Summary
Vi beskriver metoden og vigtigheden af det aktuelle applikationsbioassay til måling af insekticidmodtagelighed hos myg og bananfluer. Det præsenterede assay er højt gennemstrømning, anvender insektmasse - hvilket gør det muligt at beregne en masserelativiseret dødelig dosis i stedet for koncentration - og har sandsynligvis lavere variabilitet end andre lignende metoder.
Abstract
Den fortsatte anvendelse af insekticider til folkesundhed og landbrug har ført til udbredt insekticidresistens og hæmning af kontrolmetoder. Insekticidresistensovervågning af mygpopulationer udføres typisk gennem Centers for Disease Control and Prevention (CDC) flaskebioassays eller Verdenssundhedsorganisationens (WHO) rørprøver. Disse metoder kan imidlertid resultere i en høj grad af variation i dødelighedsdata på grund af variabel insekticidkontakt med insektet, det relativt lille antal testede organismer, omfattende variation i masse mellem populationer og konstant skiftende miljøforhold, hvilket fører til variable resultater. Dette papir præsenterer den aktuelle applikation bioassay, tilpasset som et fænotypisk bioassay med høj gennemstrømning til både myg og bananfluer, for at teste et stort antal insekter langs en række insekticidkoncentrationer.
Dette assay 1) sikrer ensartet behandling og insekticidkontakt med hver organisme, 2) producerer meget specifikke dosis-responskurver, der tegner sig for forskelle i gennemsnitlig masse mellem stammer og køn (hvilket er særligt vigtigt for feltindsamlede organismer), og 3) giver mulighed for beregning af statistisk strenge mediane dødelige doser (LD50 ), som er nødvendige for sammenligninger af resistensforhold - en alternativ overvågningsmetode fra diagnostisk dosisdødelighed, som også anvendes til overvågning af larvicidresistens. Dette assay vil være et supplerende værktøj til nøjagtig fænotyping mygpopulationer og, som illustreret ved hjælp af frugtfluer, er let at tilpasse til brug med andre insekter. Vi hævder, at dette assay vil hjælpe med at udfylde kløften mellem genotypisk og fænotypisk insekticidresistens i flere insektarter.
Introduction
Myg er ansvarlige for over 700.000 dødsfald hvert år på grund af de sygdomme, de overfører til mennesker, med over halvdelen af disse dødsfald på grund af malaria alene1. Den vigtigste forebyggende metode mod overførsel af malaria og andre vektorbårne sygdomme er brugen af insekticider, ofte i form af langvarige insekticidnet eller indendørs restsprøjtning2. Insekticidresistens er imidlertid udbredt blandt myg og andre insektvektorer samt landbrugsskadedyr 3,4. For effektivt at håndtere modstanden er overvågning af afgørende betydning5. Til dette er der behov for meget nøjagtige metoder til detektion af modstand med høj gennemstrømning. I øjeblikket er de mest udbredte værktøjer til overvågning af insekticidresistens for myg WHO-rørtest6 og CDC-flaskebioassay7. For bananfluer er den resterende kontaktpåføringsmetode (svarende til CDC-flaskebioassay) et almindeligt anvendt insekticidbioassay 8,9,10. Imidlertid er variabiliteten i data fra disse metoder typisk høj, med målinger af den samme laboratoriemygstamme, der spænder fra ~ 20-70% dødelighed i CDC-flaskeassays og 0-50% i WHO-rørprøver, når de udsættes for subletale doser11. En sådan variation er overraskende, fordi den begrænsede genetiske variation i de fleste laboratoriestammer forventes at føre til begrænset variation i insekticidfølsomheden i befolkningen. Ikke desto mindre er der stadig en høj grad af variation observeret i bioassayresultaterne.
Potentielle kilder til denne variation kan være et resultat af heterogen eksponering for insekticider mellem prøver i bioassayet på grund af indirekte eksponering for insekticider via overfladen, heterogene miljøvirkninger, normal biologisk variation mellem individer af samme genotype og variation i massen af prøver af samme population12 . En sjældent anvendt metode med højere replikabilitet er det aktuelle applikationsbioassay. I dette assay påføres insekticidet direkte på hvert insekt13,14, hvilket fjerner faktoren for heterogen eksponering af forskellige prøver inden for samme assay. På grund af denne metodes langsomme gennemstrømning anvendes den imidlertid ikke rutinemæssigt som et værktøj til overvågning af insekticidmodtagelighed for mygpopulationer. Dette papir præsenterer en modificeret protokol for det aktuelle applikationsbioassay, der giver mulighed for eksponeringer med højere gennemstrømning, samtidig med at der korrigeres for variation i insektmasse, en parameter, der korrelerer med ændringer i insekticidmodtagelighed12. En reduktion i støj og masserelateret variation i dødelighedsdata fra variabel eksponering for insekticider ville muliggøre en mere nøjagtig teknisk resistensovervågning11,15. Sådanne data kan bruges til mere præcist at forbinde fænotypisk resistens med genetiske markører, fitnessparametre og/eller vektorkompetence. Derudover demonstrerer vi, hvordan dette assay let kunne tilpasses andre insektarter ved at bruge det aktuelle applikationsbioassay på bananfluer, en mindre kropslig insektart.
Hovedbegrænsningen ved ovennævnte restkontaktanvendelser er, at eksponeringen for insekticider kan variere fra prøve til prøve inden for samme assay. I tilfælde af CDC-flaskebioassays og kontaktmetoden kan insekticideksponering variere mellem replikater af det samme assay. Insekterne udsættes for insekticid, der enten fordeles på indersiden af en glasflaske (CDC-flaskebioassay og kontaktmetode) eller på imprægneret papir (WHO-rørtest). Koncentrationen af insekticid på begge overflader (glas og papir) er kendt og forudbestemt ved screening af forskellige arter af kendte genotyper. Den mængde, der potentielt kan absorberes af insektet, kan dog variere meget afhængigt af den anvendte overflade, insekticidblandingskomponenterne, og hvor homogent insekticidet fordeles over overfladematerialet16,17. I CDC-flaskebioassayet er insekticidbelægningen på indersiden af flasken afhængig af procedurer, der anvendes af hvert laboratorium og bruger. I WHO's rørprøve er de insekticidbehandlede papirer centralt produceret og dermed højst sandsynligt ret homogene på tværs af laboratorier. I WHO-rørtesten tillader eksponeringsrøret imidlertid prøver at lande og hvile på ikke-insekticideksponeret metalnet, hvilket fører til potentiel heterogen insekticideksponering blandt prøverne inden for hver test. Den faktiske mængde insekticid, der opfanges og absorberes af prøver via hver metode, skal stadig undersøges yderligere18.
Derudover anvendes CDC-flaskebioassay, WHO-rørtest og kontaktmetode mest som tærskelassays, der kun tester en forudbestemt insekticidkoncentration. Denne fremgangsmåde kan nøjagtigt registrere tilstedeværelsen af resistens og er værdifuld til resistensovervågning (især når modstanden spredes). Tærskelassays kan imidlertid ikke kvantificere resistensens styrke, hvilket kan være mere forudsigende for interventionsværktøjernes effektivitet. Hvis der anvendes flere insekticidkoncentrationer med disse metoder, kan de bruges som intensitetsassays. Intensitetsassays for CDC-flaskebioassay og WHO-rørtesten er blevet introduceret ved at teste 5x og 10x de forudbestemte diskriminerende doser for at løse dette hul i overvågning 6,19. Samtidig med at det giver større evne til at skelne mellem resistente populationer, giver 3-5 (forudbestemte) doser begrænset opløsning til beregning af dødelige koncentrationer. Derudover anvendes myg i forskellige størrelser i sådanne assays. Alligevel er massen vigtig at måle, da større prøver muligvis har brug for en højere dosis for at blive dræbt, da den effektive dosis pr. Masseenhed vil være meget lavere end for en mindre organisme12. Beregning af en masserelativiseret dødelig dosis (mængde insekticid pr. Insektmasse) ville være en mere nyttig metrik end den mere almindelige dødelige koncentration (f.eks. Mængden af insekticid pr. Overfladeareal), da den overvejer variationen i insektmasse mellem køn, populationer og genotyper. Sådanne data vil bidrage til at udfylde kløften mellem genotypisk og fænotypisk resistens i laboratoriet og i marken og kan også give en nem måde at beregne den nødvendige anvendelseskoncentration til behandling af en population af insekter med en kendt gennemsnitsmasse.
Anvendelsen af masserelativiserede dødelige doser, der dræber 50% af prøverne (LD50), indeholder også flere andre fordele. Vurdering af toksiciteten af en specifik forbindelse i mg/kg (= ng/mg) er standard i human- og veterinærtoksikologi14, og LD50-værdier findes på sikkerhedsdatablade for materialer. Dødelige doser tillader også direkte sammenligning af toksicitet mellem forskellige kemikalier mod en bestemt art eller det samme kemikalie mod forskellige arter20 samt evaluering af høj kvalitet af nye insekticider og kemikalier13. Derudover kan LD50 give mere meningsfulde og nøjagtige resistensforhold end dem, der stammer fra diagnostiske dosisdødelighedsresultater, hvilket kan resultere i en overvurdering af resistensniveauet i en population. Derfor ville dette assay være egnet til rutinemæssige overvågningsprogrammer ved at tilvejebringe strengere resistensovervågning baseret på masserelativiserede dødelige doser afledt af flere prøver end anbefalet til andre bioassays21.
