Summary
我们描述了局部应用生物测定法在蚊子和果蝇中测量杀虫剂易感性的方法和重要性。所提出的测定是高通量的，利用昆虫质量 - 从而允许计算质量相对化致死剂量而不是浓度 - 并且可能具有比其他类似方法更低的变异性。
Abstract
继续将杀虫剂用于公共卫生和农业，导致杀虫剂普遍具有抗药性，并阻碍了控制方法。蚊子种群的杀虫剂耐药性监测通常通过疾病控制和预防中心（CDC）瓶生物测定或世界卫生组织（WHO）管测试来完成。然而，由于杀虫剂与昆虫的接触不同，测试的生物体数量相对较少，种群之间的质量差异很大，以及环境条件不断变化，这些方法可能导致死亡率数据的高度变化，从而导致结果可变。本文介绍了局部应用生物测定法，该测定法适用于蚊子和果蝇的高通量表型生物测定法，以测试沿一系列杀虫剂浓度的大量昆虫。
该测定1）确保与每个生物体的一致治疗和杀虫剂接触，2）产生高度特异性的剂量反应曲线，解释菌株和性别之间平均质量的差异（这对于现场收集的生物体尤其重要），3）允许计算统计学上严格的中位致死剂量（LD50），这对于耐药性比比较是必要的 - 诊断剂量死亡率的替代监测方法，也用于杀幼虫剂耐药性监测。该测定将成为准确表型蚊子种群的补充工具，并且如果蝇所示，易于适应与其他昆虫一起使用。我们认为，这种测定将有助于填补多种昆虫物种中基因型和表型杀虫剂抗性之间的差距。
Introduction
蚊子每年因传播给人类的疾病而造成70多万人死亡，其中一半以上仅死于疟疾1。预防疟疾和其他病媒传播疾病传播的主要方法是使用杀虫剂，通常采用长效杀虫剂蚊帐或室内滞留喷洒的形式2.然而，杀虫剂耐药性在蚊子和其他昆虫媒介以及农业害虫中很普遍3，4。为了有效管理耐药性，监测至关重要5.为此，需要高精度和高通量的电阻检测方法。目前，最普遍的蚊子杀虫剂耐药性监测工具是世卫组织试管6 和CDC瓶装生物测定7。对于果蝇的残留接触应用方法（类似于CDC瓶生物测定法）是常用的杀虫剂生物测定法8，9，10。然而，这些方法的数据差异通常很大，对同一实验室蚊子菌株的测量值从CDC瓶装测定的死亡率约为20-70%，暴露于亚致死剂量时的世卫组织管试验的死亡率为0-50%不等11。这种变异令人惊讶，因为大多数实验室菌株中有限的遗传变异预计将导致种群中有限的杀虫剂易感性变异。然而，在生物测定结果中观察到的高度变异仍然存在。
这种变异的潜在来源可能是生物测定中标本之间由于通过表面间接接触杀虫剂、异质性环境效应、同一基因型个体之间的正常生物变异以及同一种群标本质量的变化而导致的异质性杀虫剂暴露12.一种不常用且具有较高可复制性的方法，即局部应用生物测定法。在该测定中，将杀虫剂直接施用于每个昆虫13，14，除去在同一测定中不同样品的异质暴露因子。然而，由于这种方法的通量慢，它不经常用作蚊子种群的杀虫剂易感性监测工具。本文提出了一种用于局部应用生物测定的改进方案，该方案允许更高的通量暴露，同时还校正昆虫质量的变化，该参数与杀虫剂易感性的变化相关12。减少可变杀虫剂暴露的死亡率数据的噪声和质量相关变化，将允许更准确的技术耐药性监测11，15。这些数据可用于更准确地将表型抗性与遗传标记、适应性参数和/或载体能力联系起来。此外，我们展示了如何通过在果蝇（一种较小的昆虫物种）上使用局部应用生物测定来轻松地将该测定法适应其他昆虫物种。
上述残留接触应用的主要局限性是，在同一测定中，杀虫剂暴露可能因标本而异。在CDC瓶生物测定和接触方法的情况下，同一测定的重复之间可能不同，杀虫剂暴露可能不同。昆虫暴露于分布在玻璃瓶内部（CDC瓶生物测定和接触方法）或浸渍纸（WHO管试验）上的杀虫剂。杀虫剂在两个表面（玻璃和纸张）上的浓度是已知的，并通过筛选不同种类的已知基因型来预先确定。然而，可被昆虫潜在吸收的量可以根据所使用的表面、杀虫剂混合物组分以及杀虫剂在表面材料16、17上的均匀分布而有很大差异。在CDC瓶子生物测定中，瓶子内部的杀虫剂涂层取决于每个实验室和用户采用的程序。在世卫组织的试管试验中，经杀虫剂处理的试纸是集中生产的，因此很可能在实验室之间非常均匀。然而，在世卫组织试管试验中，暴露管允许标本降落并停留在非杀虫剂暴露的金属网上，从而导致每次试验中标本之间潜在的异质性杀虫剂暴露。通过每种方法被标本拾取和吸收的杀虫剂的实际量仍需进一步探索18。
此外，CDC瓶装生物测定，WHO管测试和接触方法最常用作阈值测定，仅检测一种预定的杀虫剂浓度。这种方法可以准确检测耐药性的存在，对于耐药性监测（特别是当耐药性正在传播时）很有价值。然而，阈值测定不能量化耐药性的强度，这可能更能预测干预工具的功效。如果这些方法使用多种杀虫剂浓度，则可以将它们用作强度测定。CDC瓶装生物测定和WHO管测试的强度测定是通过测试预定剂量的5倍和10倍来引入的，以解决监测中的这一差距6，19。虽然提供更大的区分耐药人群的能力，但3-5（预定）剂量提供有限的分辨率来计算致死浓度。此外，各种大小的蚊子也用于此类测定。然而，质量的测量很重要，因为较大的标本可能需要更高的剂量才能被杀死，因为每单位质量的有效剂量将远低于较小生物体12的有效剂量。计算质量相对化致死剂量（每个昆虫质量的杀虫剂量）将是一个比更常见的致死浓度（例如，每个表面积的杀虫剂量）更有用的指标，因为它考虑了性别，种群和基因型之间的昆虫质量变化。这些数据将有助于填补实验室和现场内基因型和表型抗性之间的差距，并且还可以提供一种简单的方法来计算治疗已知平均质量的昆虫种群所需的应用浓度。
