Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الفحص الحيوي للتطبيق الموضعي لتحديد سمية المبيدات الحشرية للبعوض وذباب الفاكهة

Published: January 19, 2022 doi: 10.3791/63391
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Center for Evolution and Medicine, School of Life Sciences, Arizona State University, 2United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Center for Medical, Agricultural and Veterinary Entomology

Summary

نحن نصف منهجية وأهمية الفحص الحيوي للتطبيق الموضعي لقياس قابلية المبيدات الحشرية في البعوض وذباب الفاكهة. الفحص المقدم عالي الإنتاجية ، ويستخدم كتلة الحشرات - مما يسمح بحساب جرعة قاتلة نسبية الكتلة بدلا من التركيز - ومن المحتمل أن يكون له تباين أقل من الطرق المماثلة الأخرى.

Abstract

وقد أدى استمرار استخدام المبيدات الحشرية للصحة العامة والزراعة إلى انتشار مقاومة المبيدات الحشرية وإعاقة أساليب المكافحة. عادة ما يتم ترصد مقاومة المبيدات الحشرية لمجموعات البعوض من خلال المقايسات الحيوية لزجاجات مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها (CDC) أو اختبارات أنبوب منظمة الصحة العالمية (WHO). ومع ذلك ، يمكن أن تؤدي هذه الطرق إلى درجة عالية من التباين في بيانات الوفيات بسبب الاتصال المتغير للمبيدات الحشرية بالحشرة ، والأعداد الصغيرة نسبيا من الكائنات الحية التي تم اختبارها ، والتباين الواسع النطاق في الكتلة بين السكان ، والظروف البيئية المتغيرة باستمرار ، مما يؤدي إلى نتائج متغيرة. تقدم هذه الورقة المقايسة الحيوية للتطبيق الموضعي ، والتي تم تكييفها كاختبار حيوي ظاهري عالي الإنتاجية لكل من البعوض وذباب الفاكهة ، لاختبار أعداد كبيرة من الحشرات على طول مجموعة من تركيزات المبيدات الحشرية.

يضمن هذا الفحص 1) العلاج المتسق واتصال المبيدات الحشرية مع كل كائن حي ، 2) ينتج منحنيات استجابة جرعة محددة للغاية تمثل الاختلافات في متوسط الكتلة بين السلالات والجنسين (وهو أمر مهم بشكل خاص للكائنات الحية التي تم جمعها ميدانيا) ، و 3) يسمح بحساب متوسط الجرعات المميتة الصارمة إحصائيا (LD50 )، وهي ضرورية لمقارنات نسبة المقاومة - نهج ترصد بديل من وفيات الجرعات التشخيصية، والذي يستخدم أيضا في ترصد مقاومة مبيدات اليرقات. سيكون هذا الفحص أداة تكميلية للتنميط الظاهري الدقيق لمجموعات البعوض ، وكما هو موضح باستخدام ذباب الفاكهة ، يمكن تكييفه بسهولة للاستخدام مع الحشرات الأخرى. نحن نجادل بأن هذا الفحص سيساعد في سد الفجوة بين مقاومة المبيدات الحشرية الجينية والمظهرية في أنواع الحشرات المتعددة.

Introduction

البعوض مسؤول عن أكثر من 700،000 حالة وفاة كل عام بسبب الأمراض التي ينقلها إلى البشر ، مع أكثر من نصف هذه الوفيات بسبب الملاريا وحدها1. والطريقة الوقائية الرئيسية ضد انتقال الملاريا وغيرها من الأمراض المنقولة بالنواقل هي استخدام المبيدات الحشرية، وغالبا ما تكون في شكل ناموسيات مبيدات حشرية طويلة الأمد أو رش داخلي متبقي2. ومع ذلك ، فإن مقاومة المبيدات الحشرية منتشرة على نطاق واسع بين البعوض وناقلات الحشرات الأخرى ، وكذلك الآفات الزراعية 3,4. ولإدارة المقاومة بفعالية، تكتسي المراقبة أهمية رئيسية5. لهذا ، هناك حاجة إلى طرق دقيقة للغاية وعالية الإنتاجية للكشف عن المقاومة. وفي الوقت الحالي، فإن أدوات مراقبة مقاومة المبيدات الحشرية الأكثر انتشارا بالنسبة للبعوض هي اختبار أنبوب منظمة الصحة العالمية6 والفحص الحيوي لزجاجة مركز السيطرة على الأمراض7. بالنسبة لذباب الفاكهة ، فإن طريقة تطبيق الاتصال المتبقي (على غرار الفحص الحيوي لزجاجة CDC) هي مقايسة بيولوجية شائعة الاستخدام للمبيدات الحشرية 8,9,10. ومع ذلك، فإن التباين في البيانات من هذه الطرق عادة ما يكون مرتفعا، حيث تتراوح قياسات نفس سلالة البعوض المختبري بين 20-70٪ تقريبا في اختبارات زجاجات CDC و 0-50٪ في اختبارات أنبوب منظمة الصحة العالمية عند التعرض لجرعات دون قاتلة11. هذا التباين مثير للدهشة لأن التباين الجيني المحدود في معظم سلالات المختبرات من المتوقع أن يؤدي إلى تباين محدود في قابلية المبيدات الحشرية بين السكان. ومع ذلك ، لا يزال هناك مستوى عال من التباين الذي لوحظ في نتائج الفحص البيولوجي.

ويمكن أن تكون المصادر المحتملة لهذا التباين نتيجة للتعرض غير المتجانس للمبيدات الحشرية بين العينات داخل المقايسة الحيوية بسبب التعرض غير المباشر للمبيدات الحشرية عبر السطح، والآثار البيئية غير المتجانسة، والتباين البيولوجي الطبيعي بين الأفراد من نفس النمط الوراثي، والتباين في كتلة العينات من نفس السكان12 . طريقة نادرة الاستخدام مع قابلية تكرار أعلى هي المقايسة الحيوية للتطبيق الموضعي. في هذا الفحص ، يتم تطبيق المبيد الحشري مباشرة على كل حشرة13,14 ، مما يزيل عامل التعرض غير المتجانس للعينات المختلفة داخل نفس المقايسة. ومع ذلك ، نظرا لطبيعة الإنتاجية البطيئة لهذه الطريقة ، لا يتم استخدامها بشكل روتيني كأداة لمراقبة قابلية المبيدات الحشرية لمجموعات البعوض. تقدم هذه الورقة بروتوكولا معدلا للفحص الحيوي للتطبيق الموضعي الذي يسمح بالتعرض لإنتاجية أعلى مع تصحيح التباين في كتلة الحشرات ، وهي معلمة ترتبط بالتغيرات في قابلية المبيدات الحشرية12. ومن شأن الحد من الضوضاء والتباين المرتبط بالكتلة في بيانات الوفيات الناجمة عن التعرض المتغير للمبيدات الحشرية أن يسمح بمراقبة المقاومة التقنية بدقة أكبر11,15. ويمكن استخدام هذه البيانات لربط مقاومة النمط الظاهري بدقة أكبر بالعلامات الجينية و/أو معلمات اللياقة البدنية و/أو كفاءة النواقل. بالإضافة إلى ذلك ، نوضح كيف يمكن بسهولة تكييف هذا الفحص مع أنواع الحشرات الأخرى باستخدام الفحص الحيوي للتطبيق الموضعي على ذباب الفاكهة ، وهو نوع من الحشرات أصغر حجما.

القيد الرئيسي لتطبيقات الاتصال المتبقية المذكورة أعلاه هو أن التعرض للمبيدات الحشرية قد يختلف من عينة إلى أخرى ضمن نفس الفحص. في حالة المقايسات الحيوية لزجاجة CDC وطريقة الاتصال ، قد يختلف التعرض للمبيدات الحشرية بين النسخ المتماثلة لنفس المقايسة. تتعرض الحشرات لمبيد حشري يتم توزيعه إما داخل زجاجة زجاجية (الفحص الحيوي لزجاجة CDC وطريقة الاتصال) أو على الأوراق المشربة (اختبار أنبوب منظمة الصحة العالمية). تركيز المبيدات الحشرية على كلا السطحين (الزجاج والورق) معروف ومحدد مسبقا من خلال فحص أنواع مختلفة من الأنماط الوراثية المعروفة. ومع ذلك ، فإن الكمية المتاحة لاحتمال امتصاصها من قبل الحشرة يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا اعتمادا على السطح المستخدم ، ومكونات خليط المبيدات الحشرية ، وكيفية توزيع المبيد الحشري بشكل متجانس عبر المواد السطحية16,17. في الفحص الحيوي لزجاجة CDC ، يعتمد طلاء المبيدات الحشرية الموجود داخل الزجاجة على الإجراءات المستخدمة من قبل كل مختبر ومستخدم. في اختبار أنبوب منظمة الصحة العالمية ، يتم إنتاج الأوراق المعالجة بالمبيدات الحشرية مركزيا وبالتالي من المرجح أن تكون متجانسة تماما عبر المختبرات. ومع ذلك، في اختبار أنبوب منظمة الصحة العالمية، يسمح أنبوب التعرض للعينات بالهبوط والاستناد على شبكة معدنية غير معرضة للمبيدات الحشرية، مما يؤدي إلى احتمال التعرض للمبيدات الحشرية غير المتجانسة بين العينات داخل كل اختبار. ولا تزال الكمية الفعلية من المبيدات الحشرية التي تلتقطها العينات وتمتصها عبر كل طريقة بحاجة إلى مزيد من الاستكشاف18.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن المقايسة الحيوية لزجاجة CDC ، واختبار أنبوب منظمة الصحة العالمية ، وطريقة الاتصال هي الأكثر شيوعا كاختبارات عتبة تختبر تركيزا واحدا فقط من المبيدات الحشرية المحددة مسبقا. يمكن لهذا النهج أن يكتشف بدقة وجود المقاومة وهو ذو قيمة لمراقبة المقاومة (خاصة عندما تنتشر المقاومة). ومع ذلك، لا يمكن لاختبارات العتبة تحديد قوة المقاومة، والتي قد تكون أكثر تنبؤا بفعالية أدوات التدخل. إذا تم استخدام تركيزات مبيدات حشرية متعددة مع هذه الطرق ، فيمكن استخدامها كاختبارات كثافة. تم إدخال اختبارات الشدة للفحص الحيوي لزجاجة CDC واختبار أنبوب منظمة الصحة العالمية عن طريق اختبار 5x و 10x الجرعات التمييزية المحددة مسبقا لمعالجة هذه الفجوة في الترصد 6,19. في حين توفر قدرة أكبر على التمييز بين المجموعات السكانية المقاومة ، فإن 3-5 جرعات (محددة مسبقا) توفر دقة محدودة لحساب التركيزات المميتة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام البعوض من مختلف الأحجام في مثل هذه المقاييس. ومع ذلك ، من المهم قياس الكتلة لأن العينات الأكبر قد تحتاج إلى جرعة أعلى ليتم قتلها لأن الجرعة الفعالة لكل وحدة من الكتلة ستكون أقل بكثير من جرعة الكائن الحي الأصغر12. إن حساب جرعة قاتلة نسبية الكتلة (كمية المبيد الحشري لكل كتلة حشرة) سيكون مقياسا أكثر فائدة من التركيز المميت الأكثر شيوعا (على سبيل المثال ، كمية المبيد الحشري لكل مساحة سطحية) لأنه يأخذ في الاعتبار تباين كتلة الحشرات بين الجنسين والسكان والأنماط الوراثية. ومن شأن هذه البيانات أن تساعد على سد الفجوة بين مقاومة النمط الوراثي والنمط الظاهري داخل المختبر والميدان، ويمكن أن توفر أيضا طريقة سهلة لحساب تركيز التطبيق اللازم لعلاج مجموعة من الحشرات ذات الكتلة المتوسطة المعروفة.