Den aktuelle anvendelsesmetode er blevet anvendt til overvågning af insekticidmodtagelighed for myg og fluer som et alternativ til standard bioassays for insekticidmodtagelighed, når resistens allerede er kendt eller mistænkt22,23, samt til overvågning af nogle skadedyrsinsekter24 for mere præcist at vurdere resistensprofiler og insekticid iboende toksicitet21 . I bioassays med topisk anvendelse påføres insekticidet på hver organisme, hvilket resulterer i minimal variation i insekticideksponering. Dette papir præsenterer en let tilpasset og forbedret metode, der gør det muligt at anvende insekticideksponering på et stort antal insekter på kort tid, samtidig med at der kontrolleres for insektmasse22. Denne metode med højere gennemstrømning med gode niveauer af replikabilitet kan være et nyttigt ekstra værktøj til rutinemæssig overvågning af insekticidmodtagelighed.
Protocol
BEMÆRK: Insekticider kan forårsage farer for mennesker, dyr og miljø25. Forsigtighed, træning og personlige værnemidler anbefales stærkt. Sørg for at følge materialesikkerhedsdatabladene for alle anvendte insekticider og opløsningsmidler.
1. Bageste prøver
- Bageste 3-5 dage gamle voksne myg.
BEMÆRK: Protokollen nedenfor afspejler betingelserne for Aedes aegypti-opdræt , nøje efter FN's Fødevare- og Landbrugsorganisations retningslinjer26.- Bageste myg i alle livsfaser ved 27 ± 1 °C og 75 ± 5% relativ luftfugtighed med 12:12 timers lys og mørk cykling.
- Klæk myggeæggene ved at nedsænke dem i deioniseret vand og tilsætte gær26, eller læg de nedsænkede æg inde i et vakuumkammer i 30 minutter.
BEMÆRK: Begge metoder nedsætter iltindholdet i vandet og øger udklækningen27. - Foder de nyklækkede larver fiskefoder (eller en tilsvarende kost som f.eks. kattefoder) i bakker, og hold larvetætheden så ens som muligt mellem bakkerne, da larvetætheden påvirker udviklingen12 (f.eks. 200-250 larver pr. bakke, der indeholder i alt 1,5 liter vand).
- Foder larverne hver anden dag, indtil de når puppestadiet (ca. 7-10 dage), hvilket øger mængden af mad efter behov.
BEMÆRK: Når der fodres for lidt, vil larvevæksten blive hæmmet, og larverne kan spise hinanden. Når de fodres for meget, kan larverne dø, hvilket får vandet til at gå galt. - Når pupper udvikler sig, overføres de dagligt til en vandskål i voksne myggebure og giver 10% saccharoseopløsning ad libitum.
- Optag den første dag med voksen fremkomst. Fjern de resterende pupper fra buret 2 dage efter fremkomsten starter.
BEMÆRK: Mandlige myg dukker hurtigere op. Bemærk fremkomsten af mænd og kvinder separat, og sørg for, at der er tilstrækkelige mænd og kvinder til rådighed for hver test. - Vent i 3 dage efter fjernelse af pupperne for at opnå 3-5 dage gamle myg til test.
- Bageste bananfluer (løst efter protokoller fra Zürich Universitet28).
- Bageste Drosophila stammer i lagerflasker ved 23 ± 1 ° C og 60 ± 5% relativ luftfugtighed med 12:12 timers lys og mørk cykling.
BEMÆRK: Drosophila lagerflasker skal indeholde 75 ml af et standard fluemedium, som først hældes som væske i bunden af flaskerne og derefter får lov til at størkne natten over. - Overfør kolonier til nye lagerflasker med frisk mad hver anden uge for at forhindre overbefolkning og skimmelvækst. For at gøre dette skal du slå fluer ned ved hjælp af en håndholdt kuldioxid (CO2) dispenser, overføre de anæstetiserede fluer til et vejepapir på en ispose eller et kølebord og børste fluerne i en frisk lagerflaske ved hjælp af en fintippet pensel. Sørg for at holde flaskerne på deres sider under denne proces for at forhindre fluer i at falde ind i maden og drukne.
- Bageste Drosophila stammer i lagerflasker ved 23 ± 1 ° C og 60 ± 5% relativ luftfugtighed med 12:12 timers lys og mørk cykling.
2. Forbered insekticidformuleringer ved hjælp af den gravimetriske tilgang
- Lav den første stamopløsning efter den gravimetriske tilgang ved hjælp af en analytisk skala med 0,1 mg nøjagtighed inde i en stinkhætte.
BEMÆRK: Den gravimetriske tilgang bruger masse til at måle mængderne af tilsat insekticid og opløsningsmiddel. Standardpraksis (volumetrisk tilgang) vil kræve en analytisk skala for at måle mængden af (fast) insekticid, der tilsættes, når den første stamopløsning fremstilles; Mængden af tilsat opløsningsmiddel og alle følgende fortyndinger måles dog kun i volumen. Den gravimetriske tilgang har en højere grad af nøjagtighed og foretrækkes derfor.- Bestem målkoncentrationen af insekticider og målvolumen (maksimalt 10 ml anbefales, hvis der anvendes 15 ml koniske rør for at forhindre spild ved opbevaring i en fryser) for den første stamopløsning, og beregn, hvor meget insekticid aktiv ingrediens (AI) der skal tilsættes ved hjælp af Eq (1):
(1) - Forbered et opbevaringsrør (15 ml konisk rør anbefales til større volumener, 1,5 ml mikrocentrifugeskruehætterør anbefales til volumener på 1 ml eller mindre) og mærk med insekticid og opløsningsmiddelnavn, målkoncentration og forberedelsesdato. Placer røret og låget på vægten i et stativ eller en holder, og tare skalaen.
- Den ønskede mængde fast eller flydende insekticid AI bestemt ud fra trin 2.1.1 vejes. (f.eks. deltamethrin, der anvendes til de repræsentative data) i røret og registrere massen.
- Tara skalaen og tilsæt det ønskede volumen opløsningsmiddel (svarende til målvolumenet) til røret, luk låget straks og optag massen. Luk rørets låg umiddelbart efter tilsætning af opløsningsmidlet (acetone bruges her) for at undgå fordampning og bland opløsningen.
- Optag stuetemperaturen. Nogle opløsningsmidler, såsom acetone, kan have betydelige ændringer i volumen (og følgelig densitet) afhængigt af temperaturen.
- Hvis det opbevares med det samme, skal du pakke rørets låg ind i parafilm (for at reducere fordampningen), placere det i et rørstativ /holder (for at holde sig oprejst og forhindre lækage), dække det i folie (for at forhindre UV-eksponering), placere det i en gensælgelig plastpose (for at reducere fordampningen) og placere posen i en -20 °C fryser. Hvis det ikke opbevares med det samme, skal du sørge for, at låget er fastgjort og dækket i folie eller en lysbeskyttet beholder.
- Stamopløsningens faktiske koncentration (mg/ml) beregnes ved at dividere massen af tilsat insekticid AI med mængden af tilsat opløsningsmiddel (og mængden af tilsat insekticid, hvis det er i flydende form). For at beregne volumenet af tilsat opløsningsmiddel (eller flydende insekticid) divideres den tilsatte masse med den kendte densitet, der er passende for den registrerede temperatur.
- Stamopløsningens masse masse (g/ml) beregnes ved at dividere den samlede tilsatte masse (insekticid og opløsningsmiddel) med det samlede tilsatte volumen (opløsningsmiddel og insekticid, hvis det er i flydende form). Se trin 2.1.7 for konvertering af flydende masse til volumen.
- Bestem målkoncentrationen af insekticider og målvolumen (maksimalt 10 ml anbefales, hvis der anvendes 15 ml koniske rør for at forhindre spild ved opbevaring i en fryser) for den første stamopløsning, og beregn, hvor meget insekticid aktiv ingrediens (AI) der skal tilsættes ved hjælp af Eq (1):
- Fortynd serielt den oprindelige stamopløsning via 10% fortyndinger. Brug om nødvendigt disse serielle fortyndinger til at oprette en indledende dosis-responskurve for at identificere målområdet for insekticidkoncentrationer for bioassay.
- Beregn volumenet af insekticid stamopløsning og opløsningsmidlet, der skal tilsættes til hvert rør (f.eks. 1 ml insekticid stamopløsning fortyndet i 9 ml opløsningsmiddel til en 10 ml fortynding på 10% af den foregående koncentration).
- Vortex stamopløsningen i 10 s. Tare et formærket første fortyndingsrør på skalaen. Tilsæt det krævede volumen stamopløsning til det første fortyndingsrør ved hjælp af en pipette. Luk straks låget på begge rør og optag massen i det første fortyndingsrør.
- Tare det første fortyndingsrør igen og tilsæt det krævede volumen opløsningsmiddel. Luk låget straks, registrer massen af det tilsatte opløsningsmiddel, og hvirvel den første fortynding i 10 s.