使用杀死50%标本（LD50）的质量相对化致死剂量也包含其他一些好处。以mg/kg（= ng/mg）为单位评估特定化合物的毒性是人类和兽医毒理学14的标准，LD50 值可在材料安全数据表上找到。致死剂量还允许直接比较不同化学品对特定物种或同一化学品对不同物种的毒性20，以及对新型杀虫剂和化学品的高质量评估13。此外，LD50 可以提供比诊断剂量死亡率结果更有意义和准确的耐药性比，这可能导致高估人群中存在的耐药水平。因此，该测定将适用于常规监测计划，方法是根据质量相对化致死剂量提供更严格的耐药性监测，这些剂量来自比其他生物测定推荐的更多标本21。
局部应用方法已用于蚊子和苍蝇的杀虫剂易感性监测，作为已知或怀疑耐药性时的标准杀虫剂易感性生物测定的替代方案22，23，以及用于对某些害虫昆虫的监测24 以更准确地评估耐药性和杀虫剂的内在毒性21.在局部应用生物测定中，将杀虫剂应用于每种生物体，导致杀虫剂暴露的变化最小。本文提出了一种稍微适应和改进的方法，该方法允许在短时间内将杀虫剂暴露应用于大量昆虫，同时还控制昆虫质量22。这种具有良好可复制性的高通量方法可以成为常规杀虫剂易感性监测的有用附加工具。
Protocol
注：杀虫剂可对人类、动物和环境造成危害25.强烈建议谨慎、训练和个人防护装备。请务必遵循所有所用杀虫剂和溶剂的材料安全数据表。
1. 后部试样
- 3-5天大的成年蚊子。
注：以下议定书 反映了埃及伊 蚊养殖的条件，严格遵守联合国粮食及农业组织准则26。- 所有生命阶段的后蚊子在27±1°C和75±5%相对湿度下，12：12小时明暗循环。
- 通过将蚊子卵浸入去离子水中并加入酵母26来孵化蚊子卵，或将淹没的卵放在真空室中30分钟。
注意：这两种方法都降低了水中的氧含量，并增加了27的孵化率。 - 在托盘内喂养新孵化的幼虫鱼食（或同等的饲料，如磨碎的猫肉），并保持托盘之间的幼虫密度尽可能相似，因为幼虫密度影响发育12 （例如，每个托盘200-250幼虫，总共含有1.5升水）。
- 每隔一天喂食幼虫，直到它们达到蛹阶段（约7-10天），根据需要增加食物量。
注意：当喂食太少时，幼虫的生长会受到阻碍，幼虫可能会互相吃掉。当喂食过多时，幼虫可能会死亡，导致水变臭。 - 一旦蛹发育，每天将它们转移到成年蚊笼中的水碗中， 并随意提供10%的蔗糖溶液。
- 记录成人出苗的第一天。在出苗开始后2天从笼中取出剩余的蛹。
注意：雄性蚊子出现得更快。注意男性和女性的出现，并确保每个测试都有足够的男性和女性。 - 取出蛹后等待3天，以达到3-5天大的蚊子进行测试。
- 尾果蝇（松散地遵循苏黎世大学28的协议）。
- 后 果蝇 在23±1°C和60±5%相对湿度下在储备瓶中，12：12小时光照和黑暗循环。
注意： 果蝇 储备瓶应含有75毫升标准苍蝇培养基，首先将其作为液体倒入瓶底，然后凝固过夜。 - 每两周将菌落转移到装有新鲜食物的新高汤瓶中，以防止人口过剩和霉菌生长。为此，使用手持式二氧化碳（CO2）分配器击倒苍蝇，将麻醉后的苍蝇转移到冰袋或冷却台上的称重纸上，然后使用细尖的画笔将苍蝇刷入新鲜的汤瓶中。在此过程中，请务必将瓶子放在侧面，以防止苍蝇掉入食物中并溺水身亡。
- 后 果蝇 在23±1°C和60±5%相对湿度下在储备瓶中，12：12小时光照和黑暗循环。
2. 使用重量法制备杀虫剂制剂
- 在通风橱内使用精度为0.1 mg的分析秤，按照重量法制备第一个储备溶液。
注意：重量法使用质量来测量杀虫剂和溶剂的添加量。标准做法（体积法）将需要一个分析秤来测量在制备第一个储备溶液时添加的（固体）杀虫剂的量;但是，加入的溶剂量和所有后续稀释液仅按体积测量。重量法具有更高的精度，因此是首选。- 确定第一个储备溶液的目标杀虫剂浓度和目标体积（如果使用15 mL锥形管以防止储存在冰箱中时溢出，则建议最大10 mL），并使用等式（1）计算要添加多少杀虫剂活性成分（AI）：
（1） - 准备一个储存管（对于较大体积，建议使用15 mL锥形管，对于1 mL或更小体积，建议使用1.5 mL微量离心机螺旋盖管），并用杀虫剂和溶剂名称，目标浓度和制备日期标记。将管子和盖子放在架子或支架内的秤上，然后对秤进行去皮处理。
- 称取步骤2.1.1确定的所需固体或液体杀虫剂AI的量。（例如，用于代表性数据的溴氰菊酯）进入管中并记录质量。
- 将秤去皮并向管中加入所需体积的溶剂（相当于目标体积），立即关闭盖子，并记录质量。加入溶剂（此处使用的丙酮）后立即关闭管盖，以避免蒸发并混合溶液。
- 记录室温。一些溶剂，如丙酮，可以根据温度在体积（以及密度）上发生显着变化。
- 如果立即储存，请将管盖包裹在parafilm中（以减少蒸发），将其放在管架/支架中（以保持直立并防止泄漏），盖在箔中（以防止紫外线照射），将其放在可重复密封的塑料袋中（以减少蒸发），并将袋子放在-20°C的冰箱中。如果不立即存放，请确保盖子固定并盖在铝箔或避光容器中。
- 通过将添加的杀虫剂AI的质量除以添加的溶剂体积（如果是液体形式的杀虫剂的体积）来计算储备溶液的实际浓度（mg / mL）。要计算添加的溶剂（或液体杀虫剂）的体积，请将添加的质量除以适合记录温度的已知密度。
- 通过将添加的总质量（杀虫剂和溶剂）除以添加的总体积（溶剂和杀虫剂，如果是液体形式）来计算储备溶液的密度（g / mL）。请参阅步骤2.1.7，将液体质量转换为体积。
- 确定第一个储备溶液的目标杀虫剂浓度和目标体积（如果使用15 mL锥形管以防止储存在冰箱中时溢出，则建议最大10 mL），并使用等式（1）计算要添加多少杀虫剂活性成分（AI）：
- 通过10%稀释剂连续稀释初始储备溶液。如果需要，使用这些连续稀释液创建初始剂量 - 反应曲线，以确定生物测定的杀虫剂浓度的目标范围。
- 计算杀虫剂储备溶液和要添加到每个管中的溶剂的体积（例如，将1 mL杀虫剂储备溶液稀释在9 mL溶剂中，以10 mL稀释至先前浓度的10%）。