استخدام جرعات قاتلة نسبية جماعية تقتل 50٪ من العينات (LD50) يتضمن أيضا العديد من الفوائد الأخرى. تقييم سمية مركب معين في مغ / كغ (= نانوغرام / ملغم) هو المعيار في علم السموم البشري والبيطري14 ، وتوجد قيم LD50 في صحائف بيانات سلامة المواد. تسمح الجرعات القاتلة أيضا بإجراء مقارنة مباشرة للسمية بين المواد الكيميائية المختلفة تجاه نوع معين أو نفس المادة الكيميائية تجاه الأنواع المختلفة20 ، بالإضافة إلى تقييم عالي الجودة للمبيدات الحشرية والمواد الكيميائية الجديدة13. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يوفر LD50 نسب مقاومة أكثر وضوحا ودقة من تلك المستمدة من نتائج وفيات الجرعة التشخيصية ، مما قد يؤدي إلى المبالغة في تقدير مستوى المقاومة الموجود في السكان. لذلك ، سيكون هذا الفحص مناسبا لبرامج المراقبة الروتينية من خلال توفير مراقبة مقاومة أكثر صرامة استنادا إلى جرعات قاتلة نسبية جماعية مشتقة من عينات أكثر مما هو موصى به للمقايسات الحيوية الأخرى21.

وقد استخدمت طريقة التطبيق الموضعية في ترصد قابلية البعوض والذباب لقابلية البعوض والذباب للمبيدات الحشرية كبديل للمقايسات البيولوجية القياسية لقابلية المبيدات الحشرية عندما تكون المقاومة معروفة بالفعل أو مشتبه فيها 22,23، وكذلك للترصد في بعض حشرات الآفات 24 لتقييم ملامح المقاومة والسمية الجوهرية للمبيدات الحشرية بدقة أكبر 21 . في الفحوصات الحيوية للتطبيق الموضعي ، يتم تطبيق المبيد الحشري على كل كائن حي ، مما يؤدي إلى الحد الأدنى من الاختلاف في التعرض للمبيدات الحشرية. تقدم هذه الورقة طريقة مكيفة ومحسنة قليلا تسمح بتطبيق التعرض للمبيدات الحشرية على عدد كبير من الحشرات في فترة قصيرة مع التحكم أيضا في كتلة الحشرات22. ويمكن أن تكون هذه الطريقة ذات الإنتاجية العالية مع مستويات جيدة من التكرار أداة إضافية مفيدة للترصد الروتيني لقابلية المبيدات الحشرية.

Protocol

ملاحظة: يمكن أن تسبب المبيدات الحشرية مخاطر بشرية وحيوانية وبيئية25. ينصح بشدة بالحذر والتدريب ومعدات الحماية الشخصية. تأكد من اتباع أوراق بيانات سلامة المواد لجميع المبيدات الحشرية والمذيبات المستخدمة.

1. العينات الخلفية

  1. البعوض البالغ من العمر 3-5 أيام الخلفية.
    ملاحظة: يعكس البروتوكول الوارد أدناه ظروف تربية الزاعجة المصرية ، ويتبع عن كثب المبادئ التوجيهية26 لمنظمة الأغذية والزراعة للأمم المتحدة.
    1. البعوض الخلفي من جميع مراحل الحياة في 27 ± 1 درجة مئوية و 75 ± رطوبة نسبية 5 ٪ مع 12: 12 ساعة من الضوء والظلام ركوب الدراجات.
    2. فقس بيض البعوض عن طريق غمره في ماء منزوع الأيونات وإضافة الخميرة26 ، أو ضع البيض المغمور داخل غرفة فراغ لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: كلتا الطريقتين تقلل من محتوى الأكسجين داخل الماء وتزيد من الفقس27.
    3. قم بإطعام أغذية أسماك اليرقات التي تم فقسها حديثا (أو نظام غذائي مكافئ مثل كبل القط المطحون) داخل الصواني والحفاظ على كثافة اليرقات متشابهة قدر الإمكان بين الصواني حيث تؤثر كثافة اليرقات على التنمية12 (على سبيل المثال ، 200-250 يرقات لكل صينية تحتوي على ما مجموعه 1.5 لتر من الماء).
    4. إطعام اليرقات كل يومين حتى تصل إلى مرحلة العذراء (حوالي 7-10 أيام) ، مما يزيد من كمية الطعام حسب الحاجة.
      ملاحظة: عندما تتغذى قليلا جدا ، سيتم إيقاف نمو اليرقات ، وقد تأكل اليرقات بعضها البعض. عندما تتغذى أكثر من اللازم ، قد تموت اليرقات ، مما يتسبب في تلف الماء.
    5. بمجرد تطور الشرانق ، قم بنقلها يوميا إلى وعاء مائي في أقفاص البعوض البالغة وتوفير محلول السكروز بنسبة 10٪ ad.
    6. سجل اليوم الأول من ظهور البالغين. إزالة الشرانق المتبقية من القفص 2 أيام بعد بدء الظهور.
      ملاحظة: تظهر ذكور البعوض بشكل أسرع. لاحظ ظهور الذكور والإناث بشكل منفصل وتأكد من توفر عدد كاف من الذكور والإناث لكل اختبار.
    7. انتظر لمدة 3 أيام بعد إزالة الشرانق لتحقيق البعوض البالغ من العمر 3-5 أيام للاختبار.
  2. ذباب الفاكهة الخلفية (يتبع بشكل فضفاض بروتوكولات جامعة زيورخ28).
    1. سلالات ذبابة الفاكهة الخلفية في زجاجات المخزون عند 23 ± 1 درجة مئوية و 60 ± رطوبة نسبية 5٪ مع 12: 12 ساعة من الضوء والظلام ركوب الدراجات.
      ملاحظة: يجب أن تحتوي زجاجات مخزون ذبابة الفاكهة على 75 مل من وسط ذبابة قياسي ، يتم سكبه أولا كسائل في قاع الزجاجات ثم يسمح له بالتصلب بين عشية وضحاها.
    2. نقل المستعمرات إلى زجاجات مخزون جديدة مع الطعام الطازج كل أسبوعين لمنع الاكتظاظ السكاني ونمو العفن. للقيام بذلك ، قم بهدم الذباب باستخدام موزع ثاني أكسيد الكربون (CO2) المحمول باليد ، ونقل الذباب المخدر إلى ورقة وزن على كيس ثلج أو طاولة تبريد ، وتنظيف الذباب في زجاجة مرق طازجة باستخدام فرشاة طلاء ذات رأس دقيق. تأكد من إبقاء الزجاجات على جانبيها أثناء هذه العملية لمنع الذباب من السقوط في الطعام والغرق.

