No presente protocolo, a técnica de Eletroforese de Carboidratos Assistido por Fluorophore (FACE) é usada para determinar a distribuição do comprimento da cadeia (CLD) e o comprimento médio da cadeia (ACL) do glicogênio.
As partículas glicogênio são polissacarídeos ramificados compostos de cadeias lineares de unidades de glicosísyl ligadas por α-1,4 ligações glucoside. Estes últimos são anexados entre si por α-1,6 ligações de glucoside, referidas como pontos de ramificação. Entre as diferentes formas de armazenamento de carbono (ou seja, amido, β-glucano), o glicogênio é provavelmente um dos mais antigos e bem sucedidos polissacarídeos de armazenamento encontrados em todo o mundo vivo. Cadeias glucanas são organizadas para que uma grande quantidade de glicose possa ser rapidamente armazenada ou abastecida em uma célula quando necessário. Inúmeras técnicas complementares foram desenvolvidas ao longo das últimas décadas para resolver a fina estrutura de partículas glicogênicas. Este artigo descreve a Eletroforese de Carboidratos Assistida por Fluoróforo (FACE). Este método quantifica a população de cadeias glucanos que compõem uma partícula glicogênio. Também conhecido como distribuição de comprimento de cadeia (CLD), este parâmetro espelha o tamanho da partícula e a porcentagem de ramificação. É também um requisito essencial para a modelagem matemática da biossíntese de glicogênio.
Glicogênio, usado como armazenamento de carbono e energia, é um homopolímero de glicose consistindo de cadeias lineares de unidades de glicosítil ligadas por (1 → 4)-α ligações e anexadas através de (1 → 6)-α títulos ou pontos de ramificação. Eles aparecem como β e α-partículas no citosol de uma ampla gama de organismos. β partículas são minúsculas partículas solúveis em água observadas principalmente em procariotes. Seu diâmetro varia de 20-40 nm, provavelmente ditado pelas enzimas metabolizantes glicogênio e obstáculos estéricos 1,2.
Descritas pela primeira vez em células animais, as partículas α maiores exibem até 300 nm de diâmetro com uma forma semelhante a couve-flor. Esta organização em particular pode se originar da agregação de várias partículas β ou pode surgir brotando de uma única β-partícula3. Curiosamente, um estudo recente relatou a presença de α-partículas em Escherichia coli4. No entanto, ao contrário de α partículas de células animais, esta última se desfaz rapidamente durante o processo de extração, o que pode explicar a falta de dados na literatura4. O aparecimento de α partículas em eucariotes e procariotes envolve enzimas metabolizantes de glicogênio filogeneticamente não relacionadas5. Isso levanta questões sobre a função de tais partículas e a natureza de potenciais agentes transversais entre β-partículas5.
Embora dois modelos matemáticos opostos tenham sido propostos para a formação de moléculasde glicogênio 6,7,8,9, é geralmente aceito que β partículas evoluíram em resposta à sua função metabólica como uma reserva de combustível altamente eficiente para a liberação rápida de grandes quantidades de glicose. Um grande conjunto de evidências indica que propriedades de glicogênio, como digestibilidade e solubilidade na água, estão correlacionadas com o comprimento médio da cadeia (ACL), que ditará a porcentagem de pontos de ramificação e o tamanho da partícula 2,6,7,8,10,11 . A LCA é definida pela razão entre o número total de resíduos de glicose e o número de pontos de ramificação. Normalmente, os valores da LCA variam de 11-14 e 7-23 resíduos de glicose em eucariotes e procariotes, respectivamente10. Em humanos, várias doenças de desordem glicogênio são devido ao acúmulo anormal de glicogênio. Por exemplo, a doença de Andersen está associada à atividade deficiente de uma enzima ramificada glicogênio, resultando no acúmulo de glicogênio anormal11. Em procariotes, estudos cumulativos sugerem que a LCA é um fator crítico que impacta a taxa de degradação da capacidade de sobrevivência glicógena e bacteriana12,13. Foi relatado que bactérias sintetizando partículas β com baixo valor de LCA degradam-se mais lentamente e, portanto, suportam as condições de fome por mais tempo. Assim, o conhecimento da arquitetura de β-partículas é essencial para entender a formação de partículas glicogênios anormais em doenças humanas de armazenamento de glicogênio e procariotes de sobrevivência em um ambiente deficiente de nutrientes.