- Gentag trin 2.2.2 og 2.2.3 for de resterende fortyndinger.
- Opbevar alle fortyndinger som beskrevet ovenfor i trin 2.1.6.
- De faktiske koncentrationer af fortyndingerne beregnes ved at følge trin 2.1.7.
- Beregn densiteten af hver insekticidfortynding ved at dividere den samlede tilsatte masse (insekticidopløsning og opløsningsmiddel) med det samlede volumen tilsat (insekticidopløsning og opløsningsmiddel). For hver seriel fortynding anvendes den tidligere insekticidbestandsfortyndingstæthed til at beregne den nye fortyndingstæthed efter Eq (2):
(2)
- Valgfrit: Opret insekticidfortyndinger med mindre trin ved seriel fortynding.
- Vælg koncentrationer og volumener af hver ny opløsning, der skal fremstilles ved hjælp af en dosis-respons-kurve for de indledende serielle fortyndinger, tidligere forsøg eller offentliggjort litteratur.
BEMÆRK: Udvalgte koncentrationer bør resultere i et dødelighedsområde på 0-100%, med mindst tre koncentrationer fra dette interval for at muliggøre Probit-analyse. - Brug de serielle fortyndinger som stamopløsninger til at fremstille hver ny fortynding, og følg trin 2.2 for at skabe de nye fortyndinger mellem de 10 gange fortyndinger.
- Vælg koncentrationer og volumener af hver ny opløsning, der skal fremstilles ved hjælp af en dosis-respons-kurve for de indledende serielle fortyndinger, tidligere forsøg eller offentliggjort litteratur.
- Valgfrit: Aliquot insekticidopløsningen. Hvis der fremstilles større mængder af insekticidopløsningerne, aliciteres opløsningerne i 1,5 ml skruelågsrør for at undgå forurening, fordampning og nedbrydning af stamopløsningerne fra hyppig håndtering og udsættelse for lys.
- Aliquot opløsningerne, startende fra den laveste koncentration og arbejde hen imod den højeste koncentration for at reducere potentiel forurening. Bland hver stamopløsning ved at hvirvle i 10 s, før du åbner og pipetterer det ønskede volumen (f.eks. 0,5 ml) i et formærket skruehætterør.
- Opbevar aliquoterne i en lysbestandig beholder i en -20 °C fryser.
BEMÆRK: Det anbefales regelmæssigt (månedligt) at erstatte alikvoter med små nye alikvoter taget direkte fra lagerets pesticidfortyndelser. Dette vil begrænse risikoen for kontaminering, der kan overføres til andre forsøg eller ændringer som følge af fordampning eller UV-nedbrydning, mens prøverne anvendes på bænken. Protokollen kan sættes på pause her og genstartes selv år senere, så længe insekticidopløsningerne opbevares korrekt (se trin 2.1.6) og opbevares i fryseren -20 °C.
- Brug en permanent markørpen til at markere menisken inden opbevaring for at overvåge fordampningen af opløsningsmiddel. Når du fjerner insekticidopløsning for at lave alikvoter, skal du markere menisken hver gang opløsningen fjernes.
(1)
(2)3. Forbered arbejdsområdet til bioassay til topisk anvendelse
BEMÆRK: Det anbefales at arbejde i et insekthåndteringstelt til en stationær bordplade for lettere at fange undslippe myg eller fluer. Se supplerende figur S1 for billeder af et insekthåndteringstelt.
- Fjern de nødvendige insekticidopløsninger fra fryseren, hvirvlen straks, og læg dem i en lysbestandig beholder ved stuetemperatur for at lade insekticiderne varme op til stuetemperatur inden brug.
BEMÆRK: Insekticid-UTI'er kan adskilles fra opløsningsmidlet ved køligere temperaturer. Derudover ændres acetonevolumen med temperaturen, hvilket kan ændre den påførte insekticiddosis. Blanding af opløsningerne og lade dem varme op til stuetemperatur hjælper med at sikre konsistens, når du bruger insekticidopløsningerne. - Angiv alle nødvendige værktøjer og materialer til det aktuelle applikationsassay i insekthåndteringsteltet som refereret i materialetabellen.
- Rengør sprøjtetønden og nålen med acetone af analytisk kvalitet ved at gennemføre 5 vaske pr. acetonealikvote. Udfyld dette med 5 separate alikvoter til i alt 25 vaske. Se supplerende figur S2 for sprøjte- og repeaterpipettordele.
- Sæt 5 mikrocentrifugerør ud med 0,5 ml acetone hver.
- Fyld sprøjtetønden med 0,025 ml acetone fra det første rør, og udvis derefter acetonen i en affaldsbeholder ved hurtigt at skubbe ned på stemplet. Gentag fire gange mere for at fuldføre i alt fem acetonevasker fra den samme acetone aliquot. Fyld derefter sprøjtetønden helt med luft og udvis luften og potentielle acetonrester i affaldsbeholderen. Gentag to gange mere for at fuldføre tre "vaske" med luft.
- Gentag trin 3.3.2 for de resterende 4 rør acetone.
- Opret en luftlomme i tønden mellem sprøjtestemplet og toppen af nålen ved at trække stemplet lidt op i tønden (~ 5 mm).
BEMÆRK: Denne luftlomme beskytter stemplet mod at kontakte insekticidopløsningerne og reducerer overførsel af insekticid. - Sæt sprøjten til side, indtil den er klar til brug til topisk påføring.
- Opret en nøgle, der indeholder de doser, der skal anvendes, og tildel tilfældige id'er efter tilfældige tal- eller bogstavgeneratorer (se Supplerende fil 1).
- Mærk plastikbæerne med det tilfældige ID til vurdering af blind dødelighed.
BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt, kan protokollen sættes på pause her og genstartes på en senere dag og et senere tidspunkt. Hvis der går mere end et par timer, mens du holder pause, opfordres det til at gentage trin 3.3 for at sikre, at sprøjten er ren og at placere insekticidopløsningerne tilbage i fryseren indtil ca. en time før dosering af insekterne og derefter gentage trin 3.1.
4. Forbered prøver til det aktuelle bioassay. Se figur 1 for en proceduremæssig oversigt
- Sorter og vej myggene
- Brug en aspirator drevet af sugning fra indånding, aspirere det ønskede antal 3-5 dage gamle voksne myg, der er nødvendige for analysen, herunder et overskud til at tage højde for beskadigede individer. Overfør myggene til et konisk rør (op til 100 myg pr. Rør) ved at placere spidsen af aspiratoren i røret med bomuld viklet rundt om spidsen og forsigtigt udånde og tryk på aspiratoren. Brug bomulden til at tilslutte røret, når aspiratorspidsen fjernes, og hætte derefter med låget. Undgå at fylde aspiratoren og rørene med for mange myg på én gang, da dette tilføjer yderligere stress på myggene og kan forårsage død.
- Slå kortvarigt myggene ned i rørene ved at placere dem i mindst 10 minutter ved 4 °C eller begrave dem under is i en isbakke.
BEMÆRK: Myg kan holdes ved 2 ° C i flere timer med minimal dødelighed29; Det er dog bedst at minimere den varighed, hvor myggene er på is for at reducere potentielle negative virkninger. - Overfør de væltede myg til insekthåndteringsteltet og tip forsigtigt myggene ud på en plastikbakke (f.eks. Petriskål) placeret på isen. Hæld kun ca. 50 myg ad gangen for at sikre, at hver rører ved den kølige bakke under den og forbliver slået ned.
- Sorter myggene efter køn ved forsigtigt at samle dem op ved benet (e) (eller vingerne) med tang og læg hvert køn i en separat holdekop. Tæl antallet af myg af hvert køn under sortering og stop, når det ønskede antal er nået. Under sortering skal du fjerne eventuelle myg, der er skadet (f.eks. Manglende ben) eller er ekstra store (f.eks. Unormalt forstørret mave) eller små (let skelnes med det blotte øje som mindre end den gennemsnitlige mygstørrelse for den pågældende population).
BEMÆRK: Håndtering af myggene ved hjælp af vedhængene reducerer strukturel skade på deres bløde primære kroppe (f.eks. Mave). - Optag vægten af hver kop myg ved hjælp af en analytisk skala med 0,1 mg præcision.
- Læg en tom kop med en petriskål som låg på vægten og tjære vægten. Hæld myggene i beholderen, læg låget ovenpå, og læg beholderen på skalaen.
- Registrer den kombinerede vægt og antallet af prøver på scorearket (se Supplerende fil 2). Placer straks koppen med prøver tilbage på is for at holde dem immobiliserede.
- Gentag trin 4.1.5.1-4.1.5.2, indtil alle kopper prøver er vejet.
- Opdel de tilberedte myg i grupper på 20-25 i separate kopper placeret på is mærket med de tilfældige id'er. Når du overfører myg, skal du sigte mod at reducere stress og fysisk skade forårsaget af tangen. Ideelt set skal du kun samle myggene op ved hjælp af tang 1-2 gange: en gang til sortering / vejning og en potentiel anden gang til overførsel til forsøgskopperne.