- 涡旋储备溶液10秒。在秤上将预先标记的第一个稀释管去皮。使用移液器将所需体积的储备溶液加入第一个稀释管中。立即关闭两个试管的盖子，并将质量记录在第一个稀释管中。
- 再次将第一个稀释管去皮，并加入所需体积的溶剂。立即盖上盖子，记录所加入溶剂的质量，并涡旋第一次稀释10秒。
- 对剩余的稀释液重复步骤2.2.2和2.2.3。
- 按照上述步骤2.1.6中所述储存所有稀释液。
- 按照步骤2.1.7计算稀释液的实际浓度。
- 通过将添加的总质量（杀虫剂溶液和溶剂）除以添加的总体积（杀虫剂溶液和溶剂）来计算每种杀虫剂稀释液的密度。对于每个连续稀释，使用先前的杀虫剂原液稀释的密度来计算新稀释液的密度，其密度如下方程 （2）：
(2)
- 可选：通过连续稀释以较小的增量创建杀虫剂稀释。
- 选择每种新溶液的浓度和体积，以借助初始连续稀释液，先前试验或已发表文献的剂量 - 反应曲线进行制作。
注意：所选浓度的死亡率范围应为 0-100%，此范围内至少有三个浓度，以便进行 Probit 分析。 - 使用连续稀释液作为储备溶液进行每次新的稀释，并按照步骤2.2在10倍稀释度之间创建新的稀释度。
- 选择每种新溶液的浓度和体积，以借助初始连续稀释液，先前试验或已发表文献的剂量 - 反应曲线进行制作。
- 可选：等分杀虫剂溶液。如果制造了大量杀虫剂溶液，请将溶液等分到1.5 mL螺旋盖管中，以避免频繁处理和暴露在光线下污染，蒸发和降解储备溶液。
- 从最低浓度开始等分溶液，并努力达到最高浓度以减少潜在的污染。在打开之前通过涡旋10秒将每种储备溶液混合，并将所需体积（例如，0.5 mL）移液到预标记的螺旋盖管中。
- 将等分试样储存在-20°C冰箱中的耐光容器中。
注意：建议定期（每月）用直接从库存农药稀释液中取出的小新等分试样替换等分试样。这将限制在工作台上使用样品时，污染被带到其他实验中或由于蒸发或紫外线降解而发生变化的可能性。只要杀虫剂溶液正确储存（见步骤2.1.6）并保存在-20°C冰箱中，该方案就可以在此处暂停，甚至在几年后重新启动。
- 在储存前使用永久性记号笔标记半月板，以监测溶剂蒸发。当去除杀虫剂溶液以制成等分试样时，每次取出溶液时都要标记半月板。
（1）
(2)3. 准备局部应用生物测定工作区
注意：建议在台式昆虫处理帐篷中工作，以便更容易捕获逃跑的蚊子或苍蝇。有关昆虫处理帐篷的图像，请参见 补充图 S1 。
- 从冰箱中取出所需的杀虫剂溶液，立即涡旋，并将其置于室温下的耐光容器中，让杀虫剂在使用前加热到室温。
注意：杀虫剂AI可以在较冷的温度下与溶剂分离。此外，丙酮体积随温度而变化，这可能会改变所施用的杀虫剂剂量。混合溶液并使其加热到室温有助于确保使用杀虫剂溶液时的一致性。 - 列出在材料表中引用的昆虫处理帐篷中进行局部应用测定所需的所有 工具和材料。
- 用分析级丙酮清洁注射器桶和针头，每个丙酮等分试样完成5次洗涤。用5个单独的等分试样完成此操作，总共25次洗涤。参见 补充图S2 ，了解注射器和中继器移液器部件。
- 设置5个微量离心管，每个管含有0.5 mL丙酮。
- 用第一根管中的0.025 mL丙酮填充注射器桶，然后通过迅速向下推柱塞将丙酮排入废物容器中。再重复四次，从同一丙酮等分试样中完成总共五次丙酮洗涤。然后，用空气完全填充注射器桶，并将空气和潜在的丙酮残留物排出到废物容器中。再重复两次，用空气完成三次“洗涤”。
- 对剩余的4管丙酮重复步骤3.3.2。
- 在注射器柱塞和针头顶部之间的枪管内创建一个气穴，方法是将柱塞稍微拉入枪管（~5 mm）。
注意：该气穴可防止柱塞接触杀虫剂溶液，并减少杀虫剂残留。 - 将注射器放在一边，直到准备用于局部应用。
- 创建一个包含要应用的剂量的密钥，并在随机数或字母生成器之后分配随机ID（请参阅 补充文件1）。
- 用随机ID标记塑料保温杯，以进行盲人死亡率评估。
注意：如果需要，可以在此处暂停协议，并在以后的日期和时间重新启动。如果在暂停时间超过几个小时，鼓励重复步骤3.3以确保注射器清洁，并将杀虫剂溶液放回冰箱中，直到给药前约一小时给药，然后重复步骤3.1。
4.为局部生物测定准备标本。有关过程概述，请参见图 1
- 对蚊子进行分类和称重
- 使用由吸入吸入力驱动的吸气器，吸出测定所需的所需数量的3-5天大成年蚊子，包括过量的蚊子以解释受损个体。通过将吸气器的尖端放入管中，将蚊子转移到锥形管中（每管最多100只蚊子），并将棉花包裹在尖端，然后轻轻呼气并轻拍吸气器。当吸气器尖端被移除时，使用棉花堵塞管子，然后用盖子盖住。避免一次用过多的蚊子填充吸气器和管子，因为这会增加蚊子的额外压力并可能导致死亡。
- 通过在4°C下放置至少10分钟或将它们埋在冰盘中的冰下，短暂地击倒管中的蚊子。
注意：蚊子可以在2°C下保持数小时，最低死亡率为29;然而，最好尽量减少蚊子在冰上的持续时间，以减少潜在的负面影响。 - 将被击倒的蚊子转移到昆虫处理帐篷中，并小心地将蚊子倒在放在冰上的塑料托盘（例如培养皿）上。一次只倒入大约50只蚊子，以确保每只蚊子都接触到它下面的凉爽托盘并保持被击倒。
- 按性别对蚊子进行分类，用镊子轻轻地用腿（或翅膀）捡起它们，并将每种性别放入单独的保管杯中。在分类时计算每种性别的蚊子数量，并在达到所需数量时停止。在分类时，清除任何受伤（例如，缺腿）或超大（例如，腹部异常增大）或小（用肉眼容易区分为小于该种群的平均蚊子大小）的蚊子。
注意：通过附属物处理蚊子可减少对其柔软的初级体（例如腹部）的结构损伤。 - 使用精度为0.1mg的分析秤记录每杯蚊子的重量。
