | |
| Foetal bovine serum | Gibco | 10500064 | |
| Human ALT ELISA Kit | Abcam | ab 234578 | Dilution 1:5. Time point Day 6 and 8. |
| Human Cryopreserved Kupffer Cells | Lonza Europe | Lot. 190088KC | |
| hydrocortisone | Merck | H0888-1G | |
| Incubators models: New Brunswick Galaxy 170 S, New Brunswick Galaxy 170 R and CellXpert® C170. | Eppendorf | All serviced yearly; paperwork available upon request. | |
| Inverted Microscope | Leica DMIL LED | ||
| MPS know as Organ-on-a-Chip (OOC) | CN Bio Innovations Ltd. | ||
| MPS LC-12 plate | CN Bio Innovations Ltd. | ||
| Neubauer Improved C-Chip Disposable Haemocytometer (2 channel) | Cambridge Bioscience | DHC-N01-50 | |
| P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V9002 | Dilution - none. Time point Day 8 |
| PhysioMimix MPS platform | CN Bio Innovations Ltd. | ||
| Pioglitazone | MedChemExpress Tocris | HY-13956/CS-1700 | |
| Quantichrom Urea Assay Kit – Bioassay systems | Bioassay Systems | DY970-05 | Dilution 1:2 if initial reading is too high. Time point Day 4, 6 and 8. |
| Silica gel | Sigma-Aldrich | S7625 | |
| Software used to analyse and generate all the graphs was | GraphPad Prism 9 | ||
| Stripettes 10 mL | Fisher Scientific | 11839660 | |
| Stripettes 25 mL | Fisher Scientific | 11839181 | |
| Thawing plate Cocktail A, (Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements) | Gibco | CM3000 | |
| Troglitazone | MedChemExpress Tocris | 97322-87-7 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Tubes 1.5 mL | Greiner | 616201 | |
| Weighing balance - model PA214C and AV213C | Ohaus Corp |
References
- Lisi, D. M. Drug-induced liver injury: An overview. US Pharmacist. 41 (12), 30-34 (2016).
- Kuna, L., et al. Models of drug induced liver injury (DILI)-current issues and future perspectives. Current Drug Metabolism. 19 (10), 830-838 (2018).
- Katarey, D., Verma, S. Drug-induced liver injury. Clinical Medicine. 16 (6), London, England. 104-109 (2016).
- Kullak-Ublick, G. A., et al. Drug-induced liver injury: recent advances in diagnosis and risk assessment Recent advances in clinical practice. Gut. 66, 1154-1164 (2017).
- Dirven, H., et al. Performance of pre-clinical models in predicting drug-induced liver injury in humans: a systematic review. Scientific Reports. 11 (1), 6403 (2021).
- Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies. Current Drug Metabolism. 9 (1), 1-11 (2008).
- Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line HepG2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism and Disposition. 31 (8), 1035-1042 (2003).
- Gerets, H. H. J., et al. Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins. Cell Biology and Toxicology. 28 (2), 69-87 (2012).
- Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier. Pharmaceutical Research. 23 (7), 1482-1490 (2006).
- Li, F., Cao, L., Parikh, S., Zuo, R. Three-dimensional spheroids with primary human liver cells and differential roles of kupffer cells in drug-induced liver injury. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (6), 1912-1923 (2020).
- Proctor, W. R., et al. Utility of spherical human liver microtissues for prediction of clinical drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 91 (8), 2849-2863 (2017).
- Lin, C., Khetani, S. R. Advances in engineered liver models for investigating drug-induced liver injury. BioMed Research International. 2016, 1829148 (2016).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 32 (1), 56-67 (2000).
- Bell, C. C., et al. Comparison of hepatic 2D sandwich cultures and 3D spheroids for long-term toxicity applications: A multicenter study. Toxicological Sciences. 162 (2), 655-666 (2018).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Khetani, S. R., et al. Use of micropatterned co-cultures to detect compounds that cause drug-induced liver injury in humans. Toxicological Sciences. 132 (1), 107-117 (2013).
- Ma, X., et al. Deterministically patterned biomimetic human iPSC-derived hepatic model via rapid 3D bioprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the united States of America. 113 (8), 2206-2211 (2016).
- Dieterle, P. Y. M., Dieterle, F. Tissue-specific, non-invasive toxicity biomarkers: translation from pre-clinical safety assessment to clinical safety monitoring. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (9), 1023-1038 (2009).
- Rowe, C., et al. Perfused human hepatocyte microtissues identify reactive metabolite-forming and mitochondria-perturbing hepatotoxins. Toxicology in Vitro. 46, 29-38 (2018).
- Rubiano, A., et al. Characterizing the reproducibility in using a liver microphysiological system for assaying drug toxicity, metabolism, and accumulation. Clinical and Translational Science. 14 (3), 1049-1061 (2021).
- Tsamandouras, N., Kostrzewski, T., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Hughes, D. J., Cirit, M. Quantitative assessment of population variability in hepatic drug metabolism using a perfused three-dimensional human liver microphysiological system. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 360 (1), 95-105 (2017).
- Ortega-Prieto, A. M., et al. 3D microfluidic liver cultures as a physiological pre-clinical tool for hepatitis B virus infection. Nature Communications. 9 (1), 682 (2018).
- Kostrzewski, T., et al. Three-dimensional perfused human in vitro model of non-alcoholic fatty liver disease. World Journal of Gastroenterology. 23 (2), 204-215 (2017).
- Kostrzewski, T., et al. A microphysiological system for studying nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology Communications. 4 (1), 77-91 (2020).
- Vacca, M., et al. Bone morphogenetic protein 8B promotes the progression of non-alcoholic steatohepatitis. Nature Metabolism. 2 (6), 514-531 (2020).
- Long, T. J., et al. Modeling therapeutic antibody-small molecule drug-drug interactions using a three-dimensional perfusable human liver co-culture platforms. Drug Metabolism and Disposition. 44, 1940-1948 (2016).
- Bai, J., Wang, C. Organoids and microphysiological systems: New tools for ophthalmic drug discovery. Frontiers in Pharmacology. 11, 407 (2020).
- Ribeiro, A. J. S., Yang, X., Patel, V., Madabushi, R., Strauss, D. G. Liver microphysiological systems for predicting and evaluating drug effects. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 106 (1), 139-147 (2019).
- Clark, A. M., et al. A microphysiological system model of therapy for liver micrometastases hhs public access. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1170-1179 (2014).
- Qosa, H., Ribeiro, A. J. S., Hartman, N. R., Volpe, D. A. Characterization of a commercially available line of iPSC hepatocytes as models of hepatocyte function and toxicity for regulatory purposes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 110, 107083 (2021).