Desde o primeiro isolamento do glicogênio do fígado de cachorro pelo fisiologista francês Claude Bernard no final do século XIX, muitas técnicas foram desenvolvidas para caracterizar partículas de glicogênio em detalhes. Por exemplo, microscopia eletrônica de transmissão para morfologia glicogênio (α ou β-partículas)15, espectrometria de proton-NMR para determinar a porcentagem de α-1,6 ligações16, cromatografia de exclusão de tamanho com multi-detectores para inferir o peso molecular, Eletroforese de carboidratos assistido por fluorophore (FACE)17 ou cromatografia de troca de ânion de alto desempenho com detecção amperométrica pulsada (HPAEC-PAD) para distribuição de cadeia de comprimento (CLD) e ACL determinação18.
Este trabalho se concentra no método de eletroforese de carboidratos assistido por fluorophore, que se baseia na aminação redutiva do grupo hemiacetal pela função amina primária. Historicamente, 8-amino-1,3,6-ácido trissulfônico de naftalina (ANTS) foi usado pela primeira vez para rotulagem. Mais tarde, foi substituído pelo fluoróforo mais sensível, 8-amino 1,3,6 pireno trissulfônico ácido (APTS)19.
Figura 1: A reação de aminação redutiva com ácido trissulfônico de 8-amino 1,3,6 pireno (APTS). Reação de aminação redutiva do grupo hemiacetal pela função amina primária de 8-amino 1,3,6 pirene ácido trissulfônico (APTS) em condições redutivas Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Como descrito na Figura 1, a função hemiacetal da extremidade redutora de uma cadeia glucana interage com a amina primária da APTS em condições de redução. Os grupos sulfônicos da APTS carregam cargas negativas que permitem a separação de cadeias glucanas de acordo com seu grau de polimerização (DP). A reação redutiva de amina é altamente reprodutível e eficiente. Uma rotulagem média de eficiência de 80% é obtida para DP3 a DP135 e até 88% e 97% para maltose (DP2) e glicose, respectivamente17,20. Como uma molécula de APTS reage com a extremidade redutora de cada cadeia glucana, cadeias individuais poderiam ser quantificadas e comparadas umas com as outras em uma base molar.
As propriedades físico-químicas das partículas glicogênio (por exemplo, tamanho, morfologia, solubilidade) estão diretamente associadas com o comprimento dos glucas que compõem as partículas. Qualquer desequilíbrio entre enzimas biossintéticas e catabólicas resulta na alteração da distribuição do comprimento da cadeia e, por si só, no acúmulo de glicogênio anormal que pode ser perigoso para a célula11. A análise FACE é um método de escolha para determinar a distribuição do comprimento da cadeia do glicogênio (CID). Como descrito na Figura 2, a determinação do CLD permite a inferência do valor médio do comprimento da cadeia do glicogênio (ACL), que espelha a estrutura das partículas glicogênio. Glicogênios animais com altos valores de LCA estão associados ao aparecimento de partículas anormais. A análise subtrativa é um método útil para comparar duas amostras de glicogênio de diferentes origens genéticas (mutante versus tipo selvagem). Ao traçar em escala logarítmica, os CLDs normalizados até o pico máximo, por outro lado, tem a vantagem de comparar o CLD independentemente de uma referência e nos deram informações sobre o crescente mecanismo glicogênio.
Além disso, a análise FACE é uma técnica poderosa para caracterizar as propriedades catalíticas das enzimas metabolizantes de glicogênio. Por exemplo, todas as enzimas ramificadoras de glicogênios se prendem (1 → 4)-α de ligação e transferem grupos oligomaltosssil para um (1 → 6)-α posição ou pontos de ramificação. Enzimas ramificadas são distinguíveis devido à sua afinidade com polissacarídeos (por exemplo, amilopectina, glicogênio) e o comprimento dos glucas transferidos, apesar do mecanismo catalítico similar22. Assim, várias fontes de enzimas ramificadas (humanas, vegetais, bactérias) podem ser caracterizadas e classificadas através de uma série de experimentos de incubação e comparações de CLD utilizando a análise FACE23.