2. إعداد تركيبات المبيدات الحشرية باستخدام نهج الجاذبية

  1. اصنع أول حل مخزون باتباع نهج الجاذبية باستخدام مقياس تحليلي بدقة 0.1 ملغ داخل غطاء الدخان.
    ملاحظة: يستخدم نهج قياس الجاذبية الكتلة لقياس كميات المبيدات الحشرية والمذيبات المضافة. وستتطلب الممارسة الموحدة (النهج الحجمي) مقياسا تحليليا لقياس كمية المبيد الحشري (الصلب) المضاف عند إعداد أول محلول مخزون؛ ومع ذلك ، يتم قياس كمية المذيب المضافة وجميع التخفيفات التالية بالحجم فقط. يتمتع نهج الجاذبية بمستوى أعلى من الدقة وبالتالي فهو مفضل.
    1. حدد تركيز المبيدات الحشرية المستهدفة والحجم المستهدف (يوصى باستخدام 10 مل كحد أقصى في حالة استخدام أنابيب مخروطية سعة 15 مل لمنع الانسكاب عند التخزين في الثلاجة) لمحلول المخزون الأول وحساب كمية العنصر النشط للمبيدات الحشرية (الذكاء الاصطناعي) لإضافتها باستخدام Eq (1):
       Equation 1 (1)
    2. قم بإعداد أنبوب تخزين (أنبوب مخروطي 15 مل موصى به للأحجام الأكبر ، وأنابيب غطاء لولبي لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل موصى بها لأحجام 1 مل أو أقل) وملصق باسم المبيدات الحشرية والمذيبات والتركيز المستهدف وتاريخ التحضير. ضع الأنبوب والغطاء على الميزان داخل رف أو حامل وقم بتعرية الميزان.
    3. وزن الكمية المطلوبة من المبيدات الحشرية الصلبة أو السائلة الذكاء الاصطناعي تحديدها من الخطوة 2.1.1. (على سبيل المثال ، الدلتامثرين المستخدم للبيانات التمثيلية) في الأنبوب وتسجيل الكتلة.
    4. قم بتقطيع المقياس وإضافة الحجم المطلوب من المذيب (أي ما يعادل الحجم المستهدف) إلى الأنبوب ، وأغلق الغطاء على الفور ، وسجل الكتلة. أغلق غطاء الأنبوب مباشرة بعد إضافة المذيب (الأسيتون المستخدم هنا) لتجنب التبخر وخلط المحلول.
    5. سجل درجة حرارة الغرفة. بعض المذيبات ، مثل الأسيتون ، يمكن أن يكون لها تغييرات كبيرة في الحجم (وبالتالي الكثافة) اعتمادا على درجة الحرارة.
    6. في حالة التخزين على الفور، لف غطاء الأنبوب في بارافيلم (لتقليل التبخر)، وضعه في رف / حامل أنبوب (للحفاظ على استقامته ومنع التسرب)، قم بتغطيته بورق (لمنع التعرض للأشعة فوق البنفسجية)، وضعه في كيس بلاستيكي قابل لإعادة الإغلاق (لتقليل التبخر)، وضع الكيس في ثلاجة -20 درجة مئوية. إذا لم يتم تخزينه على الفور ، فتأكد من تأمين الغطاء وتغطيته بورق أو حاوية محمية بالضوء.
    7. احسب التركيز الفعلي لمحلول المخزون (ملغم / مل) عن طريق قسمة كتلة الذكاء الاصطناعي المبيدات الحشرية المضافة على حجم المذيب المضاف (وحجم المبيد الحشري المضاف إذا كان في شكل سائل). لحساب حجم المذيب المضاف (أو المبيد الحشري السائل) ، قسم الكتلة المضافة على الكثافة المعروفة المناسبة لدرجة الحرارة المسجلة.
    8. احسب كثافة محلول المخزون (جم/مل) بقسمة الكتلة الكلية المضافة (المبيدات الحشرية والمذيبات) على الحجم الإجمالي المضاف (المذيب والمبيد الحشري، إذا كان في شكل سائل). راجع الخطوة 2.1.7 لتحويل الكتلة السائلة إلى حجم.
  2. قم بتخفيف محلول المخزون الأولي بشكل متسلسل عن طريق تخفيف 10٪. إذا لزم الأمر ، استخدم هذه التخفيفات التسلسلية لإنشاء منحنى استجابة الجرعة الأولي لتحديد النطاق المستهدف لتركيزات المبيدات الحشرية للفحص الحيوي.
    1. احسب حجم محلول مخزون المبيدات الحشرية والمذيب المراد إضافته إلى كل أنبوب (على سبيل المثال ، 1 مل من محلول مخزون المبيدات الحشرية المخفف في 9 مل من المذيب لتخفيف 10 مل بنسبة 10٪ من التركيز السابق).
    2. دوامة حل الأسهم لمدة 10 ثانية. قم بتعرية أنبوب تخفيف أول محدد مسبقا على المقياس. أضف الحجم المطلوب من محلول المخزون إلى أنبوب التخفيف الأول باستخدام ماصة. أغلق على الفور غطاء كلا الأنبوبين وسجل الكتلة في أنبوب التخفيف الأول.
    3. قم بتعرية أنبوب التخفيف الأول مرة أخرى وأضف الحجم المطلوب من المذيب. أغلق الغطاء على الفور ، وسجل كتلة المذيب المضاف ، ودوامة التخفيف الأول لمدة 10 ثوان.
    4. كرر الخطوتين 2.2.2 و2.2.3 للتخفيفات المتبقية.
    5. تخزين كافة التخفيفات كما هو موضح أعلاه في الخطوة 2.1.6.
    6. احسب التركيزات الفعلية للتخفيفات باتباع الخطوة 2.1.7.
    7. احسب كثافة كل تخفيف للمبيدات الحشرية بقسمة الكتلة الكلية المضافة (محلول المبيدات الحشرية والمذيب) على إجمالي الحجم المضاف (محلول المبيدات الحشرية والمذيبات). لكل تخفيف تسلسلي، استخدم كثافة تخفيف مخزون المبيدات الحشرية السابقة لحساب كثافة التخفيف الجديد بعد Eq (2):
      Equation 2 (2)
  3. اختياري: إنشاء تخفيفات المبيدات الحشرية مع زيادات أصغر عن طريق التخفيف التسلسلي.
    1. حدد تركيزات وأحجام كل محلول جديد لصنعه بمساعدة منحنى استجابة الجرعة للتخفيفات التسلسلية الأولية أو التجارب السابقة أو الأدبيات المنشورة.
      ملاحظة: ينبغي أن تؤدي التركيزات المختارة إلى نطاق وفيات يتراوح بين 0 و 100 في المائة، مع ما لا يقل عن ثلاثة تركيزات من هذا النطاق للسماح بتحليل البروبيت.
    2. استخدم التخفيفات التسلسلية كحلول مخزون لإجراء كل تخفيف جديد واتبع الخطوة 2.2 لإنشاء التخفيفات الجديدة بين التخفيفات 10 أضعاف.
  4. اختياري: Aliquot محلول المبيدات الحشرية. إذا تم تصنيع كميات أكبر من محاليل المبيدات الحشرية ، فقم بتحويل المحاليل إلى أنابيب ذات غطاء لولبي سعة 1.5 مل لتجنب التلوث والتبخر وتدهور محاليل المخزون من المعالجة المتكررة والتعرض للضوء.
    1. Aliquot الحلول ، بدءا من أدنى تركيز والعمل نحو أعلى تركيز للحد من التلوث المحتمل. امزج كل محلول مخزون عن طريق الدوامة لمدة 10 ثوان قبل فتح الحجم المطلوب وسحبه (على سبيل المثال ، 0.5 مل) في أنبوب غطاء لولبي محدد مسبقا.
    2. قم بتخزين الأليكوتس في حاوية مقاومة للضوء في ثلاجة -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: يوصى باستبدال الأليكوتات بانتظام (شهريا) بأليكوتات جديدة صغيرة مأخوذة مباشرة من تخفيفات مبيدات الآفات. وهذا من شأنه أن يحد من احتمال انتقال التلوث إلى تجارب أو تغييرات أخرى بسبب التبخر أو تدهور الأشعة فوق البنفسجية أثناء استخدام العينات على مقاعد البدلاء. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا وإعادة تشغيله حتى بعد سنوات ، طالما يتم تخزين محاليل المبيدات الحشرية بشكل صحيح (انظر الخطوة 2.1.6) والاحتفاظ بها في الفريزر -20 درجة مئوية.
  5. استخدم قلم تحديد دائم لوضع علامة على الغضروف المفصلي قبل التخزين لمراقبة تبخر المذيبات. عند إزالة محلول المبيدات الحشرية لصنع aliquots ، ضع علامة على الغضروف المفصلي في كل مرة تتم فيها إزالة المحلول.

3. إعداد مساحة عمل الفحص الحيوي للتطبيق الموضعي

ملاحظة: يوصى بالعمل في خيمة مناولة الحشرات على الطاولة لتسهيل التقاط البعوض أو الذباب الهارب. انظر الشكل التكميلي S1 للحصول على صور لخيمة مناولة الحشرات.

  1. قم بإزالة محاليل المبيدات الحشرية اللازمة من الفريزر ، دوامة على الفور ، وضعها في حاوية مقاومة للضوء في درجة حرارة الغرفة للسماح للمبيدات الحشرية بالدفء إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
    ملاحظة: يمكن أن تنفصل AIs المبيدات الحشرية عن المذيب في درجات حرارة أكثر برودة. بالإضافة إلى ذلك ، يتغير حجم الأسيتون مع درجة الحرارة ، مما قد يغير جرعة المبيدات الحشرية المطبقة. يساعد خلط المحاليل والسماح لها بالدفء إلى درجة حرارة الغرفة على ضمان الاتساق عند استخدام محاليل المبيدات الحشرية.
  2. حدد جميع الأدوات والمواد اللازمة لفحص التطبيق الموضعي في خيمة مناولة الحشرات كما هو مشار إليه في جدول المواد.
  3. قم بتنظيف برميل المحقنة والإبرة باستخدام الأسيتون التحليلي من خلال إكمال 5 غسلات لكل أليكوت الأسيتون. أكمل هذا مع 5 أليكوتات منفصلة لما مجموعه 25 غسلة. انظر الشكل التكميلي S2 للاطلاع على أجزاء ماصة المحاقن والمكررات.
    1. حدد 5 أنابيب طرد مركزي دقيق مع 0.5 مل من الأسيتون لكل منها.
    2. املأ برميل المحقنة ب 0.025 مل من الأسيتون من الأنبوب الأول ثم اطرد الأسيتون إلى حاوية نفايات عن طريق الضغط بسرعة على المكبس. كرر أربع مرات أخرى لإكمال ما مجموعه خمس غسلات من الأسيتون من نفس أليكوت الأسيتون. ثم املأ برميل المحقنة بالكامل بالهواء واطرد الهواء وبقايا الأسيتون المحتملة في حاوية النفايات. كرر مرتين أخريين لإكمال ثلاث "غسلات" بالهواء.
    3. كرر الخطوة 3.3.2 للأنابيب الأربعة المتبقية من الأسيتون.
    4. قم بإنشاء جيب هوائي داخل البرميل بين مكبس المحقنة والجزء العلوي من الإبرة عن طريق سحب المكبس قليلا إلى البرميل (~ 5 مم).
      ملاحظة: يحمي هذا الجيب الهوائي المكبس من ملامسة محاليل المبيدات الحشرية ويقلل من ترحيل المبيدات الحشرية.
    5. ضع المحقنة جانبا حتى تصبح جاهزة للاستخدام الموضعي.
  4. قم بإنشاء مفتاح يحتوي على الجرعات المراد تطبيقها وتعيين معرفات عشوائية بعد مولدات أرقام أو أحرف عشوائية (انظر الملف التكميلي 1).
  5. قم بتسمية أكواب الحيازة البلاستيكية بمعرف عشوائي لتقييم وفيات المكفوفين.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا وإعادة تشغيله في وقت لاحق. إذا مرت أكثر من بضع ساعات أثناء التوقف المؤقت ، يتم تشجيعها على تكرار الخطوة 3.3 للتأكد من نظافة المحقنة ووضع محاليل المبيدات الحشرية مرة أخرى في الفريزر حتى حوالي ساعة قبل جرعات الحشرات ثم تكرار الخطوة 3.1.

