Summary
İlaca bağlı karaciğer hasarı (DILI) ilaç yetmezliğinin önemli bir nedenidir. Bir karaciğer mikrofizyolojik sistemi (MPS) kullanarak bir bileşiğin DILI sorumluluğunu doğru bir şekilde tahmin etmek için bir protokol geliştirilmiştir. Karaciğer modeli, tedaviye hücresel yanıtları değerlendirmek için primer hepatik hücrelerin kokültürüne ve translasyonel olarak ilgili son noktalara sahiptir.
Abstract
DILI, insanlarda potansiyel olarak DILI'ye neden olduğu bilinen 1000'den fazla FDA onaylı ilaçla ilaç geliştirmede yıpranmanın önemli bir nedenidir. Ne yazık ki, DILI genellikle ilaçlar klinik aşamalara ulaşana kadar tespit edilmez, bu da hastaların güvenliğini riske atar ve ilaç endüstrisi için önemli kayıplara yol açar. Standart 2D modellerin DILI'yi algılamada sınırlamaları olduğu göz önüne alındığında, veri çevrilebilirliğini artırmak için daha öngörücü olan in vitro modeller geliştirmek esastır. DILI'nin nedenselliğini ve mekanik yönlerini ayrıntılı olarak anlamak için, insan birincil karaciğer parankimal ve parankimal olmayan hücrelerden (NPC'ler) oluşan ve perfüzyon altında tasarlanmış bir iskele üzerinde 3D mikrodokularda kültürlenmiş bir insan karaciğer MPS'si geliştirilmiştir. Kriyokorunmuş birincil insan hepatositleri (PHH'ler) ve Kupffer hücreleri (HKC'ler), MPS platformunda iki haftaya kadar mikrodokular olarak birlikte kültürlendi ve ilgilenilen her bileşik, dört güne kadar yedi test konsantrasyonunda karaciğer mikrodokularına tekrar tekrar dozlandı. Karaciğer fonksiyonunu değerlendirmek için fonksiyonel karaciğere özgü sonlanım noktaları (alanin aminotransferaz, ALT gibi klinik biyobelirteçler dahil) analiz edildi. Çeşitli DILI şiddetindeki bileşiklere akut ve kronik maruziyet, tek ve çok dozlu mikrodokulara verilen yanıtları karşılaştırarak değerlendirilebilir. Metodoloji, çok çeşitli şiddetli ve hafif hepatotoksik bileşiklerle doğrulanmıştır. Burada, karaciğer yetmezliğine neden olduğu için piyasadan çekilen iyi bilinen hepatotoksik bileşikler olan pioglitazon ve troglitazon için verileri gösteriyoruz. Genel olarak, karaciğer MPS modelinin DILI'yi ve hepatik fonksiyondaki değişikliklerle ilişkisini değerlendirmek için yararlı bir araç olabileceği gösterilmiştir. Model ayrıca, yeni bileşiklerin farklı hasta alt kümelerinde nasıl davrandığını ve toksisite profillerinin karaciğer hastalığı durumlarından (örneğin, viral hepatit, yağlı karaciğer hastalığı) nasıl etkilenebileceğini değerlendirmek için kullanılabilir.
Introduction
DILI, ABD ve Avrupa'da akut karaciğer yetmezliğinin en yaygın nedeni olmaya devam etmektedir ve ilaç geliştirme sürecinde bileşiklerin yıpranmasının önde gelen bir nedenidir1. Neredeyse tüm ilaç sınıfları hepatotoksisiteye neden olabilir, merkezi sinir sistemi ajanları ve antibiyotikler hastalarda DILI'ye neden olan en yaygın tedavilerdir2. İlaca bağlı hepatotoksisite, genetik, genetik olmayan ve çevresel faktörlerin karmaşık bir etkileşiminden kaynaklanır ve hepatositlerin ve kolanjiyositler ve endotel hücreleri de dahil olmak üzere diğer karaciğer hücre tiplerinin ölümüne yol açar 1,3.
DILI'ye neden olan ajanlar iki şekilde sınıflandırılabilir: öngörülebilir doza bağımlı karaciğer hasarına neden olanlar veya nadir görülen ve ilaç dozundan, yoldan veya uygulama süresinden bağımsız olarak gelişen kendine özgü DILI'ye neden olanlar, ancak ABD'deki tüm akut karaciğer başarısızlıklarının altıda birinden sadece4. Ne yazık ki, ilaçlar ilaç geliştirme sürecinin klinik aşamalarına ulaşana kadar DILI genellikle tespit edilmez. İlaca bağlı karaciğer hasarı sıralaması (veya DILIrank), DILI'ye neden olma potansiyellerine göre dört sınıfa ayrılan binden fazla FDA onaylı ilaçtan oluşur ve hastalarda kullanımları yakından izlenmelidir5.
İlaç hepatotoksisitesinin mekanizmalarını incelemek çok zor olmaya devam etmektedir ve bu nedenle, DILI'nin mekanizmalarını araştırmak için birçok klinik öncesi model geliştirilmiştir. Preklinik gelişimde DILI'yi tahmin etmek için kullanılan mevcut in vitro ve in vivo modellerin, canlı bir insan vücudundaki karmaşık, çok yönlü etkileşimler hakkında fikir vermede çeşitli sınırlamaları vardır. 2D olarak kültürlenen kanserli hepatik hücre hatları (yani, HepG2, HepaRG), aday bileşiklerin toksisitesini değerlendirmek için ilaç geliştirmenin erken aşamalarında hala kullanılmaktadır6. Buna rağmen, bu hücre hatları tek donörlerden gelir ve anormal seviyelerde karaciğer fonksiyonu gösterir ve DILI 7,8'in tespiti için her zaman yüksek hassasiyet göstermez. Kanserli hepatik hücre hatlarına alternatif olarak, PHH'ler in vitro olarak uygun şekilde kültürlenirse insan karaciğer fizyolojisini daha iyi temsil eder, ancak kültürlerinde ilaçlarla kısa kuluçka süresi, nispeten kısa yaşam süresi, hepatik gen ekspresyonu kaybı ve ilaç metabolik fonksiyonlarındaki değişiklikler gibi çeşitli sınırlamalar vardır 9,10,11 . PHH'ler, standart 2D hücre kültürü plakalarındaki hücre dışı matris proteinleri üzerinde kültürlenebilir, ancak bir dezavantaj olarak, işlevlerindeki hızlı düşüş, DILI tahmini12 için düşük duyarlılığa (<% 50) sahip oldukları anlamına gelir.
Öte yandan, hayvan modelleri üzerinde yapılan testler yavaş, pahalıdır ve insanlara tahmini tahmin etmek için türler arası bir çeviriye ihtiyaç duyar. Yeni geliştirilen ilaçların çoğu onay alamayarak bu süreci maliyetli ve risklihale getirmektedir 5. Ayrıca, yeni insana özgü modaliteleri test etmek için, hayvan modelleri, insanlara karşı gen dizisi veya immünolojik yanıt farklılıkları nedeniyle daha az uygundur13.