BEMÆRK: Et ideelt antal myg pr. Kop er 20-25, hvilket er nok til en replikat, er rimeligt at vurdere dødeligheden og bør ikke resultere i tæthedsinduceret stress / død i koppen.
- Sorter og vej bananfluerne
- Anæstesi fluerne ved hjælp af CO2 i 7 s.
BEMÆRK: Hvis fluer udsættes for CO2 i mere end 7 s, kan de have problemer med at kravle og flyve, når de vågner30. - Hæld fluerne på en ispose pakket ind i bænkpapir og brug en fintippet pensel til at adskille og tælle hanner og hunner.
- Brug penslen til forsigtigt at samle de valgte fluer op og læg dem i en ren, tom lagerflaske. Vælg lige mange han- og hunfluer (f.eks. 15 hanner og 15 hunner), og mærk lagerflaskerne med stammenavnet og bananfluetotalen (f.eks. Canton-S, 30 fluer).
BEMÆRK: Det er vigtigt at have lige mange kvindelige og mandlige bananfluer, fordi mandlige bananfluer kan opleve øget aggression mod hinanden efter at være blevet fjernet fra tilstedeværelsen af hunner31. For at undgå dødelighed eller skader uden insekticid er det derfor bedst at have lige mange mænd og kvinder (eller udelade mandlige frugtfluer helt). - Optag vægten af hver flaske bananfluer ved hjælp af en analytisk skala.
- Anbring et tomt hætteglas (mærket med et tilfældigt ID, se trin 3.4) med en petriskål som låg på skalaen og tare skalaen.
BEMÆRK: Glashætteglas anbefales til brug sammen med bananfluer, da de reducerer det statiske betydeligt. - Anæstesi flasken med bananfluer svarende til hætteglassets tilfældige ID ved hjælp af CO2 i 7 s.
- Hæld bananfluerne på vejepapir og brug papiret som en tragt til at indføre fluerne i hætteglasset. Læg petriskålslåget oven på hætteglasset med bananfluer og læg det på skalaen.
- Registrer den kombinerede vægt og antallet af prøver på scorearket, og læg derefter straks hætteglasset med bananfluer i en bakke med is med låget stadig ovenpå for at forhindre fluerne i at undslippe.
- Gentag trin 4.2.4.1-4.2.4.4 for hver flaske bananfluer.
- Anbring et tomt hætteglas (mærket med et tilfældigt ID, se trin 3.4) med en petriskål som låg på skalaen og tare skalaen.
- Anæstesi fluerne ved hjælp af CO2 i 7 s.
- Når ovenstående trin er fuldført, skal du straks gå videre til næste afsnit.
5. Dosisprøver
- Læg sprøjten med den korrekte insekticidkoncentration. Start med den mindst koncentrerede dosis og arbejd hen imod den mest koncentrerede dosis med hver gruppe af organismer. For at forhindre spild skal du kun fylde sprøjten med det nødvendige volumen insekticid plus en anbefalet ekstra 2 μL.
- Tip prøverne på vejepapir(er) placeret oven på en bakke på isen. Adskil prøverne, der er tæt på hinanden, ved hjælp af en ren, insekticidfri pensel eller vatpind for at give nem adgang til hver prøve til dosering. For myg skal du også bruge penslen til at sikre, at hver prøve ligger på deres dorsum, og deres ventrale overflade vender op.
- Brug sprøjten til at anvende en dråbe insekticidopløsning (eller acetone til kontrol) på det ventrale thorax- og maveområde for myg og dorsum for frugtfluer. Påfør en 0,2 μL dråbe (som kræver en 10 μL sprøjte) til mindre insekter såsom frugtfluer og en 0,5 μL dråbe (som kræver en 25 μL sprøjte) til myg.
BEMÆRK: Insekticidfølsomheden varierer ikke signifikant mellem primære kropsdele (såsom hoved, thorax og mave) sammenlignet med vedhæng (såsom vinger, ben eller snabel)32. Derfor behøver applikationsstedet ikke at være nøjagtigt, så længe dosisdråben påføres den primære krop. Det ventrale thorax- og maveområde vælges til myg, fordi de ofte ligger på deres rygside, når de slås ned, mens dorsum vælges til bananfluer, fordi de ofte ligger på deres ventrale side, når de slås ned. Denne reducerede specificitet af applikationsstedet hjælper med at øge gennemstrømningen af denne metode. - Hæld straks prøverne tilbage i den mærkede plastikkop og dæk koppen med net og et gummibånd. Læg koppen i en ventebakke, og noter på koppen eventuelle prøver, der blev dræbt, beskadiget eller undsluppet i denne proces (for at udelukke dem i den endelige optælling af prøver i den kop). For den første kop skal du registrere det tidspunkt, hvor doseringen er afsluttet.
- Udskift det eller de vejepapirer, som prøverne er anbragt på, for at undgå kontaminering af insekticider mellem doserne.
- Gentag doseringen for hver kop, indtil alle prøver er blevet doseret med de korrekte insekticidkoncentrationer, og registrer sluttidspunktet, når alle prøver er blevet doseret.
- Giv 10% saccharoseopløsning til hver kop via en gennemblødt vatpind og sæt kopperne til side, indtil dødeligheden vurderes den følgende dag. Opbevar myggene ved 27 ± 1 °C med 75 ± 5 % relativ luftfugtighed5 og bananfluerne ved 23 ± 1 °C med 60 ± 5 % relativ luftfugtighed.
BEMÆRK: Vær forsigtig, mens du klemmer bomuldskuglerne for at undgå overmætning eller undermætning. Bomuldskuglerne skal være fugtige, men ikke dryppende. Dryppende sukkervand i koppen kan føre til dødelighed af prøverne og dermed påvirke dødelighedsvurderingen af insekticidet.
6. Vurder dødeligheden
- Registrer prøvedødeligheden ved 24 timer efter påbegyndelsen af insekticideksponering. Klassificer myg som levende, hvis de kan flyve og holde sig oprejst; som døde, hvis de er immobile eller ataxiske (ude af stand til at stå eller lette på flugt), som beskrevet af WHO6. Følg den samme dødelighedsvurdering for bananfluer 8,33.
BEMÆRK: For at vurdere forsinket dødelighed kan dødeligheden desuden vurderes efter 48 og 72 timer med daglige sukkervandsforandringer. - Når dødeligheden er registreret, anbringes alle kopperne med prøver i en indeholdt pose i en fryser i mindst 1 time for at sikre, at alle prøver er døde inden bortskaffelse eller efterfølgende brug (f.eks. Molekylær eller kemisk analyse).
7. Udfør replikater
- Gentag trin 3-6 på et nyt sæt prøver, og pas på at udføre replikater på samme tid hver dag, da insekticidmodtagelighed kan ændre sig afhængigt af tidspunktet på dagen34.
- Sørg for mindst 3 replikater for hver koncentration for nøjagtig estimering af den dødelige dosis, der dræber 50% af prøverne (LD50). Medtag flere replikater, hvis der observeres et højt niveau af variabilitet.
- Afslut analysen, når alle data er indsamlet.
8. Analyser resultaterne
- Registrer data i et regnearksprogram, og brug den tilfældige id-nøgle til at afsløre dataene (referencetrin 3.4). Gem dataene som en tekstfil (se eksempeldata i Supplerende fil 3) til analyse i det statistiske program R35 (se eksempel R-kode i Supplerende fil 4) eller anden software efter eget valg36.
- Inden for softwareprogrammet skal du gennemføre følgende analyse. Se Supplerende fil 4 for et eksempel på en R-kode.
- Dosis af insekticid (ng) beregnes pr. prøvemasse (mg) efter Eq (3) nedenfor:
(3) - Beregn dødeligheden, og anvend Abbotts formel37 til at korrigere dødeligheden i forhold til den dødelighed, der observeres i hver kontrol37. Alternativt kan du bruge Schneider-Orelli -formlen (1947) til at korrigeredødeligheden 38. Med begge formler skal du anvende korrektionen på alle data uanset dødelighed i hver kontrol, som tidligere beskrevet37 og implementeret39, medmindre kontroldataene er usædvanligt høje (se diskussion nedenfor).
BEMÆRK: Abbotts formel og tilsvarende alternativer, såsom Schneider-Orelli-formlen, justerer dødelighedsværdierne forholdsmæssigt i forhold til omfanget af dødelighed, der ikke observeres i kontrollerne, og vil ikke medføre et fald i dødeligheden for kopper, der havde 100% dødelighed. Du kan finde flere oplysninger i de citerede referencer til disse formler. - Omdan korrigerede dødelighedsdata til probitværdier (sandsynlighedsenhed)40 og udfør lineær regression mellem insekticiddosis og transformerede dødelighedsdata. Brug en chi-kvadratisk test til at vurdere pasformen af den eller de lineære modeller.
BEMÆRK: Dødelighedsværdier på 0 (0% dødelighed) eller 1 (100% dødelighed) fjernes fra dataene, før probittransformationen afsluttes. Dette er nødvendigt på grund af arten af probittransformationen. Som sådan vil de graferede data ikke omfatte positive eller negative kontroller eller andre data, der resulterede i 0% eller 100% dødelighed (efter abbotts korrektion er blevet anvendt). - Beregn LD50 og 95% konfidensintervaller (II'er) pr. prøvestamme, population og/eller køn efter tidligere offentliggjorte metoder 39,41,42.