4. إعداد عينات للفحص الحيوي الموضعي. انظر الشكل 1 للاطلاع على نظرة عامة إجرائية

  1. فرز ووزن البعوض
    1. باستخدام شفط مدعوم بالشفط من الاستنشاق ، قم بشفط العدد المطلوب من البعوض البالغ من العمر 3-5 أيام اللازم للفحص ، بما في ذلك فائض لحساب الأفراد المتضررين. انقل البعوض إلى أنبوب مخروطي (حتى 100 بعوضة لكل أنبوب) عن طريق وضع طرف الشافط في الأنبوب مع القطن الملفوف حول الطرف والزفير بلطف والنقر على الشافط. استخدم القطن لتوصيل الأنبوب عند إزالة طرف الشافطة ثم قم بتغطيته بالغطاء. تجنب ملء الشافطة والأنابيب بالكثير من البعوض في وقت واحد ، لأن هذا يضيف ضغطا إضافيا على البعوض ويمكن أن يسبب الوفاة.
    2. اهدم البعوض لفترة وجيزة في الأنابيب عن طريق وضعها لمدة لا تقل عن 10 دقائق عند 4 درجات مئوية أو دفنها تحت الجليد في صينية ثلج.
      ملاحظة: يمكن احتجاز البعوض عند درجة حرارة 2 درجة مئوية لعدة ساعات مع الحد الأدنى من الوفيات29 ؛ ومع ذلك ، فمن الأفضل تقليل المدة التي يكون فيها البعوض على الجليد لتقليل الآثار السلبية المحتملة.
    3. انقل البعوض الذي تم إسقاطه إلى خيمة مناولة الحشرات وقم بإخراج البعوض بعناية إلى صينية بلاستيكية (على سبيل المثال ، طبق بيتري) موضوعة على الجليد. صب حوالي 50 بعوضة فقط في المرة الواحدة لضمان لمس كل منها للصينية الباردة تحتها وبقائها محطمة.
    4. فرز البعوض حسب الجنس عن طريق التقاطه بلطف من الساق (الأجنحة) (أو الأجنحة) مع ملقط ووضع كل جنس في كوب عقد منفصل. عد عدد البعوض من كل جنس أثناء الفرز وتوقف عند الوصول إلى العدد المطلوب. أثناء الفرز، قم بإزالة أي بعوض مصاب (على سبيل المثال، الساقين المفقودتين) أو كبير جدا (على سبيل المثال، تضخم البطن بشكل غير طبيعي) أو صغير (يمكن تمييزه بسهولة بالعين المجردة على أنه أصغر من متوسط حجم البعوض لتلك المجموعة).
      ملاحظة: التعامل مع البعوض بواسطة الزوائد يقلل من الأضرار الهيكلية لأجسامهم الأولية الناعمة (على سبيل المثال ، البطن).
    5. سجل وزن كل كوب من البعوض باستخدام مقياس تحليلي بدقة 0.1 ملغ.
      1. ضع كوبا فارغا مع طبق بتري كغطاء على الميزان وقم بتغطية الميزان. صب البعوض في الحاوية ، وضع الغطاء في الأعلى ، ووضع الحاوية على المقياس.
      2. سجل الوزن المشترك وعدد العينات على ورقة النتائج (انظر الملف التكميلي 2). ضع كوب العينات على الفور مرة أخرى على الجليد لإبقائها مشلولة.
      3. كرر الخطوات 4.1.5.1-4.1.5.2 حتى يتم وزن جميع أكواب العينات.
    6. قسم البعوض المحضر إلى مجموعات من 20-25 في أكواب منفصلة موضوعة على الجليد تحمل بطاقات هوية عشوائية. عند نقل البعوض ، تهدف إلى تقليل الإجهاد والأضرار الجسدية الناجمة عن الملقط. من الناحية المثالية ، التقط البعوض باستخدام ملقط 1-2 مرات فقط: مرة واحدة للفرز / الوزن ومرة ثانية محتملة للنقل إلى الكؤوس التجريبية.
      ملاحظة: العدد المثالي للبعوض لكل كوب هو 20-25 ، وهو ما يكفي للتكاثر ، وهو معقول لتقييم معدل الوفيات ، ويجب ألا يؤدي إلى الإجهاد / الموت الناجم عن الكثافة في الكأس.
  2. فرز ووزن ذباب الفاكهة
    1. تخدير الذباب باستخدام CO2 لمدة 7 ثوان.
      ملاحظة: إذا تعرض الذباب لثاني أكسيد الكربون2 لأكثر من 7 ثوان ، فقد يواجه مشكلة في الزحف والطيران عندما يستيقظ30.
    2. صب الذباب على كيس ثلج ملفوف بورق مقاعد البدلاء واستخدم فرشاة طلاء ذات رأس رفيع لفصل الذكور والإناث وعدهم.
    3. استخدم فرشاة الطلاء لالتقاط الذباب المختار بلطف ووضعه في زجاجة مرق نظيفة وفارغة. اختر أعدادا متساوية من ذكور وإناث ذباب الفاكهة (على سبيل المثال ، 15 ذكرا و 15 أنثى) وقم بتسمية زجاجات المخزون باسم السلالة وإجمالي ذبابة الفاكهة (على سبيل المثال ، كانتون-S ، 30 ذبابة).
      ملاحظة: من المهم أن يكون لديك أعداد متساوية من ذباب الفاكهة الإناث والذكور لأن ذباب الفاكهة الذكور يمكن أن يواجه عدوانا متزايدا تجاه بعضهم البعض بعد إزالته من وجود الإناث31. لذلك ، لتجنب الوفيات أو الإصابات غير الناجمة عن المبيدات الحشرية ، من الأفضل أن يكون لديك أعداد متساوية من الذكور والإناث (أو حذف ذباب الفاكهة الذكور تماما).
    4. سجل وزن كل زجاجة من ذباب الفاكهة باستخدام مقياس تحليلي.
      1. ضع قارورة فارغة (تحمل علامة بمعرف عشوائي ، ارجع إلى الخطوة 3.4) مع طبق بتري كغطاء على الميزان وقم بتغطية المقياس.
        ملاحظة: يوصى باستخدام القوارير الزجاجية مع ذباب الفاكهة لأنها تقلل بشكل كبير من الساكنة.
      2. تخدير زجاجة ذباب الفاكهة المقابلة للمعرف العشوائي للقارورة باستخدام CO2 لمدة 7 ثوان.
      3. صب ذباب الفاكهة على ورق الوزن واستخدم الورق كقمع لإدخال الذباب في القارورة. ضع غطاء طبق بتري فوق قارورة ذباب الفاكهة وضعه على الميزان.
      4. سجل الوزن المشترك وعدد العينات على ورقة النتيجة ثم ضع على الفور قارورة ذباب الفاكهة في صينية من الجليد ، مع بقاء الغطاء في الأعلى لمنع الذباب من الهروب.
      5. كرر الخطوات 4.2.4.1-4.2.4.4 لكل زجاجة من ذباب الفاكهة.
  3. عند اكتمال الخطوات المذكورة أعلاه ، انتقل على الفور إلى القسم التالي.

5. عينات الجرعة

  1. تحميل حقنة مع تركيز المبيدات الحشرية المناسبة. ابدأ بالجرعة الأقل تركيزا واعمل على الجرعة الأكثر تركيزا مع كل مجموعة من الكائنات الحية. لمنع الهدر ، قم فقط بتحميل المحقنة بالحجم المطلوب من المبيدات الحشرية بالإضافة إلى 2 ميكرولتر إضافي موصى به.
  2. ضع العينات على ورق (أوراق) الوزن الموضوعة فوق صينية على الجليد. افصل العينات القريبة من بعضها البعض باستخدام فرشاة طلاء نظيفة وخالية من المبيدات الحشرية أو قطعة قطن للسماح بسهولة الوصول إلى كل عينة للحصول على الجرعات. بالنسبة للبعوض ، استخدم فرشاة الطلاء أيضا للتأكد من أن كل عينة موضوعة على ظهرها وأن سطحها البطني متجه لأعلى.
  3. باستخدام المحقنة ، ضع قطرة واحدة من محلول المبيدات الحشرية (أو الأسيتون للمكافحة) على منطقة الصدر والبطن البطنية للبعوض والظهرية لذباب الفاكهة. ضع قطرة 0.2 ميكرولتر (والتي تتطلب حقنة 10 ميكرولتر) للحشرات الأصغر حجما مثل ذباب الفاكهة وقطرة 0.5 ميكرولتر (التي تتطلب حقنة 25 ميكرولتر) للبعوض.
    ملاحظة: لا تختلف حساسية المبيدات الحشرية اختلافا كبيرا بين أجزاء الجسم الأولية (مثل الرأس والصدر والبطن) مقارنة بالزوائد (مثل الأجنحة أو الساقين أو خرطوم)32. لذلك ، لا يجب أن يكون موقع التطبيق دقيقا طالما يتم تطبيق قطرة الجرعة على الجسم الأساسي. يتم اختيار منطقة الصدر والبطن البطنية للبعوض لأنها غالبا ما تقع على جانبها الظهري عند سقوطها ، في حين يتم اختيار الظهرية لذباب الفاكهة لأنها غالبا ما تستلقي على جانبها البطني عند سقوطها. تساعد خصوصية موقع التطبيق المتناقصة هذه على زيادة إنتاجية هذه الطريقة.
  4. صب العينات على الفور مرة أخرى في الكوب البلاستيكي المسمى وقم بتغطية الكوب بالشباك وشريط مطاطي. ضع الكوب في صينية تعليق ولاحظ على الكوب أي عينات قتلت أو تضررت أو هربت في هذه العملية (لاستبعادها في العد النهائي للعينات في ذلك الكوب). بالنسبة للكوب الأول ، سجل الوقت الذي تكتمل فيه الجرعات.
  5. استبدل ورقة (أوراق) الوزن التي توضع عليها العينات لتجنب التلوث بالمبيدات الحشرية بين الجرعات.
  6. كرر الجرعات لكل كوب حتى يتم إعطاء جميع العينات بتركيزات المبيدات الحشرية المناسبة وسجل وقت الانتهاء عندما تم إعطاء جميع العينات.
  7. قدم محلول السكروز بنسبة 10٪ لكل كوب عبر كرة قطنية مبللة واترك الأكواب جانبا حتى يتم تقييم معدل الوفيات في اليوم التالي. تخزين البعوض في 27 ± 1 درجة مئوية مع 75 ± 5 ٪ الرطوبة النسبية 5 وتطير الفاكهة في 23 ± 1 درجة مئوية مع 60 ±5 ٪ الرطوبة النسبية.
    ملاحظة: كن حذرا أثناء الضغط على كرات القطن لتجنب التشبع الزائد أو التشبع. يجب أن تكون كرات القطن رطبة ولكن لا تقطر. يمكن أن يؤدي تنقيط ماء السكر في الكوب إلى وفاة العينات وبالتالي يؤثر على تقييم وفيات المبيد الحشري.

6. تقييم معدل الوفيات

  1. تسجيل وفيات العينات في 24 ساعة بعد بدء التعرض للمبيدات الحشرية. تصنيف البعوض على أنه على قيد الحياة إذا كان بإمكانه الطيران والاحتفاظ بنفسه في وضع مستقيم ؛ كميتين إذا كانوا غير متحركين أو ترنح (غير قادرين على الوقوف أو الإقلاع للطيران) ، كما هو موضح من قبل منظمة الصحة العالمية6. اتبع نفس تقييم معدل الوفيات لذباب الفاكهة 8,33.
    ملاحظة: لتقييم الوفيات المتأخرة، يمكن تقييم معدل الوفيات بعد 48 و 72 ساعة مع التغيرات اليومية في مياه السكر.
  2. بعد تسجيل الوفيات، ضع جميع أكواب العينات في كيس محتو في الفريزر لمدة 1 ساعة على الأقل لضمان موت جميع العينات قبل التخلص منها أو استخدامها لاحقا (على سبيل المثال، التحليل الجزيئي أو الكيميائي).

7. إجراء النسخ المتماثلة

  1. كرر الخطوات من 3 إلى 6 على مجموعة جديدة من العينات ، مع الحرص على إجراء النسخ المتماثلة في نفس الوقت كل يوم ، حيث يمكن أن تتغير قابلية المبيدات الحشرية اعتمادا على الوقت من اليوم34.
  2. ضمان ما لا يقل عن 3 تكرارات لكل تركيز للتقدير الدقيق للجرعة القاتلة التي تقتل 50٪ من العينات (LD50). قم بتضمين المزيد من النسخ المتماثلة إذا لوحظ مستوى عال من التباين.
  3. أكمل التحليل بعد جمع جميع البيانات.