Sonuç olarak, daha gelişmiş üç boyutlu (3D) in vitro karaciğer modellerine olan ilgi katlanarak artmıştır. PHH'lerin asılı damlalarda veya ultra düşük bağlantı yüzeylerinde yerçekimsel agregasyon ile üretilen küresel yapılar olarak kültürlenmesi, bileşik yükümlülükleri değerlendirmek için yüksek verimli bir yöntemi temsil eder14. PHH sferoidleri, DILI'yi hastalıklı bir arka planda (örneğin, steatoz ve kolestaz) değerlendirmek için kullanılmıştır15. Stromal fibroblastlı hepatositlerin kaplanmış mikro desenli kokültürlerini16, 3D biyo-baskılı karaciğer dokularını17, hepatik parankimal olmayan hücrelere sahip veya olmayan 3D sferoid kültürleri15 içerecek şekilde çok çeşitli modeller geliştirilmiştir. Bununla birlikte, tüm bu yöntemlerin hala dezavantajları vardır ve PHH'lerin fizyolojik olarak daha alakalı bir mikro ortamda kültürlenmesi, potansiyel hepatotoksikanlara uzun süre maruz kalmanın araştırılmasını sağlamak için uzun süre daha yüksek işlevsellik seviyeleri sağlayabilir. Ek olarak, herhangi bir gelişmiş in vitro PHH kültürünün translasyonel uygunluğunu iyileştirmek için, verilerin in vivo veya klinik senaryolarda karşılaştırılmasına izin vermek için klinik olarak ilgili fonksiyonel son noktalar veya toksisite çıkış biyobelirteçleri kullanılmalıdır18.
Bu çalışmada, karaciğer toksisitesinin ayrıntılı mekanik yönlerini anlamak için in vitro karaciğer modeli olarak da bilinen Çip Üzerinde Organ (OOC) olarak da bilinen bir MPS'nin kullanılıp kullanılamayacağını değerlendirdik. MPS'nin daha önce, akış altında, 4 haftaya kadar yüksek işlevselliğe sahip 3B karaciğer mikrodokularını koruduğu gösterilmiştir19. Sistem yakın zamanda FDA tarafından test edilmiş ve ilaç toksisitesi, metabolizması ve hücre içi birikim20 gerçekleştirirken yüksek tekrarlanabilirliğe sahip olduğu gösterilmiştir. Dahası, sferoidler ve sandviç kültürleri ile karşılaştırıldığında, sistem birkaç ilacın toksisitesini tespit etmede daha kararlı bir işleve ve daha yüksek duyarlılığa sahipti20. MPS, bugüne kadar ADME 21, hastalık modellemesi (HBV 22, NAFLD23,24,25) ve ilaç-ilaç etkileşimleri 26'yı kapsayan çok çeşitli uygulamalarda kullanılmış ve potansiyel olarak akut ve kronik DILI'nin değerlendirilmesi için son derece uygun hale gelmiştir. Burada sunulan teknoloji, daha geleneksel hücre kültürleri ve hayvan modelleri ile insan klinik çalışmaları arasındaki boşluğu kapatmak için bir alternatif sunarak, ilaç geliştirme sürecinin klinik öncesi aşamalarında aday bileşiklerin karaciğer toksisitesinin değerlendirilmesini desteklemek için insan biyolojik koşullarının simülasyonuna doğru ilerlemektedir.
Protocol
Tüm çalışmalar laboratuvarda sıkı Sağlık ve Güvenlik prosedürlerini takip ederek ve kendi laboratuvar risk değerlendirmelerine ve SÇP'lerine uygun olarak yürütülmüştür. Kullanılan tüm ekipmanlara imalatın yönergelerine göre servis yapılır. Mikrobiyolojik güvenlik kabinlerine (MBSC'ler) yıllık olarak servis yapılır ve Ki-Discus (potasyum iyodür) İngiliz standartlarına göre test edilir. Protokol, Birleşik Krallık İnsan Doku Otoritesi (HTA) Uygulama Kurallarını ve direktiflerini takip eder ve bilgilendirilmiş onam (45 CFR §46.116 ve §46.117) ve İyi Klinik Uygulama (GLP), (ICH E6) ve düzenleyici ve etik komiteler için genel gerekliliklere tam olarak uyan satıcılar tarafından sağlanan etik kaynaklı birincil insan hücrelerini kullanır.
1. Hücre kültürü ortamının hazırlanması
NOT: Seeding Advanced DMEM ortamını -1. günde hazırlayın ve 4 °C'de saklayın. 1. Gün Bakım Gelişmiş DMEM ortamını hazırlayın ve 1 haftaya kadar 4 °C'de saklayın.
- PHH'ler ve HKC'lerin kokültürü için Tohumlama Gelişmiş DMEM ortamı: Bir şişe 500 mL Gelişmiş DMEM ortamı (Malzeme Tablosu) ile 18 mL Kokteyl A (nihai konsantrasyon% 3.6) ve 25 mL FBS (nihai konsantrasyon% 5) ile takviye edin.
- Bakım PH'ler ve HKC'lerin kokültürü için Gelişmiş DMEM ortamı: Bir şişe 500 mL Gelişmiş DMEM ortamı (Malzeme Tablosu) 20 mL Kokteyl B (son konsantrasyon% 4) ve 500 nM hidrokortizon ile takviye edin.
NOT: Hidrokortizon kullanım gününde taze olarak yapılacaktır ve stok çözeltisinin nasıl hazırlanacağına ve gerekli seyreltmelere ilişkin adımlar aşağıda belirtilmiştir. - Bakım İleri DMEM Ortamında 500 nM hidrokortizonun hazırlanması
- Başlangıç stoğu çözeltisinin (20 mM) hazırlanması: 7,24 mg hidrokortizonu (Malzeme Tablosu) 1 mL'lik bir cam şişeye tartın. Tartılan tam hidrokortizon miktarını kaydedin ve aşağıdaki hesaplamayı kullanarak dimetil sülfoksit (DMSO) hacmini belirleyin:
- Çalışan 100 μM hidrokortizon stok çözeltisinin hazırlanması: 995 μL Gelişmiş DMEM'ye başlangıç 20 mM stok çözeltisinden 5 μL ekleyin.
NOT: DMSO çözeltisinin 25 μL'sinin su veya ortamda adım 1'den seyreltilmesi,% 0,5 DMSO konsantrasyonu ile sonuçlanır. Son çözeltide, DMSO konsantrasyonu% 0.0025 olacaktır. Bu durumda, 5 μL'lik ek hacim, toplam hacimde önemsiz bir değişikliğe neden olur. - Gelişmiş DMEM'de çalışan 500 nM hidrokortizon çözeltisinin hazırlanması: Gelişmiş DMEM'de 1 mL'lik 500 nM hidrokortizon çözeltisi hazırlamak için, Bakım Gelişmiş DMEM ortamının 995 μL'sine 100 μM hidrokortizonun stok çözeltisinin 5 μL'sini ekleyin.
- Başlangıç stoğu çözeltisinin (20 mM) hazırlanması: 7,24 mg hidrokortizonu (Malzeme Tablosu) 1 mL'lik bir cam şişeye tartın. Tartılan tam hidrokortizon miktarını kaydedin ve aşağıdaki hesaplamayı kullanarak dimetil sülfoksit (DMSO) hacmini belirleyin:
2. MPS kurulumu ve astarlanması (Gün -1)
- Kontrol ünitesini bir hücre kültürü inkübatöründe yerleştirme istasyonu evine bağlayın ve kontrolörün arkasında bulunan kurutucu kavanozuna taze kurutucu (Malzeme Tablosu) eklendiğinden emin olun.
NOT: Kontrol ünitesi zamanla inkübatörden nem çeker ve taze kurutucu kullanılarak kuru tutulur. - Arkasında bulunan tekne rocker anahtarına basarak kontrol cihazını AÇIK duruma getirin ve sistemin dengelenmesi ve basınca ulaşması için 5 dakika bekleyin. Ardından, pnömatik raporun ekranını kontrol ederek şunları sağlayın: (i) Basınç Rezervuarı Çıkışı ~2000 mBar'a ulaştı ve (ii) Vakum Rezervuarı Çıkışı ~850 mBar'a ulaştı.
- Her plakayı ambalajdan çıkarın ve olası kusurları (eksik iskeleler, çatlaklar vb.) kontrol etmek için her kuyuyu görsel olarak inceleyin.
