Summary
Transplante alogênico de pele é um modelo padrão para ensaio de anfitrião respostas das células T aos antígenos MHC-díspares doador. Este vídeo-artigo fornece um tutorial visual de cada etapa envolvida na realização de um transplante de BALB/c--> C57BL / 6 da pele.
Abstract
Como um dos modelos mais rigorosos e menos tecnicamente desafiador, transplante cutâneo é um método padrão para ensaio de anfitrião respostas das células T aos antígenos MHC-díspares doador. O objetivo deste vídeo-artigo é proporcionar ao espectador com uma demonstração passo a passo-visual do transplante de pele usando o modelo de mouse. O protocolo é dividido em cinco componentes principais: 1) a colheita da pele do doador; 2) preparar receptor para transplante; 3) transplante de pele; 4) remoção de curativo e rejeição do enxerto de monitoramento; 5) dicas úteis. Uma vez proficiente, o procedimento em si deve ter <10 minutos para executar.
Protocol
Antes do início do experimento:
- Obter a aprovação IACUC
- Esterilizar instrumentos cirúrgicos e Q-dicas
I. tecido do doador Colheita
- Euthanize camundongo doador (de acordo com SOP instituição)
- Trás os cabelos molhados da base da orelha com álcool
- Colheita da pele de doadores cortando orelha fora na base
- Tecido lugar na placa sobre o gelo
- Ouvido Split: pinch lados ventral e dorsal do tecido na base da orelha com dente-de-rato fórceps; puxe suavemente o tecido, tecido de flutuação dorsal, superfície interna para baixo, na PBS sobre o gelo; descartar flap ventral colágenas
II. Prepare Recipiente para Transplante
- Rato anestesiar usando procedimento aprovado
- Administrar analgésico para pós-operatório o alívio da dor (ou seja, 0,05-0,1 mg / g ip Bupernex)
- Rato lugar na posição lateral
- Executar pitada dedo para garantir animal é suficientemente sedado
- Cabelos molhados com álcool e shave tórax
- Limpe área limpa com algodão embebido em álcool
III. Transplante de pele
- ~ Fazer incisão de 1 cm: pele tenda com ratos dente-forceps e cortar ~ 0,25-0,5 cm abaixo forceps
- Remover a pele de doadores de PBS, coloque em cima de cama de enxerto (com a superfície interna da pele da orelha enfrentando leito do enxerto) e remova o excesso com PBS estéril Q-Tip
- Cuidadosamente aparar a pele do doador, para que o excesso de transplante está terminantemente dentro leito do enxerto (certificando-se que as bordas do enxerto não são enroladas por baixo e que o enxerto não ressaca na pele destinatário tronco)
- Enrole destinatário no curativo estéril (com o segmento de gaze não-adesivo colocado sobre o enxerto de pele)
- Garantir que bandagem não está muito apertado (avaliar a respiração animal) e que as armas são livremente móveis
- Bandage seguro com um único fio de seda 2-0
- Coloque o animal em gaiola limpa (com lâmpada de aquecimento até animal tem suficientemente recuperado da anestesia)
- Monitorar destinatário 1-2/day para sinais de sofrimento e administrar analgésicos, conforme necessário para o alívio da dor
IV. Remoção de bandagem (6-7 dias após o transplante)
- Rato anestesiar usando procedimento aprovado
- Corte e retire fio de seda
- Com uma tesoura sem corte final, corte cuidadosamente através de bandagem (tomando cuidado para não perturbar enxerto) e remova cuidadosamente
- Retorno do mouse para gaiola limpa
- Verifique enxerto ~ 8 horas após a remoção do curativo de sinais de scabbing ou contração. Se presente, enxerto pode ter falhado a irrigar e deve ser considerada uma falha técnica.
- Monitorar diariamente para sinais de rejeição (normalmente definido como ~ 80% de necrose do tecido do doador)
- Transplantes alogênicos de pele geralmente rejeitam entre d8-12 pós-operatório
Dicas úteis V.
- A colheita de tecidos de doadores perto da base da orelha vai: 1) maximizar o tamanho do enxerto, e 2) fornecer uma saliência ventral desigual que irá facilitar a divisão
- Sempre use uma lâmina nova para barbear destinatário
- Se analgésico deve ser dado ip, administrar antes do transplante procedimento para minimizar pós-operatório de manipulação (minimizar chance de interromper o enxerto)
- Se possível, retire as luvas antes de aplicar o curativo. Luvas tendem a se ater a atadura e complicar a aplicação
- Colocação de uma sutura única no final bandage irá minimizar a remoção prematura
- Bandagem wrap tão apertado como permitido e avaliar a respiração ANTES de colocar sutura. Se bandage é muito apertado, animal vai parar de respirar. Se bandage é muito solta, animal irá removê-lo.
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Discussion
Como demonstrado neste vídeo-artigo, o modelo de transplante de pele é um método rápido e fácil para monitorar respostas de células T alogênicas. Transplante alogênico de pele tem uma vasta gama de aplicações e tem sido utilizada para ensaio da eficiência de uma variedade de agentes imunossupressores e protocolos de indução de tolerância, bem como para investigar os efeitos biológicos de vários anticorpos de bloqueio.
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Acknowledgments
NIH Imunologia Training Grant T32 AI 60573 (KRG) e NIH conceder GM 41514 (MDC)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-dissecting forceps (curved) | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Rat-tooth forceps (1x2 teeth, straight) | Fine Science Tools | 11053-10 | n=2 |
| Strabismus scissors (blunt end) | Fine Science Tools | 14074-11 | |
| Iris forceps (curved) | Fine Science Tools | 11065-07 | |
| Spring scissors (angled) | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Halsey micro needle holder | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| 10 cm plates | Corning | 430167 | |
| PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Bupernex (Buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser | 517201 | |
| Insulin syringes (29 Ga) | Monoject | 8881 600145 | |
| Q-tips | Solon Manufacturing Company | 362 | |
| Single edge razor blades (#9) | Smith & Nephew Inc. | 67-0238 | |
| Silk suture (2-0; PS-2) | Ethicon Inc. | 583H |