8. تحليل النتائج

  1. سجل البيانات في برنامج جدول بيانات واستخدم مفتاح المعرف العشوائي لكشف قناع البيانات (الخطوة المرجعية 3.4). احفظ البيانات كملف نصي (انظر مثال البيانات في الملف التكميلي 3) للتحليل في البرنامج الإحصائي R35 (انظر مثال رمز R في الملف التكميلي 4) أو أي برنامج آخر من اختيارك36.
  2. داخل البرنامج ، أكمل التحليل التالي. راجع الملف التكميلي 4 للحصول على مثال على رمز R.
    1. احسب جرعة المبيدات الحشرية (ng) لكل كتلة عينة (mg) بعد Eq (3) أدناه:
      Equation 3 (3)
    2. حساب معدل الوفيات وتطبيق صيغة أبوت 37 لتصحيح معدل الوفيات بالنسبة للوفيات التي لوحظت في كل عنصر تحكم37. بدلا من ذلك ، استخدم صيغة شنايدر-أوريلي (1947) لتصحيح معدل الوفيات38. باستخدام أي من الصيغتين، تطبيق التصحيح على جميع البيانات بغض النظر عن الوفيات في كل مكافحة، كما هو موضح سابقا37 ونفذت39، ما لم تكن بيانات المكافحة مرتفعة بشكل غير عادي (انظر المناقشة أدناه).
      ملاحظة: تقوم صيغة أبوت والبدائل المكافئة لها، مثل صيغة شنايدر-أوريللي، بتعديل قيم الوفيات بشكل متناسب مع مدى الوفيات غير الملحوظة في الضوابط ولن تسبب انخفاضا في معدل وفيات الكؤوس التي كان لديها معدل وفيات بنسبة 100٪. لمزيد من المعلومات، راجع المراجع المذكورة لهذه الصيغ.
    3. تحويل بيانات الوفيات المصححة إلى قيم بروبيت (وحدة احتمالية)40 وإجراء انحدار خطي بين جرعة المبيدات الحشرية وبيانات الوفيات المحولة. استخدم اختبار chi-square لتقييم مدى ملاءمة النموذج (النماذج) الخطية.
      ملاحظة: تتم إزالة قيم الوفيات من 0 (0٪ معدل الوفيات) أو 1 (100٪ معدل الوفيات) من البيانات قبل إكمال تحويل الاحتمال. هذا ضروري بسبب طبيعة تحول probit. على هذا النحو ، لن تتضمن البيانات البيانية عناصر تحكم إيجابية أو سلبية أو أي بيانات أخرى أدت إلى وفيات بنسبة 0٪ أو 100٪ (بعد تطبيق تصحيح أبوت).
    4. احسب فواصل الثقة LD50 و 95٪ (CIs) لكل سلالة عينة و / أو عدد السكان و / أو الجنس باتباع الطرق المنشورة سابقا 39,41,42.
    5. ملاحظة: إذا لم تتداخل CIs 95٪ من سلالتين ، فإن السلالات لها استجابات جرعة مختلفة بشكل كبير.
    6. إذا كان ذلك ممكنا، احسب نسب المقاومة (RRs) بقسمة LD 50 من سلالة الاهتمام على LD50 من سلالة المرجع/التحكم.

Figure 1
الشكل 1: مخطط بروتوكول مقايسة التطبيق الموضعي. يبدأ بروتوكول فحص التطبيق الموضعي ب (أ) فرز العينات على الجليد ، يليه (ب) وزن العينات على مقياس تحليلي ، (ج) عينات الجرعات بمحلول (حلول) المبيدات الحشرية ، و (د) فترة انتظار 24 ساعة بعد التعرض للمبيدات الحشرية مع الوصول إلى محلول السكروز بنسبة 10٪ ad libitum (عبر كرة قطنية منقوعة) ، تليها تقييم الوفيات. تشير الأسهم الحمراء إلى موقع تطبيق المبيدات الحشرية المستهدفة للبعوض (يسار) وذباب الفاكهة (يمين). لاحظ أن الصورة ليست على نطاق واسع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Representative Results

تتميز هذه النتائج التمثيلية بسلالتين مختلفتين من Ae. aegypti و Rockefeller (ROCK) وسلالة ميدانية معزولة من فلوريدا مع طفرات مقاومة الضربة القاضية المعروفة F1534C و V1016I (النمط الجيني IICC). بالإضافة إلى ذلك ، يتم عرض ذبابة الفاكهة melanogaster (كانتون: سلالة S).

يوضح الشكل 2 والشكل 3 استجابة الجرعة لكل كائن حي حسب السلالة والجنس الذي تم اختباره وفقا للبروتوكول أعلاه. وبما أنه لم يلاحظ أي فروق بين منحنيات الاستجابة للجرعة لدى ذكور وإناث البعوض داخل كل سلالة (t = 1.70، p = 0.098 ل ROCK و t = 0.64، p = 0.527 ل IICC)، تم تجميع البيانات من كلا الجنسين داخل كل سلالة من سلالات البعوض. ويبلغ LD 50 النسبي الشامل ل ROCKوIICC 0.008 نانوغرام/ملغ (مجال الموثوقية 95٪: 0-0.104) و 0.336 نانوغرام/ملغ (مجال الموثوقية 95٪: 0.235-0.438)، على التوالي. لا تتداخل CIs 95٪ من هذه القيم ، مما يشير إلى استجابات جرعات مختلفة بشكل كبير من السلالات. RR من سلالة IICC (بالنسبة لسلالة ROCK) هو 41.7 ، والتي وفقا لمنظمة الصحة العالمية ، تعتبر مقاومة للغاية5. بالنسبة لذباب فاكهة كانتون-S ، فإن LD50 النسبي للكتلة هو 0.213 نانوغرام / ملغ (مجال الموثوقية 95٪: 0-0.490).

Figure 2
الشكل 2: البيانات التمثيلية للبعوض باستخدام المقايسة الحيوية للتطبيق الموضعي. بيانات الاستجابة للجرعة التمثيلية من الفحص الحيوي للتطبيق الموضعي باتباع البروتوكول المذكور أعلاه باستخدام الدلتامثرين والبعوض: (أ) سلالات الإناث Ae. aegypti ROCK (n = 880) و IICC (n = 550) ، (B) الذكور Ae. aegypti ROCK (n = 880) و IICC (n = 569). وتراوحت تركيزات اختبار الدلتامثرين بين 0.00075 نانوغرام/ميكرولتر و9.68705 نانوغرام/ميكرولتر، وتنعكس جرعة الدلتامثرين المطبقة (ng) لكل متوسط كتلة البعوض (ملغ) على المحور x. يظهر معدل الوفيات كنسبة على المحور y. يمثل الخط الأسود من خلال كل مجموعة نقطة بيانات الإجهاد والانحدار الخطي الخاص بالجنس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: البيانات التمثيلية لذباب الفاكهة باستخدام المقايسة الحيوية للتطبيق الموضعي. بيانات الاستجابة للجرعة التمثيلية من الفحص الحيوي للتطبيق الموضعي باتباع البروتوكول المذكور أعلاه باستخدام الدلتامثرين وذباب الفاكهة: سلالة D. melanogaster Canton-S (n = 1014). تراوحت تركيزات اختبار الدلتامثرين من 0.00499 إلى 5.02876 نانوغرام/ميكرولتر، وتنعكس جرعة الدلتامثرين المطبقة (ng) لكل متوسط كتلة ذبابة الفاكهة (ملغ) على المحور x. يظهر معدل الوفيات كنسبة على المحور y. يمثل الخط الأسود الانحدار الخطي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي S1: خيمة مناولة الحشرات على الطاولة. يتم استخدام خيمة مناولة الحشرات على الطاولة لتسهيل التقاط البعوض أو الذباب الهارب أثناء فحص التطبيق الموضعي. الهيكل مغلق في A ومفتوح في B. تم بناء هذا الهيكل باستخدام أنابيب PVC ونسيج شبكي ناعم. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S2: وحدة قضيب المحاقن والمكررات. وحدة قضيب المحاقن والمكرر المستخدمة لجرعات الحشرات. تشمل الأجزاء الرئيسية 1) إبرة ، 2) برميل حقنة ، 3) مكبس ، 4) مكرر ، و 5) زر مكرر. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 1: البرنامج النصي للتوزيع العشوائي: برنامج نصي عشوائي لإنشاء تسميات غير متحيزة لجميع أكواب كل تجربة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: ورقة درجة الوفيات: ورقة درجة الوفيات للمساعدة في تقييم الوفيات. تتضمن الورقة أيضا أماكن لتسجيل جميع المعلومات المهمة الأخرى لتسجيلها ، كما هو مشار إليه في البروتوكول ، مثل أوقات بدء وانتهاء تطبيق المبيدات الحشرية. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 3: أمثلة على بيانات الوفيات: مثال على ملف البيانات المستخدم لإنشاء الشكل 2. أوصاف عنوان العمود هي كما يلي: "id" = رمز تعريف لكل نقطة بيانات. "الأنواع" = اسم النوع (على سبيل المثال، الزاعجة المصرية)؛ "مبيد حشري" = اسم المبيد الحشري المطبق موضعيا (على سبيل المثال، الدلتاميثرين)؛ "سلالة" = اسم سلالة البعوض (على سبيل المثال ، ROCK) ؛ "التاريخ" = تاريخ بدء التطبيق الموضعي ؛ "الجنس" = جنس البعوض. "العمر" = عمر البعوض (الشباب = 3-5 أيام ؛ العمر = 4 أسابيع) ؛ "total.mosq" = العدد الإجمالي للبعوض الذي تم وزنه دفعة واحدة ؛ "الوزن" = الوزن (ملغ) لجميع البعوض داخل دفعة ؛ "التركيز" = تركيز المبيدات الحشرية (ميكروغرام/مل)؛ "حقنة" = حجم القطيرات (مل) من حقنة ؛ "الجرعة" = كمية العنصر النشط للمبيدات الحشرية المطبقة على كل بعوضة (نانوغرام) ؛ "المجموع" = عدد البعوض في كل كوب ؛ "ميت" = عدد البعوض الميت في كل كوب. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

ملف تكميلي 4: رمز تحليل R: مثال على التعليمات البرمجية R التي يمكن استخدامها لإكمال تحليل Probit (كما هو موضح في الخطوة 8 من البروتوكول). يمكن استخدام النتائج التمثيلية (التي يمكن الوصول إليها عبر ملف بيانات المثال التكميلي) مع رمز R هذا. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

تقدم هذه الورقة بروتوكولا معدلا لفحص التطبيق الموضعي للبعوض وذباب الفاكهة. ويمكن تكييف هذا الإجراء بسهولة لاستخدامه في الميدان ومع الكائنات الحية الأخرى لأنه يتطلب الحد الأدنى من المعدات المتخصصة. فيما يلي الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول ، والتعديلات المحتملة ، ونصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها ، وقيود الطريقة ، وأهمية هذه الطريقة.

الخطوات الحاسمة في البروتوكول: هناك ثلاث خطوات حاسمة في البروتوكول ، إذا تم إكمالها بشكل غير صحيح ، يمكن أن تؤثر بشكل كبير على نتائج الفحص الحيوي: دقة تركيز المبيدات الحشرية ، وضربة قاضية للعينات ، وتقييم الوفيات.

دقة تركيز المبيدات الحشرية:
من المهم للغاية الحصول على حلول دقيقة للمبيدات الحشرية للحصول على منحنيات استجابة الجرعة القابلة للتكرار ونتائج ذات مغزى. النهج الحجمي لإعداد محلول المبيدات الحشرية هو أكثر شيوعا في الأدبيات لكل من المقايسة الحيوية لزجاجة CDC7 والتطبيقات الموضعية 13،14،43. ومع ذلك ، فإن نهج الجاذبية الموصوف هنا هو بطبيعته أكثر دقة بسبب النظر في درجة الحرارة من خلال تضمين كثافة (خاصة بدرجة الحرارة) ، مما يؤدي إلى إعداد صياغة أكثر دقة.