- BEMÆRK: Hvis de 95% CI'er af to stammer ikke overlapper hinanden, har stammerne signifikant forskellige dosisresponser.
- Hvis det er relevant, beregnes modstandsforhold (RR'er) ved at dividere LD50 for interessestammen med LD50 for reference-/kontrolstammen.
- Dosis af insekticid (ng) beregnes pr. prøvemasse (mg) efter Eq (3) nedenfor:
(3)
Figur 1: Aktuelt applikationsanalyseprotokoldiagram. Aktuel anvendelsesanalyseprotokol begynder med (A) sortering af prøver på is, efterfulgt af (B) vejning af prøver på analytisk skala, (C) dosering af prøver med insekticidopløsning(er) og (D) 24 timers ventetid efter insekticideksponering med adgang til 10% saccharoseopløsning ad libitum (via en gennemblødt bomuldskugle) efterfulgt af dødelighedsvurdering. Røde pile angiver mål insekticid applikationssted for myg (venstre) og frugtfluer (højre). Bemærk, at billedet ikke skal skaleres. Klik her for at se en større version af denne figur.
Representative Results
Disse repræsentative resultater har to forskellige stammer af Ae. aegypti, Rockefeller (ROCK) og en isoleret feltstamme fra Florida med kendte knockdown-resistensmutationer F1534C og V1016I (IICC-genotype). Derudover er Drosophila melanogaster (Canton: S-stamme) vist.
Figur 2 og figur 3 illustrerer dosisresponset for hver organisme efter stamme og køn, der er testet efter ovenstående protokol. Da der ikke blev observeret forskelle mellem dosis-responskurverne for mandlige og kvindelige myg inden for hver stamme (t = 1,70, p = 0,098 for ROCK og t = 0,64, p = 0,527 for IICC), blev data fra begge køn inden for hver myggestamme samlet. Den masserelativiserede LD50 for ROCK og IICC er henholdsvis 0,008 ng/mg (95% CI: 0-0,104) og 0,336 ng/mg (95% CI: 0,235-0,438). De 95 % AF DISSE værdier overlapper ikke hinanden, hvilket indikerer signifikant forskellige dosisresponser for stammerne. RR for IICC-stammen (i forhold til ROCK-stammen) er 41,7, som ifølge WHO betragtes som meget resistent5. For Canton-S-bananfluerne er den masserelativiserede LD50 0,213 ng/mg (95% CI: 0-0,490).
Figur 2: Repræsentative data for myg ved hjælp af bioassay med topisk anvendelse. Repræsentative dosis-respons-data fra bioassay med topisk anvendelse efter ovennævnte protokol ved anvendelse af deltamethrin og myg: (A) hun Ae. aegypti ROCK (n = 880) og IICC (n = 550) stammer, (B) mandlige Ae. aegypti ROCK (n = 880) og IICC (n = 569) stammer. Deltamethrin-testkoncentrationerne varierede fra 0,00075 ng/μL til 9,68705 ng/μL, og den påførte dosis deltamethrin (ng) pr. gennemsnitlig myggemasse (mg) afspejles på x-aksen. Dødeligheden vises som en andel på y-aksen. Den sorte linje gennem hver datapunktklynge repræsenterer stammen og kønsspecifik lineær regression. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative data for bananfluer ved hjælp af bioassay med topisk anvendelse. Repræsentative dosis-respons-data fra bioassay med topisk anvendelse efter ovennævnte protokol ved anvendelse af deltamethrin og bananfluer: D. melanogaster Canton-S-stamme (n = 1014). Deltamethrin-testkoncentrationerne varierede fra 0,00499 til 5,02876 ng/μL, og den påførte dosis deltamethrin (ng) pr. gennemsnitlig bananfluemasse (mg) afspejles på x-aksen. Dødeligheden vises som en andel på y-aksen. Den sorte linje repræsenterer den lineære regression. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur S1: Stationært insekthåndteringstelt. Benchtop insekthåndteringstelt bruges til lettere fangst af undslippe myg eller fluer under det aktuelle applikationsassay. Strukturen er lukket i A og åben i B. Denne struktur blev bygget med PVC-rør og finmasket stof. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S2: Sprøjte- og repeaterapplikatorenhed. Sprøjte- og repeaterapplikatorenhed, der anvendes til dosering af insekter. Hoveddelene omfatter 1) nål, 2) sprøjtetønde, 3) stempel, 4) repeater og 5) repeaterknap. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 1: Randomiseringsscript: Randomiseringsscript til at oprette ikke-partiske etiketter til alle kopper i hvert eksperiment. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: Dødelighedsscoreark: Dødelighedsscoreark for at hjælpe med dødelighedsvurdering. Arket indeholder også steder til registrering af alle andre vigtige oplysninger, der skal registreres, som der henvises til i protokollen, såsom insekticidapplikationens start- og sluttidspunktet. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 3: Eksempel på dødelighedsdata: Eksempel datafil bruges til at oprette figur 2. Beskrivelserne af kolonneoverskriften er som følger: "id" = identifikationskoden for hvert datapunkt; "arter" = artsnavn (f.eks. Aedes aegypti) "insekticid" = navnet på insekticid, der anvendes topisk (f.eks. Deltamethrin); "stamme" = navnet på myggestamme (f.eks. ROCK); "dato" = startdato aktuel anvendelse; "sex" = køn af myg; "alder" = myggenes alder (ung = 3-5 dage gammel; gammel = 4 uger gammel); "total.mosq" = det samlede antal myg vejet i batch; "vægt" = vægt (mg) af alle myg inden for batch; "koncentration" = koncentration af insekticid (μg/ml) "sprøjte" = dråbevolumen (ml) af sprøjte; "dosis" = mængde insekticid aktiv ingrediens påført hver myg (ng); "total" = antal myg i hver kop; "død" = antal døde myg i hver kop. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 4: R-analysekode: Eksempel på R-kode, der kan bruges til at fuldføre Probit-analysen (som beskrevet i trin 8 i protokollen). De repræsentative resultater (tilgængelige via den supplerende eksempeldatafil) kan bruges med denne R-kode. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Dette papir præsenterer en tilpasset protokol til det aktuelle applikationsassay for myg og frugtfluer. Denne procedure kunne let tilpasses til at blive brugt i marken og med andre organismer, da det kræver minimalt specialudstyr. Nedenfor er behandlet denne protokols kritiske trin, potentielle ændringer, fejlfindingsrådgivning, begrænsninger af metoden og betydningen af denne metode.
Kritiske trin i protokollen: Der er tre kritiske trin i protokollen, der, hvis de udfyldes forkert, kan påvirke resultaterne af bioassayet drastisk: insekticidkoncentrationsnøjagtighed, prøvenedslag og dødelighedsvurdering.
Insekticid koncentration nøjagtighed:
Det er ekstremt vigtigt at have nøjagtige insekticidopløsninger for at opnå replikerbare dosis-responskurver og meningsfulde resultater. Den volumetriske tilgang til insekticidopløsningspræparat er mere almindelig inden for litteraturen for både CDC-flaskebioassay7 og topiske anvendelser 13,14,43. Den gravimetriske tilgang, der er beskrevet her, er imidlertid i sagens natur mere nøjagtig på grund af overvejelsen af temperatur gennem inkludering af (temperaturspecifik) densitet, hvilket fører til mere nøjagtig formuleringsforberedelse.
Prøve knockdown:
At slå prøverne ned er en kritisk komponent i denne metode og muliggør nøjagtig administration af insekticidet og vægtmålingerne. At slå organismer ned indeholder dog uundgåeligt risikoen for fysisk stress og skade, som tidligere påvist30. Vær derfor forsigtig og opmærksom, når du slår prøverne ned for at sikre, at i) hver prøve slås ned i en lignende varighed, ii) længden af knockdown holdes på et minimum, og iii) metoden til knockdown holdes konsistent på tværs af alle prøver. Derudover anbefales det at teste knockdown-metoden separat inden påføring af insekticid for at sikre, at metoden er vellykket og ikke inducerer kontroldødelighed på mere end 10%. Den indledende test kan tage længere tid for en uerfaren bruger, hvilket fører til længere knockdown-tider. Vær derfor forsigtig, når du fortolker resultater fra de første assays.
Vurdering af dødelighed:
Vurdering af dødelighed kan være udfordrende, især når insekticidet ikke dræber fuldstændigt, men kun slår ned eller lemlæster myggen eller fluen. Derfor er det vigtigt at være opmærksom på, hvordan insekticidet påvirker målorganismen og have en klar definition af "døde" (eller væltede) organismer, inden det påbegyndes. Derudover anbefales det at få den samme person til at vurdere dødeligheden mellem doser og replikater for at reducere variationen.
Protokolændringer: Flere ændringer beskrevet nedenfor kan anvendes på denne protokol for at forbedre dens alsidighed og tilgængelighed.