- Sürücünün takma birimi ve denetleyici tarafından tanınıp tanınmadığını kontrol etmek için takma birimine bir sürücü (plaka açıkken) yerleştirin. Basınç Rezervuarı Çıkışının 100 mBar'dan daha az düştüğünü ve Vakum Rezervuarı Çıkışının 500 mBar'dan daha az arttığını kontrol edin.
- Rezervuar tarafına 500 μL Tohumlama Gelişmiş DMEM ortamı (37 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış) ekleyerek her bir kuyucuğu astarlayın.
- Kontrolör ekranında Prime programını seçin (sıvı filtre desteklerinden geçene kadar 2,5 μL/sn'de 3 dakika yukarı akış). NOT: 'Yukarı akış', kontrolör üzerinde, medyanın LC12 plakasındaki iskelelerden rezervuardan yukarı doğru akmasını sağlayan bir ayardır.
- Yüzey kanalını kaplamak için tüm kuyucukları 1,1 mL Seeding Advanced DMEM ortamı ile doldurun. Tüm kuyular daha sonra 1,6 mL'lik tam çalışma hacminde olacaktır.
- Sürücüleri plakalı olarak 37 °C ve %5 CO2 inkübatöre yerleştirin, yerleştirme istasyonuna bağlayın ve Incubate programını çalıştırın.
NOT: Deneyde kullanılan tüm programlar (Prime, Incubate, Seed, Media Change) MPS sisteminde önceden ayarlanmıştır. Kuluçka makinesindeki plakaları tohumlamaya hazır olana kadar hazırlayın.
3. Karaciğer hücrelerinin MPS'ye tohumlanması (0. Gün)
- Tüm PHHS ve HKC'leri önceden doğrulayın. Tüm PHH'ler ve HKC'ler Lotlar, hücre kültürü deneyi yapılmadan önce şirket içinde önceden doğrulanır (Ek Materyale bakınız).
- PHH ve HKC hücrelerinin şişelerini (Malzeme Tablosu), şişeleri sadece küçük bir buz şeridi kalana kadar 37 ° C'lik bir su banyosunda sabit bir şekilde tutarak çözün.
- Pipet PHH'leri doğrudan önceden ısıtılmış (37 ° C) Kriyokorunmuş Hepatosit Geri Kazanım Ortamı CHRM ortamından oluşan bir tüpe (tüp başına maksimum iki şişe) dönüşür.
- Hücreleri nazikçe pipetleyin, ardından kriyotüpten kalan hücreleri yıkamak için 1 mL CHRM kullanın. Çözülürken ve konik bir tüpe aktarılırken hücrelere karşı çok nazik olun.
DİKKAT Şişeleri çözme sırasında çalkalamayın ve içeriklerini yukarı ve aşağı pipetlemeyin. - Pipet HKC'ler, hücreleri kriyotüpten 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde 10 mL buz gibi soğuk Tohumlama Gelişmiş DMEM ortamına yavaşça yerleştirir.
NOT: En fazla 2 şişe HKC birleştirilebilir. - Her iki hücre tipini de oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj yapın. Süper natantı çıkarın.
- PHH'leri ılık Tohumlama Gelişmiş DMEM ortamında ve HKC'leri buz gibi soğuk Tohumlama Gelişmiş DMEM ortamında (hücre kümelenmesini azaltmaya yardımcı olmak için), tüpe eklenen hücre şişesi başına 1 mL kullanarak yeniden askıya alın ve hücreleri buz üzerine yerleştirin. Hücreleri yeniden askıya almak için nazik bir sallama eylemi kullanın.
DİKKAT: Hücre ölümüne yol açabileceğinden, pipet etkisiyle PPH'leri yeniden askıya almayın. - Hücre süspansiyonlarını birden fazla tüpten birleştirin (eğer varsa - yani, tüm PHH'ler aynı donördense), ancak hücre tiplerini karıştırmayın.
- Hücreleri sayın. Canlılığı (hem hücre tipleri, PHH'ler hem de HKC'ler için% 85'in üzerinde olmalıdır) ve toplam hücre sayısını kaydedin. Hücre canlılığı% 85'in altına düşerse, yeni bir şişe hücreyi çözün ve hücre canlılığını yeniden değerlendirin.
- Aşağıdaki formülü kullanarak hücre canlılığını hesaplayın:
- Her bir kuyucuğa tohumlanacak hücre süspansiyonunun istenen hacmini ve toplam tohumlama hacmini 400 μL'ye çıkarmak için gereken ek Tohumlama Gelişmiş DMEM ortamı hacmini hesaplayın. Kuyu başına hücre sayıları: kuyu başına 0,4 x 10 6 PHH ve kuyu başına 0,04 x 10 6 HKC ve hücre yoğunluğu 0,25 x 106 PHH / mL, sırasıyla 0,025 x 106 HKC/mL.
- Sürücüyü takma biriminden çıkarın ve MBSC'ye yerleştirin.
- Medyayı yukarıdaki iskeleden durma noktasına (tutma halkasındaki derin çentikten aşağı inerek), kanala ve rezervuara aspire edin. Kültürde 0,2 mL'lik bir "ölü hacim" bırakın, iskelenin hemen üstüne ulaşın. Hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için toplam ortamın iskelenin üstünden çıkarılmamasına özen gösterilmelidir.
- Kuyu haznesine 400 μL Seeding Advanced DMEM ortamı ekleyin, sürücüyü inkübatördeki yerleştirme istasyonuna geri döndürün ve Medya Değiştirme programını 3 dakika boyunca çalıştırın. Program 3 dakika sonra otomatik olarak duraklatılacaktır.
- Tamamlandığında, sürücüyü takma biriminden çıkarın ve MBSC'ye geri yerleştirin.
- Medyayı yukarıdaki iskeleden durma noktasına ve her bir kuyucuğun rezervuar ucuna kadar aspire edin.
- Tüpü hafifçe sallayarak PHH'leri dikkatlice yeniden askıya alın, ardından hücre süspansiyonunun gerekli hacmini her kültüre iyice ekleyin. Hücre süspansiyonunu dikkatlice pipetleyin, hücrelerin plakanın iskelesi boyunca eşit olarak dağıldığından emin olun.
NOT: İskele boyunca iyi bir kapsama alanı sağlamak için, pipet hücrelerini iskeleye indirmek için yavaş bir döner hareket kullanın. - Benzer şekilde, HKC'leri dikkatlice askıya alın ve hücre süspansiyonlarını her kültüre iyice ekleyin.
NOT: İskele boyunca iyi bir kapsama alanı sağlamak için HKC'leri tohumlamak için yavaş bir döner hareket kullanın. İki tohumlama alt adımı ayrılabilir veya iki hücre tipi uygun bir yoğunlukta önceden karıştırılabilir ve eşzamanlı olarak tohumlanabilir. - Tüm kuyucuklar her iki hücre tipini de içerdiğinde, MPS sürücüsünü fiziksel olarak bağlamadan inkübatördeki yerleştirme istasyonuna yerleştirin ve 1 saat bekletin.
- 1 saat sonra, her bir kuyucuğu 400 μL'ye ulaşmak için gerekli miktarda ek Tohumlama Gelişmiş DMEM ortamı ile doldurun ve Tohum programını çalıştırın.
- 2 dakika sonra, program otomatik olarak duraklatılır, sürücüyü inkübatörden çıkarır ve toplam 1,4 mL'lik bir hacim elde etmek için kanala yavaşça 1000 μL Seeding Advanced DMEM ortamı ekler (rezervuar ucuna kuyu odasından daha yakın) (kanallarda 200 μL ölü hacim ile).
- Plakaları inkübatöre taşıyın ve Tohum programının geri kalanını 8 saat boyunca çalıştırın.
NOT: Akış, 8 saat sonra otomatik olarak Kuluçka programına geçecektir.
4. Medya değişikliği (1. Gün)
- Sürücüyü takma biriminden çıkarın ve MBSC'ye yerleştirin.
