Summary
在这里，我们描述了使用自动移液系统接种细胞悬浮液的脂肪衍生基质/干细胞（ASC）球体的大规模生产，从而确保球体大小和形状的均匀性。这些ASC球体可用作3D生物打印方法的构建块。
Abstract
脂肪来源的基质/干细胞（ASCs）是在人皮下脂肪组织的基质血管部分中发现的细胞亚群，被认为是间充质基质/干细胞的经典来源。许多研究已经发表了用于基于支架的组织工程方法的ASC，其主要探索了这些细胞在生物活性支架上接种后的行为。然而，无支架方法正在出现，主要通过使用球体来设计 体外 和 体内的组织，以克服基于支架的方法的局限性。
球状体是由自组装过程形成的3D微组织。它们可以更好地模拟天然组织的结构和微环境，主要是由于细胞间和细胞与细胞外基质相互作用的放大。最近，主要探索球体作为疾病模型，药物筛选研究和3D生物打印的构建块。然而，对于3D生物打印方法，许多大小和形状均匀的球体对于生物制造复杂的组织和器官模型是必要的。此外，当自动产生球状体时，微生物污染的机会很小，从而提高了该方法的可重复性。
大规模生产球状体被认为是开发生物制造线的第一个强制性步骤，该生产线在3D生物打印过程中继续进行，并在生物反应器中完成组织构建的完全成熟。然而，探索大规模ASC球体生产的研究数量仍然很少，以及使用ASC球体作为3D生物打印构建块的研究数量。因此，本文旨在展示使用非粘性微成型水凝胶技术大规模生产ASC球体，将ASC球体作为3D生物打印方法的构建块。
Introduction
球状体被认为是组织工程中的无支架方法。ASC能够通过自组装过程形成球体。球体的3D微架构增加了ASC的再生潜力，包括分成多个谱系的能力1，2，3。该研究小组一直在使用ASC球体进行软骨和骨组织工程4，5，6。更重要的是，球状体被认为是组织和器官生物制造中的构建块，主要是因为它们的融合能力。
使用球状体进行组织形成取决于三个要点：（1）开发标准化和可扩展的机器人方法进行生物制造7，（2）组织球体的系统表型8，（3）开发3D组织组装方法9。这些球状体可以用不同的细胞类型形成，并通过各种方法获得，包括吊坠，重聚，微流体和微摩尔8，9，10。这些方法中的每一种都有与球体大小和形状的均匀性，形成后的球体的回收率，产生的球体数量，过程自动化，劳动强度和成本11相关的优缺点。
在微成型方法中，由于重力作用，细胞被分配并沉积在微成型的底部。非粘性水凝胶不允许细胞粘附在底部，并且细胞间相互作用导致每次衰退8，12形成单个球体。这种生物制造方法产生均匀且可控尺寸的球体，可以以最小的努力以省时的方式机器人化以进行大规模生产，并且在组织球体7，8的生物制造设计中具有良好的成本效益关键因素。该方法可以应用于形成任何细胞谱系的球体，以制备具有可预测，最佳和可控特征的新组织类型8。
生物制造被定义为“具有结构组织的生物功能产品的自动生成......”13。因此，球体的自动化生产被认为是开发生物制造生产线的第一个强制性步骤，该生产线继续在3D生物打印过程中完成，并通过球体融合完成生物打印组织的完全成熟。在这项研究中，为了提高ASC球状生物制造的可扩展性，我们使用自动移液系统来接种细胞悬浮液，从而确保球体大小和形状的均匀性。这篇论文表明，有可能产生3D生物打印方法所需的大量（数千个）球体，以生物制造更复杂的组织模型。
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Protocol
本研究中使用的ASC以前是从健康的人类供体中分离出来的，并根据巴西里约热内卢联邦大学克莱门蒂诺·弗拉加·菲略大学医院的研究伦理委员会（25818719.4.0000.5257）的描述 14进行冷冻保存。有关本研究中使用的所有材料和设备的详细信息，请参阅 材料表 。
1. ASC单层在三通道时的胰蛋白酶消化
- 打开含有80%汇合的ASC单层的175厘米2 烧瓶的组织培养物，并丢弃上清液。
- 加入7 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS，0.01 M）并洗涤单层两次。接下来，丢弃液体。
- 加入 5 mL 0.125% 胰蛋白酶和 0.78 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA）。接下来，在37°C下孵育5分钟。