- 在秤上放一个空杯子，用培养皿作为盖子，然后去皮。将蚊子倒入容器中，将盖子放在顶部，然后将容器放在秤上。
- 在评分表上记录标本的总重量和数量（参见 补充文件2）。立即将标本杯放回冰上，以保持固定。
- 重复步骤4.1.5.1-4.1.5.2，直到称量所有杯状试样。
- 将准备好的蚊子分成20-25组，放在单独的杯子上，放在标有随机ID的冰上。在转移蚊子时，要减少镊子造成的压力和物理伤害。理想情况下，仅使用镊子将蚊子捡起1-2次：一次用于分拣/称重，第二次用于转移到实验杯中。
注意：每个杯子的理想蚊子数量为20-25只，这足以重复，对于评估死亡率是合理的，并且不应导致杯中密度引起的应激/死亡。
- 对果蝇进行分类和称重
- 使用CO2 麻醉苍蝇7秒。
注意：如果苍蝇暴露于CO2 超过7秒，当它们醒来30时，它们可能会有爬行和飞行的困难。 - 将苍蝇倒在用长凳纸包裹的冰袋上，用细尖的画笔分离并计数雄性和雌性。
- 使用画笔轻轻地捡起选择的苍蝇，并将它们放入干净的空汤瓶中。选择相同数量的雄性和雌性果蝇（例如，15只雄性和15只雌性），并在库存瓶上标有菌株名称和果蝇总数（例如，Canton-S，30只果蝇）。
注意：拥有相同数量的雌性和雄性果蝇是很重要的，因为雄性果蝇在从雌性31的存在中移除后，可能会经历对彼此的高度攻击。因此，为了避免非杀虫剂的死亡或伤害，最好有相同数量的雄性和雌性（或完全省略雄性果蝇）。 - 使用分析秤记录每瓶果蝇的重量。
- 将一个空的小瓶（标有随机ID，请参阅步骤3.4）放在秤上，用培养皿作为盖子，并将秤去皮。
注意：建议将玻璃瓶与果蝇一起使用，因为它们可显着减少静电。 - 使用CO2 麻醉对应于小瓶随机ID的果蝇瓶7秒。
- 将果蝇倒在称量纸上，并将纸用作漏斗，将果蝇引入小瓶中。将培养皿盖放在果蝇小瓶的顶部，并将其放在秤上。
- 在记分表上记录标本的总重量和数量，然后立即将果蝇小瓶放入一盘冰中，盖子仍然在上面以防止果蝇逃跑。
- 对每瓶果蝇重复步骤4.2.4.1-4.2.4.4。
- 将一个空的小瓶（标有随机ID，请参阅步骤3.4）放在秤上，用培养皿作为盖子，并将秤去皮。
- 使用CO2 麻醉苍蝇7秒。
- 完成上述步骤后，请立即转到下一部分。
5. 剂量标本
- 在注射器中装入适当的杀虫剂浓度。从浓度最低的剂量开始，并努力使每组生物体达到最集中的剂量。为防止浪费，只需在注射器中装入所需体积的杀虫剂外加推荐的额外 2 μL。
- 将标本倒在放在冰上托盘上的称量纸上。使用干净、不含杀虫剂的画笔或棉签分离紧密在一起的标本，以便于获取每个标本进行给药。对于蚊子，也要使用画笔来确保每个标本都放在它们的背上，并且它们的腹面朝上。
- 使用注射器，将一滴杀虫剂溶液（或丙酮用于对照）施加到蚊子的腹侧胸部和腹部区域以及果蝇的背部。对较小的昆虫（如果蝇）应用0.2μL液滴（需要10μL注射器），对蚊子使用0.5μL液滴（需要25μL注射器）。
注意：与附属物（如翅膀、腿或长鼻）相比，主要身体部位（如头部、胸部和腹部）之间的杀虫剂敏感性没有显著差异32。因此，只要将剂量液滴施加到原体上，施用部位就不必精确。腹侧胸部和腹部区域是为蚊子选择的，因为它们在被击倒时经常躺在背侧，而果蝇则选择背侧，因为它们在被击倒时经常躺在腹侧。应用部位特异性的降低有助于提高该方法的通量。 - 立即将标本倒回标记的塑料杯中，并用网和橡皮筋盖住杯子。将杯子放入保温盘中，并在杯子上注明在此过程中被杀死，损坏或逃脱的任何标本（以将其排除在该杯子中标本的最终计数中）。对于第一个杯子，记录配料完成的时间。
- 更换放置标本的称量纸，以避免两次剂量之间的杀虫剂污染。
- 对每个杯子重复加药，直到所有试样都用适当的杀虫剂浓度加药，并记录所有试样的给药结束时间。
- 通过浸泡的棉球为每杯提供10%蔗糖溶液，并将杯子放在一边，直到第二天评估死亡率。将蚊子储存在27±1°C，相对湿度为 75±5%，果蝇在23±1°C，相对湿度为60±5%。
注意：挤压棉球时要小心，以避免过度饱和或饱和度不足。棉球应该是湿的，但不是滴水的。杯中滴下糖水会导致标本死亡，从而影响杀虫剂的死亡率评估。
6. 评估死亡率
- 记录杀虫剂暴露开始后24小时的标本死亡率。如果蚊子可以飞翔并保持直立，则将其归类为活的蚊子;如果他们不动或共济失调（无法站立或起飞飞行），如世卫组织6号所描述的那样死亡。遵循相同的果蝇死亡率评估8，33。
注意：为了评估延迟死亡率，还可以在48和72小时后通过每日糖水变化来评估死亡率。 - 记录死亡率后，将所有标本杯放在密闭袋中，在冰箱中冷冻至少1小时，以确保所有标本在处置或随后使用（例如，分子或化学分析）之前都已死亡。
7. 执行复制
- 在一组新的标本上重复步骤3-6，注意每天在同一时间进行重复，因为杀虫剂的易感性可能会根据第34天的时间而变化。
- 确保每种浓度至少重复3次，以准确估计杀死50%标本的致死剂量（LD50）。如果观察到高水平的变异性，则包括更多重复。
- 收集完所有数据后完成分析。
8. 分析结果
- 在电子表格程序中记录数据，并使用随机 ID 键取消屏蔽数据（参考步骤 3.4）。将数据保存为文本文件（参见 补充文件3中的示例数据），以便在统计程序R35 （参见 补充文件4中的示例R代码）或其他选择的软件36中进行分析。
- 在软件程序中，完成以下分析。有关示例 R 代码，请参阅 补充文件 4 。
- 按照以下等式（3）计算每个标本质量（mg）的杀虫剂（ng）剂量：
（3） - 计算死亡率并应用雅培公式37 来校正相对于在每个对照37 中观察到的死亡率的死亡率。或者，使用Schneider-Orelli（1947）公式来校正死亡率38。使用任一公式，无论每个对照的死亡率如何，都将校正应用于所有数据，如前所述37 和实施的39，除非对照数据异常高（见下面的讨论）。