- Kuyu haznesindeki Seeding Advanced DMEM ortamını durma noktasına kadar kaldırarak Medya Değişikliği gerçekleştirin.
- Kuyu haznesine 400 μL Maintenance Advanced DMEM ortamı ekleyin, sürücüyü inkübatördeki yerleştirme istasyonuna geri döndürün ve Medya Değiştirme programını 3 dakika boyunca çalıştırın. Program 3 dakika sonra otomatik olarak duraklatılacaktır.
- Sürücüyü takma biriminden ayırın ve MBSC'de rezervuar odasından, kanaldan ve iskelenin üzerindeki durma noktasından uzaktaki ortamı aspire edin. Bu noktada, kültür kuyusu ölü hacme geri dönecektir.
- Rezervuar haznesini 1,4 mL taze önceden ısıtılmış (37 °C) Bakım Gelişmiş DMEM ortamı ile doldurun.
- Sürücüyü inkübatördeki yerleştirme istasyonuna geri getirin ve Incubate programını çalıştırın.
5. Karaciğer mikrodoku kalite kontrolü (QC), medya toplama, medya değişikliği ve ilaç dozlaması (Gün 4)
- 4. günde, tohumlamanın başarılı olduğundan emin olmak için Bakım Gelişmiş DMEM ortamını ve QC kontrollerini kullanarak bir Medya Değişikliği gerçekleştirin.
NOT: QC, Laktat dehidrogenaz (LDH) ve üre ölçerek oluşan mikrodokuların sağlığını kontrol etmek için kullanılan bir işlemdir. - QC'yi çalıştırmadan önce, test edilecek her bileşik için yeni stok çözümleri hazırlayın (her bir bileşiğin çözünürlüğüne bağlı olarak% 0,1 DMSO içeren Maintenance Advanced DMEM ortamında veya Maintenance Advanced DMEM ortamında). Her bileşik için test konsantrasyonları elde etmek için seyreltmeleri buna göre hazırlayın.
- Sürücüyü ve plakayı takma biriminden ayırın ve bir MBSC'ye aktarın.
- Numune almadan önce LDH testi (Malzeme Tablosu) yapmak için pipet kullanarak her bir kuyucuktan 50 μL ortamı 96 kuyucuklu bir plakaya ve bir Üre testi (Malzeme Tablosu) için 25 μL aktarın.
NOT: LDH ve üre tahlilleri üreticinin talimatlarına uygun olarak gerçekleştirilecektir. - LDH okumaları 2 AU / 10 6 hücreden düşükse ve üre 40 μg / gün / 106 hücrenin üzerindeyse QC'den sonra deneye devam edin.
NOT: Albümin, QC olarak kullanılmaz, çünkü o gün çalıştırılması uzun bir testtir ve deney 4. Günde çekilen örneklerden tamamlandıktan sonra daha sonra test edilecektir. - Herhangi bir kuyucuk QC'de başarısız olursa, bunları deneysel tasarımdan çıkarın.
- Deney düzeni onaylandıktan sonra, kalan ortamı her bir kuyucuktan örnekleyin ve iskeleye dokunarak hücre kültürünü rahatsız etmediğinizden emin olun. Toplanan medyayı (doz öncesi örnekler olarak etiketlenmiş) daha sonraki tahliller için -80 ° C'de saklayın.
- 4.3-4.5 arasındaki adımları izleyerek MBSC'de Medya Değişikliği gerçekleştirin. Kuyuları, deneysel tasarıma göre doğru ilaç konsantrasyonuna sahip Bakım Gelişmiş DMEM ortamına değiştirin.
- Tamamlandığında, sürücüyü inkübatördeki yerleştirme istasyonuna geri getirin ve Kuluçka programını çalıştırın.
6. Medya toplama, medya değişikliği ve ilaç dozlaması (6. Gün)
- Test edilecek her bileşik için taze stok çözümleri hazırlayın (her bir bileşiğin çözünürlüğüne bağlı olarak Maintenance Advanced DMEM ortamında veya %0,1 DMSO içeren Maintenance Advanced DMEM ortamında). Plaka planına göre her bileşik için test konsantrasyonları elde etmek için buna göre seyreltmeler hazırlayın.
- Sürücüyü ve plakayı takma biriminden ayırın ve bir MBSC'ye aktarın.
- Her bir kuyucuktan (~ 1 mL) bir pipetle manuel olarak medya toplayın, iskeleye dokunarak hücre kültürünü rahatsız etmediğinizden emin olun, LDH ve Üre için tahlil. Toplanan ortamın geri kalanını daha sonraki tahliller için -80 ° C'de saklayın ve doz sonrası 48 saat numuneleri etiketleyin.
- Her bir kuyucuk, 4. Gündeki ile aynı ilaç konsantrasyonuyla ve plaka planına göre, 4.3-4.5 adımlarını izleyerek Medya Değişikliği yaparak yeniden dozlayın.
- Tamamlandığında, sürücüyü inkübatördeki yerleştirme istasyonuna geri getirin ve Kuluçka programını çalıştırın.
7. Denemeyi sonlandırma (8. Gün)
- Sürücüyü ve plakayı takma biriminden ayırın ve bir MBSC'ye aktarın.
- Bir pipet kullanarak her bir kuyucuktan manuel olarak numune alın ve iskeleye dokunarak hücre kültürünü rahatsız etmediğinizden emin olun.
- LDH ve Üre için geri çekilen medyayı test edin ve toplanan medyanın geri kalanını daha sonraki tahliller için -80 ° C'de saklayın.
- CYP3A4-glo testinin çalıştırılması.
- Bu testi kullanarak deneyin sonunda PHH'lerde sitokrom P450 CYP3A4 aktivitesi üzerinde test edilen ilaçların etkilerini ölçün.
- Üreticinin talimatlarını izleyerek algılama reaktifini yeniden oluşturun (CYP3A4 testi için, Malzeme Tablosu'na bakınız). Algılama reaktifi daha önce yeniden yapılandırılmış ve dondurulmuşsa, -20 °C dondurucudan çıkarın ve RT'de çözülmesine izin verin.
- Üreticinin talimatlarını izleyerek 20 mM stok D-luciferin standardı hazırlayın.
- Bakım Gelişmiş DMEM ortamında Luciferin IPA'nın 1:1000 seyreltilmesi ile çalışan luminojenik substrat ortamı hazırlayın (kuyu başına 2 mL luminojenik substrat ortamı).
- Luminojenik substrat ortamıyla adım 4.3-4.5'te açıklandığı gibi bir Medya Değişikliği gerçekleştirin. Luminojenik substrat ortamının 500 μL'sini giriş malzemesi olarak 1,5 mL'lik bir cam şişeye (Malzeme Tablosu) kaydedin.
- Sürücüyü inkübatördeki yerleştirme istasyonuna geri getirin ve Kuluçka programını 1,5 saat çalıştırın.
- Üreticinin talimatlarını izleyerek 1,5 mL tüplerde kültür ortamında D-luciferin standart eğrisini hazırlayın ve her standardın 50 μL'sini beyaz opak 96 delikli bir plaka üzerinde kopya halinde pipet hazırlayın (bkz.
- Süre geçtikten sonra, 7.4.9-7.4.13 adımlarını izleyerek sürücüyü takma biriminden ve CYP3A4 testi için örnek ortamdan çıkarın.
- Kuluçkadan sonra, numune ortamının 50 μL'sini her bir kuyudan ve giriş malzemesinden, standartları içeren 96 delikli opak beyaz luminometre plakasına aktarın. En üst standartlar ve numune okumaları arasında ışık taşınmasını önlemek için standartlar ve numuneler arasında opak plaka üzerinde en az iki boş sıra bırakmaya özen gösterin.