- 将10 mL 低葡萄糖 杜贝克的改良鹰培养基（DMEM LOW）与10%胎牛血清（FBS）加入组织培养175 cm2 烧瓶中，并用10mL索理移液管将细胞悬浮液充分混合。
- 用10 mL血清移液器收获细胞悬浮液并将其转移到50 mL离心管中。接下来，在400× g 下离心5分钟以获得ASC的沉淀。使用含有10%FBS的DMEM 低 重悬细胞沉淀。
- 通过台盼排除进行细胞计数。
- 计数后，在单独的15 mL离心管中总共取1×106 个ASC，以接种用非贴壁水凝胶微成型的81个衰退（总共接种10，000个细胞/ mL）。要接种256个微成型非贴壁水凝胶的衰退，将总共5个×105 个ASC放入离心管中（这里总共接种2，500个细胞/ mL）。
2. 微成型非粘附琼脂糖水凝胶制备
- 在超纯水中制备50mL的2%超纯琼脂糖无菌溶液与0.9%NaCl。在121°C下高压灭菌溶液30分钟。
- 在含有81或256个圆形凹槽的硅胶模具的中心加入500μL无菌的2%超纯琼脂糖溶液。
- 40分钟后，从硅胶模具中解压超纯琼脂糖，并将其置于12孔塑料板的孔中。
- 在孔中加入2mL DMEM LOW 与微成型琼脂糖一起，并在37°C的培养箱中在5%CO2 气氛中孵育至少12小时，然后接种ASC。
3. 使用自动移液系统对ASC球体进行生物制造
- 请检查以下各项：
- 检查层流是否开启，机柜气流是否正常工作。
- 检查设备是否连接到正确的电压。
- 检查平板电脑是否连接到设备。
- 检查机柜保护玻璃的高度是否与设备的传感器标记高度相同。
- 按设备左侧的 开/关 按钮，等待平板电脑和设备启动。
- 将吸头盒、离心管架和含有微成型琼脂糖水凝胶的板放置在设备的工作空间中。
- 在打开软件的平板电脑上，首先单击 实验室器皿编辑器。
- 设置虚拟工作台并选择移液器、吸头盒、塑料管架和板的位置。
注：虚拟工作台必须代表附件在设备中的物理位置。 - 单击“ 切换到生产 ”按钮以包括设备将在整个实验过程中执行的参数（请参阅步骤3.10）和命令。等待工具栏和 “生产清单” 在软件中打开。
- 最初，要指示命令，请包括要移取的样品数并将其拖动到 “生产列表”。
注意：样品数量是含有ASC悬浮液的塑料离心管的数量，这些悬浮液将接种在微模具的中心。 - 输入样品数量后，单击软件上的 “样品转移 ”命令按钮，将ASC悬浮液转移到包含微粒的12孔板的孔中，并将其拖到 “生产清单”中。
- 单击 “属性” 以设置设备转移样品的开始和结束位置。
- 等待软件返回到“工作表”页面。单击“选项”按钮以设置ASC自动播种的参数：i）吸气速度为15.4 s-1;ii） 点胶速度为 1 s-1;iii） 吹气延迟为0毫秒;四、吹气速度15.4秒-1;v） 初始行程为 100%。选择“水”作为“标准液体类型”。
- 设置参数以混合ASC以获得均匀的悬浮液：i）循环次数为5;ii） 速度为 6.5 s-1;iii） 体积为 300 μL。
- 设置参数后，将 40 分钟的时间添加到“生产列表”中。
注意：需要等待ASC悬浮液在微成型底部倾析所需的时间。 - 在 “生产清单”中，包括“ 试剂转移 ”选项，用于将球状培养基转移到板的相应孔中。
- 重复步骤3.9-3.11以设置转移球状培养基的位置和参数配置。
- 单击软件顶部栏上带有复选符号的按钮，以确保没有编程错误。
- 单击软件顶部栏上的“ 播放 ”按钮（带有三角形符号）以启动程序。
- 让设备启动，按照程序，等待它发出声音，表明它已经完成了。
- 收集12孔板并将其在37°C，5%CO2 的培养箱中孵育至少18小时，以使球状体完全形成并致密。
- 在培养1天，3天和7天后手动收获球体以进行分析。用微量移液管手动冲洗培养基，以从微模塑的非粘附琼脂糖水凝胶中释放球体。
- 5分钟后，在显微镜下检查以确定球体是否完全从微成型的非粘附琼脂糖水凝胶中释放出来。
- 使用微量移液管手动收集球状体，并将其转移到15 mL离心管中。
- 用0.01 M PBS洗涤球体至少两次。评估活力并对新鲜球状体样品进行生物力学分析。对于形态学分析（组织学），将球状体样品在PBS的4%多聚甲醛中孵育至少18小时，在2-8°C下。