注意：雅培公式和等效的替代方案（如施耐德-奥雷利公式）根据对照中未观察到的死亡率程度按比例调整死亡率值，并且不会导致死亡率为100%的杯子的死亡率降低。有关详细信息，请参阅这些公式的引用参考文献。 - 将校正后的死亡率数据转换为概率单位值40 ，并在杀虫剂剂量和转换后的死亡率数据之间执行线性回归。使用卡方检验来评估线性模型的拟合。
注意：在完成概率转换之前，将从数据中删除死亡率值 0（0% 死亡率）或 1（100% 死亡率）。由于概率转换的性质，这是必要的。因此，图表数据将不包括阳性或阴性对照或任何其他导致 0% 或 100% 死亡率的数据（在应用 Abbott 的校正后）。 - 按照先前发表的方法39，41，42计算每个标本菌株，群体和/或性别的LD50和95%可信区间（CI）。
- 注意：如果两个菌株的95%CI不重叠，则菌株具有显着不同的剂量反应。
- 如果适用，通过将目标应变的LD50 除以参考/对照应变的LD50 来计算电阻比（RR）。
- 按照以下等式（3）计算每个标本质量（mg）的杀虫剂（ng）剂量：
（3）
图1：局部应用测定方案图。 局部应用测定方案首先：（A）在冰上分拣标本，然后（B）在分析秤上称量标本，（C）用杀虫剂溶液给样，以及（D）杀虫剂暴露后24小时的等待期， 随意 获得10%蔗糖溶液（通过浸泡的棉球），然后进行死亡率评估。红色箭头表示蚊子（左）和果蝇（右）的目标杀虫剂施用位置。请注意，图像不是要缩放的。 请点击此处查看此图的大图。
Representative Results
这些代表性结果以埃及伊蚊（Rockefeller ）和佛罗里达州分离的野外菌株为特征，已知抗敲低突变F1534C和V1016I（IICC基因型）。此外， 还有黑腹果蝇 （Canton：S菌株）的特色。
图2 和 图3 说明了按照上述方案通过菌株和性别测试的每种生物体的剂量反应。由于在每个菌株中雄性和雌性蚊子的剂量反应曲线之间没有观察到差异（ROCK的t = 1.70，p = 0.098，IICC的 t = 0.64，p = 0.527），因此汇总了每个蚊子菌株中两性的数据。ROCK和IICC的质量相对化LD50 分别为0.008 ng / mg（95%CI：0-0.104）和0.336 ng / mg（95%CI：0.235-0.438）。这些值的95%CI不重叠，表明菌株的剂量反应显着不同。IICC菌株的RR（相对于ROCK菌株）为41.7，根据世界卫生组织的说法，被认为是高度耐药性的5。对于Canton-S果蝇，质量相对化LD50 为0.213 ng / mg（95%CI：0-0.490）。
图2：使用局部应用生物测定法的蚊子的代表性数据。根据上述方案使用倍他菊酯和蚊子进行局部应用生物测定的代表性剂量反应数据：（A）雌性埃及伊蚊ROCK（n = 880）和IICC（n = 550）菌株，（B）雄性埃及伊蚊ROCK（n = 880）和IICC（n = 569）菌株。溴氰菊酯检测浓度范围为0.00075 ng/μL至9.68705 ng/μL，每平均蚊子质量（mg）施用的溴氰菊酯剂量（mg）反映在x轴上。死亡率在 y 轴上显示为一个比例。穿过每个数据点聚类的黑线表示应变和性别特异性线性回归。请点击此处查看此图的大图。
图3：使用局部应用生物测定法的果蝇代表性数据。 根据上述方案使用溴氰菊酯和果蝇进行局部应用生物测定的代表性剂量反应数据： D. melanogaster Canton-S菌株（n = 1014）。溴氰菊酯测试浓度范围为0.00499至5.02876 ng/μL，每平均果蝇质量（mg）施用的溴氰菊酯剂量（mg）反映在x轴上。死亡率在 y 轴上显示为一个比例。黑线表示线性回归。 请点击此处查看此图的大图。
补充图S1：台式昆虫处理帐篷。 台式昆虫处理帐篷用于在局部应用测定期间更容易捕获逃跑的蚊子或苍蝇。结构在 A 中是闭合的，在 B中是开放的。该结构由PVC管和细网织物制成。 请点击此处下载此文件。
补充图S2：注射器和中继器涂药器单元。 用于昆虫加药的注射器和中继器涂药器单元。主要部件包括1）针头，2）注射器筒，3）柱塞，4）中继器和5）中继器按钮。 请点击此处下载此文件。
补充文件 1：随机化脚本： 随机化脚本，用于为每个实验的所有杯子创建无偏倚标签。 请点击此处下载此文件。
补充文件 2：死亡率评分表： 死亡率评分表，以协助评估死亡率。Sheet还包括记录协议中引用的所有其他要记录的重要信息的位置，例如杀虫剂应用的开始和结束时间。 请点击此处下载此文件。
补充文件 3：死亡率数据示例： 用于创建 图 2 的示例数据文件。列标题说明如下：“id”=每个数据点的识别码;“物种”=物种名称（例如，埃及伊 蚊）;“杀虫剂”=局部施用杀虫剂的名称（例如，溴氰菊酯）;“菌株”=蚊子菌株的名称（例如，ROCK）;“日期”=开始日期局部应用;“性”=蚊子的性别;“年龄”=蚊子的年龄（年轻=3-5天大;老=4周大）;“total.mosq” = 分批称重的蚊子总数;“重量”=批次内所有蚊子的重量（毫克）;“浓度”=杀虫剂浓度（微克/毫升）;“注射器”=注射器的液滴体积（mL）;“剂量”=应用于每只蚊子的杀虫剂活性成分的量（ng）;“总数”=每个杯子里的蚊子数量;“死”=每个杯子里死去的蚊子数量。 请点击此处下载此文件。
补充文件 4：R 分析代码： 可用于完成 Probit 分析的示例 R 代码（如协议的步骤 8 中所述）。代表性结果（可通过补充示例数据文件访问）可与此 R 代码一起使用。 请点击此处下载此文件。