Tilpasning af assayet til mindre eller større insekter:
Ved anvendelse af mindre eller større prøver anbefales det at anvende henholdsvis et mindre eller større dosisvolumen insekticid. Som et eksempel tilpassede vi myggeprotokollen til bananfluer ved at reducere dosis på 0,5 μL til en dosis på 0,2 μL. Sørg for, at den korrekte sprøjtestørrelse er valgt for det valgte dosisvolumen.
Tilpasning af assayet til feltinsekter:
Ved brug af markinsekter kan der være større variation i insektstørrelsen. Derfor vil det anbefales at veje insekterne i mindre grupper (f.eks. pr. kop) i stedet for som en stor gruppe (f.eks. Alle insekter, der anvendes til et forsøg). Dette kan hjælpe med at fange den potentielle variation i insekticidmodtagelighed forbundet med forskellene i feltinsektmasse.
Ændringer af udstyr:
Insekthåndteringstelt: Dosering af prøven kan gennemføres under et insekthåndteringstelt, der simpelthen er konstrueret med PVC-rør og myggenet. Dette kan være et alternativ til et lukket rum (f.eks. Insekt) og hjælpe med at eliminere potentiel insekticidforurening i områder, hvor insektopdræt kan forekomme. Dette insekthåndteringstelt er let at konstruere og billigt (~ $ 70). Alternativt kan et insekthåndteringsbur købes (~ $ 425).
Kølebord: Ispakninger eller bakker med is kan bruges til at slå prøven ned og/eller holde prøven slået ned.
Inkubator: Inkubatorer anbefales til opdræt af prøven og opbevaring af prøven i 24 timer efter insekticidbehandling. Hvis en inkubator ikke er tilgængelig, kan den konstrueres. Udstyr, der er nødvendigt for at bygge inkubatoren, omfatter en isoleret beholder, luftfugter, varmekabler, fugtigheds- og temperaturregulator og et lys, der skal tilføje op til en samlet pris på ~ $ 170, efter og udvidelse efter tidligere metoder44.
Holdekopper: Selvom plastikkopper bruges til at sortere og holde den behandlede prøve, ville voksforede papirkopper eller glasbeholdere være egnede alternativer.
Ændring af organisme og livsstadium:
Denne metode er meget tilpasningsdygtig til brug med andre vektorer, insekter og / eller leddyr som Culex quinquefasciatus myg32, husfluer32 og kakerlakker45 samt ikke-voksne livsstadier, såsom myglarver46.
Aktuel ændring af applikationsplacering:
Denne metode beskriver anvendelse af insekticidet på den ventrale thorax og maveregionen for myg (og dorsum for frugtfluer). Andre applikationssteder kan dog bruges, så længe eksponeringsstedet er konsistent. Konsistens er vigtig, fordi insekticidfølsomheden kan variere afhængigt af applikationsplacering32.
Rådgivning til fejlfinding: Denne metode har flere trin, der oprindeligt er udfordrende. Nedenfor er beskrevet nogle af de mest almindelige problemer, man kan støde på.
Lækkende/fordampende insekticidopløsninger:
Insekticider opløses almindeligvis i acetone, en meget flygtig forbindelse. Det betyder, at acetone fordamper hurtigt ved stuetemperatur, hvilket øger insekticidkoncentrationerne over tid. Hvis insekticidopløsningerne ser ud til at lække eller fordampe, skal du genskabe opløsningerne, sikre, at rørets låg er tæt på, og dobbelttjekke, at opbevaringsprotokollerne følges korrekt (f.eks. Parafilm bruges, og rørene opbevares oprejst). Hvis lækage vedvarer, kan du prøve at fylde rørene med et lavere volumen for at give mere plads til den ændring i volumen, acetonen oplever ved forskellige temperaturer. Derudover, hvis du bruger acetone som opløsningsmiddel, skal du sikre dig, at rørene er klassificeret til acetonelagring (f.eks. FEP, TFE og PFA-plast). Hvis du bruger hydrofobe insekticider, skal du opbevare opløsningerne i glashætteglas (da hydrofobe insekticider klæber til glas mindre end plast). Det er også god praksis at markere opløsningens menisk inden opbevaring for at overvåge fordampningen.
Vægtdrift på mikrobalance ved vejning af organismer:
Hvis vægtaflæsningen på vægten driver (langsomt går op eller ned), kan dette skyldes statisk. Drift forekommer oftest ved vejning af organismer i plastemner, da plast let kan holde en statisk ladning. For at undgå dette kan et vejepapir placeres under den plastbeholder, der vejes, eller der kan anvendes en ikke-plastisk beholder som glas.
Unormal dødelighed resultater:
Der er mange måder, hvorpå dødelighedsresultaterne kan virke unormale, såsom at observere høj dødelighed i kontrollerne eller høj / lav dødelighed gennem alle insekticiddoser. Gennemgå følgende tilfælde for fejlfinding af hvert scenarie.
Høj kontroldødelighed
Hvis der er høj dødelighed i kontrolgruppen (10% eller derover), skal du evaluere knockdown-metoden og den tid, prøverne slås ned. Hvis det er muligt, forkort den tid, hvor prøverne er slået ned. Andre potentielle faktorer, der skal overvejes for høj dødelighed i kontrollerne, omfatter i) kontrol af, om inkubatorindstillingerne er korrekte - unormale temperaturer og / eller fugtighed kan føre til øget dødelighed. Temperatur og fugtighed skal kontrolleres med en uafhængig datalogger. ii) Vurdering af insekthåndtering. Håndtering af insekter for meget eller for groft kan føre til høj dødelighed. iii) Kontrol af, om der ikke er nogen insekticidforurening i den 100 % acetone, der anvendes til behandling af kontrolgruppen, eller på instrumenteringen. Udskift acetone og rengør alle instrumenter med acetone eller ethanol. Undgå forurening ved ofte at udskifte handsker, forhindre spild og rengøringsinstrumenter. Bemærk, at i Supplerende fil 3 døde maksimalt to myg inden for kontrolkopperne (kun acetone). Dette dødelighedsniveau betragtes ikke som højt (det er mindre end 10%), og derfor var der ingen grund til bekymring.
Høj dødelighed i alle eksponerede grupper (men ikke i kontrolgrupper)
Brug lavere insekticidkoncentrationer eller mindre dosisvolumener til testning. De anvendte doser kan være over den mindste dosis, der ikke vil fremkalde dødelighed. Brug flere 10 gange fortyndinger til at identificere det korrekte dosisområde, og udelukke forurening. For at undgå forurening skal du begynde at dosere med den laveste koncentration og arbejde hen imod den højeste koncentration. Sørg desuden for, at alt anvendt udstyr rengøres regelmæssigt med acetone og / eller ethanol, de doser, der påføres prøven, er meget små, og selv den mindste krydskontaminering kan påvirke resultaterne.
Lav dødelighed i alle udsatte grupper
Brug højere insekticidkoncentrationer. De anvendte doser kan alle være for lave til at forårsage dødelighed i befolkningen. For at identificere det korrekte dosisområde skal du udsætte prøverne for flere flere 10 gange koncentrerede doser. Sørg for, at insekticidopløsningerne ikke er udløbet eller nedbrudt (muligvis på grund af høj temperatur eller lyseksponering). Hvis opløsningerne er udløbet eller mistænkes for at være nedbrudt, skal du genskabe opløsningerne og sikre, at de korrekte opbevaringsforhold følges.
Inkonsekvent dødelighed mellem replikater/dage
Det tidspunkt på dagen, hvor insekter udsættes for insekticidet, kan påvirke det udtrykte resistensniveau, især for metabolisk resistens34. Gentag denne protokol i det samme tidsvindue hver dag for at undgå tid på dagen som en potentiel variabel, der bidrager til ændringer i dødeligheden. Andre potentielle faktorer, der bidrager til inkonsekvent dødelighed mellem replikater, omfatter i) prøver, der opdrættes forskelligt mellem eksperimenter. Sørg for, at alle prøver er af samme aldersgruppe, opdrættet ved samme temperatur og lignende tætheder og fødetilgængelighed. ii) insekticidkoncentrationer, der nedbrydes over tid eller bliver mere koncentrerede på grund af acetonefordampning. Genindspil løsningerne og sørg for korrekte opbevaringsforhold. iii) Inkonsekvent dødelighedsscore. Sørg for, at den samme person scorer dødelighed eller udvikle en klar protokol, der skal bruges konsekvent på tværs af holdet. Brug blind scoring til at reducere bias i dødelighedsscoring.
Insekter, der klæber til overfladen af sorteringsbakken:
Acetone reagerer på plast, der anvendes i denne protokol, såsom petriskåle. Prøven vil sandsynligvis klæbe til overfladen, hvis der anvendes acetone på petriskåle eller lignende plastoverflader. Denne vedhæftning kan undgås ved at beklæde sorteringsbakken med vejepapir eller ved hjælp af en ikke-plastisk sorteringsbakke. Derudover kan kondens på overfladen af plast i sorteringsbakken eller holdekopper føre til, at insekter klæber til kondensen, eller prøven kan være for kold og potentielt fryse til overfladen. Juster knockdown-metoden for at reducere kondens og samtidig forhindre, at prøverne bliver for kolde/frosne (f.eks. Anbring vejepapir mellem prøverne og plastsorteringsbakken).