Como mencionado na introdução, o HPAEC-PAD também é um método alternativo para determinar a distribuição do comprimento da cadeia18. Ambas as técnicas requerem a hidrólise completa de (1 → 6)-α ligações ou pontos de ramificação por enzimas desbranching do tipo isoamylase antes de separar a piscina de glucas lineares de acordo com seu grau de polimerização (DP). No entanto, o método HPAEC-PAD abriga duas desvantagens em relação ao FACE: (1) a resposta de pulso amperométrico diminui à medida que as cadeias glucan aumentam, o que não fornece informações quantitativas. Este problema de viés de massa pode ser contornado usando HPAEC-ENZ-PAD que envolve um reator de enzima pós-coluna entre a coluna de troca de ânion e o PAD24. O reator enzimáculo da coluna hidrólise malto-oligossacarídeos em resíduos de glicose permitindo uma resposta amperométrica de pulso constante. (2) O HPAEC-PAD permite a separação de cadeias glucanas com um grau de polimerização até 70. Embora a resolução seja suficiente para determinar o CLD de amostras de glicogênio, o FACE separa cadeias com DPs até 150, adequadas para amostras de amido17. É essencial ter em mente que tanto a análise HPAEC-PAD quanto a FACE têm prós e contras. Por exemplo, a reação de aminação requer um grupo hemiacetal livre para reagir com a função amina primária da APTS. Isso implica que a rotulagem APTS não pode ser usada para cadeias glucanos sem extremidades redutoras (por exemplo, inulina). O método HPAEC-PAD não requer a presença de extremidades redutoras. Um segundo aspecto interessante do método HPAEC-PAD é que a coluna de troca de ânion pode ser carregada com alguns miligramas de glúcanos lineares, permitindo a purificação de malto-oligossacarídeo com um DP específico ou malto-oligocarídeo de 14C-radiolabeled para o ensaio enzimático 18,25. Finalmente, embora a espectrometria de massa (por exemplo, MALDI-TOF) seja uma tecnica rápida e sensível para determinar a distribuição do comprimento da cadeia, este tecnic parece ser menos reprodutível. Superestima a quantidade de cadeias glucanas longas26. No entanto, este último pode ser usado para uma aplicação específica, como a imagem MALDI para mapear a presença de glicogênio através do tecido celular27.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pelo CNRS, pela Université de Lille CNRS e pela ANR concede “MathTest” (ANR-18-CE13-0027).
AG-501-X8 Resin | BioRad | #1436424 | Storage Room temperature |
100 mM sodium acetate buffer, pH 4.8 | Dissolve 0.82 g of sodium acetate in 80 mL of water. Adjust pH to 4.8 with acetic acid and complete the volume to 100 mL with water—storage at room temperature. | ||
APTS stock solution | Merck | 09341-5MG | Dissolve 5 mg of APT in 48 mL acetic acid 0.2 M. Storage at -20 °C. |
Capillary | Sciex Separations, Les Ulis, France | ||
Chromeleon 6.80 SR8 Build 2623 | Thermofisher | select :File>import/restore>ANDI/chromatography in the open window: select "add" select cdf file > import > next Choose the folder where your file will downloaded in Chromeleon software> finish click on QNT-Editor> parameter "Min Area" select "Range" 0.05 [Signal]*min. |
|
Excel | Microsoft | Open Excel> New file> save the file > File menu click on Import > In the open window choose "csv." as type file > select your asc file > a new window appears Step 1: choose Macintosh or Window and then used default setting for the steps 2 and 3. > Y values appear in column A> Manually add a Time column by incrementing 0.25 second to each cell that corresponds to the frequency (4Hz) for acquisition data . Then plot the graph. | |
Free-Dry apparatus | Christ | alpha 2-4 LO plus | before the freezing-drying process, samples are stored at -80 °C for 1 h. |
Isoamylase | Megazyme | E-ISAMY | 180 U/mg of protein |
Maltoheptaose | Merck | M7753 | |
N-Linked carbohydrate separation buffer | Sciex Separations, Les Ulis, France | 477623 | Storage at 4 °C |
Pullulanase | Megazyme | E-PULKP | 30 U/mg of protein |
Sodium cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 296813-100ML | 1 M Sodium cyanoborohydride in THF |
Vaccum-evaporator | Eppendorf | Concentrator 5301 | Set the temperature at 30 °C. Centrifuge until the samples are dried |