Discussion
本文提出了一种适用于蚊子和果蝇局部应用测定的方案。该程序可以很容易地适应在野外和其他生物体中使用，因为它需要最少的专用设备。下面讨论了该协议的关键步骤，潜在的修改，故障排除建议，方法的局限性以及此方法的重要性。
协议中的关键步骤： 方案中有三个关键步骤，如果完成不正确，可能会对生物测定的结果产生巨大影响：杀虫剂浓度准确性，标本敲低和死亡率评估。
杀虫剂浓度精度：
拥有准确的杀虫剂解决方案以获得可复制的剂量 - 反应曲线和有意义的结果非常重要。杀虫剂溶液制备的体积法在CDC瓶生物测定7和局部应用13，14，43的文献中更为常见。然而，这里描述的重量法本质上是更准确的，因为通过包含（温度特异性）密度来考虑温度，从而导致更准确的配方制备。
标本敲低：
敲低标本是这种方法的关键组成部分，可以精确地施用杀虫剂和重量测量。然而，击倒生物体不可避免地包含物理压力和损伤的风险，如前所述30。因此，在敲低试样时要小心谨慎，以确保i）每个试样被敲低的时间相似，ii）敲低的长度保持在最低限度，iii）敲低方法在所有试样上保持一致。此外，建议在施用杀虫剂之前单独测试敲低方法，以确保该方法成功并且不会诱发大于10%的控制死亡率。对于没有经验的用户，初始测试可能需要更长的时间，从而导致更长的击倒时间。因此，在解释第一次测定的结果时要小心。
死亡率评估：
评估死亡率可能具有挑战性，特别是当杀虫剂不会完全杀死，而只会击倒或致残蚊子或苍蝇时。因此，在开始之前，重要的是要了解杀虫剂如何影响目标生物体，并对“死亡”（或击倒）生物体有明确的定义。此外，建议让同一人评估剂量和重复之间的死亡率，以减少变异。
协议修改： 下面描述的几种修改可以应用于该协议，以提高其多功能性和可访问性。
使测定适用于较小或较大尺寸的昆虫：
当使用较小或较大的标本时，建议分别施用较小或较大剂量体积的杀虫剂。例如，我们将0.5μL剂量减少到0.2μL剂量，从而将蚊子方案应用于果蝇。确保为所选剂量选择正确的注射器尺寸。
使测定适应野外昆虫：
当使用田间昆虫时，昆虫的大小可能会有更大的变化。因此，建议将昆虫分成较小的组（例如，每杯）称重，而不是作为一个大组（例如，用于一个实验的所有昆虫）。这可以帮助捕获与田间昆虫质量差异相关的杀虫剂易感性的潜在变化。
设备改造：
昆虫处理帐篷：标本的加样可以在昆虫处理帐篷下完成，该帐篷仅用PVC管和蚊帐建造。这可以替代封闭的房间（例如，昆虫），并有助于消除可能发生昆虫饲养的区域的潜在杀虫剂污染。这种昆虫处理帐篷易于建造且成本低廉（约70美元）。或者，可以购买一个昆虫处理笼（约425美元）。
冷却台：冰袋或冰盘可用于击倒标本和/或保持标本被击倒。
培养箱：建议使用培养箱饲养标本，并在杀虫剂处理后将标本保持24小时。如果没有孵化器，可以建造它。建造培养箱所需的设备包括绝缘容器，加湿器，加热电缆，湿度和温度控制器以及灯，其总成本应为约170美元，遵循并扩展了以前的方法44。
保温杯：虽然塑料杯用于分拣和保温处理过的标本，但蜡衬里纸杯或玻璃容器将是合适的替代品。
生物体和生命阶段修饰：
这种方法非常适用于其他载体，昆虫和/或节肢动物，如 Culex quinquefasciatus 蚊子32，家蝇32和蟑螂45，以及非成虫生命阶段，如蚊子幼虫46。
局部应用位置修改：
这种方法描述了将杀虫剂应用于蚊子的腹侧胸部和腹部区域（以及果蝇的背部）。但是，只要暴露部位一致，就可以使用其他应用位置。一致性很重要，因为杀虫剂的敏感性可以根据施用地点32而变化。
故障排除建议： 此方法有几个最初具有挑战性的步骤。下面描述的是一些可能遇到的最常见问题。
泄漏/蒸发杀虫剂溶液：
杀虫剂通常溶解在丙酮中，丙酮是一种高挥发性的化合物。这意味着丙酮在室温下迅速蒸发，随着时间的推移增加杀虫剂的浓度。如果杀虫剂溶液似乎泄漏或蒸发，请重新制作溶液，确保管的盖子紧紧地打开，并仔细检查是否正确遵循了存储协议（例如，正在使用parafilm，并且管子是直立存储的）。如果泄漏持续存在，请尝试用较低的体积填充管子，以便为丙酮在不同温度下经历的体积变化留出更多空间。此外，如果使用丙酮作为溶剂，请确保管子的额定丙酮储存（例如，FEP，TFE和PFA塑料）。如果使用疏水性杀虫剂，请将溶液储存在玻璃瓶中（因为疏水性杀虫剂对玻璃的粘附力小于塑料）。在储存之前标记溶液的半月板以监测蒸发也是一种很好的做法。
称量生物体时微量天平上的重量漂移：
如果秤上的重量读数漂移（缓慢上升或下降），这可能是由于静电。漂移最常发生在称量塑料物品中的生物体时，因为塑料很容易保持静电荷。为了避免这种情况，可以将称重纸放在正在称重的塑料容器下方，也可以使用玻璃等非塑料容器。
异常死亡率结果：
死亡率结果可能看起来异常，例如在对照组中观察到高死亡率，或者在所有杀虫剂剂量中观察到高/低死亡率。查看以下案例以对每个方案进行故障排除。
高控制死亡率
如果对照组的死亡率很高（10%或更高），请评估敲低方法和敲低标本的时间长度。如果可能，缩短试样被击倒的时间长度。对照中高死亡率需要考虑的其他潜在因素包括i）检查培养箱设置是否正确 - 异常的温度和/或湿度可能导致死亡率增加。应使用独立的数据记录仪检查温度和湿度。ii） 评估昆虫处理情况。过多或过于粗略地处理昆虫可能导致高死亡率。iii）检查用于治疗对照组的100%丙酮或仪器上是否有杀虫剂污染。更换丙酮，并用丙酮或乙醇清洁所有仪器。通过经常更换手套、防止溢出和清洁仪器来避免污染。请注意，在 补充文件3中，最多有两只蚊子在对照杯内死亡（仅丙酮）。这种死亡率水平被认为并不高（低于10%），因此，没有理由担心。