ضربة قاضية عينة:
يعد هدم العينات مكونا حاسما في هذه الطريقة ويسمح بالإدارة الدقيقة للمبيد الحشري وقياسات الوزن. ومع ذلك ، فإن هدم الكائنات الحية يحتوي حتما على خطر الإجهاد البدني والضرر ، كما هو موضح سابقا30. لذلك ، كن حذرا ويقظا عند هدم العينات لضمان i) يتم هدم كل عينة لفترة مماثلة ، ii) يتم الاحتفاظ بطول الضربة القاضية إلى الحد الأدنى ، و iii) يتم الحفاظ على طريقة الضربة القاضية متسقة عبر جميع العينات. بالإضافة إلى ذلك ، ينصح باختبار طريقة الضربة القاضية بشكل منفصل ، قبل استخدام المبيدات الحشرية ، للتأكد من نجاح الطريقة وعدم الحث على التحكم في الوفيات التي تزيد عن 10٪. قد يستغرق الاختبار الأولي وقتا أطول للمستخدم عديم الخبرة ، مما يؤدي إلى أوقات أطول للضربة القاضية. لذلك ، كن حذرا عند تفسير نتائج الفحوصات الأولى.

تقييم الوفيات:
يمكن أن يكون تقييم الوفيات أمرا صعبا ، خاصة عندما لا يقتل المبيد الحشري تماما ولكنه يهدم أو يشوه البعوضة أو الذبابة فقط. لذلك ، من المهم أن تكون على دراية بكيفية تأثير المبيد الحشري على الكائن الحي المستهدف وأن يكون لديك تعريف واضح للكائنات الحية "الميتة" (أو المحطمة) قبل البدء. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى بأن يقوم نفس الشخص بتقييم الوفيات بين الجرعات والتكرارات لتقليل الاختلاف.

تعديلات البروتوكول: يمكن تطبيق العديد من التعديلات الموضحة أدناه على هذا البروتوكول لتحسين تنوعه وإمكانية الوصول إليه.

تكييف الفحص مع الحشرات الأصغر أو الأكبر حجما:
عند استخدام عينات أصغر أو أكبر ، ينصح بتطبيق كمية جرعة أصغر أو أكبر من المبيدات الحشرية ، على التوالي. على سبيل المثال ، قمنا بتكييف بروتوكول البعوض مع ذباب الفاكهة عن طريق تقليل جرعة 0.5 ميكرولتر إلى جرعة 0.2 ميكرولتر. تأكد من اختيار حجم المحقنة الصحيح لحجم الجرعة المختارة.

تكييف الفحص مع الحشرات الميدانية:
عند استخدام الحشرات الميدانية ، قد يكون هناك المزيد من الاختلاف في حجم الحشرات. لذلك ، يوصى بوزن الحشرات في مجموعات أصغر (على سبيل المثال ، لكل كوب) بدلا من وزنها كمجموعة كبيرة (على سبيل المثال ، جميع الحشرات المستخدمة في تجربة واحدة). هذا يمكن أن يساعد في التقاط التباين المحتمل في قابلية المبيدات الحشرية المرتبطة بالاختلافات في كتلة الحشرات الميدانية.

تعديلات المعدات:
خيمة مناولة الحشرات: يمكن إكمال جرعات العينة تحت خيمة مناولة الحشرات التي يتم بناؤها ببساطة باستخدام أنابيب PVC وشبكة البعوض. يمكن أن يكون هذا بديلا للغرفة المغلقة (على سبيل المثال ، الحشرية) ويساعد في القضاء على التلوث المحتمل بالمبيدات الحشرية في المناطق التي قد تحدث فيها تربية الحشرات. هذه الخيمة التي تتعامل مع الحشرات سهلة البناء ومنخفضة التكلفة (~ 70 دولارا). بدلا من ذلك ، يمكن شراء قفص مناولة الحشرات (~ 425 دولارا).

طاولة التبريد: يمكن استخدام أكياس الثلج أو صواني الثلج لهدم العينة و / أو الحفاظ على العينة مهدمة.

الحاضنة: يوصى باستخدام الحاضنات لتربية العينة والاحتفاظ بالعينة لمدة 24 ساعة بعد المعالجة بالمبيدات الحشرية. إذا لم تكن الحاضنة متوفرة ، فيمكن إنشاؤها. تشمل المعدات اللازمة لبناء الحاضنة حاوية معزولة ، ومرطب ، وكابلات حرارية ، ووحدة تحكم في الرطوبة ودرجة الحرارة ، وضوء ، والذي يجب أن يضيف ما يصل إلى تكلفة إجمالية تبلغ ~ 170 دولارا ، بعد الطرق السابقة44 والتوسع فيها.

حمل الكؤوس: على الرغم من أن الأكواب البلاستيكية تستخدم لفرز العينة المعالجة والاحتفاظ بها ، إلا أن الأكواب الورقية المبطنة بالشمع أو الحاويات الزجاجية ستكون بدائل مناسبة.

تعديل الكائن الحي ومرحلة الحياة:
هذه الطريقة قابلة للتكيف للغاية للاستخدام مع النواقل الأخرى والحشرات و / أو المفصليات مثل Culex quinquefasciatus mosquito 32 ، وذباب المنزل32 ، والصراصير45 ، وكذلك مراحل الحياة غير البالغة ، مثل يرقات البعوض46.

تعديل موقع التطبيق الموضعي:
تصف هذه الطريقة تطبيق المبيد الحشري على منطقة الصدر والبطن البطنية للبعوض (والظهرية لذباب الفاكهة). ومع ذلك، يمكن استخدام مواقع التطبيقات الأخرى طالما أن موقع التعرض متسق. الاتساق مهم لأن حساسية المبيدات الحشرية يمكن أن تختلف بناء على موقع التطبيق32.

نصيحة استكشاف الأخطاء وإصلاحها: تحتوي هذه الطريقة على العديد من الخطوات التي تمثل تحديا في البداية. فيما يلي بعض المشكلات الأكثر شيوعا التي قد يواجهها المرء.

تسرب / تبخير حلول المبيدات الحشرية:
عادة ما تذوب المبيدات الحشرية في الأسيتون ، وهو مركب شديد التقلب. وهذا يعني أن الأسيتون يتبخر بسرعة في درجة حرارة الغرفة، مما يزيد من تركيزات المبيدات الحشرية بمرور الوقت. إذا بدا أن محاليل المبيدات الحشرية تتسرب أو تتبخر ، فأعد تشكيل المحاليل ، وتأكد من أن غطاء الأنبوب قيد التشغيل بإحكام ، وتحقق مرة أخرى من اتباع بروتوكولات التخزين بشكل صحيح (على سبيل المثال ، يتم استخدام parafilm ، ويتم تخزين الأنابيب في وضع مستقيم). إذا استمر التسرب، فحاول ملء الأنابيب بحجم أقل للسماح بمساحة أكبر للتغيير في حجم الأسيتون الذي يختبره في درجات حرارة مختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كنت تستخدم الأسيتون كمذيب ، فتأكد من تصنيف الأنابيب لتخزين الأسيتون (على سبيل المثال ، FEP و TFE و PFA البلاستيكية). في حالة استخدام مبيدات حشرية كارهة للماء ، قم بتخزين المحاليل في قوارير زجاجية (حيث تلتصق المبيدات الحشرية الكارهة للماء بالزجاج أقل من البلاستيك). من الممارسات الجيدة أيضا وضع علامة على الغضروف المفصلي للمحلول قبل التخزين لمراقبة التبخر.

انجراف الوزن على الميزان الدقيق عند وزن الكائنات الحية:
إذا كانت قراءة الوزن على الميزان تنجرف (ترتفع أو تنخفض ببطء) ، فقد يكون هذا بسبب الثبات. غالبا ما يحدث الانجراف عند وزن الكائنات الحية في العناصر البلاستيكية ، حيث يمكن للبلاستيك بسهولة الاحتفاظ بشحنة ثابتة. لتجنب ذلك ، يمكن وضع ورقة وزن أسفل الحاوية البلاستيكية التي يتم وزنها ، أو يمكن استخدام حاوية غير بلاستيكية مثل الزجاج.

نتائج الوفيات غير الطبيعية:
هناك العديد من الطرق التي قد تبدو بها نتائج الوفيات غير طبيعية ، مثل ملاحظة ارتفاع معدل الوفيات في الضوابط أو ارتفاع / انخفاض معدل الوفيات في جميع جرعات المبيدات الحشرية. راجع الحالات التالية لاستكشاف أخطاء كل سيناريو وإصلاحها.

ارتفاع معدل الوفيات السيطرة
إذا كان هناك معدل وفيات مرتفع في المجموعة الضابطة (10٪ أو أكثر) ، فقم بتقييم طريقة الضربة القاضية وطول الوقت الذي يتم فيه هدم العينات. إذا كان ذلك ممكنا ، قم بتقصير طول الفترة الزمنية التي يتم فيها هدم العينات. تشمل العوامل المحتملة الأخرى التي يجب مراعاتها لارتفاع معدل الوفيات في الضوابط i) التحقق مما إذا كانت إعدادات الحاضنة صحيحة - يمكن أن تؤدي درجات الحرارة و / أو الرطوبة غير الطبيعية إلى زيادة الوفيات. يجب التحقق من درجة الحرارة والرطوبة باستخدام مسجل بيانات مستقل. ب) تقييم التعامل مع الحشرات. يمكن أن يؤدي التعامل مع الحشرات أكثر من اللازم أو تقريبا إلى ارتفاع معدل الوفيات. iii) التحقق مما إذا كان لا يوجد تلوث بالمبيدات الحشرية في الأسيتون 100٪ المستخدم لعلاج المجموعة الضابطة أو على الأجهزة. استبدل الأسيتون ونظف جميع الأدوات بالأسيتون أو الإيثانول. تجنب التلوث عن طريق استبدال القفازات بشكل متكرر ومنع الانسكاب وأدوات التنظيف. لاحظ أنه في الملف التكميلي 3 ، مات اثنان كحد أقصى من البعوض داخل أكواب التحكم (الأسيتون فقط). لا يعتبر هذا المستوى من الوفيات مرتفعا (فهو أقل من 10٪) ، وبالتالي ، لم يكن هناك سبب للقلق.

ارتفاع معدل الوفيات في جميع المجموعات المعرضة (ولكن ليس في المجموعات الضابطة)
استخدم تركيزات أقل من المبيدات الحشرية أو كميات جرعات أصغر للاختبار. قد تكون الجرعات المستخدمة أعلى من الحد الأدنى للجرعة التي لن تحفز الوفيات. استخدم عدة تخفيفات 10 أضعاف لتحديد نطاق الجرعة الصحيح ، واستبعاد التلوث. لتجنب التلوث ، ابدأ الجرعات بأقل تركيز واعمل على تحقيق أعلى تركيز. بالإضافة إلى ذلك ، تأكد من تنظيف جميع المعدات المستخدمة بانتظام باستخدام الأسيتون و / أو الإيثانول ، والجرعات المطبقة على العينة صغيرة جدا ، وحتى أدنى تلوث متقاطع يمكن أن يؤثر على النتائج.

انخفاض معدل الوفيات في جميع الفئات المعرضة
استخدام تركيزات أعلى من المبيدات الحشرية. قد تكون الجرعات المستخدمة منخفضة جدا بحيث لا تسبب وفيات بين السكان. لتحديد نطاق الجرعة الصحيح ، قم بتعريض العينات لعدة جرعات مركزة أكثر من 10 أضعاف. تأكد من أن محاليل المبيدات الحشرية لم تنته صلاحيتها أو تتحلل (ربما بسبب ارتفاع درجة الحرارة أو التعرض للضوء). إذا انتهت صلاحية المحاليل أو اشتبه في تدهورها، فأعد صياغة الحلول وتأكد من اتباع ظروف التخزين المناسبة.