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Representative Results
自动移液系统可以在15分钟内将ASC细胞悬浮液接种到一个12孔板的12个孔中。使用81微成型的非粘附水凝胶将在方案结束时产生972个球体。使用256微成型的非粘附水凝胶将在方案结束时产生3，072个球状体。分析ASC球体的尺寸和形状的均匀性。来自具有81个衰退的微模具的ASC球状体在培养期间显示出均匀的直径，而来自具有256个衰退的微成型物的ASC球体（图1C，D）。最小和最大直径（球形）的比率接近1，在微霉菌的ASC球体中，有81和256个衰退（图1E，F）。活力、形态学和力分析的结果（图2）为ASC球体的成功大规模生产提供了证据。
图 1：ASC 球体显示出高直径再现性。 来自微成型非粘性水凝胶的ASC球体的代表性光学显微照片，具有（A）81个圆形衰退和（B）256个圆形衰退。（三、四）球体直径为1、3和7天，分别由5个微成型的非粘性水凝胶组成，分别具有81和256个圆形衰退。（英，女）最小和最大直径的微模塑非粘性水凝胶的比率分别为81和256个圆形衰退。为了测量球体的最小和最大直径，每周使用配备数码相机的光学显微镜采集图像。使用ImageJ软件测量宽度和长度。通过将宽度除以长度（球体球率）来获得每个球体的直径比。从微成型的非粘性水凝胶中共测量了85个球状体，其中有81个圆形衰退，从微成型的非粘性水凝胶中共测量了160个球体，其中有256个圆形衰退。数据表示为均值±标准差。星号表示方差分析非参数且未配对后进行多次比较（**P < 0.001; ****P < 0.0001）获得的 P 值。比例尺 = 100 μm。缩写：ASC =脂肪组织干/基质细胞。请点击此处查看此图的大图。
图2：ASC球体显示出高细胞活力. （A）从具有256个圆形衰退的微成型，非粘性水凝胶中第7天ASC球体的活性测定的荧光显微照片。分别以绿色和红色观察活细胞和死细胞。死亡控制显示在插图中。（B）由微成型的非粘性水凝胶中的苏木精和曙红染色的ASC球体切片，具有81个圆形衰退。将固定的球状体样品嵌入石蜡中，并使用切片机将样品切割成5μm厚的切片。（C）在第7天以μN为单位测量的ASC球体的压缩阻力。数据是从五个球体中收集的，根据先前描述的方法5，±标准差表示为平均值。星号表示通过双向方差分析（非参数和不成对）获得的 P 值，然后进行多次比较。比例尺 = 50 μm。缩写：ASC =脂肪组织干/基质细胞。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
本文介绍了使用自动移液器系统大规模生成ASC球体。该协议的关键步骤是精确设置软件，以确保正确的细胞悬浮液体积，速度和移液距离。方案中描述的参数是在多次试验后确定的，以优化ASC细胞悬浮液分配到含有微成型，非粘附水凝胶的12孔板的孔中。通过测量球体的直径和球形度来评估优化。微成型非贴壁水凝胶的面积和高度用于计算分配细胞悬浮液的理想速度。如果细胞悬浮液由设备以不同的分配速度接种，这将直接影响球体的形成。因此，这些是在设备试用后需要优化的关键参数。此协议有一些限制。只有在微成型品中的非贴壁水凝胶中接种ASC才能自动化，然后添加细胞培养基。系统的功能受到设备和软件版本的限制。然而，这种可重复方法的主要优点是可以产生多达3，072个ASC球体 - 大小和形状均匀且可行 - 人为错误或污染的风险很小。大量的生物制造的ASC球体可以直接加载到3D生物打印机中，以产生更复杂的组织模型。
一般而言，众所周知，准确和自动化的移液在细胞培养的自动化中起着核心作用。自动化细胞培养系统可实现大规模生产，并提高技术准确性、可重复性和工艺效率15.因此，自动化系统可以促进大规模生产，这是常见的，并且有利于工业环境16，17。然而，很少有研究描述开发自动化3D细胞培养系统的方案7，18，19，20，21。