R-analysefejl:
Når dødelighedsdataene er indsamlet, kan der opstå en række komplikationer under analysen. Den mest almindelige årsag til, at en R-kode ikke kan fuldføre handlingerne for datafilen, er, at dataformatet ikke stemmer overens med koden (f.eks. kolonneoverskrifter og/eller tomme celler). Hvis der opstår mere alvorlige komplikationer, skal du se de R-hjælpesider, der er indbygget i Rstudio35.
Begrænsninger af den ovenfor beskrevne aktuelle anvendelsesmetode:
Insekticidabsorption via topisk påføringsmetode efterligner ikke naturlig eksponering:
Aktuel anvendelse på den primære krop er ikke den naturlige måde at absorbere insekticider på. I marken absorberer insekter for det meste insekticider gennem deres ben i løbet af den tid, de er i kontakt med den insekticidbehandlede overflade eller på deres vinger gennem små aerosolpartikler47,48, snarere end en hurtig eksponering på den ventrale overflade. Den direkte anvendelse af en kendt insekticiddosis vil imidlertid nøjagtigt fastslå et fænotypisk respons på insekticider, der er nødvendige for genetiske og evolutionære undersøgelser eller sammenligninger af insekticidmodtagelighed på tværs af rum eller tid. Denne tilgang er derfor gavnlig for test af teknisk resistens, men vil ikke direkte måle praktisk resistens (effektiviteten af det faktiske interventionsværktøj i en feltindstilling15). Det er dog vigtigt at bemærke, at de nuværende standardmetoder (f.eks. WHO-rørprøver og CDC-flaskebioassays) heller ikke kan fange eller efterligne aerosoleksponering (dvs. ved tåge) insekticideksponering i marken.
Aktuelle applikationsassays kan kun vurdere kontaktabsorptionsinsekticider:
Denne metode er beregnet til insekticider, der virker ved kontakt med og absorption af insekticidet og ikke til brug sammen med orale insekticider, såsom borsyre, der almindeligvis anvendes i attraktive giftige sukkerlokkemad49.
Betydningen af metoden:
Den aktuelle anvendelsesmetode udvider veletablerede standarder for insekticidbioassays ved at beregne den dødelige dosis (ikke koncentration) og måle teknisk (ikke praktisk) resistens15. Nedenfor er fordelene og ulemperne ved denne metode i forhold til eksisterende insekticidmodtagelighedsassays.
Beregning af dødelig dosis:
Denne metode bestemmer den dødelige dosis af insekticidet snarere end den dødelige koncentration, som CDC og WHO bioassays bruger til at etablere den diskriminerende dosis11. Den dødelige dosis er mere meningsfuld, fordi det er en kvantificeret mængde insekticid, der vides at fremkalde dødelighed. I modsætning hertil overvejer den dødelige koncentration ikke, hvor meget insekticid organismen faktisk erhverver. Ved brug af den dødelige dosisberegning kan forskelle mellem køns- eller størrelsesafhængige modtagelighedsprofiler observeres og kvantificeres mere præcist, hvilket gør denne måling endnu mere alsidig.
Teknisk modstand:
Denne metode vurderer teknisk modstand, som er modstand som målt under standardiserede, kontrollerede miljøer. Sådanne målinger er egnede til overvågning af spredningen af insekticidresistens og sammenkædning af fænotypisk resistens med potentielle markører15. På grund af den faldende variation i dødeligheden som følge af bioassay med topisk anvendelse giver det mulighed for bedre identifikation af nye resistensmarkører. På grund af den unaturlige eksponering af insekticider for myggen er dette assay imidlertid ikke egnet til estimering af effektiviteten af en bestemt intervention i en bestemt population. Andre assays er nødvendige til målinger af en sådan praktisk resistens15.
Prøvens tilpasningsevne:
Denne metode kan praktiseres på andre vigtige leddyr såsom afgrødeskadedyr (f.eks. Colorado kartoffelbille), husskadedyr (f.eks. Kakerlakker og sengebugs) eller bestøvere (f.eks. Bier) med enkle ændringer i knockdown-tilgangen og / eller insekticiddosis, volumen og / eller koncentration (som beskrevet ovenfor). Den lette tilpasningsevne kan hjælpe med at analogisere insekticidresistensforskning på tværs af forskellige forskningsområder. Anvendelsen af en LD50-værdi i stedet for en dødelig koncentration, der dræber 50% af prøverne (LC50), muliggør nøjagtig sammenligning på tværs af arter.
Koste:
I lighed med CDC-flaskebioassays og WHO-rørprøver er omkostningerne til at køre det aktuelle applikationsassay minimale (se materialetabellen). De væsentlige stykker udstyr er sprøjten (ca. $ 70) og dispenseren (ca. $ 100), som kan genbruges på tværs af assays.
Antal nødvendige prøver:
Der skal anvendes mindst 20-25 prøver pr. Topisk applikationsanalysekop. Det anbefales, at mindst fem insekticidkoncentrationer testes pr. forsøg, og mindst tre replikater anbefales til proceduren. Samlet set resulterer dette i mindst 300-375 prøver, der er nødvendige for en komplet test, der kan sammenlignes med antallet af prøver, der er nødvendige for at udføre resistensintensitetstest ved hjælp af WHO-rørprøver eller CDC-flaskebioassays. Men hvis der opnås reduceret variabilitet med bioassay med topisk anvendelse, kan det samme antal prøver føre til mere statistisk magt til at sammenligne modtagelighedsdata på tværs af rum eller tid.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af en CAREER-pris fra National Science Foundation til SH under prisnummer 2047572. Vi takker Damien Rivera for hans hjælp til opdræt af bananfluer og forberedelse til topisk applikationsanalyse, Dr. Ganetzky ved University of Wisconsin-Madison for at dele sin Canton-S-bananfluestamme, Centers for Disease Control and Prevention for at dele Rockefeller-stammen og United States Department of Agriculture Center for Medical Agricultural and Veterinary Entomology for at dele IICC-isolinstammen. Figur 1 blev oprettet med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thomas Scientific | 20A00L068 | Acetone aliquot storage |
| 1.5 mL screw cap tubes | Thomas Scientific | 1182K23 | Insecticide dilution storage |
| 15 mL conical tubes | VWR | 339651 | Insecticide dilution storage |
| 20 mL glass scintillation vials | Fisher Scientific | 0334125D | Fruit fly weighing |
| 25 μL syringe | Fisher Scientific | 14815288 | Topical applicator |
| Acetone | Fisher Scientific | AC423240040 | ACS 99.6%, 4 L |
| Aedes aegypti (IICC strain) | USDA CMAVE | NA | Insecticide resistant |
| Aedes aegypti (Rockefeller strain) | CDC | NA | Insecticide susceptible |
| Analytical scale | Fisher Scientific | 14-557-409 | Precision up to 0.1 mg |
| Aspirator | Amazon | 6.49986E+11 | Mosquito collection device |
| Bench paper | VWR | 89126-794 | Place under workspace |
| Cotton swabs | Amazon | B092S8JVQN | Use for sorting insects |
| Cotton wool balls | Amazon | B0769MKZWT | Use for sucrose solution |
| Dispenser | Fisher Scientific | 1482225 | Repeater pipettor |
| Drosophila melanogaster (Canton-S strain) | University of Wisconsin-Madison | NA | Insecticide susceptible |
| Fine-tipped paint brushes | Amazon | B07KT2X1BK | Use for sorting insects |
| Fruit fly stock bottles | Fisher Scientific | AS355 | Use for rearing and sorting fruit flies |
| Hand-held CO2 dispenser | Fisher Scientific | NC1710679 | Use for knocking down insects |
| Holding cups | Amazon | B08DXG7V1S | Clear plastic |
| Ice pack | Amazon | B08QDWMMW5 | Use for knocking down fruit flies |
| Ice trays | Amazon | 9301085269 | Use for knocking down insects |
| Insect forceps | Amazon | B07B4767WR | Insect forceps |
| Insecticide | Sigma-Aldrich Inc | 45423-250MG | Deltamethrin |
| Labeling stickers | Amazon | B07Q4X9GWX | 3/4" Color dot stickers |
| Labeling tape | Amazon | B00X6A1GYK | White tape |
| Netting | Amazon | B07F2PHHWV | Use for covering holding cups and insect handling tent |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712H371 | 100 mm x 15 mm |
| PVC Pipe | Lowe’s | 23971 | Insect handling tent materials |
| Rubber bands | Amazon | B00006IBRU | Use for securing mesh/net on cups |
| Sucrose | Amazon | B01J78INO0 | Granulated White Sugar |
| Weighing paper | VWR | 12578-165 | 4" x 4" |
References
- World Health Organization. Vector-borne diseases. World Health Organization. , https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/vector-borne-diseases (2020).
- World Health Organization. Global plan for insecticide resistance management in malaria vectors. World Health Organization. , https://apps.who.int/iris/handle/10665/44846 (2012).
- Liu, N. Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions. Annual Review of Entomology. 60 (1), 537-559 (2015).
- Hemingway, J., Ranson, H. Insecticide resistance in insect vectors of human disease. Annual Review of Entomology. 45 (1), 371-391 (2000).