所有暴露组（但对照组除外）死亡率高
使用较低的杀虫剂浓度或较小的剂量进行测试。使用的剂量可能高于不会诱发死亡的最低剂量。使用几种10倍稀释液来确定正确的剂量范围，并排除污染。为避免污染，请开始以最低浓度加样，并努力达到最高浓度。此外，确保使用的所有设备都定期用丙酮和/或乙醇清洁，施加在试样上的剂量非常小，即使是最轻微的交叉污染也可能影响结果。
所有暴露群体的死亡率低
使用较高的杀虫剂浓度。使用的剂量可能都太低，无法导致人口死亡。为了确定正确的剂量范围，将标本暴露于几个10倍的浓缩剂量。确保杀虫剂溶液未过期或降解（可能是由于高温或光照）。如果解决方案已过期或被怀疑已降级，请重新制作解决方案并确保遵循适当的存储条件。
重复/天之间的死亡率不一致
昆虫暴露于杀虫剂的时间可能会影响所表达的抗药性水平，特别是对于代谢抗性34。在每天的同一时间窗口重复此方案，以避免一天中的时间作为导致死亡率变化的潜在变量。导致重复之间死亡率不一致的其他潜在因素包括i）实验之间差异饲养的标本。确保所有标本的年龄范围相同，在相同的温度和相似的密度和食物供应下饲养。ii）杀虫剂浓度随着时间的推移而降解或由于丙酮蒸发而变得更加浓缩。重新制定解决方案并确保适当的储存条件。iii） 死亡率评分不一致。确保同一个人对死亡率进行评分，或制定一个明确的方案，以便在整个团队中一致使用。使用盲评分来减少死亡率评分的偏差。
粘在分拣托盘表面的昆虫：
丙酮与该协议中使用的塑料发生反应，例如培养皿。如果在培养皿或类似的塑料表面上使用丙酮，试样可能会粘附在表面上。通过在分拣托盘上衬有称量纸或使用非塑料分拣托盘，可以避免这种粘连。此外，分拣托盘或保温杯中塑料表面的冷凝会导致昆虫粘附在冷凝物上，或者标本可能太冷并可能冻结到表面。调整敲低方法以减少冷凝，同时防止试样变得太冷/冷冻（例如，将称量纸放在试样和塑料分拣托盘之间）。
R 分析误差：
一旦收集了死亡率数据，分析过程中可能会发生各种并发症。R 代码无法完成数据文件操作的最常见原因是数据格式与代码不匹配（例如，列标题和/或空单元格）。如果出现更严重的并发症，请参阅 Rstudio35 中内置的 R 帮助页面。
上述局部应用方法的局限性：
通过局部施用方法吸收杀虫剂不会模仿自然暴露：
在原体上局部应用不是杀虫剂吸收的自然方式。在野外，昆虫大多通过腿部吸收杀虫剂，在它们与经杀虫剂处理的表面接触的时间长度上或在翅膀上通过小气溶胶颗粒47，48吸收杀虫剂，而不是在腹侧表面快速暴露。然而，直接应用已知杀虫剂剂量将准确地建立对杀虫剂的表型反应，这是遗传和进化研究或跨空间或时间比较杀虫剂易感性所必需的。因此，这种方法有利于测试技术耐药性，但不会直接测量实际耐药性（实际干预工具在现场设置中的功效15）。然而，重要的是要注意，目前的标准方法（例如，世卫组织试管试验和CDC瓶装生物测定）也无法捕获或模拟现场的气溶胶（即通过雾化）杀虫剂暴露。
局部应用测定只能评估接触吸收杀虫剂：
该方法适用于通过接触和吸收杀虫剂而起作用的杀虫剂，并且不用于口服杀虫剂，例如通常用于有吸引力的有毒糖饵中的硼酸49。
方法的意义：
局部应用方法通过计算致死剂量（非浓度）和测量技术（不实用）抗性15，扩展了已建立的杀虫剂生物测定标准。下面给出了该方法相对于现有杀虫剂敏感性测定的优缺点。
致死剂量计算：
该方法确定杀虫剂的致死剂量，而不是CDC和WHO生物测定用于确定判别剂量11的致死浓度。致死剂量更有意义，因为它是已知可诱发死亡率的定量杀虫剂。相比之下，致死浓度不考虑生物体实际获得的杀虫剂量。当使用致死剂量计算时，可以更准确地观察和量化性别或大小依赖性易感性特征之间的差异，使这种测量更加通用。
技术阻力：
该方法评估技术电阻，即在标准化，受控环境中测量的电阻。这种测量适用于监测杀虫剂耐药性的传播，并将表型耐药性与潜在标志物15联系起来。由于局部应用生物测定导致死亡率变化降低，因此可以更好地鉴定新的耐药标志物。然而，由于杀虫剂不自然地暴露于蚊子，该测定不适用于估计特定干预措施在特定人群中的疗效。需要其他测定来测量这种实际电阻15。
试样适应性：
这种方法可以在其他重要的节肢动物上实施，例如作物害虫（例如，科罗拉多马铃薯甲虫），家养害虫（例如蟑螂和臭虫）或传粉媒介（例如蜜蜂），只需简单地改变敲低方法和/或杀虫剂剂量，体积和/或浓度（如上所述）。适应性的易用性可以帮助类比不同研究领域的杀虫剂耐药性研究。使用LD50 值代替杀死50%标本的致命浓度（LC50）可以跨物种进行准确比较。
成本：
与CDC瓶装生物测定和WHO试管测试类似，运行局部应用测定的成本最低（见 材料表）。必不可少的设备是注射器（约70美元）和分配器（约100美元），可在分析过程中重复使用。
所需试样数量：
每个局部应用测定杯应使用至少20-25个标本。建议每个实验至少测试五种杀虫剂浓度，建议至少三次重复。总体而言，这导致完成测试至少需要300-375个标本，与使用WHO管测试或CDC瓶装生物测定进行耐药强度测试所需的标本数量相当。然而，如果局部应用生物测定法降低了变异性，则相同数量的标本可能会产生更大的统计能力来比较跨空间或时间的易感性数据。
Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项研究得到了美国国家科学基金会授予SH的CAREER奖的支持，奖项编号为2047572。我们感谢Damien Rivera在果蝇饲养和局部应用测定准备方面的帮助，威斯康星大学麦迪逊分校的Ganetzky博士分享了他的Canton-S果蝇菌株，疾病控制和预防中心分享了洛克菲勒菌株，美国农业部医学农业和兽医昆虫学中心分享了IICC同种线菌株。 图 1 是使用 BioRender.com 创建的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thomas Scientific | 20A00L068 | Acetone aliquot storage |
| 1.5 mL screw cap tubes | Thomas Scientific | 1182K23 | Insecticide dilution storage |
| 15 mL conical tubes | VWR | 339651 | Insecticide dilution storage |
| 20 mL glass scintillation vials | Fisher Scientific | 0334125D | Fruit fly weighing |
| 25 μL syringe | Fisher Scientific | 14815288 | Topical applicator |
| Acetone | Fisher Scientific | AC423240040 | ACS 99.6%, 4 L |
| Aedes aegypti (IICC strain) | USDA CMAVE | NA | Insecticide resistant |
| Aedes aegypti (Rockefeller strain) | CDC | NA | Insecticide susceptible |
| Analytical scale | Fisher Scientific | 14-557-409 | Precision up to 0.1 mg |
| Aspirator | Amazon | 6.49986E+11 | Mosquito collection device |
| Bench paper | VWR | 89126-794 | Place under workspace |
| Cotton swabs | Amazon | B092S8JVQN | Use for sorting insects |
| Cotton wool balls | Amazon | B0769MKZWT | Use for sucrose solution |
| Dispenser | Fisher Scientific | 1482225 | Repeater pipettor |
| Drosophila melanogaster (Canton-S strain) | University of Wisconsin-Madison | NA | Insecticide susceptible |
| Fine-tipped paint brushes | Amazon | B07KT2X1BK | Use for sorting insects |
| Fruit fly stock bottles | Fisher Scientific | AS355 | Use for rearing and sorting fruit flies |
| Hand-held CO2 dispenser | Fisher Scientific | NC1710679 | Use for knocking down insects |
| Holding cups | Amazon | B08DXG7V1S | Clear plastic |
| Ice pack | Amazon | B08QDWMMW5 | Use for knocking down fruit flies |
| Ice trays | Amazon | 9301085269 | Use for knocking down insects |
| Insect forceps | Amazon | B07B4767WR | Insect forceps |
| Insecticide | Sigma-Aldrich Inc | 45423-250MG | Deltamethrin |
| Labeling stickers | Amazon | B07Q4X9GWX | 3/4" Color dot stickers |
| Labeling tape | Amazon | B00X6A1GYK | White tape |
| Netting | Amazon | B07F2PHHWV | Use for covering holding cups and insect handling tent |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712H371 | 100 mm x 15 mm |
| PVC Pipe | Lowe’s | 23971 | Insect handling tent materials |
| Rubber bands | Amazon | B00006IBRU | Use for securing mesh/net on cups |
| Sucrose | Amazon | B01J78INO0 | Granulated White Sugar |
| Weighing paper | VWR | 12578-165 | 4" x 4" |
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