- Işıldayan bir reaksiyon başlatmak için her bir kuyucuğa 50 μL Luciferin Algılama Reaktifi ekleyin.
- Işıldayan sinyali dengelemek için RT'deki plakayı karanlıkta 20 dakika boyunca bir plaka çalkalayıcıda inkübe edin.
- Bir luminometre veya CCD kamera kullanarak parlaklığı kaydedin.
- Her noktanın ortalamasını alarak ve ardından boşlukların ortalamasını çıkararak standart eğriyi çizin. Örneklerin geri kalanındaki metabolik hızı (pmol / dak / 106 hücre) hesaplamak için çizginin denklemini kullanın, yapılan seyreltmeleri dahil etmeyi unutmayın.
- İskeleleri bir çift cımbız kullanarak plakalardan çıkarın ve mikrodokuyu rahatsız etmemeye dikkat ederek her bir kuyucukta 500 μL D-PBS (Ca ++ ve Mg ++ olmadan) içeren 24 kuyucuklu bir plakaya yerleştirin.
- 10x büyütmede ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu kullanarak her iskelenin anlık görüntülerini alın.
- ATP tahlilini (bkz. Malzeme Tablosu) üreticinin talimatlarını izleyerek çalıştırma:
- Reaktifi RT'de çözün.
- Her yıkama adımı için iskeleleri 500 μL D-PBS (Ca++ ve Mg++ olmadan) ile iki kez yıkayın.
- Her iskeleye 120 μL reaktif ve 120 μL PBS ve boş bir kuyuya aynı hacimleri ekleyin (bu boş olarak işlev görür). Alüminyum folyo kaplı plakayı bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve parlaklık sinyalini stabilize etmek için 5 dakika boyunca kuvvetlice (500 rpm) ve ardından 30 dakikalık inkübasyon ile çalkalayın.
- Lize numunelerin 100 μL'sini kopya halinde, ölçüm için şeffaf bir düz tabanlı 96 kuyu tahlil plakasına aktarın. Boş kuyuların, yüksek lüminesanslı diğer ölçüm kuyularının yanına yerleştirilmediğinden emin olun.
- Bir mikro plaka okuyucu kullanarak parlaklığı kaydedin.
- Numunelerdeki reaktif tarafından tespit edilen ATP'yi belirlemek için numunelerin lüminesansını standartların lüminesansı ile karşılaştırın.
Representative Results
Makalede, DILI'yi değerlendirmek için kullanılan bir karaciğer MPS modeli açıklanmaktadır. MPS, akış altında 4 haftaya kadar yüksek oranda işlevsel tutulan 3B karaciğer mikrodokularının oluşturulmasını kolaylaştırır. PHH'ler / HKC'ler, bir büyüme ortamı ile perfüze edilen karaciğer mikrodokuları oluşturmak için kollajen kaplı iskelelere ekilir ve QC kontrolünden geçtikten sonra bileşiklerle dozlanır. Burada, yapısal olarak benzer iki bileşik olan ancak farklı DILI şiddetlerine sahip troglitazon ve pioglitazon için veriler gösteriyoruz.
4. Günde, ilaç dozundan önce, oluşan karaciğer mikrodokularının QC kontrolü değerlendirilir ve LDH salınımı ve üre sentezinden oluşur (Şekil 1A). QC, karaciğer MPS'sinin son derece tutarlı ve işleyen karaciğer mikrodokuları ürettiğini doğrulamayı amaçlamaktadır. Burada sunulan veriler üç deneyden üretilmiştir ve düşük çalışma içi ve çalışma arası değişkenlik ile iyi düzeyde tekrarlanabilirlik göstermektedir. 8 günlük bir kültürden sonra, çoklu sağlık ve hepatik metrikler (albümin, üre, CYP3A4, ATP) değerlendirilir ve kontrol mikrodokuları yüksek düzeyde hepatik işlevsellik ve tekrarlanabilirlik gösterir (Şekil 1B, C). Kontrast faz mikroskobu ve karaciğer mikrodokularının IF boyanması ( Ek Materyale Bakınız), iskelenin mikro kanalları boyunca yüksek tohumlama tutarlılığı gösterir ve HKC'lerin PHH mikrodokularındaki dağılımını ortaya çıkarır (Şekil 1D)
Şekil 1: Karaciğer MPS, yüksek oranda tekrarlanabilir veriler ve tutarlı mikro dokular üretir . (A) 4. Günde 3D Karaciğer mikrodoku QC ölçümleri ve 8. Gün'de çalışmanın sonunda işlevsellik değerlendirmesi -(B) Albümin ve Üre, (C) CY3A4 ve ATP). Veriler 3 deneyden toplanmıştır; Her deneyde, 3 araç kontrol replikası vardı. Gösterilen veriler Ortalama ± SD, N = 9'dur. (D) DILI'yi değerlendirmek için karaciğer MPS platformunda PH'lerin ve HKC'lerin birlikte kültürlenmesiyle oluşturulan 3D karaciğer mikrodokularının faz kontrast mikroskobu (10x ve 20x) ve IF'si. HKC'leri görselleştirmek için, tohumlamadan önce HKC'ler eGFP'yi eksprese eden bir adenoviral vektör ile dönüştürüldü (Ek Materyale bakınız). Temsili fotomikrograflar gösterilmiştir. Transdüksiyon ve görüntüleme, hücre lokalizasyonunu göstermek için bağımsız bir deney olarak gerçekleştirildi ve tarif edilen DILI protokolü ile yapılmadı. HKC hücreleri, deneysel hücre kültüründe kullanılmadan önce şirket içinde önceden doğrulanır ve çözülme sonrası aktivasyonun düşük seviyelerine sahip olmalıdır; bu, IL-6 ve TNF-alfa biyobelirteçleri ölçülerek değerlendirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Troglitazonun şiddetli DILI'ye neden olduğu bilinmektedir; Tip 2 diyabet tedavisi için lisansını takiben, kullanımıyla ilişkili karaciğer hasarı sıklığı nedeniyle piyasada 3 yıl sonra FDA tarafından geri çekildi. Bugüne kadar, yayınlanan hayvan çalışmaları, troglitazonun ciddi karaciğer hasarına neden olma potansiyelini tahmin edememiştir. Bu bileşiğin toksisitesi standart in vitro 2D hepatik tahlillerde de tespitedilmemiştir 14.
MPS'deki karaciğer mikrodokuları 96 saat boyunca troglitazon ile dozlandı ve troglitazona akut maruz kalmayı takiben, ALT ve LDH salınımı ile tespit edilen Cmax tahrikli akut toksik bir cevaba ve albümin ve üre üretiminde hızlı bir azalmaya neden oldu (Şekil 2A). 96 saatlik maruziyetten sonra örneklenen hücresel son nokta (ATP içeriği) ve CYP3A4 aktivitesi (metabolik biyotransformasyonu değerlendirmek için), troglitazonun neden olduğu daha fazla doğrulanmış toksisite ve EC: 50 değerleri diğer son noktalarla oldukça karşılaştırılabilir (Şekil 2B). MPS'de 8 günlük kültürden sonra alınan Brightfield mikroskopisi görüntüleri, pozitif kontrol ve en üstteki iki test konsantrasyonunda troglitazon ile tedavi edilen replikalarda görülen genelleştirilmiş doku ölümü/bozulmasının aksine, iskele boyunca eşit şekilde tohumlanmış sağlıklı bir karaciğer mikrodokusunu ortaya koymaktadır (Şekil 2C).
Şekil 2: Birden fazla hepatotoksik sonlanım noktası kullanılarak troglitazon DILI riskinin belirlenmesi. Karaciğer mikrodokuları 96 saat boyunca yedi test troglitazon konsantrasyonuna maruz bırakıldı ve (A) LDH salınım, ALT salınım, Albümin üretimi, Üre sentezi, CYP3A4 aktivitesi ve ATP içeriği ile karşılaştırıldı. Mavi çizgiler - 48 saat pozlama (yalnızca medya uç noktaları), kırmızı çizgiler - 96 saat pozlama. Pozitif kontrol 100 μM klorpromazin idi. Tüm son noktalar aynı karaciğer MPS kültürlerinden ölçülür. Gösterilen veriler ortalama ± SD, N = 3'tür. (B) Verilerden üretilen E:50 sayılarının özeti. N.D. = veri çizilebilir değil. Satır = test edilmedi. (C) 8 günlük kültürden sonra karaciğer mikrodokularının temsili parlak alan mikroskopisi (büyütme 10x). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Pioglitazona maruz kalmayı takiben karaciğer toksisitesi de araştırıldı. Pioglitazon, düşük DILI endişesi4 olduğu bilinen bir bileşiktir ve klasik 2D primer hepatosit kültürlerinde ve hatta bazı daha gelişmiş 3D modellerde hepatotoksisite göstermemiştir10,11. Test edilen her iki zaman noktasında da hafif hepatotoksik etkiler gözlenmiştir (Şekil 3). LDH veya ALT salınımı algılanmadı; Bununla birlikte, 48 saat sonra, albümin ve üre üretiminde yaklaşık 25x Cmaksimumda hafif bir azalma gözlenmiştir (Şekil 3A). ATP içeriğinde çok küçük bir azalma da yüksek pioglitazon konsantrasyonlarında gözlendi, ancak bu anlamlı değildi. EC:50 doz-yanıt eğrilerinden üretilen değerler Şekil 3B'de sunulmuştur. Mikroskopi, test edilen en yüksek iki konsantrasyonda pioglitazona 96 saat maruz kaldıktan sonra hafif mikrodoku değişikliği olduğunu ortaya koydu (Şekil 3C). Sonuçlar, karaciğer MPS'sinin hafif DILI endişesi olan bileşiklerin toksisitesini tespit etme yeteneğini göstermektedir.
Şekil 3: Çoklu hepatotoksik sonlanım noktaları kullanılarak pioglitazon DILI riskinin belirlenmesi. Karaciğer mikrodokuları 96 saat boyunca yedi test pioglitazon konsantrasyonuna maruz bırakıldı ve (A) LDH salınım, ALT salınım, Albümin üretimi, Üre sentezi, CYP3A4 aktivitesi ve ATP içeriği ile karşılaştırıldı. Mavi çizgiler - 48 saat pozlama (yalnızca medya uç noktaları), kırmızı çizgiler - 96 saat pozlama. Pozitif kontrol 100 μM klorpromazin idi. Tüm son noktalar aynı karaciğer MPS kültürlerinden ölçülür. Gösterilen veriler ortalama ± SD, N = 3'tür. (B) Verilerden oluşturulan EC:50 sayılarının özeti. N.D. = veri çizilebilir değil. Satır = test edilmedi. (C) 8 günlük kültürden sonra karaciğer mikrodokularının temsili parlak alan mikroskopisi (büyütme 10x). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
İn vivo veya klinik senaryoları (LDH salınımı, Üre sentezi, Albümin üretimi, CYP3A4 aktivitesi, ATP içeriği, ALT salınımı) temsil edebilecek tüm fonksiyonel son noktaları ve toksisite çıkış biyobelirteçlerini değerlendirerek ve 48 saat ve 96 saat boyunca yedi noktalı bir doz aralığında dozlanan test edilmiş her iki bileşik için üretilen verileri doğrulayarak, "hepatotoksisite imzası" vermek için bir ısı haritası oluşturulmuştur, Farklı düzeylerde DILI kaygısına sahip bileşiklerin tanımlanmasına yardımcı olur (Şekil 4).
Şekil 4: Karaciğer MPS ile "toksisite imzasının" belirlenmesi. Troglitazon ve pioglitazonun altı fonksiyonel karaciğere özgü son noktadan (LDH salınımı, Üre sentezi, Albümin üretimi, ALT salınım, CYP3A4 aktivitesi ve ATP içeriği) yedi noktalı doz aralığına 48 saat ve 96 saat maruz kaldıktan sonra ısı haritası gösterilmesi. Her değer Ortalama, N = 3 olarak oluşturulur ve örnekleri kontrol etmek için normalleştirilir. Renk çubuklarındaki değerler, temel denetimlere göre kat artışı temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Materyal: Mikrodokuların floresan mikroskopla görüntülenmesi ve hücrelerin ön yeterlilik değerlendirmesi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Discussion
MPS, insan organlarının fonksiyonel birimlerini in vitro olarak özetlemek üzere tasarlanmıştır ve geleneksel 3B hücre kültürü modellerinin sınırlamalarını ele almak üzere geliştirilmiştir27. Karaciğer, MPS kullanılarak en çok modellenen organlardan biridir ve çok çeşitli sistemler geliştirilmiştir. İnsan karaciğeri, ilaç metabolizmasından ve toksik ilaç metabolitlerinin üretilmesinden sorumludur ve işlevi, bileşiklerin DILI sorumluluğunun değerlendirilmesi de dahil olmak üzere ilaç geliştirme için modellemek için kilit bir unsurdur28. Burada, karaciğer MPS kullanarak DILI'yi değerlendirmek için yeni bir yöntem sunduk; protokol, DILI'ye nasıl neden olabileceğini belirlemek için test edilen her bileşik için mekanik içgörülerin aranmasını ve aynı zamanda son derece hassas ve sağlam bir tahlil olmasını sağlar. Karaciğer mikrodokuları, PHH ve HKC'lerin bir kokültürü olan ve standart in vitro karaciğer modelleri20'ye kıyasla yüksek düzeyde albümin ve üre üretiminin yanı sıra yüksek CYP3A4 aktivitesi ile oldukça işlevsel olan MPS plakalarında oluşur.
Burada açıklanan DİLİ modeli, ilaç geliştirme sürecinde klinik öncesi testlerin sonraki aşamalarında yararlı bir araç olarak hizmet edebilse de, bazı sınırlamaları da vardır. MPS'nin çoğunluğu şu anda piyasada bulunduğundan, düşük verimli bir platformdur ve bu nedenle büyük ölçekli uyuşturucu tarama faaliyetleri için kullanımı daha zordur. PPH'lerin ve HKC'lerin pıhtılaşmasıyla oluşan mikrodokulardan oluşan DILI modeli, insan karaciğerinin karmaşıklığını da tamamen yakalayamaz ve farklı hücre türlerini (örneğin, bağışıklık hücreleri) dahil ederek daha fazla optimizasyon, mevcut modele değer katmak için faydalı olacaktır. Bu tek organlı MPS, ortak bir ortamı paylaşabilen ve hücresel veya endokrin düzeyde organ çapraz konuşmasına izin verebilen ve yalnızca karaciğerin kendisiyle sınırlı olmayan toksisiteye ilişkin mekanik içgörülerin daha iyi anlaşılmasına yardımcı olabilecek diğer organ platformlarıyla da birleştirilebilir. Ayrıca, nispeten yeni herhangi bir teknoloji gibi, maliyetli ve dolayısıyla sınırlı erişilebilirlik olarak kabul edilebilir.
MPS, tek veya çok insanlı dokuların organotipik modellerini geliştirmek için kullanılan bir platformdur. Sistem bir kontrolör, göbek kablosu ve plakanın yerleştirildiği MPS sürücüsünden oluşur (Şekil 5A). Her karaciğer MPS plakası, birincil karaciğer hücrelerini mühendislik iskelelerinde 3D olarak kültürlemek için 12 bağımsız açık kuyuya sahiptir. Özetle, sistem QC tarafından kontrol edilir ve plakalar Gün -1'de astarlanır, PHH'ler ve HKC'ler sıfır Günü'nde plakalara yerleştirilir (Şekil 5B, bkz. 1). Gömülü mikro pompalar, 3D mikro dokuların oluşumunu kolaylaştırmak için hücre kültürü ortamının iskeleler aracılığıyla dolaşımını kolaylaştırır (Şekil 5B, bkz. 2). Oluşan mikro dokular 4. günde QC'd, 4 gün boyunca her 48 saatte bir her bileşiğin farklı konsantrasyonları ile dozlanır ve 8. günde son nokta biyobelirteçleri için test edilir (Şekil 5C). MPS plakasındaki DILI testinin deneysel zaman çizelgesi Şekil 5B'de gösterilmiştir.
Şekil 5: Mikrofizyolojik sistem ve standart bir DILI testinin deneysel zaman çizelgesi. (A) Bileşenleri ile mikrofizyolojik sistem: kontrolör (1), göbek kablosu (2), yerleştirme istasyonu (3), MPS sürücüsü (4) ve LC12 plakası (5). (B) PH'lerin ve HKC'lerin LC12 plakası üzerine 1. Gün (1) ve gömülü mikropompalar üzerine tohumlanması, iskelelere tohumlanan 3D mikro dokular aracılığıyla ayarlanabilir akış hızlarına sahip hücre kültürü ortamının dolaşımını kolaylaştırır (2). (C) Çalışma sonunda iskelelerin yıkılması. (D) Deneysel zaman çizelgesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Protokolü gerçekleştirirken, başlamadan önce sağlam bir sistem QC kontrolünün yapılması, sistemin pnömatik olarak doğru çalışıp çalışmadığının kontrol edilmesi ve sarf malzemesi plakalarının görsel olarak incelenmesi ve tüm kuyularda eşit işlevsellik sağlamak için verimli bir şekilde astarlanması önemlidir. Yüksek kaliteli birincil insan hücrelerine sahip olmak, hücre kültürü deneylerinde tutarlı bir şekilde yapıştığı ve 3D etkileşimler oluşturduğu bilinen hepatositlerle bu protokol için çok önemlidir. Bu hücrelerin çözülmesi de kritik bir adımdır, çünkü birincil hepatositler pipetleme eylemi ile yeniden askıya alınmamalıdır, çünkü bu hızla hücre ölümüne yol açabilir. % 85'in üzerinde hücre canlılığına sahip olmak, başarılı tohumlama için kritik öneme sahiptir, çünkü büyük miktarda hücresel enkaz 3D mikrodoku oluşumuna müdahale edecektir. 4. Gün'de oluşan karaciğer mikrodokularının QC kontrolü de önemlidir ve kullanıcının kabul edilebilir LDH ve Üre seviyelerinin ölçülmesini sağlaması gerekir, çünkü aralık dışı parametreler düşük kaliteli doku oluşumunun göstergesi olabilir ve doğrudan sorun gidermeye izin verebilir. Son olarak, hücre kültürü ortamında kullanılan hidrokortizon, hepatositlerin metabolik işlevselliğini korumak için gerekli olduğu gibi, hücre kültürü işlevselliğini etkileyebilecek istenmeyen bozulmaları önlemek için kullanım gününde taze olarak hazırlanmalıdır.
Önemli karmaşıklığa sahip olmasına rağmen, karaciğer MPS, insan karaciğerinin tüm hücre tiplerini içermez. Fizyolojik alaka düzeyini artırmak içinmodel 24,29'a daha fazla hücre tipi eklemek mümkündür, ancak bunlar yalnızca kullanım bağlamı için açık bir gerekçe ile eklenmelidir. DILI üzerinde çalışmak için PHH anahtar hücre tipidir ve HKC'lerin bu modele dahil edilmesi bazı immünolojik yanıtların belirlenmesini sağlar. Ayrıca, insan karaciğerlerinden izole edilen PPH'lerin ve ticari olarak temin edilebilen kriyokorunmuş PPH'lerin lottan lota bazı farklılıklar gösterme eğiliminde olduğu da belirtilmelidir. Burada, bu protokolün, yüksek kaliteli hücre preparatları ile kullanıldığında tekrarlanabilir sonuçlar ürettiğini gösterdik. Bununla birlikte, bazı lot-lot varyasyonları beklenecektir ve bu, havuzlanmış çok sayıda çoklu bağışçı kullanılarak daha da aşılabilir. Bu sınırlamalar, PHH'lerin birçok fonksiyonel özelliğini özetleyen ve ilaç geliştirme sürecinde kullanılan iPSC'den farklılaşmış hepatosit benzeri hücreler kullanılarak aşılabilir30. HKC'ler ayrıca çözülme sırasında çok fazla değişkenlik ve yüksek düzeyde aktivasyon gösterir; Bu nedenle, HKC'lerin donörleri deneysel hücre kültüründe (doğrulanmış PHH'lerle kokültür) kullanılmadan önce şirket içinde önceden doğrulanır ve düşük çözülme sonrası aktivasyon seviyelerine sahip olmalıdır; bu, IL-6 ve TNF-alfa biyobelirteçleri ölçülerek değerlendirilir (bakınız Ek Materyal).
Burada sunulan veriler, tahlilin DILI'yi doğru bir şekilde tespit edebildiğini ve 2D10,11 ve hatta bazı 3D modeller tarafından tespit edilemeyen hepatotoksikanların tanımlanmasına yardımcı olduğunu doğrulamaktadır. MPS'den üretilen veriler, sahalar arası tekrarlanabilirlik20 dahil olmak üzere proses standardizasyonu ve uyumlaştırma eksikliği nedeniyle farmasötik endüstrisi tarafından düzenleyici sunumlar veya ilaç taraması amacıyla hala standart olarak kullanılmamaktadır. Burada gösterilen veriler ve deneysel yaklaşımlar bunu ele almakta ve karaciğer modelinin yeni bileşiklerin sorumluluğunu doğru bir şekilde tahmin etmek için DILI ekranlarında rutin ve sağlam bir şekilde kullanılabileceğini göstermektedir.
Bir "hepatotoksisite imzası" üretmek için bir dizi uç noktayı ölçerek, farklı seviyelerde DILI endişesine sahip bileşiklerin (diğer in vitro yöntemlerle tespit edilemeyen bileşikler dahil) ve bunların ortaya çıkan toksisite mekanizmalarının tanımlanmasına yardımcı olur. Bu teknoloji, bir tarafta geleneksel hücre kültürü ve hayvan modelleri ile insan klinik çalışmaları arasındaki boşluğu kapatabilir ve ilaç geliştirme sürecinin bir parçası olarak karaciğer toksisitesinin klinik öncesi değerlendirmesi için insan biyolojik koşullarının simülasyonuna doğru ilerleyebilir.
Disclosures
Tüm yazarlar CN Bio Innovations Limited çalışanıdır.