- World Health Organization. Monitoring and managing insecticide resistance in Aedes mosquito populations. World Health Organization. , https://apps.who.int/iris/handle/10665/204588 (2016).
- World Health Organization. Test procedures for insecticide resistance monitoring in malaria vector mosquitoes (Second edition). World Health Organization. , http://www.who.int/malaria/publications/atoz/9789241511575/en/ (2016).
- McAllister, J. C., Scott, M. CONUS manual for evaluating insecticide resistance in mosquitoes using the CDC bottle bioassay kit. Centers for Disease Control and Prevention. , https://www.cdc.gov/zika/pdfs/CONUS-508.pdf (2020).
- Duneau, D., et al. Signatures of insecticide selection in the genome of Drosophila melanogaster. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (11), 3469-3480 (2018).
- Pittendrigh, B., Reenan, R., ffrench-Constant, R. H., Ganetzky, B. Point mutations in the Drosophila sodium channel gene para associated with resistance to DDT and pyrethroid insecticides. Molecular & General Genetics: MGG. 256 (6), 602-610 (1997).
- Rinkevich, F. D., Du, Y., Dong, K. Diversity and convergence of sodium channel mutations involved in resistance to pyrethroids. Pesticide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 93-100 (2013).
- Lissenden, N., et al. Review and meta-analysis of the evidence for choosing between specific pyrethroids for programmatic purposes. Insects. 12 (9), 826 (2021).
- Owusu, H. F., Chitnis, N., Müller, P. Insecticide susceptibility of Anopheles mosquitoes changes in response to variations in the larval environment. Scientific Reports. 7 (1), 3667 (2017).
- Brito-Sierra, C. A., Kaur, J., Hill, C. A. Protocols for testing the toxicity of novel insecticidal chemistries to mosquitoes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e57768 (2019).
- Burgess, E. R., King, B. H., Geden, C. J. Oral and topical insecticide response bioassays and associated statistical analyses used commonly in veterinary and medical entomology. Journal of Insect Science. 20 (6), 1-9 (2020).
- Namias, A., Jobe, N. B., Paaijmans, K. P., Huijben, S. The need for practical insecticide-resistance guidelines to effectively inform mosquito-borne disease control programs. eLife. 10 (1), 65655 (2021).
- Zhu, X., et al. Manipulating solid forms of contact insecticides for infectious disease prevention. Journal of the American Chemical Society. 141 (1), 16858-16864 (2019).
- Dang, K., Singham, G. V., Doggett, S. L., Lilly, D. G., Lee, C. Y. Effects of different surfaces and insecticide carriers on residual insecticide bioassays against bed bugs, Cimex spp. (Hemiptera: Cimicidae). Journal of Economic Entomology. 110 (2), 558-566 (2017).
- Spielmeyer, A., Schetelig, M. F., Etang, J. High-throughput analysis of insecticides on malaria vectors using liquid chromatography tandem mass spectrometry. PLoS ONE. 14 (2), 0211064 (2019).
- Bagi, J., et al. When a discriminating dose assay is not enough: measuring the intensity of insecticide resistance in malaria vectors. Malaria Journal. 14 (1), 210 (2015).
- Pridgeon, J. W., Becnel, J. J., Clark, G. G., Linthicum, K. J. Permethrin induces overexpression of multiple genes in Aedes aegypti. Journal of Medical Entomology. 46 (3), 1-8 (2009).
- World Health Organization. Guidelines for efficacy testing of insecticides for indoor and outdoor ground-applied space spray applications. World Health Organization. , https://apps.who.int/iris/handle/10665/70070 (2009).
- Estep, A. S., et al. Quantification of permethrin resistance and kdr alleles in Florida strains of Aedes aegypti (L.) and Aedes albopictus (Skuse). PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (10), 0006544 (2018).
- Waits, C. M., et al. A comparative analysis of resistance testing methods in Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) from St. Johns County, Florida. Florida Entomologist. 100 (3), 571-577 (2017).
- Kostromytska, O. S., Wu, S., Koppenhöfer, A. M. Diagnostic dose assays for the detection and monitoring of resistance in adults from Listronotus maculicollis (Coleoptera: Curculionidae) populations. Journal of Economic Entomology. 111 (5), 2329-2339 (2018).
- Aktar, W., Sengupta, D., Chowdhury, A. Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards. Interdisciplinary Toxicology. 2 (1), 1-12 (2009).
- Maïga, H., et al. Guidelines for routine colony maintenance of Aedes mosquito species. IAEA Physical and Chemical Sciences. , http://www-naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/guidelines-for-routine-colony-maintenance-of-Aedes-mosquito-species-v1.0.pdf (2017).
- Gjullin, C. M., Hegarty, C. P., Bollen, W. B. The necessity of a low oxygen concentration for the hatching of aedes mosquito eggs. Journal of Cellular Physiology. 17 (2), 193-202 (1941).
- Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420 (1), 27-44 (2008).
- Jass, A., Yerushalmi, G. Y., Davis, H. E., Donini, A., MacMillan, H. A. An impressive capacity for cold tolerance plasticity protects against ionoregulatory collapse in the disease vector Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 222 (1), 214056 (2019).
- Bartholomew, N. R., Burdett, J. M., Vandenbrooks, J. M., Quinlan, M. C., Call, G. B. Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia. Scientific Reports. 5 (1), 15298 (2015).
- Jung, Y., Kennedy, A., Chiu, H., Mohammad, F., Claridge-Chang, A., Anderson, D. J. Neurons that function within an integrator to promote a persistent behavioral state in Drosophila. Neuron. 105 (2), 322-333 (2020).
- Aldridge, R. L., Kaufman, P. E., Bloomquist, J. R., Gezan, S. A., Linthicum, K. J. Impact of topical application site on the efficacy of permethrin and malathion to Culex quinquefasciatus. Journal of the American Mosquito Control Association. 32 (4), 300-307 (2016).
- Rinkevich, F. D., et al. Distinct roles of the DmNav and DSC1 channels in the action of DDT and pyrethroids. Neuro Toxicology. 47 (1), 99-106 (2015).
- Balmert, N. J., Rund, S. S. C., Ghazi, J. P., Zhou, P., Duffield, G. E. Time-of-day specific changes in metabolic detoxification and insecticide resistance in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Journal of Insect Physiology. 64 (1), 30-39 (2014).
- R Core Team. R: a language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. R Core Team. , https://www.r-project.org/ (2021).
- Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PLoS ONE. 10 (12), 0146021 (2015).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of the American Mosquito Control Association. 3 (2), 302-303 (1987).
- Ravichandran, S. Data analysis through SAS with special emphasis on Probit analysis. National Academy of Agricultural Research Management (NAARM). , https://naarm.org.in/VirtualLearning/vic/e-chapters/Probit_Analysis-ravichandran.pdf (2021).
- Smith, L. B., et al. CYP-mediated resistance and cross-resistance to pyrethroids and organophosphates in Aedes aegypti in the presence and absence of kdr. Pesticide Biochemistry and Physiology. 160 (1), 119-126 (2019).
- Finney, D. J. Probit Analysis. , Cambridge University Press. Cambridge, England. (1971).
- Silva, J. J., Kouam, C. N., Scott, J. G. Levels of cross-resistance to pyrethroids conferred by the Vssc knockdown resistance allele 410L+1016I+1534C in Aedes aegypti. PLOS Neglected Tropical Diseases. 15 (7), 0009549 (2021).
- Fan, Y., Scott, J. G. The F1534C voltage-sensitive sodium channel mutation confers 7- to 16-fold resistance to pyrethroid insecticides in Aedes aegypti. Pest Management Science. 76 (1), 2251-2259 (2020).
- Miller, A. L. E., Tindall, K., Leonard, B. R. Bioassays for monitoring insecticide resistance. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2129 (2010).
- Glunt, K. D., et al. Long-lasting insecticidal nets no longer effectively kill the highly resistant Anopheles funestus of southern Mozambique. Malaria Journal. 14 (1), 298 (2015).
- ffrench-Constant, R. H., Roush, R. T. Resistance detection and documentation: the relative roles of pesticidal and biochemical assays. Pesticide Resistance in Arthropods. Roush, R. T., Tabashnik, B. E. , Springer. Boston, MA. (1990).
- Akdag, K., et al. Synthesis and larvicidal and adult topical activity of some hydrazide-hydrazone derivatives against Aedes aegypti. Marmara Pharmaceutical Journal. 18 (1), 120-125 (2014).
- Richards, S. L., Byrd, B. D., Reiskind, M. H., White, A. V. Assessing insecticide resistance in adult mosquitoes: perspectives on current methods. Environmental Health Insights. 14 (1), (2020).
- Cooperband, M., Golden, F., Clark, G., Jany, W., Allan, S. Prallethrin-induced excitation increases contact between sprayed ultra-low volume droplets and flying mosquitoes (Diptera: Culicidae) in a wind tunnel. Journal of Medical Entomology. 47 (1), 1099-1106 (2010).
- Barbosa, D. S., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. Evaluation of attractive toxic sugar baits (ATSB) against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in laboratory. Tropical Biomedicine. 36 (2), 578-586 (2019).