معدل وفيات غير متسق بين التكرارات / الأيام
يمكن أن يؤثر الوقت من اليوم الذي تتعرض فيه الحشرات للمبيد الحشري على مستوى المقاومة المعبر عنها ، خاصة بالنسبة للمقاومة الأيضية34. كرر هذا البروتوكول خلال نفس الفترة الزمنية كل يوم لتجنب الوقت من اليوم كمتغير محتمل يساهم في التغيرات في معدل الوفيات. وتشمل العوامل المحتملة الأخرى التي تسهم في الوفيات غير المتسقة بين النسخ المتماثلة (أ) العينات التي يتم تربيتها بشكل تفاضلي بين التجارب. تأكد من أن جميع العينات من نفس الفئة العمرية ، وتربى في نفس درجة الحرارة وكثافة مماثلة وتوافر الغذاء. ب) تتحلل تركيزات المبيدات الحشرية بمرور الوقت أو تصبح أكثر تركيزا بسبب تبخر الأسيتون. أعد تصميم الحلول وتأكد من ظروف التخزين المناسبة. ج) تسجيل معدل وفيات غير متسق. تأكد من أن الشخص نفسه يسجل معدل الوفيات أو طور بروتوكولا واضحا لاستخدامه باستمرار عبر الفريق. استخدم الدرجات العمياء لتقليل التحيز في تسجيل الوفيات.

الحشرات الملتصقة بسطح صينية الفرز:
يتفاعل الأسيتون مع المواد البلاستيكية المستخدمة في هذا البروتوكول ، مثل أطباق Petri. من المرجح أن تلتصق العينة بالسطح إذا استخدمت الأسيتون على أطباق بتري أو الأسطح البلاستيكية المماثلة. يمكن تجنب هذا الالتصاق عن طريق بطانة درج الفرز بورق الوزن أو باستخدام صينية فرز غير بلاستيكية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي التكثيف على سطح البلاستيك في صينية الفرز أو حمل الأكواب إلى التصاق الحشرات بالتكثيف ، أو قد تكون العينة باردة جدا وربما تتجمد على السطح. اضبط طريقة الضربة القاضية لتقليل التكثيف مع منع العينات من أن تصبح باردة جدا / مجمدة (على سبيل المثال ، ضع ورق الوزن بين العينات ودرج الفرز البلاستيكي).

أخطاء تحليل R:
بمجرد جمع بيانات الوفيات ، قد تحدث مجموعة متنوعة من المضاعفات أثناء التحليل. السبب الأكثر شيوعا لعدم تمكن رمز R من إكمال الإجراءات الخاصة بملف البيانات هو أن تنسيق البيانات لا يتطابق مع التعليمة البرمجية (على سبيل المثال، عناوين الأعمدة و/أو الخلايا الفارغة). في حالة ظهور مضاعفات أكثر خطورة، ارجع إلى صفحات تعليمات R المضمنة في Rstudio35.

قيود طريقة التطبيق الموضعية الموضحة أعلاه:
امتصاص المبيدات الحشرية عن طريق طريقة التطبيق الموضعية لا يحاكي التعرض الطبيعي:
التطبيق الموضعي على الجسم الأساسي ليس الطريقة الطبيعية لامتصاص المبيدات الحشرية. في هذا المجال ، تمتص الحشرات في الغالب المبيدات الحشرية من خلال أرجلها على مدى طول الفترة الزمنية التي تكون فيها على اتصال بالسطح المعالج بالمبيدات الحشرية أو على أجنحتها من خلال جزيئات الهباء الجوي الصغيرة47,48 ، بدلا من التعرض السريع على السطح البطني. ومع ذلك، فإن التطبيق المباشر لجرعة معروفة من المبيدات الحشرية سيحدد بدقة استجابة النمط الظاهري للمبيدات الحشرية، اللازمة للدراسات الجينية والتطورية أو مقارنات قابلية المبيدات الحشرية عبر المكان أو الزمان. لذلك ، فإن هذا النهج مفيد لاختبار المقاومة التقنية ولكنه لن يقيس المقاومة العملية مباشرة (فعالية أداة التدخل الفعلية في الإعداد الميداني15). ومع ذلك، من المهم ملاحظة أن الطرق القياسية الحالية (مثل اختبارات أنابيب منظمة الصحة العالمية والمقايسات الحيوية لزجاجات مراكز السيطرة على الأمراض) لا يمكنها أيضا التقاط أو محاكاة التعرض للمبيدات الحشرية في هذا المجال أو محاكاته.

يمكن لمقايسات التطبيق الموضعي تقييم المبيدات الحشرية لامتصاص الاتصال فقط:
هذه الطريقة مخصصة للمبيدات الحشرية التي تعمل من خلال ملامسة وامتصاص المبيد الحشري وليس للاستخدام مع المبيدات الحشرية الفموية ، مثل حمض البوريك المستخدم عادة في طعوم السكر السامة الجذابة49.

أهمية الطريقة:
تتوسع طريقة التطبيق الموضعية في المعايير الراسخة للمقايسات الحيوية للمبيدات الحشرية عن طريق حساب الجرعة القاتلة (وليس التركيز) وقياس المقاومة التقنية (غير العملية)15. فيما يلي مزايا وعيوب هذه الطريقة على اختبارات قابلية المبيدات الحشرية الحالية.

حساب الجرعة المميتة:
تحدد هذه الطريقة الجرعة القاتلة من المبيد الحشري ، بدلا من التركيز القاتل الذي تستخدمه المقايسات الحيوية لمراكز السيطرة على الأمراض ومنظمة الصحة العالمية لتحديد الجرعة التمييزية11. الجرعة القاتلة أكثر أهمية لأنها كمية كمية من المبيدات الحشرية المعروفة بأنها تسبب الوفيات. في المقابل ، لا يأخذ التركيز القاتل في الاعتبار مقدار المبيدات الحشرية التي يكتسبها الكائن الحي بالفعل. عند استخدام حساب الجرعة المميتة ، يمكن ملاحظة الاختلافات بين ملفات تعريف القابلية المعتمدة على الجنس أو الحجم بدقة أكبر وتحديدها كميا ، مما يجعل هذا القياس أكثر تنوعا.

المقاومة التقنية:
تقوم هذه الطريقة بتقييم المقاومة التقنية ، وهي المقاومة كما يتم قياسها في بيئات موحدة خاضعة للرقابة. وهذه القياسات مناسبة لمراقبة انتشار مقاومة المبيدات الحشرية وربط مقاومة النمط الظاهري بالعلامات المحتملة15. بسبب انخفاض التباين في الوفيات الناتج عن الفحص الحيوي للتطبيق الموضعي ، فإنه يسمح بتحديد علامات المقاومة الجديدة بشكل أفضل. ومع ذلك ، بسبب التعرض غير الطبيعي للمبيدات الحشرية للبعوض ، فإن هذا الفحص غير مناسب لتقدير فعالية تدخل معين في مجموعة سكانية محددة. هناك حاجة إلى فحوصات أخرى لقياس هذه المقاومة العملية15.

القدرة على التكيف مع العينة:
يمكن ممارسة هذه الطريقة على المفصليات المهمة الأخرى مثل آفات المحاصيل (على سبيل المثال ، خنفساء البطاطس في كولورادو) ، أو الآفات المنزلية (على سبيل المثال ، الصراصير وبق الفراش) ، أو الملقحات (مثل النحل) مع تغييرات بسيطة على نهج الضربة القاضية و / أو جرعة المبيدات الحشرية وحجمها و / أو تركيزها (كما هو موضح أعلاه). يمكن أن تساعد سهولة القدرة على التكيف في تشبيه أبحاث مقاومة المبيدات الحشرية عبر مجالات البحث المختلفة. يتيح استخدام قيمة LD 50 بدلا من التركيز القاتل الذي يقتل 50٪ من العينات (LC50) مقارنة دقيقة بين الأنواع.

كلف:
على غرار المقايسات الحيوية لزجاجة CDC واختبارات أنبوب منظمة الصحة العالمية ، فإن تكاليف تشغيل فحص التطبيق الموضعي ضئيلة (انظر جدول المواد). القطع الأساسية من المعدات هي المحقنة (حوالي 70 دولارا) والموزع (حوالي 100 دولار) ، والتي يمكن إعادة استخدامها عبر المقاييس.

عدد العينات المطلوبة:
يجب استخدام ما لا يقل عن 20-25 عينة لكل كوب فحص تطبيقي موضعي. يوصى باختبار ما لا يقل عن خمسة تركيزات من المبيدات الحشرية لكل تجربة ، مع ما لا يقل عن ثلاثة تكرارات موصى بها لهذا الإجراء. وعموما، ينتج عن ذلك ما لا يقل عن 300-375 عينة مطلوبة لإجراء اختبار كامل، مقارنة بعدد العينات اللازمة لإجراء اختبارات شدة المقاومة باستخدام اختبارات أنبوب منظمة الصحة العالمية أو المقايسات الحيوية لزجاجات CDC. ومع ذلك ، إذا تم تحقيق انخفاض التباين باستخدام الفحص الحيوي للتطبيق الموضعي ، فقد يؤدي نفس العدد من العينات إلى مزيد من القوة الإحصائية لمقارنة بيانات القابلية عبر المكان أو الزمان.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم دعم هذا البحث من خلال جائزة CAREER من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم إلى SH تحت رقم الجائزة 2047572. نشكر داميان ريفيرا على مساعدته في تربية ذبابة الفاكهة وإعدادها لفحص التطبيق الموضعي ، والدكتور غانيتسكي في جامعة ويسكونسن ماديسون على مشاركة سلالة ذبابة الفاكهة كانتون إس ، ومراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها لمشاركة سلالة روكفلر ، ومركز وزارة الزراعة الأمريكية للحشرات الطبية الزراعية والبيطرية لتقاسم سلالة أيزولين IICC. تم إنشاء الشكل 1 مع BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Thomas Scientific 20A00L068 Acetone aliquot storage
1.5 mL screw cap tubes Thomas Scientific 1182K23 Insecticide dilution storage
15 mL conical tubes VWR 339651 Insecticide dilution storage
20 mL glass scintillation vials Fisher Scientific 0334125D Fruit fly weighing
25 μL syringe Fisher Scientific 14815288 Topical applicator
Acetone Fisher Scientific AC423240040 ACS 99.6%, 4 L
Aedes aegypti (IICC strain) USDA CMAVE NA Insecticide resistant
Aedes aegypti (Rockefeller strain) CDC NA Insecticide susceptible
Analytical scale Fisher Scientific 14-557-409 Precision up to 0.1 mg
Aspirator Amazon 6.49986E+11 Mosquito collection device
Bench paper VWR 89126-794 Place under workspace
Cotton swabs Amazon B092S8JVQN Use for sorting insects
Cotton wool balls Amazon B0769MKZWT Use for sucrose solution
Dispenser Fisher Scientific 1482225 Repeater pipettor
Drosophila melanogaster (Canton-S strain) University of Wisconsin-Madison NA Insecticide susceptible
Fine-tipped paint brushes Amazon B07KT2X1BK Use for sorting insects
Fruit fly stock bottles Fisher Scientific AS355 Use for rearing and sorting fruit flies
Hand-held CO2 dispenser Fisher Scientific NC1710679 Use for knocking down insects
Holding cups Amazon B08DXG7V1S Clear plastic
Ice pack Amazon B08QDWMMW5 Use for knocking down fruit flies
Ice trays Amazon 9301085269 Use for knocking down insects
Insect forceps Amazon B07B4767WR Insect forceps
Insecticide Sigma-Aldrich Inc 45423-250MG Deltamethrin
Labeling stickers Amazon B07Q4X9GWX 3/4" Color dot stickers
Labeling tape Amazon B00X6A1GYK White tape
Netting Amazon B07F2PHHWV Use for covering holding cups and insect handling tent
Petri dishes Fisher Scientific FB0875712H371 100 mm x 15 mm
PVC Pipe Lowe’s 23971 Insect handling tent materials
Rubber bands Amazon B00006IBRU Use for securing mesh/net on cups
Sucrose Amazon B01J78INO0 Granulated White Sugar
Weighing paper VWR 12578-165 4" x 4"