Acknowledgments
CN Bio Innovations Ltd. bu çalışmayı finanse etti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well cell culture cluster plates flat bottom | Corning | 3524 | |
| 96 well clear assay plates, flat bottom clear plastic | Greiner | 655101 | |
| 96 well plates black flat bottom | Corning | 3915 | |
| 96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | ThermoScientific | 165306 | |
| Advanced DMEM (1x) | Gibco | 12491015 | Cell culture media. |
| AssayMax Albumin ELISA Kit | AssayPro | EA3201-1 | Dilution 1:250. Time point Day 4, 6, and 8. |
| Cell Maintenance Cocktail B, (Primary Hepatocyte Maintenance Supplements) | Gibco | CM4000 | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9682 | Dilution 1:1. Time point Day 8. |
| Chlorpromazine HCl | Sigma Aldrich | C8138 | |
| Chromacol blue lids, 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps | ThermoScientific | 9-SCK(B)-ST1 | glass vial |
| Chromacol vials, 9 mm Clear Glass Screw Thread Vials | ThermoScientific | 2-SVW | |
| Class 2 Microbiological Safety Cabinets - Trimat2 1500 exhaust | Contained Air Solutions | ||
| Conical tubes 50 mL | Greiner | 227261 | |
| Cryopreserved Hepatocyte Recovery Medium (CHRM) | ThermoFisher Scientific | Gibco CM7000 | |
| Cryopreserved primary human hepatocytes | BioIVT Europe | Lot. RAS | |
| CytoTox 96 Cytotoxicty (LDH) Assay Kit | Promega | G1781 | Dilution - none. Time point Day 4, 6 and 8 |
| >Data analysis model used to generate the graph and EC:50 curves was nonlinear regression (curve fit) asymmetric sigmoidal, 5PL, where X is log(concentration | GraphPad Prism 9 | ||
| Disposable PES Filter Units 500mL | Fisher Scientific | 15913307 | |
| Disposable Pipette Basins 50ml | Fisher Scientific | 12369175 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich | Sigma D2650 | |
| Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (D-PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | |
| Easy Reader Conical Polypropylene Centrifuge Tubes 15 mL | Fisher Scientific | 11889640 | |
| Foetal bovine serum | Gibco | 10500064 | |
| Human ALT ELISA Kit | Abcam | ab 234578 | Dilution 1:5. Time point Day 6 and 8. |
| Human Cryopreserved Kupffer Cells | Lonza Europe | Lot. 190088KC | |
| hydrocortisone | Merck | H0888-1G | |
| Incubators models: New Brunswick Galaxy 170 S, New Brunswick Galaxy 170 R and CellXpert® C170. | Eppendorf | All serviced yearly; paperwork available upon request. | |
| Inverted Microscope | Leica DMIL LED | ||
| MPS know as Organ-on-a-Chip (OOC) | CN Bio Innovations Ltd. | ||
| MPS LC-12 plate | CN Bio Innovations Ltd. | ||
| Neubauer Improved C-Chip Disposable Haemocytometer (2 channel) | Cambridge Bioscience | DHC-N01-50 | |
| P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V9002 | Dilution - none. Time point Day 8 |
| PhysioMimix MPS platform | CN Bio Innovations Ltd. | ||
| Pioglitazone | MedChemExpress Tocris | HY-13956/CS-1700 | |
| Quantichrom Urea Assay Kit – Bioassay systems | Bioassay Systems | DY970-05 | Dilution 1:2 if initial reading is too high. Time point Day 4, 6 and 8. |
| Silica gel | Sigma-Aldrich | S7625 | |
| Software used to analyse and generate all the graphs was | GraphPad Prism 9 | ||
| Stripettes 10 mL | Fisher Scientific | 11839660 | |
| Stripettes 25 mL | Fisher Scientific | 11839181 | |
| Thawing plate Cocktail A, (Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements) | Gibco | CM3000 | |
| Troglitazone | MedChemExpress Tocris | 97322-87-7 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Tubes 1.5 mL | Greiner | 616201 | |
| Weighing balance - model PA214C and AV213C | Ohaus Corp |
References
- Lisi, D. M. Drug-induced liver injury: An overview. US Pharmacist. 41 (12), 30-34 (2016).
- Kuna, L., et al. Models of drug induced liver injury (DILI)-current issues and future perspectives. Current Drug Metabolism. 19 (10), 830-838 (2018).
- Katarey, D., Verma, S. Drug-induced liver injury. Clinical Medicine. 16 (6), London, England. 104-109 (2016).
- Kullak-Ublick, G. A., et al. Drug-induced liver injury: recent advances in diagnosis and risk assessment Recent advances in clinical practice. Gut. 66, 1154-1164 (2017).
- Dirven, H., et al. Performance of pre-clinical models in predicting drug-induced liver injury in humans: a systematic review. Scientific Reports. 11 (1), 6403 (2021).
- Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies. Current Drug Metabolism. 9 (1), 1-11 (2008).
- Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line HepG2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism and Disposition. 31 (8), 1035-1042 (2003).
- Gerets, H. H. J., et al. Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins. Cell Biology and Toxicology. 28 (2), 69-87 (2012).
- Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier. Pharmaceutical Research. 23 (7), 1482-1490 (2006).
- Li, F., Cao, L., Parikh, S., Zuo, R. Three-dimensional spheroids with primary human liver cells and differential roles of kupffer cells in drug-induced liver injury. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (6), 1912-1923 (2020).
- Proctor, W. R., et al. Utility of spherical human liver microtissues for prediction of clinical drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 91 (8), 2849-2863 (2017).
- Lin, C., Khetani, S. R. Advances in engineered liver models for investigating drug-induced liver injury. BioMed Research International. 2016, 1829148 (2016).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 32 (1), 56-67 (2000).
- Bell, C. C., et al. Comparison of hepatic 2D sandwich cultures and 3D spheroids for long-term toxicity applications: A multicenter study. Toxicological Sciences. 162 (2), 655-666 (2018).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Khetani, S. R., et al. Use of micropatterned co-cultures to detect compounds that cause drug-induced liver injury in humans. Toxicological Sciences. 132 (1), 107-117 (2013).
- Ma, X., et al. Deterministically patterned biomimetic human iPSC-derived hepatic model via rapid 3D bioprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the united States of America. 113 (8), 2206-2211 (2016).
- Dieterle, P. Y. M., Dieterle, F. Tissue-specific, non-invasive toxicity biomarkers: translation from pre-clinical safety assessment to clinical safety monitoring. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (9), 1023-1038 (2009).
- Rowe, C., et al. Perfused human hepatocyte microtissues identify reactive metabolite-forming and mitochondria-perturbing hepatotoxins. Toxicology in Vitro. 46, 29-38 (2018).
- Rubiano, A., et al. Characterizing the reproducibility in using a liver microphysiological system for assaying drug toxicity, metabolism, and accumulation. Clinical and Translational Science. 14 (3), 1049-1061 (2021).
- Tsamandouras, N., Kostrzewski, T., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Hughes, D. J., Cirit, M. Quantitative assessment of population variability in hepatic drug metabolism using a perfused three-dimensional human liver microphysiological system. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 360 (1), 95-105 (2017).
- Ortega-Prieto, A. M., et al. 3D microfluidic liver cultures as a physiological pre-clinical tool for hepatitis B virus infection. Nature Communications. 9 (1), 682 (2018).
- Kostrzewski, T., et al. Three-dimensional perfused human in vitro model of non-alcoholic fatty liver disease. World Journal of Gastroenterology. 23 (2), 204-215 (2017).
- Kostrzewski, T., et al. A microphysiological system for studying nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology Communications. 4 (1), 77-91 (2020).
- Vacca, M., et al. Bone morphogenetic protein 8B promotes the progression of non-alcoholic steatohepatitis. Nature Metabolism. 2 (6), 514-531 (2020).
- Long, T. J., et al. Modeling therapeutic antibody-small molecule drug-drug interactions using a three-dimensional perfusable human liver co-culture platforms. Drug Metabolism and Disposition. 44, 1940-1948 (2016).
- Bai, J., Wang, C. Organoids and microphysiological systems: New tools for ophthalmic drug discovery. Frontiers in Pharmacology. 11, 407 (2020).
- Ribeiro, A. J. S., Yang, X., Patel, V., Madabushi, R., Strauss, D. G. Liver microphysiological systems for predicting and evaluating drug effects. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 106 (1), 139-147 (2019).
- Clark, A. M., et al. A microphysiological system model of therapy for liver micrometastases hhs public access. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1170-1179 (2014).
- Qosa, H., Ribeiro, A. J. S., Hartman, N. R., Volpe, D. A. Characterization of a commercially available line of iPSC hepatocytes as models of hepatocyte function and toxicity for regulatory purposes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 110, 107083 (2021).