Mehesz和合作者7 和梅塞格尔 - 里波利斯及其同事21 使用类似的方案来生物制造ASC球体。在Mehesz等人的研究中，作者使用了相同的自动移液系统。然而，他们的实验方案只产生了96个球体，而目前工作中开发的实验方案能够一次产生多达3，072个ASC球体，大小和形状均匀。Meseguer-Ripolles等人21 还使用自动移液系统生产多达73个肝球体。现在讨论的另一种大规模制造球体的方法 是通过 微流体装置。然而，迄今为止发表的文章已经探索了开发更好的设备的技术，这些设备可以产生球体，而不是增加球体制造的规模7，20。
另一种可用于制造大量球状体的方法是使用旋转瓶。然而，关于这种技术的一个主要问题是难以控制球体22，23的大小和形状。此外，3D生物打印也已经大规模应用于生物制造球体。在Daly和Kelly19的研究中，作者使用喷墨技术在聚己内酯微室中产生大量球体。球体在大小和形状上是可行的和均匀的。
本工作中描述的方案的主要应用是大规模生物制造3D生物打印所需的ASC球体。正如Mironov和合作者24所讨论的那样，需要数千个球体来生物制造复杂的组织和器官模型。该协议中描述的自动化方法将允许制造大量ASC球体，这些球体可以直接加载到3D生物打印机中。也可以将这些球体区分为所需的中胚层通路，以工程肌肉骨骼组织。De Moor和合作者25 开发了一种高通量方法，用于制造大量血管化球体，用于未来的3D生物打印应用。
可以修改设备以改进协议。该设备的最新版本允许使用更多数量的板，这可以增加产生的ASC球体的数量。同样的最新版本允许板的精确堆叠，这也将提供更好的协议效率。总之，我们成功地展示了一种方案，允许在15分钟内使生物制造达到3，072个ASC球体的大小和形状均匀，这被认为是为组织工程应用构建生物制造生产线的第一步。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢国家计量、质量和技术研究所（INMETRO，RJ，巴西）使用他们的设施。这项研究得到了里约热内卢州（Faperj）研究支持卡洛斯·恰加斯·菲略研究支持基金会（财务代码：E26/202.682/2018和E-26/010.001771/2019）、国家科学技术发展委员会（CNPq）（财务代码：307460/2019-3）和海军研究办公室（ONR）（财务代码：N62909-21-1-2091）的部分支持。这项工作得到了国家再生医学科学技术中心-INCT再生（http://www.inctregenera.org.br/）的部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plastic plate | Corning | 3512 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | CLS430828 | |
| EpMotion 5070 | Eppendorf | 5070000282 | |
| epT.I.P.S. Motion | Eppendorf | 30015231 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15576028 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) | Gibco | 31600034 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array | Sigma | Z764000 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array | Sigma | Z764019 | |
| phosphate saline buffer (PBS) | Sigma | 806552 | |
| sodium chloride (NaCl) | Sigma | S8776 | |
| tissue culture flask | Corning | 430720U | |
| trypan | Lonza | 17-942E | |
| trypsin | Gibco | 27250018 | |
| ultrapure agarose | Invitrogen | 16500100 |
References
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