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. Vector-borne diseases. World Health Organization. , https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/vector-borne-diseases (2020).
  2. World Health Organization. Global plan for insecticide resistance management in malaria vectors. World Health Organization. , https://apps.who.int/iris/handle/10665/44846 (2012).
  3. Liu, N. Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions. Annual Review of Entomology. 60 (1), 537-559 (2015).
  4. Hemingway, J., Ranson, H. Insecticide resistance in insect vectors of human disease. Annual Review of Entomology. 45 (1), 371-391 (2000).
  5. World Health Organization. Monitoring and managing insecticide resistance in Aedes mosquito populations. World Health Organization. , https://apps.who.int/iris/handle/10665/204588 (2016).
  6. World Health Organization. Test procedures for insecticide resistance monitoring in malaria vector mosquitoes (Second edition). World Health Organization. , http://www.who.int/malaria/publications/atoz/9789241511575/en/ (2016).
  7. McAllister, J. C., Scott, M. CONUS manual for evaluating insecticide resistance in mosquitoes using the CDC bottle bioassay kit. Centers for Disease Control and Prevention. , https://www.cdc.gov/zika/pdfs/CONUS-508.pdf (2020).
  8. Duneau, D., et al. Signatures of insecticide selection in the genome of Drosophila melanogaster. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (11), 3469-3480 (2018).
  9. Pittendrigh, B., Reenan, R., ffrench-Constant, R. H., Ganetzky, B. Point mutations in the Drosophila sodium channel gene para associated with resistance to DDT and pyrethroid insecticides. Molecular & General Genetics: MGG. 256 (6), 602-610 (1997).
  10. Rinkevich, F. D., Du, Y., Dong, K. Diversity and convergence of sodium channel mutations involved in resistance to pyrethroids. Pesticide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 93-100 (2013).
  11. Lissenden, N., et al. Review and meta-analysis of the evidence for choosing between specific pyrethroids for programmatic purposes. Insects. 12 (9), 826 (2021).
  12. Owusu, H. F., Chitnis, N., Müller, P. Insecticide susceptibility of Anopheles mosquitoes changes in response to variations in the larval environment. Scientific Reports. 7 (1), 3667 (2017).
  13. Brito-Sierra, C. A., Kaur, J., Hill, C. A. Protocols for testing the toxicity of novel insecticidal chemistries to mosquitoes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e57768 (2019).
  14. Burgess, E. R., King, B. H., Geden, C. J. Oral and topical insecticide response bioassays and associated statistical analyses used commonly in veterinary and medical entomology. Journal of Insect Science. 20 (6), 1-9 (2020).
  15. Namias, A., Jobe, N. B., Paaijmans, K. P., Huijben, S. The need for practical insecticide-resistance guidelines to effectively inform mosquito-borne disease control programs. eLife. 10 (1), 65655 (2021).
  16. Zhu, X., et al. Manipulating solid forms of contact insecticides for infectious disease prevention. Journal of the American Chemical Society. 141 (1), 16858-16864 (2019).
  17. Dang, K., Singham, G. V., Doggett, S. L., Lilly, D. G., Lee, C. Y. Effects of different surfaces and insecticide carriers on residual insecticide bioassays against bed bugs, Cimex spp. (Hemiptera: Cimicidae). Journal of Economic Entomology. 110 (2), 558-566 (2017).
  18. Spielmeyer, A., Schetelig, M. F., Etang, J. High-throughput analysis of insecticides on malaria vectors using liquid chromatography tandem mass spectrometry. PLoS ONE. 14 (2), 0211064 (2019).
  19. Bagi, J., et al. When a discriminating dose assay is not enough: measuring the intensity of insecticide resistance in malaria vectors. Malaria Journal. 14 (1), 210 (2015).
  20. Pridgeon, J. W., Becnel, J. J., Clark, G. G., Linthicum, K. J. Permethrin induces overexpression of multiple genes in Aedes aegypti. Journal of Medical Entomology. 46 (3), 1-8 (2009).
  21. World Health Organization. Guidelines for efficacy testing of insecticides for indoor and outdoor ground-applied space spray applications. World Health Organization. , https://apps.who.int/iris/handle/10665/70070 (2009).
  22. Estep, A. S., et al. Quantification of permethrin resistance and kdr alleles in Florida strains of Aedes aegypti (L.) and Aedes albopictus (Skuse). PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (10), 0006544 (2018).
  23. Waits, C. M., et al. A comparative analysis of resistance testing methods in Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) from St. Johns County, Florida. Florida Entomologist. 100 (3), 571-577 (2017).
  24. Kostromytska, O. S., Wu, S., Koppenhöfer, A. M. Diagnostic dose assays for the detection and monitoring of resistance in adults from Listronotus maculicollis (Coleoptera: Curculionidae) populations. Journal of Economic Entomology. 111 (5), 2329-2339 (2018).
  25. Aktar, W., Sengupta, D., Chowdhury, A. Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards. Interdisciplinary Toxicology. 2 (1), 1-12 (2009).
  26. Maïga, H., et al. Guidelines for routine colony maintenance of Aedes mosquito species. IAEA Physical and Chemical Sciences. , http://www-naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/guidelines-for-routine-colony-maintenance-of-Aedes-mosquito-species-v1.0.pdf (2017).
  27. Gjullin, C. M., Hegarty, C. P., Bollen, W. B. The necessity of a low oxygen concentration for the hatching of aedes mosquito eggs. Journal of Cellular Physiology. 17 (2), 193-202 (1941).
  28. Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420 (1), 27-44 (2008).
  29. Jass, A., Yerushalmi, G. Y., Davis, H. E., Donini, A., MacMillan, H. A. An impressive capacity for cold tolerance plasticity protects against ionoregulatory collapse in the disease vector Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 222 (1), 214056 (2019).
  30. Bartholomew, N. R., Burdett, J. M., Vandenbrooks, J. M., Quinlan, M. C., Call, G. B. Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia. Scientific Reports. 5 (1), 15298 (2015).
  31. Jung, Y., Kennedy, A., Chiu, H., Mohammad, F., Claridge-Chang, A., Anderson, D. J. Neurons that function within an integrator to promote a persistent behavioral state in Drosophila. Neuron. 105 (2), 322-333 (2020).
  32. Aldridge, R. L., Kaufman, P. E., Bloomquist, J. R., Gezan, S. A., Linthicum, K. J. Impact of topical application site on the efficacy of permethrin and malathion to Culex quinquefasciatus. Journal of the American Mosquito Control Association. 32 (4), 300-307 (2016).
  33. Rinkevich, F. D., et al. Distinct roles of the DmNav and DSC1 channels in the action of DDT and pyrethroids. Neuro Toxicology. 47 (1), 99-106 (2015).
  34. Balmert, N. J., Rund, S. S. C., Ghazi, J. P., Zhou, P., Duffield, G. E. Time-of-day specific changes in metabolic detoxification and insecticide resistance in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Journal of Insect Physiology. 64 (1), 30-39 (2014).
  35. R Core Team. R: a language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. R Core Team. , https://www.r-project.org/ (2021).
  36. Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PLoS ONE. 10 (12), 0146021 (2015).
  37. Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of the American Mosquito Control Association. 3 (2), 302-303 (1987).
  38. Ravichandran, S. Data analysis through SAS with special emphasis on Probit analysis. National Academy of Agricultural Research Management (NAARM). , https://naarm.org.in/VirtualLearning/vic/e-chapters/Probit_Analysis-ravichandran.pdf (2021).
  39. Smith, L. B., et al. CYP-mediated resistance and cross-resistance to pyrethroids and organophosphates in Aedes aegypti in the presence and absence of kdr. Pesticide Biochemistry and Physiology. 160 (1), 119-126 (2019).
  40. Finney, D. J. Probit Analysis. , Cambridge University Press. Cambridge, England. (1971).
  41. Silva, J. J., Kouam, C. N., Scott, J. G. Levels of cross-resistance to pyrethroids conferred by the Vssc knockdown resistance allele 410L+1016I+1534C in Aedes aegypti. PLOS Neglected Tropical Diseases. 15 (7), 0009549 (2021).
  42. Fan, Y., Scott, J. G. The F1534C voltage-sensitive sodium channel mutation confers 7- to 16-fold resistance to pyrethroid insecticides in Aedes aegypti. Pest Management Science. 76 (1), 2251-2259 (2020).
  43. Miller, A. L. E., Tindall, K., Leonard, B. R. Bioassays for monitoring insecticide resistance. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2129 (2010).
  44. Glunt, K. D., et al. Long-lasting insecticidal nets no longer effectively kill the highly resistant Anopheles funestus of southern Mozambique. Malaria Journal. 14 (1), 298 (2015).
  45. ffrench-Constant, R. H., Roush, R. T. Resistance detection and documentation: the relative roles of pesticidal and biochemical assays. Pesticide Resistance in Arthropods. Roush, R. T., Tabashnik, B. E. , Springer. Boston, MA. (1990).
  46. Akdag, K., et al. Synthesis and larvicidal and adult topical activity of some hydrazide-hydrazone derivatives against Aedes aegypti. Marmara Pharmaceutical Journal. 18 (1), 120-125 (2014).
  47. Richards, S. L., Byrd, B. D., Reiskind, M. H., White, A. V. Assessing insecticide resistance in adult mosquitoes: perspectives on current methods. Environmental Health Insights. 14 (1), (2020).
  48. Cooperband, M., Golden, F., Clark, G., Jany, W., Allan, S. Prallethrin-induced excitation increases contact between sprayed ultra-low volume droplets and flying mosquitoes (Diptera: Culicidae) in a wind tunnel. Journal of Medical Entomology. 47 (1), 1099-1106 (2010).
  49. Barbosa, D. S., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. Evaluation of attractive toxic sugar baits (ATSB) against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in laboratory. Tropical Biomedicine. 36 (2), 578-586 (2019).

Tags

علم الأحياء، العدد 179،
الفحص الحيوي للتطبيق الموضعي لتحديد سمية المبيدات الحشرية للبعوض وذباب الفاكهة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jensen, B. M., Althoff, R. A.,… More

Jensen, B. M., Althoff, R. A., Rydberg, S. E., Royster, E. N., Estep, A., Huijben, S. Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies. J. Vis. Exp. (179), e63391, doi:10.3791/63391 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter